JPS602320B2

JPS602320B2 - 新規ペンタデカペプチド

Info

Publication number: JPS602320B2
Application number: JP57066080A
Authority: JP
Inventors: 信一大箸; 友邦国分; 勝白木; 圭四郎津田; 真二澤野
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-04-20
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1985-01-21
Also published as: JPS58183656A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規なべンタデカベプチドに関するものであ
る。

さらに詳しくいえば、本発明は、ソマトスタチン２８の
ラジオィムノアッセイに有用なべンタデカベプチドに関
するものである。ソマトスタチン１４は、ひつじの視床
下部から抽出されるテトラデカベプチドで、成長ホルモ
ン、インシュリン、グルカゴン、ガストリン、セクレチ
ン、甲状腺刺激ホルモンなどの分泌を抑制する因子とし
て知られている。また、ソマトスタチン２８は、ソマト
スタチン１４のＮ端にさらに１４個のアミノ酸単位が結
合したポリベブチドで、ソマトスタチン１４よりも高い
活性を示す因子で、ソマトスタチン１４とは異なる作用
を呈するものであることから、生体中でのこれの濃度測
定は非常に重要な意味を有している。しかしながら、ソ
マトスタチン２８については、専用の測定法がなく、ソ
マトスタチソ１４を測定するためのラジオィムノアッセ
ィ法を代用しているのが実情であるが、これには測定に
先立って、ゲル炉過法などのはん雑な手段でソマトスタ
チン１４と分離しておことが必要になり、その実用化は
非常に困難であった。

本発明者らは、このソマトスタチン２８を直接的に測定
する技術を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ソマトス
タチン２８の側鎖の末端部分に相当するテトラデカベプ
チドのＮＱ位にヨウ素による標識可能なＬ−チロシル基
を導入した化合物を標識抗原とすることにより、ソマト
スタチン２８のラジオィムノアッセィが可能になること
を見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、次の式で表わされる新規なべンタ
デカベブチドを提供するものである。Ｈ−Ｔ〆−Ｓｅｒ
−ＡＩａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＡＩａ−
Ｍｅｔ−ＡＩａ−Ｐｒｏ−ＡＪｇ−ＧＩｕ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ一〇日ただし、式中の各記号は以下のアミノ酸単位
を意味する。

ＡＩａ；Ｌーアラニン，Ａ止ｇ；Ｌーアルギニン，Ａｓ
ｎ：Ｌーアス／ゞラギン，ＧＩｕ；Ｌーグルタミン酸，
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン，Ｍｅｔ；Ｌーメチオニン，Ｐｒｏ
；Ｌープロリン，Ｓｅｒ；Ｌーセリン，Ｔｙｒ：Ｌ−チ
ロシン。

本発明のペンタデカベプチドは、ベプチド合成の際に用
いられる常法に従い、アミノ基の保護されたＱ−アミノ
酸とカルボキシル基の保護されたＱ−アミノ酸とを上記
の構造の順序に順次べプチド結合させることにより製造
することができる。

この際のべプチド形成は、活性ェステル化法、混合酸無
水物法、活性アミノ化法、縮合剤を用いる方法など公知
の方法の中から適当に選択して行うことができるが、特
に有利なのは合成樹脂をべ−スとした固相合成法である
。この方法によると、先ず反応性基をもつ合成樹脂例え
ばクロルメチルポリスチレン樹脂にアミノ基を保護した
Ｌ−リジンの活性誘導体を反応させて、Ｌ−リジル基の
結合した合成樹脂を製造し、次いでＬ−リジル基のＱ位
のァミノ基の保護基を脱離し、これにアミノ基を保護し
たＬ−アルギニンを反応させたのち、そのァミノ基の保
護基を脱藤するという操作を繰り返し、１９固のＱ−ア
ミノ酸を結合させ、所望のペンタデカベプチドを得るこ
とがきる。このようにして得られた本発明のペンタデカ
ベプチドは、末端のＬ−チロシル基を放射性ヨウ素で際
議し、ソマトスタチン２８ラジオィムノアッセィ用標識
化合物として供することができる。

次に実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例中に示されている略号は以下の意味をもつ。ＳＳ
；ソマトスタチンＡＩａ；Ｌーアラニン単位Ａｒｇ；Ｌーアルギニン単位Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン単位ＧＩｕ；Ｌーグタミン酸単位Ｌｙｓ：Ｌーリジン単位Ｍｅｔ；Ｌ−メチオニン単位Ｐｒｏ；Ｌープロリン単位Ｓｅｒ：Ｌーセリン単位Ｔｙｒ：Ｌーチロシン単位ＤＣＣ；ジシクロヘキシルカルポジイミドＴＥＡ；トリ
エチルアミンＴＦＡ；トリフルオロ酢酸ＤＭＦ；ジメチルホルムアミドＢＭ；ｔープトキシカルボニル基Ｂｒ一Ｚ；ｏ−フロモベンジルオキシカルボニル基ＣＩ
−Ｚ；ｏークロロベンジルオキシカルボニル基Ｂｚｌ；
ペンジル基ＭＢ；ｐ−メチルベンジル基Ｔｏｓ；トシル基ＯＮｐ：ｐーニトロフヱニルェステル基実施例風ＢＭ−Ｌ松（ＣＩ−Ｚ）一樹脂の製造ＢＭ−Ｌ侭（
ＣＩ−Ｚ）−ＯＨのｔーブチルアミン塩４．機夕を酢酸
エチル中に分散させ、ＩＭクエン酸水溶液、水とふって
脱塩し、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち、酢酸エチ
ルを除去した。

残ったオイルを１５の‘のメタノールに溶かし、トリメ
チルベンジルアンモニウムヒドロキシドメタノール溶液
（４０％）４の‘を加えた。

完全に混合したのちこれをロータリーェバポレータ−に
かけ、メタノールを除去した。残った塩にジオキサンを
加え、ェバポレーターで乾園した。この操作をさらに、
ジオキサン、メタノールについて１回ずつ繰り返したの
ち、残った塩を十分真空乾燥した。この塩を６０の‘の
ＤＭＦにとかし、クロルメチル化ポリスチレン樹脂（架
橋度１％）５夕を加え、終夜かきまぜた。グラスフィル
ター上に樹脂を集め、ＤＭＦ、メタノール、水、メタノ
ール、ジクロルメタンの順に洗い、真空乾燥して、ＢＭ
−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）一樹脂５．５夕を得た。この樹脂
のＬ＄含量は、樹脂１夕あたり０．２７ミリモルであっ
た。｛８）Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）一Ｓｅｒ（Ｂ
ｚｌ）−ＡＩａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ一Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ
Ｉａ一Ｍｅｔ−山ａ−Ｐｒｏ−Ａ鴇（Ｔｏｓ）‐ＧＩｕ
（ＢＺＩ）一〜ｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−樹
脂の製造合成は固相合成法により、ベプチド自動合成装
置を用いて行った。

Ｑーアミノ基の保護基にはＢＸを使い、アミノ酸側鎖の
保護には次のようなものを用いた。ＧＩｕ，Ｓｅｒ；Ｂ
ｚｌ：〜ｇ；Ｔｏｓ；Ｌｙｓ；ＣＩ−Ｚ；Ｔｙｒ；Ｂｒ
−Ｚ。各アミノ酸の縮合は第１表に示した工程に従って
行った。アミノ酸誘導体及びＤＣＣは、樹脂についたＬ
＄の２．５倍当量用い、それぞれ２回ずつ縮合を繰り返
した。Ａｓｎの導入には活性ェステル法を用い、第２表
の工程に従って行った。舷ｃ一Ａｓｎ−ＯＮｐはＬｙｓ
に対して８倍当量を用いた。全縮合工程を終ったのち、
樹脂をグラスフィルター上に集め、ＤＭＦ、メタノール
、ジクロルメタン、メタノールの順に洗い、真空乾燥し
た。この方法により、舷ｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）樹脂２
．８夕から４．５９夕の操護べプチド樹脂が得られた。
第１表第２表 ‘Ｃ｝Ｈ−ＴＭ−Ｓｅｒ−ＡＩａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ａｓｎ−Ｐｍ一ＡＩａ−Ｍｅｔ一ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−ＧＩｕ−ＡＪｇ−Ｌｙｓ−ＯＨの製造節ｃ‐Ｔｙｒ
（Ｂｒ‐Ｚ）‐Ｓｅｒ（ＢＺＩ）−ＡＩａ−Ａｓｎ−Ｓ
ｅｔ−（Ｂｚｌ）−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＡＩａ−Ｍｅｔ−
ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＧＩｕ（Ｂｚｌ）
−〜ｇ（Ｔｏｓ）−Ｌが（ＣＩ−Ｚ）−樹脂４．５０夕
に、アニソール６泌を加えて１晩放置したのち、反応容
器をドライアイスーェタノールで冷しながらＨＦ５０舷
を加え、０℃で１時間反応させた。

減圧下でフッ化水素及びアニソールを除き、残留物を酢
酸エチルで十分洗った。これを２Ｍ酢酸で抽出し、グラ
スフィルターで樹脂を除去した。こうして縛られた粗べ
プチドの酢酸水溶液を弱塩基性イオン交予期樹脂を通し
たのち、凍結乾燥して、粗べプチドを得た。粗べプチド
はセフアデツクスＧ−２５によるゲル涙過（溶出液：２
Ｍ酢酸）、カルボキシメチルセルロースによるイオン交
換クロマト（溶出液：０．０８Ｍ〜０．釧路酸アンモニ
ウム）、逆相系分取用高速液体クロマト（溶出液：０．
０９Ｍ酢酸アンモニウム、９％ァセトニトリル）で精製
し、高純度のＨ−Ｔｙｒ‐Ｓｅｒ‐ＡＩａ‐Ａｓｎ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｎａ−Ｍｅｔ−ＡＩａ−Ｐｒｏ
−Ａ【ｇ−ＧＩｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ一ＯＨ４６０のタ得
た。ＨＰＬＣによる分析条件：カラム：日立ゲル３０球（４×１５仇岬）溶出液
：０．２Ｍトリエチルアンモニウムホスフエート、６％
アセトニトリル検出：ＵＶ２２皿ｍ溶出位置：７．３分（このクロマトグラムを第１図に示
す。

）鮒ＨＣＩによる加水分解（２幼時間、４３時間）後の
アミノ酸組成Ｔｙｒ：○‐９歌１｝，Ｓｅｒ：１‐９７
【２｝，ＡＩａ：２‐９７｛３’，ＡＳｐ：２．０び２
１，Ｐｒｏ：２．１３２１，Ｍｅｔ：０‐９４【１１，
Ａｒｇ：２．１秋２），ＧＩｕ：１．０４（１｝，Ｌが
：０．９９１ーカッコ内の値は理論値参考例次に本発明のペンタデカベプチドを用いてＳＳ−２８の
ラジオィムノアッセィを行った例を示す。

風標識抗原の調製本発明のペンタデカベプチドを以下
のようにしてＮａ１２５１により標識する。

反応試験管にｐＨ５．０の０．０９Ｍ酢酸アンモニウム
緩衝液１０ムそペンタデカベプチド５ムタを含むｐＨ５
．０の０．０８Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液５山そ、Ｎａ
位５１０．３〜０．５仏Ｃｊ、乳酸過酸イ技酵素（１０
０ｎ夕／仏そ）３山夕、過酸化水素（１０２ｎ多／仏そ
）２仏〆を順次装入し、２分間放置後再度同濃度の過酸
化水素３山そを加え、さらに３分間放置したのち、ｐＨ
４．６の氷冷した０．０８Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液０
．５の‘を加えて反応を停止させた。

次いでこの反応混合物をカルボキシメチルセルロースの
カラムクロマトグラフイー（０．６×１２伽）に通し、
ｐＨ４．６の０．０５〜０．８Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液により溶離し、直線濃度勾配下で２の‘ずつの分画を
集め、凶５１で標識されたペンタデカベプチドを得た。

各分画の放射活性を測定すると、分画２に遊離ヨウ素の
放射活性が認められ、また、抗原性を有するペンタデカ
ベブチドのピークは分画１２に現れ、その比放射能は、
２０〜３０仏Ｃｉ／仏夕であった。‘Ｂ’抗ＳＳ−２８
血清の調製ＳＳ−２８をグルタルアルデヒドを用いてウ
シ血清ァルブミン（以下斑Ａと略記する）と複合させ、
この一定量を生理食塩水１Ｍに溶解し、これに等量のフ
ロィンド助剤（Ｆｒｅ肌船ａｄｉｕｖａｎｔ）を加えて
乳化させたものを、４羽の家兎に１羽当り数１０か所の
皮内に注射し、これを２週間ごとに４〜５回反覆した。

４羽の家兎のうち１羽について特異的な抗体Ｒ５６１を
得た。

｛Ｃ｝標準液の調製合成により製造したＳＳ−２８を緩衝液に溶解し、その
１必中にそれぞれ３１．２５ｐ夕，６２．５ｐ夕，１２
５ｐ夕，２５の夕，５０肌夕，ｌｎ夕，机夕，４ｎ夕及
び飢夕のＳＳ−２８を含む標準液を調製した。

また、本発明化合物の特異性を検べるために、同様にし
て緩衝液１必中にそれぞれｌｎ夕，１皿夕，１０仇夕，
１〃夕及び１０ムタのＳＳ−１４を含む標準液を調製し
た。

この際の緩衝液としては、０．１％ゼラチン水溶液と０
．２％ＢＳＡ水溶液と０．０２９ＭＥＤＴＡ水溶液と０
．１８ＭＮａＣＩ水溶液と０．０１Ｍ日よ０４水溶液と
の混合物であって、ｐＨ７．５のもの（以下ＧＢＰＢＳ
と略記する）を使用した。

このものは、標識抗原、抗血清、ＳＳ−２８の調製や希
釈などにも用いられた。■ ＳＳ一２８のラジオイムノ
アツセイガラス試験管（０．８×９伽）に、ＧＢＰ斑０．２泌、
合成ＳＳ一２８の標準液０．１叫、抗血清Ｒ５６１（５
００倍希釈）０．１の‘、■で得た標識抗原０．１の‘
（約５００比ｐｍ）を順次装入し、４℃で４８時間イン
キュベートし、デキストラン被覆炭を用いてＢＦを分離
した。

標識抗原とＲ５６１抗体との結合館、すなわち抗体の力
価を求め、Ｂ／Ｔ（総放射線量）×１００（％）で表わ
した。次に抗血清Ｒ５６１を１００び音、２０００倍、
４００ぴ音及び８００ぴ音‘こ希釈したものについて、
同様にして力価を求め、その結果を第２図に示す。

他方、本発明化合物の合成標準ＳＳ−２８に対する最少
検出下限値は６２．５ｐ夕／反応チューブで、その標準
曲線は第３図に実線として示すとおりであった。

また、本発明化合物を標識抗原として用いた場合の交さ
性の特異性を示すために、ＳＳ−１４に対する標準曲線
を求めたところ、第３図の破線に示すとおりで、全く交
さ性は認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明化合物のクロマトグラム、第２図は、
本発明化合物を標識抗原としたときの、抗血清Ｒ５６１
についての希釈曲線、第３図は本発明化合物の合成標準
ＳＳ−２８及びＳＳ−１４に対する標準曲線である。第１／図第２図第３図

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｌ−チロシル−Ｌ−セリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ア
スパラギル−Ｌ−セリルＬ−アスパラギル−Ｌ−プロリ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ
−プロリル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ア
ルギニル−Ｌ−リジン。