JPS60227690A - アキカラマツの組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明はアキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｒｕｍ　ｍ１ｎｕ
ｓＬ、　ｖａｒ、打匣圏匹朋旧ｑ、　＝Ｔ、柚μゆ犯１
月−ＤＣ，）の組織培養方法に関する。さらに詳しくは
液体培地を用いて、アキカラマツを組織培養することに
より有用成分であるベルベリンを多量に効率よく生産す
る方法に関する。

〔産業上の利用分野〕

キンポウゲ科の植物であるアキカラマツにはベルベリン
が含有されており、このアルカロイドは例えば整腸薬、
細菌性腸疾患治療剤、染料などに利用されその需要は大
きい。

〔従来の技術〕

しかしながら、天然で生育したアキカラマツからベルベ
リンを直接採取する方法は、アキカラマツ植物体のベル
ベリン含量が極めて少ないこと、又その生育等が自然環
境や天候に左右され、また該植物の収集にも時間と手間
がかかるため有利な方法とは言えない。

そこで、これらに代わるものとして組織培養法によるア
キカラマツの増殖方法がこれ迄に提案されており、例え
ばファイトケミストリー（Ｐｈｙｔｏ−ｃｈｅｍｉｔｒ
ｙ）　２１巻１４１９〜１４２１頁（１９８２年）には
、植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）およびカイネチンを含有させたにｕｒａ
ｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇの固型培地を用いてアキカラマ
ツを組織培養する方法が提案されている。該方法によれ
ば、ベルベリンの生成量は乾燥重量当たり天然のアキカ
ラマツでは０．００１９％であるのに対して、２．４−
Ｄをｉ、ｏｐｐｍおよび５．０ｐｐｍ含むＭＳ培地を用
いた組織培養によって得られたカルスではそれぞれ０．
２５％および０．６７％のベルベリンが含まれる旨の記
載がなされている。しかし、該方法においてもベルへリ
ンの生成量は未だ不充分であり、ベルベリンを工業的に
組織培養を用いて生産するためには、ベルベリン生成能
が従来公知のものより更に高い培養細胞の得られる培地
を開発する必要がある。ところで、一般には植物の組織
培養においては生育する培養細胞の性質は用いられる培
地の種類、例えば培地の成分組成および該成分の含有量
等によって影響を受けることが知られている。

〔発明の目的〕

本発明者等はかかる点を認識した上で、ベルへリン生成
能の高いアキカラマツ培養細胞を得るための組織培養方
法について鋭意検討した。

〔発明の構成〕

その結果下記方法を採用すれば良いことを見出し、本発
明を完成するに到った。

すなわち、本発明によれば、アキカラマツの組織培養を
液体培地を用いて行うことを特徴とするベルベリンの製
造法が提供される。

本発明で使用される液体培地は、無機成分および炭素源
を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を
添加し、更に必要に応してアミノ酸類を添加した培地で
ある。

該液体培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム
、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄
、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、コラ素
、コバルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、
具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム
、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、
モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カ
リウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を
例示できる。

該液体培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とそ
の誘導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級
アルコールなどを例示できる。

該液体培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタ
レン酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）、Ｉ
）−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）インドール酪酸（ＩＢＡ）等のオ
ーキシン類およびベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチ
ン、ゼアチン等のサイトカイニン類を例示できるが、本
発明では特にＮＡＡおよびＢＡから選ばれる少なくとも
一種の植物ホルモンを含有していることがベルベリンの
生成量が多くなるなどの点から望ましい。更に必要に応
じてこれ以外の前記植物ホルモンを適宜の量更に追加す
ることができる。

該液体培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピ
リドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウ
ム、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニ
コチン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタ
ミンＢ参などを例示できる。

該液体培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、ア
ラニン、グルタミン酸、システィン、チロシン、および
リジンなどを例示できる。

本発明の前記液体培地は、通常は、前記無機成分を０．
１μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１ｇ／ｆｆ
ないし約１００　ｇ　／　ｌ、前記植物ホルモン類を中
でもＮＡＡを通常は約１μＭないし約１ｏｏｏμＭ、好
ましくは約５０μＭないし約１００μＭ、ＢＡを通常は
約０．１μＭないし約１００μＭ、好ましくは約１μＭ
ないし約１０μＭ、前記ビタミン類を約０．１　ｍｇ／
　ｊ！ないし約１５０ｍｇ／Ａおよび前記アミノ酸類を
０ないし約１０００ｍｇ／　１含ませて使用されること
が望ましい。

本発明のアキカラマツの組織培養に用いられる前記液体
培地として具体的には、従来から知られている植物の組
織培養に用いられている液体培地、例えば、ムラシゲ・
スクーグ（’６２）　（Ｍｕｒａｓｈｉ−ｇｅ＆Ｓｋｏ
ｏｇ）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９
６５）　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培
地、ホワイト（”６３）　（Ｉｌｈｉｔｅ　）の培地、
ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ　）のＢ＝５培地、三井の
Ｍ−９培地等に前記した植物ホルモンおよび炭素源を添
加し、更に必要に応じて前記したビタミン類、アミノ酸
類を添加して調製される液体培地を例示できるが、本発
明ではこの中でも特にリンスマイヤー・スクーグ又はム
ラシゲ・スクーグの液体培地を用いて調製される液体培
地が好ましい。なお、上記した従来公知の液体培地の組
成に関しては、例えば、性向、中黒、古谷著の「新植物
組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１朝倉書店１９７９年に
記載されている。

本発明では前記した植物ホルモン類の中でもＮＡＡとＢ
Ａを併用することがベルベリンの生成量を増し、又後述
するベルベリンの細胞外への放出量を増大させる点から
も好ましい。

本発明の組織培養方法の好適例として、例えば次の方法
を例示することができる。すなわち、アキカラマツの根
、葉、茎、種子、花芽から採取された組織片を、殺菌処
理後、寒天で固めたリンスマイヤー・スクーグの固型培
地上に置床し、２０ないし３０℃で２０ないし３０日程
度放置して組織片の一部をカルス化させる。このように
して得られたカルスを本発明者等が開発した特定の液体
培地を用いて継代培養することによって、アキカラマツ
細胞の代謝産物であるベルベリンを細胞外へ放出する性
質を有した生育速度の速い安定した培養細胞をえること
ができる。本発明の方法では特にこの安定化したベルベ
リン放出性の培養細胞を本発明の液体培地に添加して振
とうとすることにより組織培養を行う方法を採用するこ
とが好ましいが、本発明の方法は必ずしもこのベルベリ
ン放出ｆ１の培養細胞を使用する方法に限定されるもの
ではない。

本発明の液体培地を使用すればベルベリンの生成量は従
来法に比べて著しく多くなり、しかも培養細胞として先
のベルベリン放出性培養細胞を使用した場合にはベルベ
リンの細胞外への放出量が増大し、従ってベルベリンの
分離が容易になるという利点がある。一方、本発明の液
体培地のうちでも植物ホルモン類として２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸のみを添加した液体培地を用いた場合
には、ベルベリン放出性培養細胞を使用してもベルベリ
ンは該培地中にほとんど放出されないことを本発明者等
は認めた。

本発明の組織培養においては光は必ずしも必要ではなく
、暗所での培養が培養細胞の生育に望ましい。本発明の
液体培地における培養温度としては、通常２０ないし３
０℃であるが、特に２３ないし２８℃が好適であり、該
温度がこれよりも低くなっても、高くなっても培養細胞
の増殖速度は低下する。

本発明の液体培地を用いた組織培養において、特にベル
ベリンが細胞内から液体培地中に放出される場合を採用
したときには、通常ベルベリン総生成量のうち約８０％
以上が細胞外へ放出されるが、この場合、ベルベリンの
硝酸塩又は塩化物は冷水に難溶性の塩であることから、
本発明の一実施態様として液体培地が硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどによる硝酸イオ
ン、塩素イオンを含有する液体培地を使用することによ
り、該放出ベルベリンを硝酸ベルベリン、塩化ベルベリ
ンの黄色結晶として析出さすことができる。この場合、
該放出ベルベリンは黄色析出結晶以外にも液体培地に溶
解した形で存在している場合もある。従ってベルベリン
の分離法としては例えば培養終了後の培養混合物に硝酸
イオン、塩素イオンを適宜の量加えて適宜の温度に冷却
して熔解ベルベリンを析出させ、然る後に黄色析出結晶
を液体培地から拾い出すなどの従来法とは異なる分離方
法を採用することも可能である。

本発明の液体培地の一実施態様として、リン酸塩例えば
リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等の無機成分の濃度
が１７０ｍｇ／ｎ以下、好ましくは１００　ｍｇ／　７
！以下である液体培地を用い、ベルベリン放出性の培養
細胞を使用して組織培養を行った場合には、培養細胞の
成長が抑制されてベルベリンの細胞外への放出量が増大
するという好ましい現象を本発明者等は見出している。

本発明の方法では、組織培養によって得られるベルベリ
ンを分離する方法として例えば以下に述べる方法を必要
に応じて採用することができる。

（１）培養終了後、培養細胞と代謝産物のベルベリンを
含む、培養混合物を加熱してベルベリンを該培養混合物
中の液体培地に溶解させた状態で０ 濾過等の方法により溶液と固形物に分離し、次に該溶液
を通常１０℃以下に冷却してベルベリンを黄色結晶とし
て析出させる。この場合必要に応じて、該溶液に硝酸イ
オン又は塩素イオンを添加してベルベリンを硝酸塩又は
塩化物の黄色結晶として析出させてもよい。次に濾過等
の方法により該黄色析出物を単離する。

（２）培養混合物を例えば遠心分離するか、あるいは適
宜な孔径を有するナイロン若しくは金属製のフィルター
を用いて培養混合物を濾過することによって、培養細胞
と黄色結晶析出物の固形混合物を液体培地から分離し、
該固形混合物をクロロホルム、メタノール、エタノール
等の溶剤で処理してベルベリンを該溶剤に抽出し、晶出
させてベルベリンを単離する。一方、先の分離された液
体にはベルベリンを熔解しているが、これは例えばＡｍ
ｂｅｒｌｉｔｅ　ＸＡＤ−２等のイオン交換樹脂に吸着
させた後、メタノールで溶出し、晶出させてベルベリン
を単離する。分離された液体に溶解しているベルベリン
を単離する方法と１ しては、これ以外にも必要に応じて、該分離液体を例え
ばクロロホルム等の溶剤で処理して抽出分離するか、あ
るいは先の（１）の方法の中で示したように該液体に硝
酸イオン、塩素イオンを加えてベルベリンを析出させて
分離する方法を採用することもできる。

（３）生成ベルベリンが細胞中に残存している場合には
、培養混合物から（２）と同様の濾過等の方法によって
培養細胞を分離し、この培養細胞を破砕処理してからベ
ルへリンを抽出分離する方法を採用することもできる。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、液体培地を用いるのでタンク等を利用
した大量培養が可能であり、また、ベルベリンが細胞外
に放出される培養細胞を用いた場合にはベルベリンの分
１ｉ１１を操作が簡単となり、しかも培養細胞の増殖が
速やかで、かつベルベリンを確実に大量生産することが
できる工業上有用な方法である。

〔実施例〕

以下に本発明の内容を実施例によって更に詳しく説明す
る。

実施例１ アキカラマツの葉、葉柄、花芽を通常の方法で滅菌し、
ＮＡＡを１００μＭ、ＢＡ５μＭおよびシュークロース
を３０ｇ／Ｉｌの濃度で含む、リンスマイヤー・スクー
グの固型培地を用いて、これらのものから通常の方法に
よりカルスを誘導した。

用いるアキカラマツの組織によってはカルスの増殖およ
びベルベリン生成能が異なっているので、このカルスを
先のリンスマイヤー・スクーグの固型培地を用いて暗所
下２５℃で成長分裂させて、黄色が濃く生育の良いカル
スを選抜しながら約１年にねったて継代培養することに
より、更に黄色の濃いベルベリン産生量の多い生育の良
い安定したカルスを得た。

次に該選抜カルスをＮＡＡを１００μＭ、ＢＡを５μＭ
およびシュークロースを３０ｇ／１２の濃度で３ ２ 含む、リンスマイヤー・スクーグの液体培地に移して、
温度２５℃、振とう１００ストローク／分の条件で継代
培養し、黄色が濃く生育の良い培養細胞を先を太くした
駒込ピペットで選抜してこれを新鮮な液体培地に移し変
えて再び培養を繰り返した。

この場合の選抜細胞を新鮮な液体培地に移してかことに
よって、ベルベリンの生成量が多くしかも生成したベル
ベリンを細胞外へ８０％以上放出するベルベリン放出性
の培養細胞をえることができた。

次にこのベルベリン放出性の培養細胞を１００ｍ１のエ
ルレンマイヤーフラスコを用いて、ＮＡＡｌｏｏ　メＺ
Ｍ、ＢＡ５μＭおよびシュークロースを３０ｇ／Ｉｌ含
むリンスマイヤー・スクーグの液体培地で培養温度２５
℃、１００ストローク／分の条件で振とうさせながら１
８日間培養することにより、培地３０ｍ１あたり２４．
．２ｍｇの硝酸ベルベリンを生産することができた。な
お、該生成ベルベリンのうち１２．４％が細胞内に存在
し、残りは培地中に存在した。

４ 培地中では一部のベルベリンが星状晶及び柱状晶の硝酸
ベルベリンとして析出した。

実施例２ 実施例１で用いたベルベリン放出性の培養細胞を、ＮＡ
Ａ１００μＭ、ＢＡ５μＭ１シュークロース３０　ｇ　
／　１　、、Ｎ　Ｈ４ＣＩ　４０ｍ　Ｍ、、Ｋ　Ｎ　０
３２０ｍ　Ｍを含む改変リンスマイヤー・スクーグ（、
Ｌ　Ｓ　）の液体培地で実施例１と同一条件により培養
することにより、培地３０「１当たり１９．５ｍｇのベ
ルベリンが生産された。なお培地中では一部のベルベリ
ンが針状晶の塩化ベルベリン（約１０％の硝酸ベルベリ
ンを含む）として析出した。

実施例３ 実施例１で用いたベルベリン放出性のアキカラマツ培養
細胞を、ＮＡＡｌｏｏ　μＭ、ＢＡ５μＭ１シュークロ
ース３０ｇ／βを含み、リン酸を含まない改変ＬＳ液体
培地を用いた以外は実施例１と同一条件で培養を行った
。この場合、細胞増殖は通５ 常のＬＳ培地の約半分程度に抑制されたにもかかわらず
ベルベリン生成量は通常のＬＳ培地と同程度であり、し
たがって細胞当たりのベルベリン生産量は実施例１の２
倍になった。

出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人　山　口　和 ６

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アキカラマツの組織培養を液体培地を用いて行う
   ことを特徴とするベルベリンの製造法。