JPS60234579A - 枯草菌において特定遺伝子の表現を増幅する方法およびこれによつて得られた菌株 - Google Patents
枯草菌において特定遺伝子の表現を増幅する方法およびこれによつて得られた菌株Info
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- JPS60234579A JPS60234579A JP59115355A JP11535584A JPS60234579A JP S60234579 A JPS60234579 A JP S60234579A JP 59115355 A JP59115355 A JP 59115355A JP 11535584 A JP11535584 A JP 11535584A JP S60234579 A JPS60234579 A JP S60234579A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、桿菌、特に枯草菌の中において特定遺伝子の
表現を増幅する方法に関するものである。
表現を増幅する方法に関するものである。
枯草菌は現在、遺伝子工学技術による異種遺伝子の表現
のための選択的宿主を成す。なぜかならば、この細菌は
工業段階における発酵条件の知られている非病原菌だか
らである。
のための選択的宿主を成す。なぜかならば、この細菌は
工業段階における発酵条件の知られている非病原菌だか
らである。
自己複製可能なシラスミドを使用してシラスミドＤＮＡ
によって枯草菌の菌株を形質転換することは、かなり以
前から知られていた。
によって枯草菌の菌株を形質転換することは、かなり以
前から知られていた。
しかし、枯草菌の中におけるこれらの雑種プラスミドの
不安定性に関連した種々の問題が存在する。この不安定
は下記の２型に区分される。
不安定性に関連した種々の問題が存在する。この不安定
は下記の２型に区分される。
−宿主細胞によるシラスミドの完全欠失に対応する分離
不安定性、 一配列の組換、もつとも多くの場合に配列の欠失に対応
する構造的不安定性。
不安定性、 一配列の組換、もつとも多くの場合に配列の欠失に対応
する構造的不安定性。
これらの不安定現象は枯草菌において大腸菌におけるよ
りもはるかに頻繁である。これは、現代技術において宿
主細胞として後者の菌がはるかに多（使用される理由の
一部を説明する。
りもはるかに頻繁である。これは、現代技術において宿
主細胞として後者の菌がはるかに多（使用される理由の
一部を説明する。
この問題は、異種遺伝子のクローニングが枯草菌の染色
体の中で実施されうるならば解決できよう。その場合に
は安定性がはるかに大となるからである。
体の中で実施されうるならば解決できよう。その場合に
は安定性がはるかに大となるからである。
故に、枯草菌の染色体の中に異種遺伝子を組込む目的で
、組込みベクターが構成された。これらのベクターは、
枯草菌の染色体の、組込を保証する相同分節の存在を本
質的特徴としている。
、組込みベクターが構成された。これらのベクターは、
枯草菌の染色体の、組込を保証する相同分節の存在を本
質的特徴としている。
これらのベクターの染色体中への組込みは、大体に下記
の２プロセスによって生じる。
の２プロセスによって生じる。
１°）キャンペル（１９６２）によって記述された単一
１乗換′を含む組換生起の場合（第１図）。
１乗換′を含む組換生起の場合（第１図）。
この組込みメカニズムは、ベクターが受容体細胞中にお
いて環状化される場合にのみ生じる。この環状化は、ベ
クターが内部反復を有する場合に分子間組換生起の結果
として生じ（ミシエルほか、１９８２ ）、あるいは受
容体細胞の染色体の中に相同配列を残存させながら分子
間組替生起の結果として生じることができるにオーダほ
か、１９８２）。
いて環状化される場合にのみ生じる。この環状化は、ベ
クターが内部反復を有する場合に分子間組換生起の結果
として生じ（ミシエルほか、１９８２ ）、あるいは受
容体細胞の染色体の中に相同配列を残存させながら分子
間組替生起の結果として生じることができるにオーダほ
か、１９８２）。
ベクターが内部反復を含む場合にはこのベクターそのも
のの有する相同配列、あるいは受容体細胞の染色体の有
する相同配列をマトリックスとして使用して、切断の修
復によってベクターが環状化されるものと思われる（
１９８２．１９８３ 、ミシエルほかによってプラスミ
ドについて示されたごとく）。
のの有する相同配列、あるいは受容体細胞の染色体の有
する相同配列をマトリックスとして使用して、切断の修
復によってベクターが環状化されるものと思われる（
１９８２．１９８３ 、ミシエルほかによってプラスミ
ドについて示されたごとく）。
キャンベル型メカニズムの組込みは相同配列の重複を生
じ、この重複が異質ＤＮＡを包囲する（ハルデンヴアン
クほか、１９８０；ニオーデほか、１９８２ ）。
じ、この重複が異質ＤＮＡを包囲する（ハルデンヴアン
クほか、１９８０；ニオーデほか、１９８２ ）。
２°）二重１乗換“メカニズムの場合。この場合には、
線形ベクターは、非相同配列の両側に、枯草菌の染色体
ＤＮＡと相同の２区域を有しなければならない（ハリス
ーワリツクおよびレーデルペルグ、１９７７ ；ニオー
デほか、１９８２ ）。もしこのベクターの有する２染
色体分節が染色体の中で隣接していなければ、二重１乗
換′によるベクターの組込みがこれら２相同区域の間に
位置する染色体部分の欠失を生じるにオーダほか、１９
８２）。
線形ベクターは、非相同配列の両側に、枯草菌の染色体
ＤＮＡと相同の２区域を有しなければならない（ハリス
ーワリツクおよびレーデルペルグ、１９７７ ；ニオー
デほか、１９８２ ）。もしこのベクターの有する２染
色体分節が染色体の中で隣接していなければ、二重１乗
換′によるベクターの組込みがこれら２相同区域の間に
位置する染色体部分の欠失を生じるにオーダほか、１９
８２）。
枯草菌におけるこのような染色体組込みは、自己複製型
シラスミドベクターの場合のように遺伝子増幅をうろこ
とができない。ところで遺伝子増幅は、クローニングさ
れた遺伝子の大表現のため、従って対応の蛋白質の工業
生産を保証するため、遺伝子工学分野で現在求められて
いる条件の１つである。
シラスミドベクターの場合のように遺伝子増幅をうろこ
とができない。ところで遺伝子増幅は、クローニングさ
れた遺伝子の大表現のため、従って対応の蛋白質の工業
生産を保証するため、遺伝子工学分野で現在求められて
いる条件の１つである。
本発明は、その染色体の中で特定の遺伝子を増幅させた
桿菌菌株の製造方法において、ａ）前記遺伝子を有する
少くとも１種の組込プラスミドベクターを前記桿菌染色
体の中に組込み、その際に染色体の中において、 ・少くとも前記の遺伝子とその表現要素を含む増幅単位
と呼ばれる少くとも一種のＤＮＡ配列および両端におい
て、直接方向において同形の２配列と、 ・別に選択性遺伝子のための暗号づけ増幅単位とを生じ
、 ｂ）次に、得られた桿菌菌種を選択性遺伝子に対応する
選択培地上で培養することによって選択し、選択前の細
菌集団に比して増大した前記遺伝子の模写数の存在に対
応する表現型の菌株を採取することを特徴とする方法に
よって、前述の欠点を解決することができる。
桿菌菌株の製造方法において、ａ）前記遺伝子を有する
少くとも１種の組込プラスミドベクターを前記桿菌染色
体の中に組込み、その際に染色体の中において、 ・少くとも前記の遺伝子とその表現要素を含む増幅単位
と呼ばれる少くとも一種のＤＮＡ配列および両端におい
て、直接方向において同形の２配列と、 ・別に選択性遺伝子のための暗号づけ増幅単位とを生じ
、 ｂ）次に、得られた桿菌菌種を選択性遺伝子に対応する
選択培地上で培養することによって選択し、選択前の細
菌集団に比して増大した前記遺伝子の模写数の存在に対
応する表現型の菌株を採取することを特徴とする方法に
よって、前述の欠点を解決することができる。
増幅単位は好ましくは、前記遺伝子とその表現要素とを
含む増幅単位から成り、この配列のＮ末端は増幅単位の
あとに位置する配列に類似し、これらの２類似配列を下
記において１重複配列′と呼ぶ。
含む増幅単位から成り、この配列のＮ末端は増幅単位の
あとに位置する配列に類似し、これらの２類似配列を下
記において１重複配列′と呼ぶ。
下記の実施例を読めば明かなように、この方法により、
染色体の水準において遺伝子増幅を受けた枯草菌菌株を
選択標識としてまた特定の遺伝子として選択することが
できる。
染色体の水準において遺伝子増幅を受けた枯草菌菌株を
選択標識としてまた特定の遺伝子として選択することが
できる。
一般的に１選択性遺伝子は、化学組成物、特に抗生物質
：カナマイシン、クロルアンフェニコール、アンビチリ
ンまたはテトラサイクリンなどに対して抵抗性の遺伝子
であろう。
：カナマイシン、クロルアンフェニコール、アンビチリ
ンまたはテトラサイクリンなどに対して抵抗性の遺伝子
であろう。
このような条件においては、抗生物質に対して非常に抵
抗性の菌株を選択すればよいのであるから、菌株の選択
は容易である。
抗性の菌株を選択すればよいのであるから、菌株の選択
は容易である。
故に、重複配列のほかにＫｍ遺伝子と、特定遺伝子とし
てのＣｍ遺伝子とを含む増幅単位を用い、Ｋｍに対して
非常に抵抗性の菌株を選択することによりＣｍ遺伝子増
幅を実施することができる。
てのＣｍ遺伝子とを含む増幅単位を用い、Ｋｍに対して
非常に抵抗性の菌株を選択することによりＣｍ遺伝子増
幅を実施することができる。
この実験は、Ｃｍ遺伝子の代りに興味ある蛋白質の暗号
づけ遺伝子を使用した場合の本発明の利点を示している
。
づけ遺伝子を使用した場合の本発明の利点を示している
。
選択圧を保持しなくても安定なこの蛋白質の高生産性菌
株を得ることができる。
株を得ることができる。
第３図においては、重複配列りと、標識遺伝子および興
味ある蛋白質の暗号づけ遺伝子を含む増幅された配列Ｍ
とから成る増幅単位Ｕ、Ａ、を含む上側の増幅性構造か
ら本発明の方法によって増幅された遺伝子の概略構造（
下側）が示されている。
味ある蛋白質の暗号づけ遺伝子を含む増幅された配列Ｍ
とから成る増幅単位Ｕ、Ａ、を含む上側の増幅性構造か
ら本発明の方法によって増幅された遺伝子の概略構造（
下側）が示されている。
技術面において、組込ベクターはその原理とその特殊の
製作法において公知である。
製作法において公知である。
先に述べたように、組込が実施されるにはベクターが桿
菌菌株の染色体のものと同様のＤＮＡ配列を有すること
が必要である。若干の場合には、野生桿菌の染色体の断
片を有するベクター、例えば遺伝子ｔｈｙ Ｂあるいは
下記においてＸと呼ばれる遺伝子の全部または一部を含
むベクターを使用する。他の場合には、例えばｐＢＲ３
２２などの細菌シラスミドから生じた特定の配列をあら
かじめ染色体の中に導入する。；の場合には、同一の配
列を有する組込ベクターを使用すればよい。この最後の
技術は特に実施が簡単である。
菌菌株の染色体のものと同様のＤＮＡ配列を有すること
が必要である。若干の場合には、野生桿菌の染色体の断
片を有するベクター、例えば遺伝子ｔｈｙ Ｂあるいは
下記においてＸと呼ばれる遺伝子の全部または一部を含
むベクターを使用する。他の場合には、例えばｐＢＲ３
２２などの細菌シラスミドから生じた特定の配列をあら
かじめ染色体の中に導入する。；の場合には、同一の配
列を有する組込ベクターを使用すればよい。この最後の
技術は特に実施が簡単である。
一般的に、組込ベクターは、重複配列、標識遺伝子およ
び特定遺伝子から成る増幅単位を含み、桿菌の染色体は
組込前において重複配列を含む。
び特定遺伝子から成る増幅単位を含み、桿菌の染色体は
組込前において重複配列を含む。
また本発明は、本発明の方法を実施して得られた桿菌、
特に枯草菌の菌株、ならびに特定遺伝子によって暗号づ
けられた生成物の製造のための、得られた菌株の培養法
に関するものである。
特に枯草菌の菌株、ならびに特定遺伝子によって暗号づ
けられた生成物の製造のための、得られた菌株の培養法
に関するものである。
おどろくべきことに、本発明を使用して増幅された構造
は、一般にこの種の構造が特に不安定であると認められ
ているにもかかわらず、この種の構造を得た細菌の種類
とその部位（染色体あるいはプラスミＰ）がどのようで
あれ、きわめて安定であることが確Ｍ９れた。故に本発
明は工業的に開発可能の菌株をうることかできる。
は、一般にこの種の構造が特に不安定であると認められ
ているにもかかわらず、この種の構造を得た細菌の種類
とその部位（染色体あるいはプラスミＰ）がどのようで
あれ、きわめて安定であることが確Ｍ９れた。故に本発
明は工業的に開発可能の菌株をうることかできる。
以下において、本発明を付図に示す実施例について詳細
に説明する。
に説明する。
反対表記のないかぎり、各種酵素はメーカによって推奨
された技術によって製造された。
された技術によって製造された。
１）菌株Ａの中におけるカナマイシン抵抗遺伝子の増幅
の研究 １．１．） 菌株Ａの構築 遺伝子増幅の研究のため、ｐＢＲ３２２配列から誘導さ
れた２個の同形の直接反復型配列でフ１う４舛れた（
ｆｌａｎｑｕ６ ）カナマイシン抵抗遺伝子から成る構
造を枯草菌の染色体の中に導入する。
の研究 １．１．） 菌株Ａの構築 遺伝子増幅の研究のため、ｐＢＲ３２２配列から誘導さ
れた２個の同形の直接反復型配列でフ１う４舛れた（
ｆｌａｎｑｕ６ ）カナマイシン抵抗遺伝子から成る構
造を枯草菌の染色体の中に導入する。
この構造を含む菌株（菌株Ａと呼ぶ）は下記の２段階で
構築された。
構築された。
ａ）枯草菌の染色体の中にｐＢＲ３２２の第一模写を二
重乗換の生起によって挿入する段階にオーダはか、１９
８２ ） （菌株αの取得）、ｂ）キャンベル型メカニ
ズムによるｐＢＲ３２２の第二模写と遺伝子Ｋｍとの挿
入（菌株Ａの取得）。
重乗換の生起によって挿入する段階にオーダはか、１９
８２ ） （菌株αの取得）、ｂ）キャンベル型メカニ
ズムによるｐＢＲ３２２の第二模写と遺伝子Ｋｍとの挿
入（菌株Ａの取得）。
この構築の各段階を第４図に略示した。
ａ） ｐＢＲ３２２の第一模写の挿入（菌株α）枯草菌
の染色体の中にｐＢＲ３２２の第一模写を挿入するため
、組込ベクターｐＨＶ４５２を使用する。
の染色体の中にｐＢＲ３２２の第一模写を挿入するため
、組込ベクターｐＨＶ４５２を使用する。
このベクターは枯草菌の染色体の２分節と〔その一方は
ｔｈｙ Ｂ遺伝子を有しく ’ｒｈｙ Ｂ分節と呼ぶ）
他方は公知の機能を営まない（Ｘ分節と呼ぶ）〕、プラ
スミドＥＥｃｏｌｉ ｐＨＶ ３３Δ８１とから成る（
ダゲールはか、１９８４ ）。ｐＨＶ３３ Δ８１は、
ｐｃ’１９４のクロルアンフェニコール抵抗遺伝子（Ｉ
ｏｒｄ卸ｅ−ｓｅｕ、 １９７５）と、遺伝子ＴｃＲの
一部を欠失したｐＢＲ３２２とから成る。これら２つの
染色体分節の故に、ｐＨＶ４５２が枯草−の染色体の中
に組込まれて、宿主細菌にクロルアンフェニコール抵抗
を与えることができる。
ｔｈｙ Ｂ遺伝子を有しく ’ｒｈｙ Ｂ分節と呼ぶ）
他方は公知の機能を営まない（Ｘ分節と呼ぶ）〕、プラ
スミドＥＥｃｏｌｉ ｐＨＶ ３３Δ８１とから成る（
ダゲールはか、１９８４ ）。ｐＨＶ３３ Δ８１は、
ｐｃ’１９４のクロルアンフェニコール抵抗遺伝子（Ｉ
ｏｒｄ卸ｅ−ｓｅｕ、 １９７５）と、遺伝子ＴｃＲの
一部を欠失したｐＢＲ３２２とから成る。これら２つの
染色体分節の故に、ｐＨＶ４５２が枯草−の染色体の中
に組込まれて、宿主細菌にクロルアンフェニコール抵抗
を与えることができる。
枯草菌の―株ＳＢ ２０２のコンピテント細胞を形質転
換するため、エンドヌクレアーゼＢｇｅＮニよって線形
化されたｐＨＶ４５２を使用した。１０５被転換体Ｃｍ
Ｒ／ＤＮＡμｇ が得られた。すべての被転換体はＩｌ
＠−であった。これは、線形化されたｐＨＶ４５２がプ
ラスミド／染色体分節’ｒｈｙ ＢとＸとの間に複式組
替が発生した結果として枯草菌の染色体の中に組込まれ
たことを示す（第４図）にオーダはか、１９８２ ）。
換するため、エンドヌクレアーゼＢｇｅＮニよって線形
化されたｐＨＶ４５２を使用した。１０５被転換体Ｃｍ
Ｒ／ＤＮＡμｇ が得られた。すべての被転換体はＩｌ
＠−であった。これは、線形化されたｐＨＶ４５２がプ
ラスミド／染色体分節’ｒｈｙ ＢとＸとの間に複式組
替が発生した結果として枯草菌の染色体の中に組込まれ
たことを示す（第４図）にオーダはか、１９８２ ）。
この場合、これらの分節の間にあって遺伝子１１ｖＡを
含む初染色体区域は欠失されてｐＨＶ３３△８１によっ
て代置され、遺伝子ｉ１ｖ Ａの欠失が菌株に対して表
現型１１ｅ−を与える（パラほか、１９６５ ）。
含む初染色体区域は欠失されてｐＨＶ３３△８１によっ
て代置され、遺伝子ｉ１ｖ Ａの欠失が菌株に対して表
現型１１ｅ−を与える（パラほか、１９６５ ）。
被転換体ＣｍＲ１１ｅ−の染色体分析は、これが第４図
に図示の構造を有することを示している。故にこのよう
に構成された菌株は、染色体区域ＴｈｙＢとＸとの間に
挿入されたｐＢＲ３２２から誘導された配列を含む。
に図示の構造を有することを示している。故にこのよう
に構成された菌株は、染色体区域ＴｈｙＢとＸとの間に
挿入されたｐＢＲ３２２から誘導された配列を含む。
ｂ） ｐＢＲ３２２の第２模写と遺伝子ＫｍＲとの挿入
（菌株Ａ） カナマイシン抵抗遺伝子の周囲にｐＢＲ３２２配列の１
複を含む菌株を構成するため、菌株αのｐＢＲ３２２区
域の中に、キャンペル型の組替発生によって、ｐＢＲ３
２２の配列とカナマイシン抵抗遺伝子とからなるプラス
ミドを組込んだ。
（菌株Ａ） カナマイシン抵抗遺伝子の周囲にｐＢＲ３２２配列の１
複を含む菌株を構成するため、菌株αのｐＢＲ３２２区
域の中に、キャンペル型の組替発生によって、ｐＢＲ３
２２の配列とカナマイシン抵抗遺伝子とからなるプラス
ミドを組込んだ。
使用されたプラスミドｐＨＶ４５７は、ｐＢＲ３２２ノ
配列と分節Ｓａｕ ３Ａ ｌ ｓ ＩＶおよびｐＵＢｌ
ｌｏ（黄色ブドウ球菌のプラスミド）とを含む（グリス
ザンおよびデユラン、１９７８ ）。ｐＢＲ３２２の部
位ＢａｍＨＩ の中に挿入されたこれらの分節はカナマ
イシン抵抗遺伝子を含み、また制限酵素Ｂｇｌ ｍの部
位を含む（ミシエルほか１．１９８２） （第４図）。
配列と分節Ｓａｕ ３Ａ ｌ ｓ ＩＶおよびｐＵＢｌ
ｌｏ（黄色ブドウ球菌のプラスミド）とを含む（グリス
ザンおよびデユラン、１９７８ ）。ｐＢＲ３２２の部
位ＢａｍＨＩ の中に挿入されたこれらの分節はカナマ
イシン抵抗遺伝子を含み、また制限酵素Ｂｇｌ ｍの部
位を含む（ミシエルほか１．１９８２） （第４図）。
枯草菌の染色体の中へのｐＨＶ４５７の模写単独の組込
を選択することが不可能であることが確認されたので、
このプラスミドを菌株８Ｂ ２０２ （Ｔｒｐ−）のコ
ンピテント細胞の中に、菌株ハ侶２４６（Ｔｒｐ＋）
の染色体ＤＮＡと共に導入した。得られた被転換体Ｔｒ
ｐ のうちで、５％の栄養系がカナマイシンに対して抵
抗性であった。被転換体馳１Ｔｒｐ＋の染色体ＤＮＡを
抽出し、Ｂｇｌ ｍまたはＥｃ。
を選択することが不可能であることが確認されたので、
このプラスミドを菌株８Ｂ ２０２ （Ｔｒｐ−）のコ
ンピテント細胞の中に、菌株ハ侶２４６（Ｔｒｐ＋）
の染色体ＤＮＡと共に導入した。得られた被転換体Ｔｒ
ｐ のうちで、５％の栄養系がカナマイシンに対して抵
抗性であった。被転換体馳１Ｔｒｐ＋の染色体ＤＮＡを
抽出し、Ｂｇｌ ｍまたはＥｃ。
ＲＩによって制限したのち、ゾンデとしてｐＲＹ３３Δ
８１ を使用して、サザンの雑種形成技術によって分析
した。得られたオートラジオグラフは、分析された被転
換体が第４図と第５図に図示の構造を有することを示す
。故にこのようにして構成された菌株Ａはその染色体の
中に増幅構造を有し、この構造においてカナマイシン抵
抗遺伝子力ＰＢＲ３２２から誘導された２相同配列で７
ラン勿れている。
８１ を使用して、サザンの雑種形成技術によって分析
した。得られたオートラジオグラフは、分析された被転
換体が第４図と第５図に図示の構造を有することを示す
。故にこのようにして構成された菌株Ａはその染色体の
中に増幅構造を有し、この構造においてカナマイシン抵
抗遺伝子力ＰＢＲ３２２から誘導された２相同配列で７
ラン勿れている。
この説明において定義されたような菌株Ａの増幅単位は
ｐＨＶ４５７である。この菌株はカナマイシンと直接に
接触させられたことは一度もなく、カナマイシン抵抗表
現型はこの菌株の副次培養によって検出されたことを注
意しなければならない。
ｐＨＶ４５７である。この菌株はカナマイシンと直接に
接触させられたことは一度もなく、カナマイシン抵抗表
現型はこの菌株の副次培養によって検出されたことを注
意しなければならない。
細菌の検出
菌株Ａの中において、全集団によって寛容される以上の
カナマイシン濃度（亜阻害濃度）に対して抵抗性の細菌
並集団を探求するため、菌株Ａの培養株の複数アリクオ
ツドを、カナマイシンの増量濃度を含有する固体媒地上
に展開した。
カナマイシン濃度（亜阻害濃度）に対して抵抗性の細菌
並集団を探求するため、菌株Ａの培養株の複数アリクオ
ツドを、カナマイシンの増量濃度を含有する固体媒地上
に展開した。
その結果は下記を示す。
一遺伝子脂の１模写はこの抗生物質１μｇ／ｄに対する
抵抗性を与える（この遺伝子を含まない親菌株ＳＢ ２
０２は０．５μｇ／ｍｌ のカナマイシンに対して抵抗
性である）。
抵抗性を与える（この遺伝子を含まない親菌株ＳＢ ２
０２は０．５μｇ／ｍｌ のカナマイシンに対して抵抗
性である）。
一菌株Ａの中に、１μｇ／ｍ１以上のカナマイシン濃度
に対して抵抗性の細菌が存在する。これらの細菌の頻度
は１０−４〜５弓Ｏ−７の範囲である。
に対して抵抗性の細菌が存在する。これらの細菌の頻度
は１０−４〜５弓Ｏ−７の範囲である。
カナマイシンの増大濃度（１〜１０μｇ／ｍＪ）を含有
する液体培地（初濃度は１０６細胞／ａ）の中に菌株Ａ
を接種した。全時間中、これらの培養株の光学密度を６
００ ｎＭで測定した。
する液体培地（初濃度は１０６細胞／ａ）の中に菌株Ａ
を接種した。全時間中、これらの培養株の光学密度を６
００ ｎＭで測定した。
この実験の結果は下記を示す。
一カナマイシン１０μｇ／ｍｌに対して抵抗性の偶発的
並集団の存在（Ａ ＫｍＲｌ。と呼ぶ）。その頻度は５
．１０− である。この亜集団は約（９）分の世代時間
と共に増大する。８時間の培養ののち、この亜集団が多
数となる。
並集団の存在（Ａ ＫｍＲｌ。と呼ぶ）。その頻度は５
．１０− である。この亜集団は約（９）分の世代時間
と共に増大する。８時間の培養ののち、この亜集団が多
数となる。
２〜１０μｇ／ｍＪのカナマイシン濃度を含有する液体
媒質の中で菌株Ａの順次培養により（３０細胞世代に対
応）、２ ； ２．５ ； ３ ； ４ ； ５ ；
８および１０μｇ／Ｉｌｌのカナマイシンに抵抗する菌
株を富化精製した。
媒質の中で菌株Ａの順次培養により（３０細胞世代に対
応）、２ ； ２．５ ； ３ ； ４ ； ５ ；
８および１０μｇ／Ｉｌｌのカナマイシンに抵抗する菌
株を富化精製した。
一場一
下記の技術により細菌染色体中の遺伝子増幅を検出する
ことができる。すなわち、増幅構造を含む菌株から抽出
された染色体ＤＮＡを、増幅単位（Ｕ、Ａ、）中に単一
の切断部位を有するエンドヌクレアーゼによって制限し
た。この制限は、種々の染色体分節のほか、増幅単位に
相当する分節を生じる。もし増幅度が十分であれば、こ
の制限のアガロースゲル中電気泳動分析により、′非増
幅′親菌株から抽出された染色体ＤＮＡ中には存在しな
いＵ、Ａ、に対応する帯域を見ることができる。
ことができる。すなわち、増幅構造を含む菌株から抽出
された染色体ＤＮＡを、増幅単位（Ｕ、Ａ、）中に単一
の切断部位を有するエンドヌクレアーゼによって制限し
た。この制限は、種々の染色体分節のほか、増幅単位に
相当する分節を生じる。もし増幅度が十分であれば、こ
の制限のアガロースゲル中電気泳動分析により、′非増
幅′親菌株から抽出された染色体ＤＮＡ中には存在しな
いＵ、Ａ、に対応する帯域を見ることができる。
それぞれのカナマイシン抵抗性菌株の染色体中のｐＨＶ
４５７の増幅を検出するためにこの技術を使用した。こ
れらの菌株の染色体ＤＮＡと菌株Ａのものを抽出し、次
にエンドヌクレアーゼＣ１ａ １によって制限した。こ
の酵素はｐＨＶ４５７の中に単一の切断部位を有する。
４５７の増幅を検出するためにこの技術を使用した。こ
れらの菌株の染色体ＤＮＡと菌株Ａのものを抽出し、次
にエンドヌクレアーゼＣ１ａ １によって制限した。こ
の酵素はｐＨＶ４５７の中に単一の切断部位を有する。
この制限の生成物をアガロースゲル中電気泳動法によっ
て分析した。それぞれの菌株のＤＮＡの中に、菌株Ａの
染色体ＤＮＡ中には存在しない帯域が現れる。その分子
量はｐＨＶ４５７の分子量に等しく、この帯域がｐＢＲ
３２２の配列と混種している。これらの結果は、この帯
域がｐＨＶ４５７に対応することを暗示している。電気
泳動技術および雑株形成技術によって観察されたこの帯
域の強い強度は、増幅された構造が直接反復として配置
された多数のｐＨＶ４５７模写から成ることを示してい
る。
て分析した。それぞれの菌株のＤＮＡの中に、菌株Ａの
染色体ＤＮＡ中には存在しない帯域が現れる。その分子
量はｐＨＶ４５７の分子量に等しく、この帯域がｐＢＲ
３２２の配列と混種している。これらの結果は、この帯
域がｐＨＶ４５７に対応することを暗示している。電気
泳動技術および雑株形成技術によって観察されたこの帯
域の強い強度は、増幅された構造が直接反復として配置
された多数のｐＨＶ４５７模写から成ることを示してい
る。
また、２種の方法、すなわちアガロースゲル中の電気泳
動法とサザン技術による雑種形成とによって、カナマイ
シン抵抗性菌株から抽出された全ＤＮＡは染色体外形状
を含まないことを確認した。
動法とサザン技術による雑種形成とによって、カナマイ
シン抵抗性菌株から抽出された全ＤＮＡは染色体外形状
を含まないことを確認した。
これらの菌株における増幅度（Ｕ、Ａ、／染色体の数）
を測定するため、Ｃ１ａＩによって制限されたそのＤＮ
Ａと、既知量の線形ｐＨＶ４５７と混合されまたは混合
されていない菌株Ａの遺伝子ＤＮＡとをアガロースゲル
中電気泳動法によって分析した。
を測定するため、Ｃ１ａＩによって制限されたそのＤＮ
Ａと、既知量の線形ｐＨＶ４５７と混合されまたは混合
されていない菌株Ａの遺伝子ＤＮＡとをアガロースゲル
中電気泳動法によって分析した。
それぞれの菌株のＤＮＡ中に観察される帯域の強さを既
知量のｐＨＶ４５７をもって観察された帯域強さとデン
シトメータによって比較することにより、これらの菌株
の含むＵ、Ａ、／染色体の数を測定した。これらの結果
を第６図に示す。カナマイシイの２μｇ／Ｉｌｌから５
ｆｉｇ／Ｉｒｅまでは、Ｕ、Ａ。
知量のｐＨＶ４５７をもって観察された帯域強さとデン
シトメータによって比較することにより、これらの菌株
の含むＵ、Ａ、／染色体の数を測定した。これらの結果
を第６図に示す。カナマイシイの２μｇ／Ｉｌｌから５
ｆｉｇ／Ｉｒｅまでは、Ｕ、Ａ。
／染色体の数がこの抗生物質の濃度に比例して増大する
。カナマイシンの２μｇ ／ ｍｌにおいて、細菌は染
色体あたりｐＨＶ４５７の７複製を含み、５μｇ／酊か
ら加複製を含んでいる。染色体の分子量が２．５−１０
Ｄ、 ｐＨＶ４５７ｏ分子量が４−１０６Ｄとすれば
（３０Ｘ ４−１０６／２，５−１０’＝ ０．０５
）増幅の全幅は細菌ゲノムの約５％に相当する。
。カナマイシンの２μｇ ／ ｍｌにおいて、細菌は染
色体あたりｐＨＶ４５７の７複製を含み、５μｇ／酊か
ら加複製を含んでいる。染色体の分子量が２．５−１０
Ｄ、 ｐＨＶ４５７ｏ分子量が４−１０６Ｄとすれば
（３０Ｘ ４−１０６／２，５−１０’＝ ０．０５
）増幅の全幅は細菌ゲノムの約５％に相当する。
１．６）増幅度の増大
より高い増幅度を有する細菌を分離するために下記の２
アプローチを用いた。
アプローチを用いた。
＆）カナマイシンに対する高抵抗性細菌を得る（カナマ
イシン１０μｇ／ＷＬＩ以上の濃度に対して抵抗性）、 ｂ）アミカシン（Ａｍｋ ）抵抗性細菌をうる。
イシン１０μｇ／ＷＬＩ以上の濃度に対して抵抗性）、 ｂ）アミカシン（Ａｍｋ ）抵抗性細菌をうる。
実際に、抗生物−質ディスク周辺の成長阻害テストは、
菌株ＡＫＦｎＲ１ｏがカナマイシンよりもアミカシンに
対して敏感であることを示した。
菌株ＡＫＦｎＲ１ｏがカナマイシンよりもアミカシンに
対して敏感であることを示した。
１０〜３２０μｇ ／ＦｒＬｖのカナマイシンに抵抗性
の菌株はすべて約３０Ｕ 、Ａ 、／染色体を含む。
の菌株はすべて約３０Ｕ 、Ａ 、／染色体を含む。
これらの結果は、
一高増幅度を有１−るａ菌が存在しないこと、またはカ
ナマイシンがこのような細菌を選択しえないこと、 一高抵抗性は遺伝子ＫｎＩＲの増幅度の増大と関連しな
いことを示す。
ナマイシンがこのような細菌を選択しえないこと、 一高抵抗性は遺伝子ＫｎＩＲの増幅度の増大と関連しな
いことを示す。
アミカシン抵抗性細菌
アミカシ／の増大濃度を含有する固体媒質上に菌株ＡＫ
ｒｒＩＲ１ｏの培養株を展張することにより、その波及
性効果はアミカシン２．５μｇ／ｍＪ含有の固体媒質上
において５０チであることが確認された。
ｒｒＩＲ１ｏの培養株を展張することにより、その波及
性効果はアミカシン２．５μｇ／ｍＪ含有の固体媒質上
において５０チであることが確認された。
２．５μｇ／ｍＡ 以上のアミカシン濃度に対して抵抗
性の細菌をうるため、アミカシンの増大濃度を含む液体
媒質に菌株Ａ ＩＧｎＲｌ ０を接種し、順次サイクル
を実施した。このようにして、それぞれ４；８ ； １
６ ； ３２および一μｇ／１１１のアミカシンに対し
て抵抗性の菌株を分離した（菌株ＡＩＴＩＫＲ４〜Ａ
ｒｎｌ（Ｒ６４） ｏそのＤＮＡを抽出し、Ｃ１ａ Ｉ
によって制限した。
性の細菌をうるため、アミカシンの増大濃度を含む液体
媒質に菌株Ａ ＩＧｎＲｌ ０を接種し、順次サイクル
を実施した。このようにして、それぞれ４；８ ； １
６ ； ３２および一μｇ／１１１のアミカシンに対し
て抵抗性の菌株を分離した（菌株ＡＩＴＩＫＲ４〜Ａ
ｒｎｌ（Ｒ６４） ｏそのＤＮＡを抽出し、Ｃ１ａ Ｉ
によって制限した。
アミカシン抵抗性菌株（６４μｇ／ＩＲＩまで）の隔離
と、これらの菌株のＤＮＡ分析は、これらの菌種が約５
００ 、 Ａ 、 ／染色体を含有し、増幅の全幅が細
菌染色体の７．５チに相等することを示している。
と、これらの菌株のＤＮＡ分析は、これらの菌種が約５
００ 、 Ａ 、 ／染色体を含有し、増幅の全幅が細
菌染色体の７．５チに相等することを示している。
故にアミカシンは、カナマイシンをもって得られる増幅
度より高い増幅度を有する細菌の選定を可能にする。カ
ナマイシンの場合と同様に、アミカシンの増大濃度に対
して抵抗性のそれぞれの菌株を隔離することができるが
、その増幅度は一定にとどまる。このような増幅度の限
界は、５０Ｕ。
度より高い増幅度を有する細菌の選定を可能にする。カ
ナマイシンの場合と同様に、アミカシンの増大濃度に対
して抵抗性のそれぞれの菌株を隔離することができるが
、その増幅度は一定にとどまる。このような増幅度の限
界は、５０Ｕ。
Ａ、／染色体以上を含有する細菌が存在しないと推定す
るが、アミカシンがこれらの細菌を選定できないと推定
することによって説明することができる。
るが、アミカシンがこれらの細菌を選定できないと推定
することによって説明することができる。
１．７） ４’−アデノシルヌクレオチジルトランスフ
４′−アデノシルヌクレオチジルトランス７エラーゼは
、ｐＵＢｌｌｏのカナマイシン抵抗遺伝子によって暗号
づけられた酵素である。
４′−アデノシルヌクレオチジルトランス７エラーゼは
、ｐＵＢｌｌｏのカナマイシン抵抗遺伝子によって暗号
づけられた酵素である。
菌株Ａおよびカナマイシンの亜阻害濃度に対して抵抗性
の種々の菌株の粗抽出物の中におけるこの酵素の活性を
測定した。
の種々の菌株の粗抽出物の中におけるこの酵素の活性を
測定した。
得られた結果（第７図）は、この活性が細菌中に存在す
る遺伝子数に対して、１に近い傾斜をもって比例して増
大することを示す。これは、カナマイシン抵抗遺伝子の
各模写が４’ ＡＮＴの生産に対して同様に寄与するこ
とを示す。またこの酵素の活性が同様に、カナマイシン
高抵抗菌株の粗抽出物（濃度〉ｌＯμｇ／ｌ）中におい
て測定された。
る遺伝子数に対して、１に近い傾斜をもって比例して増
大することを示す。これは、カナマイシン抵抗遺伝子の
各模写が４’ ＡＮＴの生産に対して同様に寄与するこ
とを示す。またこの酵素の活性が同様に、カナマイシン
高抵抗菌株の粗抽出物（濃度〉ｌＯμｇ／ｌ）中におい
て測定された。
これらの菌株を含む４’ＡＮＴ活性は菌株Ａ Ｋｍ”Ｂ
中に存在する活性に等しい。
中に存在する活性に等しい。
これらの結果全体は、これらの菌株の高抵抗性細菌で４
’ＡＮＴ活性の増大によるものでもなく、また増幅度の
増大によるものでもないことを明かにしている。他の現
象がその原因である。
’ＡＮＴ活性の増大によるものでもなく、また増幅度の
増大によるものでもないことを明かにしている。他の現
象がその原因である。
増幅構造の安定性を研究するため、菌株ＡＫｆｎＲ１ｏ
の新培養株から得られた１０ 細胞を、抗生物質を含ま
ない液状培地に接種した。３世代ののち、非選択的培地
中に１０８細胞をもって第２培養サイクルを接種した。
の新培養株から得られた１０ 細胞を、抗生物質を含ま
ない液状培地に接種した。３世代ののち、非選択的培地
中に１０８細胞をもって第２培養サイクルを接種した。
１６細胞世代に相当するこの型の５連続培養を実施した
。各培養の終了時に、アリクオツドを採取し、０または
７．５μｇ／νのカナマイシンを含有する固体培地上に
展張した。
。各培養の終了時に、アリクオツドを採取し、０または
７．５μｇ／νのカナマイシンを含有する固体培地上に
展張した。
これらの培養中の生存しうる細菌数および培養中に存在
する７、５μｇ／ｒｔＬｌのカナマイシンに対して抵抗
性の細菌数を計数によって測定した（各測定ごとに約１
０００集落が計数された）。
する７、５μｇ／ｒｔＬｌのカナマイシンに対して抵抗
性の細菌数を計数によって測定した（各測定ごとに約１
０００集落が計数された）。
非選択的培地中において１６世代ののち、細菌ＫｍｉＬ
７５ の比率は９０％以上である（この値は計数信頼度
の限界である）。カナマイシン７．５μｇ／継を含有す
る培地上において、ｐＨＶ４５７の加、加または１５模
写を有する菌株Ａの波及性効果はそれぞれ１００．２５
および０．１％であるから、非選択性培地において実施
された１６世代から生じた細菌は平均２０Ｕ、Ａ、／染
色体以上を保存したと結論することができる。
７５ の比率は９０％以上である（この値は計数信頼度
の限界である）。カナマイシン７．５μｇ／継を含有す
る培地上において、ｐＨＶ４５７の加、加または１５模
写を有する菌株Ａの波及性効果はそれぞれ１００．２５
および０．１％であるから、非選択性培地において実施
された１６世代から生じた細菌は平均２０Ｕ、Ａ、／染
色体以上を保存したと結論することができる。
また、表現型ＩＧｎＲ７５の欠失／世代確率はく５・１
０−４である。さらに、非選択的培地中で実施された５
世代から出た細菌の染色体ＤＮＡを抽出し、−七の増幅
度をデンシトメータによって測定した。これらの細菌は
ある場合には約３０Ｕ 、Ａ 、 ／染色体を含有し、
他の場合には２８Ｕ 、Ａ 、／染色体を含有していた
。故に表現型分析と生化学分析は増幅構造の安定性が大
であることを示す。
０−４である。さらに、非選択的培地中で実施された５
世代から出た細菌の染色体ＤＮＡを抽出し、−七の増幅
度をデンシトメータによって測定した。これらの細菌は
ある場合には約３０Ｕ 、Ａ 、 ／染色体を含有し、
他の場合には２８Ｕ 、Ａ 、／染色体を含有していた
。故に表現型分析と生化学分析は増幅構造の安定性が大
であることを示す。
２） ＊株ＢとＣにおけるカナマイシン抵抗染色体の増
幅の研究 菌株Ａの中に含まれる構造はカナマイシン抵抗遺伝子の
増幅を可能とする。この増幅は、ｐＢＲ３２２の配列の
特殊性によるものであろうか、あるいは重複の存在によ
るものであろうか。下記の２つの場合についてカナマイ
シン抵抗遺伝子の増幅を研究することにより、これら２
つの仮説を検証した。
幅の研究 菌株Ａの中に含まれる構造はカナマイシン抵抗遺伝子の
増幅を可能とする。この増幅は、ｐＢＲ３２２の配列の
特殊性によるものであろうか、あるいは重複の存在によ
るものであろうか。下記の２つの場合についてカナマイ
シン抵抗遺伝子の増幅を研究することにより、これら２
つの仮説を検証した。
一遺伝子が、ｐＢＲ３２２のものと異る同形配列でフラ
ン芹れている場合、 一重複によって包囲されていない場合。
ン芹れている場合、 一重複によって包囲されていない場合。
２．１）菌株ＢとＣの構築
これらの菌株は、環状ベクターと染色体との間の一回の
組替生起を必要とするキャンベル型メカニズムにより、
あるいは線状ベクターと染色体との間の２回の組替生起
によりにオーダほか、１９８２ ） 、枯草菌の染色体
の中に組込ベクターを挿入することによって構成された
。
組替生起を必要とするキャンベル型メカニズムにより、
あるいは線状ベクターと染色体との間の２回の組替生起
によりにオーダほか、１９８２ ） 、枯草菌の染色体
の中に組込ベクターを挿入することによって構成された
。
使用された組込ベクターはｐＨＶ４５８である。このベ
クターは、ｐＨＶ４５７と、ｐ）ｒＶ４３Ｂから生じる
２染色体分節Ｔｈｙ ＢおよびＸ（それぞれ２Ｋｂおよ
び３．３ Ｋｂ ） とから成るにオーダをまか、１９
８２）（第８図）。これは枯草菌において非複製であっ
て、ｐＵＢ １１０のカナマイシン抵抗染色体を含む。
クターは、ｐＨＶ４５７と、ｐ）ｒＶ４３Ｂから生じる
２染色体分節Ｔｈｙ ＢおよびＸ（それぞれ２Ｋｂおよ
び３．３ Ｋｂ ） とから成るにオーダをまか、１９
８２）（第８図）。これは枯草菌において非複製であっ
て、ｐＵＢ １１０のカナマイシン抵抗染色体を含む。
このベクターはその２つの染色体分節により、下記の二
態様で枯草菌の染色体の中に組込まれる。
態様で枯草菌の染色体の中に組込まれる。
ａ）キャンペル型メカニズムにより、’ｒｈｙｎまたは
Ｘ区域において、カナマイシン抵抗遺伝子の周囲に、組
込部位に対応する分節の重複を作る。このようにして構
築された２菌株を下記において菌株ＢｔおよびＢｘと呼
ぶ（第８図）。
Ｘ区域において、カナマイシン抵抗遺伝子の周囲に、組
込部位に対応する分節の重複を作る。このようにして構
築された２菌株を下記において菌株ＢｔおよびＢｘと呼
ぶ（第８図）。
ｂ）組替の二重生起により、区域’ｒｈｙ ＢとＸとの
間に位置する遺伝子１１ｖ Ａを有する染色体分節の欠
失を生じ、この分節の代りにｐＨＶ４５７を用いる（第
８図）。このように構成された菌株を菌株Ｃと呼ぶ。
間に位置する遺伝子１１ｖ Ａを有する染色体分節の欠
失を生じ、この分節の代りにｐＨＶ４５７を用いる（第
８図）。このように構成された菌株を菌株Ｃと呼ぶ。
枯草菌の染色体の中へのカナマイシン抵抗遺伝子の模写
単独の組込みを直接に選択することが不可能であるから
、これらの３菌株を構成するため菌株ＳＢ ２０２ （
Ｔｒｐ−）のコンピテント細胞を、菌株ＨＶＳ ２４６
（Ｔｒｐ＋） （Ｄ染色体ＤＮＡと共にｐＨＶ４５８
によって形質転換した。得られた被転換体Ｔｒｐ のう
ち、１０チの栄養系冷♂を検出し、その７５チはＩＩ・
、２５％はｌ１ｅ−であった。
単独の組込みを直接に選択することが不可能であるから
、これらの３菌株を構成するため菌株ＳＢ ２０２ （
Ｔｒｐ−）のコンピテント細胞を、菌株ＨＶＳ ２４６
（Ｔｒｐ＋） （Ｄ染色体ＤＮＡと共にｐＨＶ４５８
によって形質転換した。得られた被転換体Ｔｒｐ のう
ち、１０チの栄養系冷♂を検出し、その７５チはＩＩ・
、２５％はｌ１ｅ−であった。
２．１．１） 被転換体Ｋｍ” Ｉｌ＠−（菌株Ｃ）こ
れらの被転換体がＣ型の構造（第８図）を有することを
証明するため、２被転換体ＩＧｎＲＩｌｅ−の染色体Ｄ
ＮＡを抽出した。Ｅｃｏ ＲＩまたはＢｇｌ ｍによる
制限ののちに、ｐＨＶ４５８をゾンデとして使用してス
ーザン技術によりＤＮＡを分析した。
れらの被転換体がＣ型の構造（第８図）を有することを
証明するため、２被転換体ＩＧｎＲＩｌｅ−の染色体Ｄ
ＮＡを抽出した。Ｅｃｏ ＲＩまたはＢｇｌ ｍによる
制限ののちに、ｐＨＶ４５８をゾンデとして使用してス
ーザン技術によりＤＮＡを分析した。
オートラジオグラフィーののちに得られた結果は、枯草
菌の染色体の区域’ｒｈｙ Ｂ −Ｘの中に二重組替生
起によってｐＨＢ４５８の単量体を組込む際に期待され
る結果に対応している。一方においてはこれらの被転換
体がｐＢＲ３２２の配列との相同区域を含み、他方にお
いてはこれらが遺伝子１１ｖＡを失ったことを証明する
ことにより、このような結果が確認された。
菌の染色体の区域’ｒｈｙ Ｂ −Ｘの中に二重組替生
起によってｐＨＢ４５８の単量体を組込む際に期待され
る結果に対応している。一方においてはこれらの被転換
体がｐＢＲ３２２の配列との相同区域を含み、他方にお
いてはこれらが遺伝子１１ｖＡを失ったことを証明する
ことにより、このような結果が確認された。
２．１．２ ） 被転換体ＫｍＲＩＩ＠” （菌株Ｂｔ
とＢｘ ）６被変換体に＋１１Ｒ１１＊＋をサザｙの雑
種形成技術によって分析した。それらの染色体ＤＮＡを
抽出し、次にＥｅｏＲＩ またはＢｇｌ ｌによって制
限したのち、ｐＨＶ４５８と雑種形成した。得られた結
果は、４被変換体がキャンペル型メカニズムによって染
色体の中に組込まれたｐＨＶ４５８の単量体を含み、他
の２被変換体は、ｐＨＶ４５８の多数の模写を含み、枯
草菌の染色体の中へのｐＨＶ４５８の重合体の組込みか
ら生じることを示している。
とＢｘ ）６被変換体に＋１１Ｒ１１＊＋をサザｙの雑
種形成技術によって分析した。それらの染色体ＤＮＡを
抽出し、次にＥｅｏＲＩ またはＢｇｌ ｌによって制
限したのち、ｐＨＶ４５８と雑種形成した。得られた結
果は、４被変換体がキャンペル型メカニズムによって染
色体の中に組込まれたｐＨＶ４５８の単量体を含み、他
の２被変換体は、ｐＨＶ４５８の多数の模写を含み、枯
草菌の染色体の中へのｐＨＶ４５８の重合体の組込みか
ら生じることを示している。
前記の結果からは、菌株ＳＢ ２０２の染色体の中にｐ
ＨＶ４５８を組込む部位（’ｒｈｙ ＢまたはＸ）を知
ることができない。これを確認するため、ｐＨＶ４５８
の単量体を含む被変換体の染色体ＤＮＡと、菌株Ｃの染
色体ＤＮＡとを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ によ
って制限した。この酵素はｐＨＶ４５８の中において固
有の部位を認識する（第８図）。これらの制限されたＤ
ＮＡをサザンの技術によって１■４５８と雑種形成した
。菌株ＣのＤＮＡは、約６ Ｋｂの分節に対応する雑種
形成帯域を示していた。ところで、菌株Ｃの染色体ＤＮ
ＡのＢａｍ ＨＩ による制限はｐＨＶ４５８と雑種形
成されうる２分節を生じ（第８図）、その幅は、染色体
ＤＮＡ中の隣接ＢａｍＨＩ 部位の位置に依存している
。その結果、遺伝子ｔｈｙ Ｂを含む分節が２，４ Ｋ
ｂ 以上の幅を有しなければならないのに対して、Ｘに
対応する分節は９Ｋｂ 以上の幅を有しなければならな
い。故に、雑種形成によって検出された６ Ｋｂ の分
節は遺伝子ｔｈｙ Ｂを含む分節に対応するのに対して
、９Ｋｂ以上の幅の分節Ｘを含む分節は検出されなかっ
た。
ＨＶ４５８を組込む部位（’ｒｈｙ ＢまたはＸ）を知
ることができない。これを確認するため、ｐＨＶ４５８
の単量体を含む被変換体の染色体ＤＮＡと、菌株Ｃの染
色体ＤＮＡとを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ によ
って制限した。この酵素はｐＨＶ４５８の中において固
有の部位を認識する（第８図）。これらの制限されたＤ
ＮＡをサザンの技術によって１■４５８と雑種形成した
。菌株ＣのＤＮＡは、約６ Ｋｂの分節に対応する雑種
形成帯域を示していた。ところで、菌株Ｃの染色体ＤＮ
ＡのＢａｍ ＨＩ による制限はｐＨＶ４５８と雑種形
成されうる２分節を生じ（第８図）、その幅は、染色体
ＤＮＡ中の隣接ＢａｍＨＩ 部位の位置に依存している
。その結果、遺伝子ｔｈｙ Ｂを含む分節が２，４ Ｋ
ｂ 以上の幅を有しなければならないのに対して、Ｘに
対応する分節は９Ｋｂ 以上の幅を有しなければならな
い。故に、雑種形成によって検出された６ Ｋｂ の分
節は遺伝子ｔｈｙ Ｂを含む分節に対応するのに対して
、９Ｋｂ以上の幅の分節Ｘを含む分節は検出されなかっ
た。
これはおそらく、このような分節がニトロセルローズの
フィルター上に有効に転送されるには大きすぎたからで
あろう。ｐ）ＩＶ４５８の単量体を含む４被転換体のう
ちの２体のＤＮＡは、菌株Ｃにおいて観察された帯域と
類似の帯域を示す。菌株Ｂｔ とＢｘ （第８図）の期
待構造の分析は、Ｂｔ Ｗの構造を含むＤＮＡのみがこ
の帯域を発生できることを示している。
フィルター上に有効に転送されるには大きすぎたからで
あろう。ｐ）ＩＶ４５８の単量体を含む４被転換体のう
ちの２体のＤＮＡは、菌株Ｃにおいて観察された帯域と
類似の帯域を示す。菌株Ｂｔ とＢｘ （第８図）の期
待構造の分析は、Ｂｔ Ｗの構造を含むＤＮＡのみがこ
の帯域を発生できることを示している。
故に、染色体区域’ｒｈｙ Ｂ中へのキャンペル型メカ
ニズムによるｐＨＶ４５８の組込みから、菌株Ｃと共通
の６Ｋｂ帯域を有する２種の被変換体が生じる。故にこ
のように形成された菌株はカナマイシン抵抗遺伝子を包
囲する分節’ｒｈｙ Ｂの重複を含む（菌株Ｂｔ）。染
色体区域Ｘ中へのｐＨＶ４５８の組込みから、他の２種
の被変換体が生じる。これらの菌株はカナマイシン抵抗
遺伝子を包囲する分節Ｘの重複を含む（菌株Ｂｘ）（第
８図）。菌株ＡおよびＣと同様に、これらの二菌株（Ｂ
ｔとＢ）Ｃ）はカナマイシンと直接に接触させられなか
った。
ニズムによるｐＨＶ４５８の組込みから、菌株Ｃと共通
の６Ｋｂ帯域を有する２種の被変換体が生じる。故にこ
のように形成された菌株はカナマイシン抵抗遺伝子を包
囲する分節’ｒｈｙ Ｂの重複を含む（菌株Ｂｔ）。染
色体区域Ｘ中へのｐＨＶ４５８の組込みから、他の２種
の被変換体が生じる。これらの菌株はカナマイシン抵抗
遺伝子を包囲する分節Ｘの重複を含む（菌株Ｂｘ）（第
８図）。菌株ＡおよびＣと同様に、これらの二菌株（Ｂ
ｔとＢ）Ｃ）はカナマイシンと直接に接触させられなか
った。
２．２）菌株Ｂ中の増幅
２．２．１）カナマイシンの亜阻害濃度に対して抵抗性
のＢ型細菌の検出 菌株ＢｔとＨｚの培養のアリクオツドを、その各種濃度
に対する波及性効果を測定するため、カナマイシンの増
大濃度を含有する固体媒地上に展張した。その結果、下
記が明かとなった。
のＢ型細菌の検出 菌株ＢｔとＨｚの培養のアリクオツドを、その各種濃度
に対する波及性効果を測定するため、カナマイシンの増
大濃度を含有する固体媒地上に展張した。その結果、下
記が明かとなった。
、）’菌株Ｂｘ は菌株Ａと同様に行動する。この菌株
はカナマイシン１μｇ／ｗＬｌに抵抗し、亜阻害カナマ
イシン濃度（２〜８μｇ ／ Ｎ ） に抵抗すること
のできる細菌を含む。これらの細菌の頻度は１０ 〜１
０ の範囲である。
はカナマイシン１μｇ／ｗＬｌに抵抗し、亜阻害カナマ
イシン濃度（２〜８μｇ ／ Ｎ ） に抵抗すること
のできる細菌を含む。これらの細菌の頻度は１０ 〜１
０ の範囲である。
ｂ）菌株Ｂｔは菌株ＡおよびＢｘよりもカナマイシン抵
抗性である。なぜかなら、２μｇ／ＦＩＬＥのカナマイ
シン上のその波及性効果は５・１０−１である（ １０
−’ではなく）からである。またこの菌株Ｂｔは４．８
．１６μｇ／ｍｌのカナマイシン上で成長することので
きる細菌を含んでいる。この菌株の高カナマイシン抵抗
は、染色体起源のプロモータによる遺伝子＆−の転写増
大に由来する可能性がある。
抗性である。なぜかなら、２μｇ／ＦＩＬＥのカナマイ
シン上のその波及性効果は５・１０−１である（ １０
−’ではなく）からである。またこの菌株Ｂｔは４．８
．１６μｇ／ｍｌのカナマイシン上で成長することので
きる細菌を含んでいる。この菌株の高カナマイシン抵抗
は、染色体起源のプロモータによる遺伝子＆−の転写増
大に由来する可能性がある。
１０μｇ／ｌ１ｒｌカナマイシン抵抗性細菌を富化する
ため、菌株Ａの場合と同様に、１０μｇ／ｍのカナマイ
シンを含有する液体培地中で菌株Ｂｔ およびＢｘを培
養した。
ため、菌株Ａの場合と同様に、１０μｇ／ｍのカナマイ
シンを含有する液体培地中で菌株Ｂｔ およびＢｘを培
養した。
菌株Ａの場合と同様に、選択的培地中での菌株Ｂｘの培
養中に、カナマイシン抵抗並集団の富化を明かにするこ
とができた。非選択的培地中においては、この亜集団は
富化されない。
養中に、カナマイシン抵抗並集団の富化を明かにするこ
とができた。非選択的培地中においては、この亜集団は
富化されない。
２．２．３ ） カナマイシンに対して高抵抗性のＢｘ
型細菌の取得 カナマイシンの増大濃度を含有する液状培地中での続連
サイクルによって、１０μｇ／ｍＡ〜Ｏ０’Ｉｇ／ｒＲ
１のカナマイシン抵抗を有する、菌株Ｂｘ 由来の菌株
が得られた。
型細菌の取得 カナマイシンの増大濃度を含有する液状培地中での続連
サイクルによって、１０μｇ／ｍＡ〜Ｏ０’Ｉｇ／ｒＲ
１のカナマイシン抵抗を有する、菌株Ｂｘ 由来の菌株
が得られた。
２．２．４） Ｂ型菌株の増幅度の測定１０μｇ −２
０ｍｇ ／Ｉｌｌのカナマイシン抵抗性菌株Ｂｘ中に含
有されるｐＨＶ４５８の模写数をデンシオメータによっ
て測定した。これらの菌株はすべて、約２０Ｕ、Ａ、／
染色体を含有する。
０ｍｇ ／Ｉｌｌのカナマイシン抵抗性菌株Ｂｘ中に含
有されるｐＨＶ４５８の模写数をデンシオメータによっ
て測定した。これらの菌株はすべて、約２０Ｕ、Ａ、／
染色体を含有する。
菌株Ａの場合と同様に、Ｂｘ型菌株のカナマイシン抵抗
の増大は増幅度の増大と関連していない。
の増大は増幅度の増大と関連していない。
故にこれらの菌株の高抵抗性は染色体増幅とは別個の現
象によるものである。
象によるものである。
デンシオメータにより、１０μｇ／ｄのカナマイシン抵
抗性Ｂｔ型菌株は約５Ｕ、Ａ、／染色体を含むことを確
認した。選択剤としてのカナマイシンの使用は高増幅庇
を有するＢｔ 型菌株を隔離することができないと推測
される。なぜかならば、１０μｇ／αのカナマイシン抵
抗性のＡ型およびＢｘ型菌株は最大増幅度を含むからで
ある。
抗性Ｂｔ型菌株は約５Ｕ、Ａ、／染色体を含むことを確
認した。選択剤としてのカナマイシンの使用は高増幅庇
を有するＢｔ 型菌株を隔離することができないと推測
される。なぜかならば、１０μｇ／αのカナマイシン抵
抗性のＡ型およびＢｘ型菌株は最大増幅度を含むからで
ある。
菌株ＢｔＫｒｎＲ４゜の低増幅度は、この遺伝子の過表
現を生じる染色体起源のプロモータが増幅単位の中に含
有されていると推定することによって説明することがで
きよう。カナマイシン抵抗遺伝子がｐＨＶ４５７の小分
節Ｂｇｌ Ｉ −Ｂａｍ ＨＩ の方向に配向されてい
ることを知っており（Ｊ、Ｅ、デービス、私的通信）ま
た菌株Ａ、Ｂｔ、Ｂｘの構造およびそれらのカナマイシ
ン抵抗度を認識しているから、この染色体起源プロモー
タが分節’ｒｈｙ Ｂの中に位置すると結論することが
できる。
現を生じる染色体起源のプロモータが増幅単位の中に含
有されていると推定することによって説明することがで
きよう。カナマイシン抵抗遺伝子がｐＨＶ４５７の小分
節Ｂｇｌ Ｉ −Ｂａｍ ＨＩ の方向に配向されてい
ることを知っており（Ｊ、Ｅ、デービス、私的通信）ま
た菌株Ａ、Ｂｔ、Ｂｘの構造およびそれらのカナマイシ
ン抵抗度を認識しているから、この染色体起源プロモー
タが分節’ｒｈｙ Ｂの中に位置すると結論することが
できる。
菌株ＡＫｎＩＲ１ｏの場合と同様にして菌株Ｂｘ １Ｇ
ｎＲ１゜の中で増幅された構造の安定性を研究した。
ｎＲ１゜の中で増幅された構造の安定性を研究した。
菌株Ｂｘ Ｋｍ”、。の中で増幅された構造（２０Ｕ。
Ａ、／染色体）の安定性は菌株＆、ＫｍＲ１゜中におい
て観察された安定性に類似している。また細胞ＫｙｎＲ
７、５が世代時間によってＫｍ８７ 、５ となる確率
はく６・１０ である。
て観察された安定性に類似している。また細胞ＫｙｎＲ
７、５が世代時間によってＫｍ８７ 、５ となる確率
はく６・１０ である。
菌株Ｂｘの中で増幅された構造の安定性が菌株ＡＫｎ１
”１゜の中に存在するものと同様であるから、菌株Ａの
中から欠失されるが菌株ＢＸの中に存在する染色体区域
が増幅構造の安定性を変更させることのできる特殊の機
能を含まないと結論することができる。
”１゜の中に存在するものと同様であるから、菌株Ａの
中から欠失されるが菌株ＢＸの中に存在する染色体区域
が増幅構造の安定性を変更させることのできる特殊の機
能を含まないと結論することができる。
２．３）菌株Ｃ
１μｇ／Ｉｌｌのカナマイシンに対して抵抗性の菌株Ｃ
から、１０−２０・・・・・・３２０μｇ／―のカナマ
イシンに対して抵抗性の菌株を得た。これらの菌株にお
いてはカナマイシン抵抗遺伝子の増幅は全く検出されな
かった。これらの結果は、菌株Ｃの中に増幅構造を含む
亜集団が存在しないことを暗示している。従って、この
遺伝子が増幅されうるためにはその周囲の重複が必須で
あると思われる。前述のようにして得られたＣ型菌株の
高抵抗度はカナマイシンに対する菌株の感度の一時変異
によるものと思われる。
から、１０−２０・・・・・・３２０μｇ／―のカナマ
イシンに対して抵抗性の菌株を得た。これらの菌株にお
いてはカナマイシン抵抗遺伝子の増幅は全く検出されな
かった。これらの結果は、菌株Ｃの中に増幅構造を含む
亜集団が存在しないことを暗示している。従って、この
遺伝子が増幅されうるためにはその周囲の重複が必須で
あると思われる。前述のようにして得られたＣ型菌株の
高抵抗度はカナマイシンに対する菌株の感度の一時変異
によるものと思われる。
Ａ型、Ｈｚ型、Ｂｔ型およびＣ型の菌株について実施さ
れた研究は、カナマイシン抵抗遺伝子は、これが２つの
同形配列の中間に挿入された場合にのみ増幅されうろこ
とを示している。これらの観察を一般化し、観察された
増幅がカナマイシン抵抗遺伝子を含むＤＮＡ断片の特殊
性によるものではないことを示すため、クロルアンフェ
ニコール抵抗遺伝子が同形配列によって包囲されている
場合と包囲されていない場合の増幅を研究した。
れた研究は、カナマイシン抵抗遺伝子は、これが２つの
同形配列の中間に挿入された場合にのみ増幅されうろこ
とを示している。これらの観察を一般化し、観察された
増幅がカナマイシン抵抗遺伝子を含むＤＮＡ断片の特殊
性によるものではないことを示すため、クロルアンフェ
ニコール抵抗遺伝子が同形配列によって包囲されている
場合と包囲されていない場合の増幅を研究した。
３．１）構築
３．１．１） 菌株α
菌株αの構築はパラグラフ１．１． ａ ）の中に記載
されている。この菌株はその染色体の中に、ｐＢＲ３２
２から誘導されｐｃ １９４（ｐＨＶ３３Δ８１） ノ
クロルアンフエニコール抵抗遺伝子を有し同形配列によ
って包囲されていない配列を含んでいる。
されている。この菌株はその染色体の中に、ｐＢＲ３２
２から誘導されｐｃ １９４（ｐＨＶ３３Δ８１） ノ
クロルアンフエニコール抵抗遺伝子を有し同形配列によ
って包囲されていない配列を含んでいる。
３．１．２） 菌株り
菌株りの染色体の中には、ｐｃ１９４のクロルアンフェ
ニコール抵抗遺伝子を包囲した菌株Ａ中に含まれる重複
に類似の重複（ｐＢＲ３２２から誘導された配列重複）
が存在する。この菌株を構築するため、枯草菌における
非複製シラスミド、ＰＨＶ３３Δ８１によって菌株Ｃの
コンピテント細胞を形質転換した（ダゲールほか、１９
８３）。
ニコール抵抗遺伝子を包囲した菌株Ａ中に含まれる重複
に類似の重複（ｐＢＲ３２２から誘導された配列重複）
が存在する。この菌株を構築するため、枯草菌における
非複製シラスミド、ＰＨＶ３３Δ８１によって菌株Ｃの
コンピテント細胞を形質転換した（ダゲールほか、１９
８３）。
菌株Ｃの染色体の中へのｐＩ（Ｖ△８１の重合体の組込
を防止するため、プラスミドｐＨＶ３３△８１の調製は
強く重合されていた。Ｐｓｔ １によってあらかじめ線
形化されたこのプラスミドｐＨＶ３３Δ８１の調製のＤ
ＮＡによって、菌株Ｃのコンピテント細胞を形質転換し
た。このように線形化されたシラスミ）％はその形質転
換能の一部を保持している。線形化プラスミドと受容体
細胞中に存在する相同配列との間の相互作用によって、
このプラスミドの有する切断が修復されるからである（
コンタントおよびデユラン、１９７９）。２・１０ の
被転換体ＱｒＩＲ／ＩＮＡμｇが得られた。ＥｃｏＲＩ
とＢｇｌ Ｉｔ によって切断された被転換体から抽出
されたＤＮＡ全量をｐＨＶ４５７と雑種形成した。その
構造はめられる菌株りの構造（第９図）に対応していた
。
を防止するため、プラスミドｐＨＶ３３△８１の調製は
強く重合されていた。Ｐｓｔ １によってあらかじめ線
形化されたこのプラスミドｐＨＶ３３Δ８１の調製のＤ
ＮＡによって、菌株Ｃのコンピテント細胞を形質転換し
た。このように線形化されたシラスミ）％はその形質転
換能の一部を保持している。線形化プラスミドと受容体
細胞中に存在する相同配列との間の相互作用によって、
このプラスミドの有する切断が修復されるからである（
コンタントおよびデユラン、１９７９）。２・１０ の
被転換体ＱｒＩＲ／ＩＮＡμｇが得られた。ＥｃｏＲＩ
とＢｇｌ Ｉｔ によって切断された被転換体から抽出
されたＤＮＡ全量をｐＨＶ４５７と雑種形成した。その
構造はめられる菌株りの構造（第９図）に対応していた
。
３．２）クロルアンフェニコール抵抗遺伝子の増幅３．
２．１）菌株Ｄ クロルアンフェニコールの増大濃度を含む液状媒地中に
おいて菌株Ｄ（クロルアンフェニコール５μｇ／ＴＲＩ
抵抗）の１＠次培養により、１０〜５０μｇ／ｌのクロ
ルアンフェニコールに対して抵抗性の菌株を得た。
２．１）菌株Ｄ クロルアンフェニコールの増大濃度を含む液状媒地中に
おいて菌株Ｄ（クロルアンフェニコール５μｇ／ＴＲＩ
抵抗）の１＠次培養により、１０〜５０μｇ／ｌのクロ
ルアンフェニコールに対して抵抗性の菌株を得た。
菌株りの培養から、種々の増幅度を有し２．５と７Ｕ、
Ａ、／染色体を含む菌株を隔離することができる。故に
、菌株Ａ、ＢＸおよびＢｔの中に見られるカナマイシン
抵抗遺伝子の増幅は、遺伝子＆−を有する配列の特殊性
によるものではない。
Ａ、／染色体を含む菌株を隔離することができる。故に
、菌株Ａ、ＢＸおよびＢｔの中に見られるカナマイシン
抵抗遺伝子の増幅は、遺伝子＆−を有する配列の特殊性
によるものではない。
故に実験条件において、７Ｕ 、Ａ 、／染色体以上を
含む菌株を隔離することは不可能であった。
含む菌株を隔離することは不可能であった。
この結果を説明することのできる２つの仮説がある。丁
なわち、クロルアンフェニコールがこれらの菌株を選択
することができないが、あるいはこれらの菌株が存在し
ないかである。
なわち、クロルアンフェニコールがこれらの菌株を選択
することができないが、あるいはこれらの菌株が存在し
ないかである。
３．２．２ ） 菌株α
菌株αは５μｇ ／ ｍｌのクロルアンフェニコールに
抵抗する。この菌株から、５μｇ／ｍ１４以上のクロル
アンフェニコール濃度に対して抵抗性の細菌をうろこと
は不可能であった。５μｇ／ＩＩＡのクロルアンフェニ
コール抵抗性菌株のＤＮＡ全量を抽出し、デンシオメー
タによって分析した。増幅構造はまったく検出されなか
った。
抵抗する。この菌株から、５μｇ／ｍ１４以上のクロル
アンフェニコール濃度に対して抵抗性の細菌をうろこと
は不可能であった。５μｇ／ＩＩＡのクロルアンフェニ
コール抵抗性菌株のＤＮＡ全量を抽出し、デンシオメー
タによって分析した。増幅構造はまったく検出されなか
った。
菌株りとαについて実施されたこれらの研究は、クロル
アンフェニコール抵抗遺伝子が２つの同形配列の間に挿
入されれば増幅されうろことを示す。
アンフェニコール抵抗遺伝子が２つの同形配列の間に挿
入されれば増幅されうろことを示す。
４、）２種の遺伝子の共増幅
２種の遺伝子の共増幅が可能であることを示すため、菌
株Ｅを構築した。その染色体の中に、クロルアンフェニ
コール抵抗遺伝子を含ｊｙ ｐＨＶ ３３Δ８１と、カ
ナマイシン抵抗遺伝子を含むｐＨＶ４５８とが挿入され
た。これらの２つのプラスミドが２つの配列Ｘによって
包囲されてＵ、Ａ、ｒＩ＆１２を構築する（第１０図）
。この構造の場合、ｐＨＶ４５８の増幅は必ず計［Ｖ３
３Δ８１の増幅を伴う。また菌株Ｅは、Ｕ、Ａ、Ｎｉｌ
を成すクロルアンフェニコール抵抗遺伝子ｐＨＶ３３Δ
８１を包囲するｐＢＲ３２２）配列の重複を含む（第１
０図）。ｐＨＶ３３へ８１の増幅はｐＨＶ４５８の増幅
とは無関係でありうる。
株Ｅを構築した。その染色体の中に、クロルアンフェニ
コール抵抗遺伝子を含ｊｙ ｐＨＶ ３３Δ８１と、カ
ナマイシン抵抗遺伝子を含むｐＨＶ４５８とが挿入され
た。これらの２つのプラスミドが２つの配列Ｘによって
包囲されてＵ、Ａ、ｒＩ＆１２を構築する（第１０図）
。この構造の場合、ｐＨＶ４５８の増幅は必ず計［Ｖ３
３Δ８１の増幅を伴う。また菌株Ｅは、Ｕ、Ａ、Ｎｉｌ
を成すクロルアンフェニコール抵抗遺伝子ｐＨＶ３３Δ
８１を包囲するｐＢＲ３２２）配列の重複を含む（第１
０図）。ｐＨＶ３３へ８１の増幅はｐＨＶ４５８の増幅
とは無関係でありうる。
４．１）菌株Ｅの構築
菌株ＢＸ （７）コンピテント細胞が、Ｐｓｔ Ｉニ、
Ｊｌ、ツてあらかじめ線形化されたシラスミドｐＨＶ３
３Δ８１によってクロルアンフェニコール抵抗に関して
形質転換された（パラグラフ３．１．２．参照）。３μ
ｇ／ｌのクロルアンフェニコールに抵抗性の１０２被転
換体／ ＤＮＡμｇを得た。第１０図に図示の構造を有
する推定される栄養系が選ばれた。
Ｊｌ、ツてあらかじめ線形化されたシラスミドｐＨＶ３
３Δ８１によってクロルアンフェニコール抵抗に関して
形質転換された（パラグラフ３．１．２．参照）。３μ
ｇ／ｌのクロルアンフェニコールに抵抗性の１０２被転
換体／ ＤＮＡμｇを得た。第１０図に図示の構造を有
する推定される栄養系が選ばれた。
４．２ ） ｐＨＶ ４５８とｐＨＶ３３Δ８１の増幅
１０μｇ／ｍＡのカナマイシンまたは増大濃度のクロル
アンフェニコール（０〜４０μｇ ／ｌｄ ） 金含有
する液状培地の中に菌株Ｂの細胞を接種した。１８時間
のインキュベーションののち、ｌＯμｇ／ｍｌカナマイ
シン抵抗性細胞と、５μｇ／Ｆｎｌクロルアンフェニコ
ール抵抗性細胞の割合を固体媒質上展張によって測定し
た。
１０μｇ／ｍＡのカナマイシンまたは増大濃度のクロル
アンフェニコール（０〜４０μｇ ／ｌｄ ） 金含有
する液状培地の中に菌株Ｂの細胞を接種した。１８時間
のインキュベーションののち、ｌＯμｇ／ｍｌカナマイ
シン抵抗性細胞と、５μｇ／Ｆｎｌクロルアンフェニコ
ール抵抗性細胞の割合を固体媒質上展張によって測定し
た。
非選択培地中での菌株Ｅの培養の結果、１０μｇ／ｌカ
ナマイシン抵抗性細胞の割合は２．５・１０−５である
（菌株ＡとＢｘ について測定された値に近い値）。５
μｇ／μクロルアンフェニコール抵抗性細胞の割合は３
．３・１０−６である。予期されたように、１０μｇ／
νカナマイシンに対して抵抗性の細菌は、１０μｇ／ｒ
Ｌｌのカナマイシンを含有する液状媒地での培養中に富
化された（固体培地脂、。
ナマイシン抵抗性細胞の割合は２．５・１０−５である
（菌株ＡとＢｘ について測定された値に近い値）。５
μｇ／μクロルアンフェニコール抵抗性細胞の割合は３
．３・１０−６である。予期されたように、１０μｇ／
νカナマイシンに対して抵抗性の細菌は、１０μｇ／ｒ
Ｌｌのカナマイシンを含有する液状媒地での培養中に富
化された（固体培地脂、。
上での波及性効果は１）。この富化に伴って、５μｇ／
αクロルアンフェニコール抵抗性細菌の量が増大した。
αクロルアンフェニコール抵抗性細菌の量が増大した。
固体媒地Ｃｍ２５ 上の波及性効果は０．１゜１０μｇ
／ＩＮのカナマイシンの存在における培養中のクロルア
ンフェニコール抵抗遺伝子の非誘導が、Ｃｍ２５ 上の
波及性効果がＫＩｎｌｏ 上よりも劣ること（１／１０
）の原因に相違ない。
／ＩＮのカナマイシンの存在における培養中のクロルア
ンフェニコール抵抗遺伝子の非誘導が、Ｃｍ２５ 上の
波及性効果がＫＩｎｌｏ 上よりも劣ること（１／１０
）の原因に相違ない。
これらの結果は、一方の遺伝子（遺伝子畑−の増幅が同
一増幅単位中に存在する他方の遺伝子（遺伝子ｃｒｎＲ
）の増幅を伴うことを示している。
一増幅単位中に存在する他方の遺伝子（遺伝子ｃｒｎＲ
）の増幅を伴うことを示している。
クロルアンフェニコールの低濃度（１５μｇ／―まで）
で実施される培養の場合、クロルアンフェニコール抵抗
性遺伝子とカナマイシン抵抗性遺伝子との共増幅は微弱
であるようだ。これは、ｐＨｖ３３Δ８１（Ｕ、Ａ、嵐
１の一部を成す）（第１０図）の独立の増幅、またはカ
ナマイシン抵抗遺伝子の不十分な共増幅（増幅度が１０
μｇ／ＩＬＩカナマイシン抵抗を与えるには小さすぎる
）によるものかもしれない。１５μｇ／ＷＬＩ以上のク
ロルアンフェニコール濃度においては、クロルアンフェ
ニコール抵抗細菌の富化に伴って１０μｇ／αカナマイ
シン抵抗性細菌が富化されることを注意しよう（細胞ｃ
ｍＲ２，に対する細胞伶−１゜の比は５０％から９０チ
に増大する）。これは、Ｕ、Ａ、Ｎ１１２の増幅がＵ。
で実施される培養の場合、クロルアンフェニコール抵抗
性遺伝子とカナマイシン抵抗性遺伝子との共増幅は微弱
であるようだ。これは、ｐＨｖ３３Δ８１（Ｕ、Ａ、嵐
１の一部を成す）（第１０図）の独立の増幅、またはカ
ナマイシン抵抗遺伝子の不十分な共増幅（増幅度が１０
μｇ／ＩＬＩカナマイシン抵抗を与えるには小さすぎる
）によるものかもしれない。１５μｇ／ＷＬＩ以上のク
ロルアンフェニコール濃度においては、クロルアンフェ
ニコール抵抗細菌の富化に伴って１０μｇ／αカナマイ
シン抵抗性細菌が富化されることを注意しよう（細胞ｃ
ｍＲ２，に対する細胞伶−１゜の比は５０％から９０チ
に増大する）。これは、Ｕ、Ａ、Ｎ１１２の増幅がＵ。
Ａ、Ｉ’＆１単独の増幅よりも優先的に生じることを意
味する。
味する。
実施例において使用された菌株とシラスミドの特性と起
源を下表に要約する。
源を下表に要約する。
菌株 遺伝学的標識 起源
太腸菌
ＨＶＣ４５ｔｈｒＡｌ １ｅｕ−６ｔｈ＋−１１ａｃＹ
１ ｔｏｎＡ２１ Ｒ，デービス５ｕｐＦ４４ ｈｓｄ
ＲｒｐｓＬ 枯草菌 ８Ｂ２０２ ｔｒｐＣ２ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉ
ｇＨ２Ｐ 、シエーファα （ａ） ｔｒｐＣ２ｔｙｒ
Ａｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ’２ 本明細書ｉｎｓ ［
ｐＨＶ４５２］ ｄｅｌ （ｉｌｖＡ２）Ａ （ａ）
ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２ｉｎｓ ［ｐＨＶ
４５２］本明細書ｄｅｌ ［１ｌｖＡ２］ ｉｎｓ［ｐ
ｌ（Ｖ４５７］ｄｕｐ ［ｐＢＫ３２２Ｑ８１’） ＢＸ （ａ）ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＦ（２本
明細書ｉｎｓ ［ｐＨ１７４５８，Ｘ’］ ｄｕｐ ＣＸＩ ｄｕｐ （ＴｈｙＢ）Ｃ（ａ） ｔｙ
ｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２本明細書ｉｎｓ ［ｐ
ＨＶ４５８］ ｄｅｌ ［１ｌｖＡ２’１Ｄ （ａ）ｔ
ｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｇＨ２本明細書ｉｎｓ ［
ｐＨＶ４５８］ ｄｅｌ ［：１ｌｖＡ２：］ ｉｎｓ ［ｐＨＶ３３ｆ
ｆｌｌ〕ｄｕｐ ［ρ■日２漣１〕 Ｅ （ａ） ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２本明
細書ｉｎｓ ［ｐ［（Ｖ４５８．Ｘ） ｄｕｐ ［Ｘ］ ｄｕｐ ［ＴｂｙＢ］ｉｎｓ ［ｐＨ
Ｖ３３Ｑ８１］ ｄｕｐ （ｐＢＲ３２２＄１）（ａ）
枯草菌の染色体中にプラスミドを挿入することによる
遺伝学的修飾、 １） ｉｎｓとこれに続くカッコ付きプラスミド名は、
そのプラスミドが染色体の中に挿入されることを意味す
る。
１ ｔｏｎＡ２１ Ｒ，デービス５ｕｐＦ４４ ｈｓｄ
ＲｒｐｓＬ 枯草菌 ８Ｂ２０２ ｔｒｐＣ２ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉ
ｇＨ２Ｐ 、シエーファα （ａ） ｔｒｐＣ２ｔｙｒ
Ａｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ’２ 本明細書ｉｎｓ ［
ｐＨＶ４５２］ ｄｅｌ （ｉｌｖＡ２）Ａ （ａ）
ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２ｉｎｓ ［ｐＨＶ
４５２］本明細書ｄｅｌ ［１ｌｖＡ２］ ｉｎｓ［ｐ
ｌ（Ｖ４５７］ｄｕｐ ［ｐＢＫ３２２Ｑ８１’） ＢＸ （ａ）ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＦ（２本
明細書ｉｎｓ ［ｐＨ１７４５８，Ｘ’］ ｄｕｐ ＣＸＩ ｄｕｐ （ＴｈｙＢ）Ｃ（ａ） ｔｙ
ｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２本明細書ｉｎｓ ［ｐ
ＨＶ４５８］ ｄｅｌ ［１ｌｖＡ２’１Ｄ （ａ）ｔ
ｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｇＨ２本明細書ｉｎｓ ［
ｐＨＶ４５８］ ｄｅｌ ［：１ｌｖＡ２：］ ｉｎｓ ［ｐＨＶ３３ｆ
ｆｌｌ〕ｄｕｐ ［ρ■日２漣１〕 Ｅ （ａ） ｔｙｒＡｌ ａｒｏＢ２ ｈｉｓＨ２本明
細書ｉｎｓ ［ｐ［（Ｖ４５８．Ｘ） ｄｕｐ ［Ｘ］ ｄｕｐ ［ＴｂｙＢ］ｉｎｓ ［ｐＨ
Ｖ３３Ｑ８１］ ｄｕｐ （ｐＢＲ３２２＄１）（ａ）
枯草菌の染色体中にプラスミドを挿入することによる
遺伝学的修飾、 １） ｉｎｓとこれに続くカッコ付きプラスミド名は、
そのプラスミドが染色体の中に挿入されることを意味す
る。
２） ｄｅｌまたはｄｕｐとこれに続く遺伝子名、配列
またはシラスミド名は、シラスミドの挿入後に、それぞ
れこの遺伝子、配列またはプラスミドの欠失または重複
のあったことを意味する。
またはシラスミド名は、シラスミドの挿入後に、それぞ
れこの遺伝子、配列またはプラスミドの欠失または重複
のあったことを意味する。
３）シラスミドが多数個所に挿入されうるとき、その組
込部位はプラスミＰの名称のあとに示される。
込部位はプラスミＰの名称のあとに示される。
シラスミド 構 築 参照文献
ｐＢＲ３２２栄養系ベクター ゼリパ→λ９７７
ｐｃ１９４ 自然隔離 ヨルダネス久
９７５
ｐＵＢｌｌｏ 自然隔離 グリスザンは力＼９７８
ＴｅＲ１９８１
ｐＨＶ３３ ｐｃ１９４とｐＢＲ３２２とノ〃〃間の雑
種 ｐＨＶ３３湖Ｉ ＢａｍＨＩによって切断さ ダゲール
ほか、れＢＡＬ３１によって浸食 １９８４ されたｐＨＶ３３ ｐＨＶ４３８ ｐＨＶ３２と枯草菌染色体 二オーデほ
か、の分節ＴｈｙＢお゛よびＸ １９８２ との間の雑種 ｐＨＶ４５２ ｐＨＶ３３聞１と、枯草菌染 本明細書
色体の分節’ｒｈｙｎおよび Ｘとの間の雑種 ｐＨＶ４５７ ｐＢＲ３２２の部位ＢａｍＨＩ 本明細
書の中に挿入されたｐＵＢ １１０の分節５ａｕ３Ａ Ｉとｙ ｐＷ４５８ ｐＨＶ４５７と、枯草菌染 本明細書およ
びＸとの間の雑種 ７、／′ ／′ 参考文献 Ｂａｒａｔ Ｍ、、 Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ
Ｃ０及び５ｃｈｎｅｉｄｅｒ ＡｌＭ。
種 ｐＨＶ３３湖Ｉ ＢａｍＨＩによって切断さ ダゲール
ほか、れＢＡＬ３１によって浸食 １９８４ されたｐＨＶ３３ ｐＨＶ４３８ ｐＨＶ３２と枯草菌染色体 二オーデほ
か、の分節ＴｈｙＢお゛よびＸ １９８２ との間の雑種 ｐＨＶ４５２ ｐＨＶ３３聞１と、枯草菌染 本明細書
色体の分節’ｒｈｙｎおよび Ｘとの間の雑種 ｐＨＶ４５７ ｐＢＲ３２２の部位ＢａｍＨＩ 本明細
書の中に挿入されたｐＵＢ １１０の分節５ａｕ３Ａ Ｉとｙ ｐＷ４５８ ｐＨＶ４５７と、枯草菌染 本明細書およ
びＸとの間の雑種 ７、／′ ／′ 参考文献 Ｂａｒａｔ Ｍ、、 Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ
Ｃ０及び５ｃｈｎｅｉｄｅｒ ＡｌＭ。
（１９６５） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 ９０：３５
１−３６９Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ａ、 （１９６２） Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ Ｇｅｎｅｔ、１１：１０１−１４５Ｃ
ｏｎｔｅｎｔｅ Ｓ、及びＤｕｂｎａｕ Ｄ、 （１９
７９） Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１Ｄａｇｅ
ｒｔ Ｍ、、 Ｊｏｎｅｓ Ｉ＋Ｍ＋、Ｇａｚｅ Ａ、
、Ｒｏｍａｃ Ｓ、。
１−３６９Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ａ、 （１９６２） Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ Ｇｅｎｅｔ、１１：１０１−１４５Ｃ
ｏｎｔｅｎｔｅ Ｓ、及びＤｕｂｎａｕ Ｄ、 （１９
７９） Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１Ｄａｇｅ
ｒｔ Ｍ、、 Ｊｏｎｅｓ Ｉ＋Ｍ＋、Ｇａｚｅ Ａ、
、Ｒｏｍａｃ Ｓ、。
Ｎ１ａｕｄｅｔ Ｂ、及びＥｈｒｌｉｃｈ Ｓ、Ｄ、（
１９８４） ＥＭＢＯＪ。
１９８４） ＥＭＢＯＪ。
旦：８ｌ−８６
Ｇｒｙｃｚａｎ Ｔ、Ｊ、及びＤｕｂｎａｕ Ｄ、（１
９７８） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
９７８） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７５：１４２８−１４
３２Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ Ｓ、 Ｂａｎｎｅｒ Ｃ１
Ｄ、Ｂ、、Ｏｌｌｌｎｇｔｏｎ Ｊ、Ｆ、。
３２Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ Ｓ、 Ｂａｎｎｅｒ Ｃ１
Ｄ、Ｂ、、Ｏｌｌｌｎｇｔｏｎ Ｊ、Ｆ、。
Ｌｏｓｉｃｋ Ｒ１，Ｈｏｃｈ Ｊ、Ａ、、 Ｏ’Ｃｏ
ｎｎｏｒ Ｍ、Ｂ、及びＳｏｎｅｎｓｈｅｉｍＢ、Ｌ、
（１９８０） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４２：９
Ｏ−９８Ｈａｒｒｉｓ七ｒｔｖｉｃｋ ＲｏＭ、及びＬ
ｅｄｅｒｂｅｒｇ Ｊ、（１９７７）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、１３３：１２４６−１２５３Ｉｏｒｄａｎｅ８
ｃｕ Ｓ、 （１９７５） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１２４：５９７−６Ｌ１１Ｍｉｃｈｅｌ Ｂ、、 Ｎ
１ａｕｄｅｔ Ｂ、及びＥｈｒｌｉｃｈ Ｓ、Ｄ、 （
１９８２）１Ｍ３０ Ｊ、 １：１５６５−１５７１Ｍ
ｉｃｈｅｌ Ｂ、、 Ｎ１ａｕｄｅｔ Ｂ、及びＥｈｒ
ｌｌｃｈ Ｓ、Ｄ、（１９８３）Ｐｌａｓｍｉｄ １０
：１−１Ｏ Ｎｉａｕｄｅｔ Ｂ、、 ＧｏｆｆＩｅ Ａ、及びＥｈ
ｒｌｉｃｈ Ｓ、Ｄ、 （１９８２）Ｇｅｎｅ １９：
２７７−２８４
ｎｎｏｒ Ｍ、Ｂ、及びＳｏｎｅｎｓｈｅｉｍＢ、Ｌ、
（１９８０） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４２：９
Ｏ−９８Ｈａｒｒｉｓ七ｒｔｖｉｃｋ ＲｏＭ、及びＬ
ｅｄｅｒｂｅｒｇ Ｊ、（１９７７）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、１３３：１２４６−１２５３Ｉｏｒｄａｎｅ８
ｃｕ Ｓ、 （１９７５） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１２４：５９７−６Ｌ１１Ｍｉｃｈｅｌ Ｂ、、 Ｎ
１ａｕｄｅｔ Ｂ、及びＥｈｒｌｉｃｈ Ｓ、Ｄ、 （
１９８２）１Ｍ３０ Ｊ、 １：１５６５−１５７１Ｍ
ｉｃｈｅｌ Ｂ、、 Ｎ１ａｕｄｅｔ Ｂ、及びＥｈｒ
ｌｌｃｈ Ｓ、Ｄ、（１９８３）Ｐｌａｓｍｉｄ １０
：１−１Ｏ Ｎｉａｕｄｅｔ Ｂ、、 ＧｏｆｆＩｅ Ａ、及びＥｈ
ｒｌｉｃｈ Ｓ、Ｄ、 （１９８２）Ｇｅｎｅ １９：
２７７−２８４
第１図は単式組替生起の略示図、第２図は複式組替生起
の略示図、第３図は遺伝子増幅の略示図、第４図は菌株
αとＡの構築図、第５図は菌株Ａの構造図、第６図は遺
伝子模写数／カナマイシン抵抗のグラフ、第７図は遺伝
子模写数７４’ ＡＮＴ活性のグラフ、第８図は菌株Ｂ
ｔ、ＢＸ、Ｃの構築と構造を示す図、第９図は菌株りの
構造図、また第１０図は菌株Ｅの構造図である。 出願人代理人 猪 股 清 Ｋｍ 抵抗 、 ｐｑ／ｍｌ Ｆ旧−６ ｐＨＶ ４５７．接写数 Ｆ旧−７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号０発 明
者 エブリーヌ、ビニール フランス国９５５８ｏＸ
＠発 明 者 スタニスラス、エルリ フランス国７５
００５゜シュ ０発 明 者 ブリジット、ニオーデ フランス国７５
２５１、つ、２ エトルシ、リュ、デュ、マリノー、３ パリ、リュ、リネ、４ パリ、セデ、０飄プラース、ジュシ
の略示図、第３図は遺伝子増幅の略示図、第４図は菌株
αとＡの構築図、第５図は菌株Ａの構造図、第６図は遺
伝子模写数／カナマイシン抵抗のグラフ、第７図は遺伝
子模写数７４’ ＡＮＴ活性のグラフ、第８図は菌株Ｂ
ｔ、ＢＸ、Ｃの構築と構造を示す図、第９図は菌株りの
構造図、また第１０図は菌株Ｅの構造図である。 出願人代理人 猪 股 清 Ｋｍ 抵抗 、 ｐｑ／ｍｌ Ｆ旧−６ ｐＨＶ ４５７．接写数 Ｆ旧−７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号０発 明
者 エブリーヌ、ビニール フランス国９５５８ｏＸ
＠発 明 者 スタニスラス、エルリ フランス国７５
００５゜シュ ０発 明 者 ブリジット、ニオーデ フランス国７５
２５１、つ、２ エトルシ、リュ、デュ、マリノー、３ パリ、リュ、リネ、４ パリ、セデ、０飄プラース、ジュシ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、染色体の中で特定遺伝子を増幅させた桿菌の菌株の
製造方法において、 （ａ） 前記遺伝子を有する少くとも一種の組込シラス
ミドベクターを桿菌の染色体の中に組込み、染色体の中
に、 少くとも前記の遺伝子およびその表現要素を含む増幅単
位と呼ばれる少くとも１種のＤＮＡ配列および両端にお
いて直接方向に同形の２配列と、 さらに選択性遺伝子のための暗号付は増幅単位とを生じ
る段階と、 （ｂ） 次に、選択性遺伝子に対応する選択培地上での
培養によって得られた桿菌の菌株を選択し、選択前の細
菌集団に対して増大した前記遺伝子の模写数の存在に対
応する表現型の菌株を採取する段階とを特徴とする方法
。 ２、選択標識は化合物に対する抵抗性遺伝子であって、
（ｂ）段階に際して、この化合物に対して最高の抵抗性
を示す菌株を選択することを特徴とする特許請求の範囲
第１項による方法。 ３、化合物は抗生物質であることを特徴とする特許請求
の範囲第２項による方法。 ４、選択標識は遺伝子ＫｍまたはＣｍであることを特徴
とする特許請求の範囲第３項による方法。 ５、重複配列と呼ばれる同形配列は細菌シラスミドから
生じることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４
項のいずれかによる方法。 ６、重複配列はｐＢＲ３２２から生じることを特徴とす
る特許請求の範囲第５項による方法。 ７、重複配列は野生種枯草菌の染色体のＤＮＡ配列の全
部または一部によって構築されることを特徴とする特許
請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかによる方法。 ８、重複配列は遺伝子ＴｈＹ Ｂの全部または一部によ
って構成されることを特徴とする特許請求の範囲第５項
乃至第７項のいずれかによる方法。 ９、 （ａ）段階において、組込プラスミドベクターは
少くとも、 ・重複配列、標識遺伝子および特定遺伝子から成る増幅
単位を含み、桿菌の染色体は組込前に重複配列を含むこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第８項のいず
れかによる方法。 １０、桿菌の染色体中に存在する重複配列は、組込プシ
スミドベクターによる組込によって導入されたことを特
徴とする特許請求の範囲第９項による方法。 １１、特許請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかの
方法を実施して得られた桿菌の菌株。 １２、枯草菌を使用することを特徴とする特許請求の範
囲第１１項による菌株。 １３、特定蛋白質の製造方法において、前記蛋白質につ
いて特定遺伝子が暗号づけする特許請求の範囲第１１項
または第１２項のいずれかによる菌株を培地中において
培養し、次に表現された蛋白質を隔離することを特徴と
する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8406701A FR2563533B1 (fr) | 1984-04-27 | 1984-04-27 | Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues |
| FR8406701 | 1984-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60234579A true JPS60234579A (ja) | 1985-11-21 |
| JPH0665306B2 JPH0665306B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=9303577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59115355A Expired - Lifetime JPH0665306B2 (ja) | 1984-04-27 | 1984-06-05 | 枯草菌において特定遺伝子の表現を増幅する方法およびこれによつて得られた菌株 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4959316A (ja) |
| EP (1) | EP0166628B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0665306B2 (ja) |
| AT (1) | ATE44766T1 (ja) |
| DE (1) | DE3571646D1 (ja) |
| FR (1) | FR2563533B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02211862A (ja) * | 1988-06-22 | 1990-08-23 | Toagosei Chem Ind Co Ltd | 抗昆虫蛋白産生枯草菌 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU620326B2 (en) * | 1987-02-27 | 1992-02-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
| FR2627508B1 (fr) * | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
| CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
| JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
| FR2650292B1 (fr) * | 1989-07-27 | 1994-03-04 | Institut Recherche Agronomique | Procede de production de proteine a partir de souches de bacillus subtilis et procede de preparation desdites souches |
| US5695976A (en) * | 1989-12-18 | 1997-12-09 | Novo Nordisk A/S | Stable integration of DNA in bacterial genomes |
| DE4216246A1 (de) * | 1992-05-16 | 1993-11-18 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation |
| DK153992D0 (da) * | 1992-12-22 | 1992-12-22 | Novo Nordisk As | Metode |
| US5733753A (en) * | 1992-12-22 | 1998-03-31 | Novo Nordisk A/S | Amplification of genomic DNA by site specific integration of a selectable marker construct |
| US5861273A (en) * | 1993-12-21 | 1999-01-19 | Celtrix Phamraceuticals, Inc. | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
| JP2002516116A (ja) * | 1998-05-27 | 2002-06-04 | ノボザイムス バイオテック，インコーポレイティド | 遺伝子のコピー数を変化させることによりポリペプチドを生産するための方法 |
| EP1169466A4 (en) * | 1999-03-23 | 2005-02-23 | Univ Michigan State | SYNTHESIS OF 1,2,3,4-TETRAHYDROXYBENZENES AND 1,2,3-TRIHYDROXYBENZENES USING MYO-INOSITOL-1PHOSPHATE SYNTHASE AND MYO-INOSITOL 2-DEHYDROGENASE |
| DK1805296T3 (da) | 2004-10-22 | 2010-01-18 | Novozymes As | Stabil genomisk integrering af multipie polynukleotidkopier |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
| GB2068971B (en) * | 1980-01-30 | 1983-06-08 | Searle & Co | Recombinant dna techniques |
| EP0074808A3 (en) * | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
| JPS59501195A (ja) * | 1982-07-09 | 1984-07-12 | ボイス トンプソン インスチチユ−ト フオ−プラント リサ−チ，インコ−ポレ−テツド | 原核生物における遺伝子工学 |
-
1984
- 1984-04-27 FR FR8406701A patent/FR2563533B1/fr not_active Expired
- 1984-06-05 JP JP59115355A patent/JPH0665306B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-26 AT AT85400830T patent/ATE44766T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-26 DE DE8585400830T patent/DE3571646D1/de not_active Expired
- 1985-04-26 EP EP85400830A patent/EP0166628B1/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-12-18 US US07/135,515 patent/US4959316A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02211862A (ja) * | 1988-06-22 | 1990-08-23 | Toagosei Chem Ind Co Ltd | 抗昆虫蛋白産生枯草菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2563533B1 (fr) | 1986-08-22 |
| ATE44766T1 (de) | 1989-08-15 |
| JPH0665306B2 (ja) | 1994-08-24 |
| EP0166628B1 (fr) | 1989-07-19 |
| FR2563533A1 (fr) | 1985-10-31 |
| US4959316A (en) | 1990-09-25 |
| EP0166628A1 (fr) | 1986-01-02 |
| DE3571646D1 (en) | 1989-08-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |