JPS60234592A - 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は１還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤＨと略す）の製造法、詳しくはニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＨＡＤと
略す）を酵素的に還元するＮＡＤＨの製造法に関するも
のである。

従来技術 ＮＡＤＨは、脱水素酵素の補酵素として重要な物質であ
ることが知られている０またその特徴ある紫外線の吸収
の故に、各種酵素反応の検出に用いられる。即ち還元型
であるＮＡＤＨは、３４０ｎｍにおける釦著な吸収を示
し、酸化型であるＭＡＤは、全（吸収を示さないかため
に、脱水素酵素反応の補酵素としてＮＡＤＨを使用する
ことで、血清、尿中のピルビン酸、オキザロ酢酸等の生
体内各種物質の酵素分析における明確な指標とすること
ができる。

ＮＡＤＨはＭＡＤを還元することによって得られる。

ＮＡＤの還元には亜ニチオン酸ナトリウム（ＮａｌＳ２
０４）のような還元剤を用いる化学的な方法もあるが、
この方法では種々の異性体が形成され、それらは酵素反
応に対して阻害作用を有しているので、生化学試薬とし
ては使用できない。他方、ＮＡＤを補酵素とする脱水素
酵素を用いる酵素的な還元方法によれば、異性体が形成
されないため現在では酵素的還元方法が、一般的に用い
られている。

従来、ＮＡＤＨを酵素的に製造する方法としてはＮＡＤ
　（！：エタノールをアルコール脱水素酵素の存在下で
反応させ、アセトアルデヒドを生成させると同時にＮＡ
ＤＨを生成させていた。

アルコール脱水素酵素の反応は次のような式で表わされ
る反応である。

ＮＡＤ　十エタノール←→ＮＡＤＨ＋アセトアルデヒド
＋鹸−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一（１
）しかしなから、中性付近では（１）式の反応の化学平
衡は著しく逆反応側に傾いており、通常の条件ではＮＡ
Ｄの還元反応はほとんど進行しない。

そのためアルコール脱水素酵素を用いるＮＡＤの還元は
従来反応液をｐＨｌＯ前後にして行っている。しかし、
このような反応条件下では、アルコール脱水素酵素が不
安定となり、さらにＨｋＤがアルカリ分解を起こしＮＡ
ＤＨの回収率か低くなるといった問題点がある。

この問題を改良した方法として、反応生成物のＮＡＤ）
ｌ、アセトアルデヒドを弱塩基性イオン交換樹脂に吸着
させることでｐＨ５〜８の安定ｐＨ領域下で実施する報
告（特開昭５３−５２６９１号）もあるか操作が煩雑で
あることは否めない。

これとは別に、ＮＡＤを酵素的に還元する方法として、
ＭＡＤとき酸をぎ酸膜水素酵素の存在下で反応させ、炭
酸ガスを生成させると同時にＮＡＤＨを生成する方法が
報告されている（特開昭５４−１０１４９１号）。

ぎ酸膜水素酵素の反応は次のような式で表わされる反応
である。

ＮＡＤ＋十ぎ酸−ＮＡＤＨ＋ｏｏ、　＋ｕ＋　−−−−
（２）この反応はｐＨ７，５前後の中性域で良く進行す
るので、ＮＡＤＨの収率もきわめてよく、かつ簡便な方
法といえる。しかしなから、本発明者らは、危険物であ
るき酸を大量規模での反応に使用することに非常な危惧
を抱いた。即ち、ぎ酸は強い刺激臭のある揮発性液体で
腐食性を有し、皮膚につくと発病することか知られてい
る。それ故に、工場規模での操業に際しては、反応に使
用するタンクの腐食と従事する労働者の安全に特別な配
慮を払わなければならない。

発明の目的 本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、その目的は以下の条件：（１ン基質としてき酸のよ
うな刺激性・腐食性の危険な物質を使わない。

（２）アルカリ側ではＮＡＤが分解し易く、酸性側では
ＮＡＤＨが分解し易いことから、還元反応は必然的に中
性領域で行わなければならない。それ故にｐＨ６〜８の
範囲で平衡がＮＡＤＨ生産に傾いている反応であること
が必須である。

（３）反応がＮＡＤＨ生産に傾くためには、き酸膜水素
酵素の反応と同じ（、ＮＡＤ）Ｉの還元と同時に炭酸ガ
ス等の反応系外に出易い生成物があることが必須である
。

（４補酵素としてＮＡＤを要求すること。

（５）使用する酵素が人手し易いこと。

に合致する製造方法を提供することにある。

発明の構成 本発明は、ＮＡＤとりんご酸とをりんご酸膜水素酵素の
存在下で反応させて・ＮＡＤＨを生成させることからな
るＮＡＤＨの製法に関する。

本発明者等は、ＭＡＤと食品添加物であるりんご酸とを
りんご酸膜水素酵素（例えはＥｏ　１　、１　。

１．３８＞の存在下で反応させてＮＡＤＨを生成させる
ことで上記要求課題をことごとく満足させ得る理想的な
ＮＡＤＨの工業的生産法の発明をすることができた。り
んご酸膜水素酵素を用いるＮＡＤからＩＩＡＤＨの工業
的生産の試みは今まで全く行われていない。

りんご酸膜水素酵素の反応は次のような式で表わされる
。

りんご酸十ＨＡＤ＋−ピルビン酸＋００！＋ＮＡＤＨ十
肋−−−−−−−−−−−−−−−−−（３）この反応
（３）は、ｐＨ７，５前後のほとんど中性領域で充分進
行するので１使用する基質、酵素量も少なくてすみ、Ｎ
ＡＤ、　ＮＡＤＨの反応途中での分解も抑制される。更
に（３）式の反応において、反応糸を減圧条件において
生成する炭酸ガスを反応糸から除去した場合には、反応
は更にＮＡＤＨ生成に進み易くなってＮＡＤＨ生産を極
めて円滑に行うことができる。

本発明の反応は、水または緩衝液（トリス−塩酸緩衝液
、りん酸緩衝液など）中で好ましくはｐ）Ｉ６〜８で行
う。反応液にはＭ、ｇ　イオノ、たとえばＭｇＯ１ｚや
ＭｇＳＯ４を添加することが好ましい。反応液中にはＮ
ＡＤを好ましくは０．０５〜１０％（Ｗ／ｖ）、りんこ
酸を好ましくは０．０２〜５％（Ｗ／ｖ）添加して、こ
れにりんご除脱水素酵素を粉末酵素または酵素溶液とし
て添加する。りんご酸はＬ−型りんご酸でも良（、ＤＬ
−型りんご酸を用いても良い。

りんご除脱水素酵素を固定化する場合には、ポリアクリ
ルアミド法、ゲルタールアルデヒドと反応剤またはカラ
ゲニン等の多糖類を用いる方法等の周知の方法で固定化
できる。使用するりんご除脱水素酵素はエシェリヒア・
コリ（１！；５ｏｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）、ラ
クトバシルス・アラビノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ａｒａｂｉｎｏｓｕｓ　）等の公知のすべてのり
んご除脱水素酵素（酵素ハンドブック、第１４頁）朝食
書店５１９Ｂ２年発行参照）を使用することができる。

即ち、（３）式の反応を触媒する酵素であれば、全ての
生物起源の酵素を使用することが可能である。

酵素源としては、酵素自体以外にりんご酸膜水素酵素活
性を有する菌体を凍結融解・有機溶媒処理、界面活性剤
処理等で膜透過性を増大させた菌体そのものを反応に使
用することも可能である。

反応を減圧条件で実施した場合には、生成する炭酸ガス
が系外にほぼ完全に除去できるのでＨＡＤの還元反応を
非常に効率良く行うことが可能である。

本反応は通常は２０〜４０°Ｃで好ましくは攪拌しつつ
実施する。反応時間は上記条件では２〜６時間である。

反応終了後Ｓ反応液に２倍容量のエチルアルコールを加
えて、りんご酷税水素酵素を沈澱させ洩プフナー漏斗等
を用いて許過、または遠心分離によって除去する。

固定化酵素または固定化菌体を反応に用いた場合には、
沢過によって簡単に酵素を分離することが可能であり、
更に回収した固定化酵素、固定化菌体は縁り返し酵素反
応に使用することが可能である。

次いで、得られたＰ＠液、または遠心上澄にアルコール
濃度が９０％になるようにエチルアルフールを添加して
ＮＡＤＨを沈澱させる。ＮＡＤＨノ沈澱物は更にエチル
アルコール、エーテル等によって洗浄した後、真空乾燥
して粉末とする。

生成したＮＡＤＨの補酵素活性は乳酸脱水素酵素を用い
て定量できる（メソッドｅオブ・エンザイマチツク・ア
ナリシス第４巻、第２０５３頁・アカデミツクプレス、
・１９７４年発行参照）。

本方法により、ＮＡＤＨはＮＡＤからほぼ１００％の収
率で得られる。

実施例の説明 次に本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例　１ 反応槽にｌＱｍＭのＭｇＯ１２を含む５ＱｍＭりん酸緩
衝ｔ＆　（ｐＨ７，５）　５００ｍｔを入れ、これにＮ
ＡＤ５ＰおよびＬ−りんこ＠１５？を添加し、ＩＮのＮ
ａＯＨにてｐＨを７５に調整した。更にエシェリヒア・
コリよりザ・ジャーナル・オプ・ザ・バイオケミストリ
ー第７３巻第１６９〜１８０頁（１９７３年）記載の方
法で調製したりんご除脱水素酵素（］！ｉｏ　１．１．
１．３８　）を５０酵素単位添加して、３０℃でゆるや
かに攪拌しつつ５時間反応させた。反応終了時のｐＨは
７．８であった。

反応液中のＭＡＤ　、　ＨＡＤＨを高速液体クロマトグ
ラフィーで定量した結果、計算上９５％のＮＡＤが還元
されたことになる。得られた反応液にエチルアルコール
を１０００ｍ／添加し、３０分間静置した後、冷却遠心
機で遠心分離して酵素を除去した。次いで、上澄液にエ
チルアルコールを９０％濃度になるまで添加し・２時間
放置した。生じたＮＡＤＨの沈澱を遠心分離にて集め・
９０％エチルアルコールで２回、エチルエーテルで２回
洗浄した後、真空乾燥してＮＡＤＨ４，５ｉｉ’を得た
。ＮＡＤＨの純度は乳酸脱水素酵素を用いる分析法で９
７％であった。

実施例　２ 反応槽にｌＱｍＭのＭｇＯ１１を含む５０ｍＭりん酸紗
衝ｔ（ｐＨ７，５）　５００ｍｔを入れ、これにＭＡＤ
５ＦおよびＬ−りんご酸１．５Ｆを添加し、ＩＮのＮａ
ＯＨにてｐＨを７５に調整した。更にエシェリヒア・コ
リ由来のりんご酸膜水素酵素（ｎｏ　１　。

１．１．３８　）　５０酵素単位を添加して３０＠Ｃで
ゆるやかに攪拌しつつ、減圧（２０ｓｎＨｇ）条件下に
おいて５時間反応を行った。反応終了時のｐＨは８０で
あった。

反応液中の１１１ＡＤ　、　ＮＡＤＨを高速液体クロマ
トグラフィーで定量した結果、計算上９８％のＮＡＤが
還元されたことになる。得られた反応液にエチルアルコ
ールを１０１００Ｏ添加し、冷却遠心機で遠心分離して
酵素を除去した後、上澄に更にエチルアルコールを９０
％濃度になるまで添加し、２時間放置した。生じたＮＡ
ＤＨの沈澱を遠心分離して９０％エチルアルコールで２
回、エチルエーテルで２回洗浄した後、真空乾燥してＮ
ＡＤＨ４，８Ｐを得た。ＮＡＤＨの純度は乳酸脱水素酵
素を用いる分析で９８％であった。

発明の効果 以上、詳細に説明したとおり、本発明によってＮＡＤか
らＮＡＤＨが簡便かつ安全な方法で効率良く製造するこ
とができ、本発明は従来法と比較して工業的に優れたＮ
ＡＤＨの製造技術を開発した点で効果を有する。

特許出願人　賓酒造株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドとり
   んご酸とをりんご除脱水素酵素の存在下で反応させ、還
   元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを生成
   させることを特徴とする還元型ニコチンアミド・アデニ
   ン・ジヌクレオチドの製法。 ２、　反応を減圧下で、生成する炭酸ガスを反応系外に
   除去しつつ行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の製法。