JPS6024185A - 生物学的活性接合物、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的活性保持タンパク質及びグリコプロテ
ィン特に酵素の水溶性の生物学的活性保持接合物並びに
その製法及び用途に関する。

従来の技術 英国特許第１１７４８５４号明細書中に或種の多糖類例
えばペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、セルロン酸、
カラゲナン及びリケニンウロン酸と塩基性アミノ基又は
フェノール性ヒドロキシル基含有の生物学的活性物質と
の接合物が開示されている。これらの接合物は水溶型の
生物学的活性物質を使用する試薬系において使用され得
るものであり、その使用場所で不溶化されるか又は不溶
性であり、しかもこの接合物は使用全過程において活性
を保持する。かような系の−・例は反応系内での可溶性
接合酵素の使用及びカルシウムイオン添加による接合物
の分離である。これらの接合物はカップリング剤例えば
水溶性ジイミド、水溶性ジイミド存在下のエチルクロロ
ポルメート、ヒドラジンヒトレートの使用及びそれに続
く亜硝酸又は三酸化イオウ−Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド錯体の使用により塩基性アミノ基又はフェノール性
ヒドロキシル基含有の錯化有機化合物と前記の酸との結
合のための公知方法に従って製造された。

ＵＳＳＲ特許第７０７９２４号明細書は薬学的酵素学及
び生化学的研究に使用されるための多糖類変性の水溶性
タンパク分解酵素を開示している。

該酵素は等モル量のタンパク分解酵素とアルギン酸とを
ｐＨ７，５において反応させｐｕｔ、ｏ〜１．５に酸性
化させた後に生成物を単離することとにより製造された
。アルギン酸はアルギネートを酸で沈澱させ凍結乾燥し
て製造される。

ビオテクノロジイレタアズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙＬｅｔｔｅｒｓ　４　（１９８２）　、３８．７−３
９２）はプロピレングリコールアルギネートをアルカリ
性条件下でゼラチンと混合すると強い共有結合ゲルを生
成することを開示している。或種の酵素即ちベーターグ
ルコンダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びウリカーゼ
はゼラチン導入の以前においてアルギネートエステル上
に固定化された。

他の文献（ＢｉｏＬｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　Ｌ　８
　（Ｌ　９７６　）１３２５及び１９　（１９７７）１
７３９）には酵素とデキストラン又はカルホキジメチル
デキストランとの接合物が記載されているがこれらの接
合物は有毒性のカンプリング剤、例えば臭化シアノケン
の使用によって製造される。

他の作文（Ｊ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｓｍｅｔ、　Ｃｂｅｍ
、２１（１９７０）、４４１−４５７）にはプロピレン
グリコールアルギネートとゼラチンとの反応の結果ゼラ
チンの不溶化が起こることが記載されている。かように
変性されたゼラチンのフィルムは未変性ゼラチンに比較
してより高い温度で次工程としての写真技法上の加工に
供され得るのである。

この作文の著者によればこのゼラチン変性方法の用途と
して硬質ゼラチンカプセル製造が可能である。

一明が解決しようとする問題点 本発明は反応の際の副生物が接合物に対し有害でなく有
毒でもない経済的で単純な操作によって製造され得る生
物学的活性保持タンパク質又はグリコプロテインと多糖
類誘導体との生物学的活性保持接合物を提供する。この
接合物は原タンパク質自体に比しより有益に変改された
生物学的諸性質を有する。

問題点を解決する手段 本発明の新規な水溶性生物学的活性接合部は（１１第１
級アミノ基を有する生物学的活性タンパク質又はグリコ
プロティン、（２）Ｄ−マヌロン酸及びＬ−グルロン酸
、好ましくはアルギン酸のヘテロポリマー、及び（３）
アルキレングリコール、好ましくは１，２−プロピレン
グリコールの（上記３種物質の）残基（複数）を有し、
この接合物は“アミドおよび任意にエステル結合を介し
て残基（１）に結合すると共にエステル結合を介して残
基（３）に結合する残基（２）”を有し、この接合物は
該タンパク質又はグリコプロティンの生物学的活性を示
す。

本発明の一態様に従えば上記の新規接合物は第１級アミ
ノ基含有の生物学的活性タンパク質又はグリコプロティ
ンとＤ−マヌロン酸及びＬ−グルロン酸のヘテロポリマ
ーの水溶性アルキレングリコールエステルとを水性媒質
中で混合することにより製造される。該エステルは好ま
しくは水不溶性カルシウム塩を形成しない程度に充分に
高度にエステル化されていて該エステルと該クンバク質
のアミノ基との部分的（即ち不完全な）反応を起こすの
に充分なｐｌ＋にまで該水性媒質のｐＨを上昇させ、そ
れから該媒質のｐＨを下げて反応を完結させるものであ
る。

作用及び発明の効果 本発明の新規接合物は食品用に通常許容され得る材料例
えばプロピレングリコールアルギネートと食用縁の酵素
とからすべて誘導され得る。合成に際し周囲温度下でア
ルカリ性条件を短時間だけ使用するのみであってこれは
タンパク質変性の危険を顕著に減する。有毒なカンプリ
ング剤を必要としない。ただ商業上人手され得る出発原
料物質を要するのみであり複雑な高価な工程例えば凍結
乾燥の使用を回避する。

本発明の接合物は原タンパク質例えば原酵素に比し重要
な技術的諸利益を有する。特に接合された酵素は原酵素
に比しより高いｐＨ及びより高い温度の下でその活性を
保有する。酵素活性のｐＨ域の高いｐＨへの拡大の可能
性は従前技術においてｐＨの遠域の相違にもとづき２工
程またはそれ以上の工程によって酵素学的連続反応を行
う場合に比し単に酵素学的反応を組合わせるだけでよい
ようにする。ｐｎの低速域を有する酵素をｐＨの高速域
をも有する接合物へ転化させると両遠域工程を組合わせ
ることが可能となり、これは経済的に有利である。酵素
の熱安定性も又接合によって増大される。

本発明の新規接合物は通常は水溶液中で製造される。ア
ルギネートエステルとタンパク質とのカップリング反応
はｐｕ上昇性の試薬例えばアルカリ金属の水酸化物、炭
酸塩又は重炭酸塩又はそれらの混合物により触媒される
。この反応は多価アルコール例えばグリセロール又はソ
ルビトール及びカルシウムイオンの存在下に行われる。

本発明で有用なヘテロポリマーの型は高度エステル化ア
ルキレングリコールエステル、好ましくはポリウロン酸
の１．２−プロピレングリコールエステルであって該エ
ステルばＭ／Ｇ比０．１〜１０、好ましくは０．３〜１
．５、最も有利には約１においてＤ−マヌロン酸残基と
Ｌ−グルロン酸残基とを有するエステルである。該エス
テルとしてアルギン酸エステルが例えば商標名Ｍａｎｕ
ｃｏＩＥｓｔｅｒ　Ｅ／ＲＥとして商業上入手可能であ
る。反応混合物中のヘテロポリマーエステルの水性の濃
度は、アルカリ性のｐＨに調整される直前において生物
学的活性タンパク質と混合される際に、約１〜５％　Ｗ
／ｖ１好適には約３％である。

アルカリ金属水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩或いはそれ
らの混合物はアルカリ性付与源の提供のために有利に使
用される。反応媒質のｐＨを好ましくは９．５〜１０．
５に、好適には１０．０に調節する。反応を水性媒質中
で５０℃以下、有利には周囲温度下で行うことが最良で
ある。通常の場合に反応は１〜６０分以内で、通常約１
０分間で充分に進行し、そこで媒質を中性のｐＨにまで
調節して反応を停止させる。アルカリ−不安定性のタン
パク質を使用した場合にはアルカリ性ｐＨに保つ時間を
更に短縮するのがよい。通常はｐＨを中性に調整するこ
とによって反応を終結させるけれども３〜９の範囲のい
かなるｐＨであっても差支えない。つまり反応はこれ以
上に進まず接合物は該範囲内で安定であるからである。

接合物へ転化し得る生物学的活性タンパク質の諸例は工
業的酵素例えばプロテアーゼ及び好ましくはアルカリプ
ロテアーゼ、多糖類用ヒドロゲナーゼ、リパーゼ、グル
コースイソメラーゼ、ラクターゼ、グルコアミラーゼ、
熱安定性アミラーゼを包含するアルファーアミラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びインベルター
ゼである。アミノ基封鎖用試薬を使用する実験の結果は
アルギネートエステルとタンパク質とを結合させる結合
鎖は主としてアミドであることを証明した。

例えば酵素とフルオレスセインイソチオシアネートとを
先ず反応させた場合にその有効アミノ基（複数）を封鎖
すると、それに続くプロピレングリコールアルギネート
との反応による接合物が僅かな収量で得られるに過ぎな
い。従って遊離アミノ基をもついかなる生物学的活性タ
ンパク質又は　・グリコプロティンも接合物製造のため
に使用され得る。

下記の諸例によって本発明を更に例示する。該例におい
て分析の一般的諸方法は丁亥のようにして行われた。

カルバゾール（エタノールからの再結晶、１００■）を
エタノール（分光器で検定された等級のもの、１００ｍ
β）中に溶かした。既知量（１，−Ｏｍβ）の資料（０
〜１００μｇのへキスロン酸含有）と、ホウケイ酸ガラ
ス製試験管（１２！ｘ１．５ｃＪ１１）中の６ｍβの硫
酸（Ｍ、Ａ、Ｒ，，９８％ｖ／ｖ）とを冷却下に混合し
た。これを湧水浴中におき２０分間加熱した。この溶液
を室温に冷却し０．２ｍＩ２のカルバゾール試薬を振盪
しながら加えた。室温に４５分間放置した後に５３０　
ｍｍで光学密度を測定した。標準線を作成した。

グルコースオキシダーゼ試薬によるグルコースこの検量
線作成により既知の吸収値の読みからグルコース濃度を
直接知り得ることになる。

グルコースオキシダーゼ〔黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ）　から得られたシグマケミカル社製品
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｅ、Ｃ，
１，１，３，４）；　１９５００単位／ｇｌの５０■、
パーオキシダーゼ〔西洋ワサビから得られたシグマケミ
カル社製品（、Ｅ、Ｃ，１゜１１．１．７）；　９０プ
ルプロガリン単位／■）の１０■及び２，２・−アジノ
ージ−（３−エチル）−ヘンズチアゾリンスルホン酸）
−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ、シグマケミカル社製品
）の５０■をＴＭＳ−ヒドロキシルメチル−メチルアミ
ン（ＴＳＩＳ）緩衝液（０，１２５Ｍ、ｐＨ７，０）に
より４００ｍｎに希釈した。この溶液を０℃に貯蔵した
。

Ｄ−グルコースの濃度をＴＲｌ５緩衝液中１０〜８０μ
ｇ　／　ｍ　ｉｔの範囲にあるようにした。これらの濃
度の各試料（０，０１ｍ１）を試薬（０，１ｍ１）対し
て加えた。反応混合物をグリコースオキシダーゼの適温
即ち３７°Ｃにおいて水浴中１５分間恒温保持した。各
グルコース濃度について４２０　ｎｍで吸収値を測定し
た。

発色団の最大吸収波長を４８０ｎｍから５５５ｎｍへ高
めることによりアセトアルデヒドはレゾルシノール試薬
においてフラクトースに対し干渉することが報告されて
いる。該干渉はフラクトースの一定量の存在下でのアセ
トアルデヒドの定量を可能とする。１，２−ジヒドロキ
シプロノマンは過ヨウ素酸によりアセトアルデヒドへ酸
化される。

プロピレングリコール（Ｐ、Ｇ、）に対する本測定法は
この系にもとづく。

プロピレングリコールの５〜５０μｇ　／　ｍ　（ｌを
含む試料溶液（０，１ｍｊりを（打栓試験管の中ヘビペ
ットを用いて注入し、硫１１２（６２，５ｍＭ、０．１
ｍ６）中の過ヨウ素酸溶液（２５ｍＭ）をを加えた。こ
の混合液を室温に３０分間装０てからナトリウムメタビ
サルファイト（Ｉ　Ｍ　；　０．０５ｍ１）を加えた。

５分間後にＤ−フラクトース（０，４ｍＭ、０．２５ｍ
１りを加え、続いてレゾルシノール試薬〔レゾルシノー
ルの貯Ｒ用水溶液（１２ｍＭ、１ｖｏｌ）に対しＡ、　
Ｒ，−級の塩酸（１０ｖｏｌ）を添加することによる使
用直前調製品〕の３，０ｍ４を加えた。この混合溶液を
８０℃に５分間加熱してから室温に冷し特性的赤色発色
団の吸収値を５５５ｎｍで測定した。

この方法を用いて下記の数値にもとづく標準曲線を作成
した： Ｐ、Ｇ、μｇ／ｍｊ！　Ｏ，Ｄ、５５５ｎｍ５　０．２ １０　０．２７ １６．５　０．３６５ ２０　０．３８５ ３３　０．４５ ５０　０．４７ この測定値をプロットして本質的に直線である検量線を
得たがこれは３０μｇ　／　ｍ　ｊ！よりも高い濃度で
漸近線となった。

アルファーアミラーゼ活性に対するアミロクローム試験
法 アルファーアミラーゼは青色染料に共有結合で結合して
いる水不溶性アミロースを対染料結合鎖を攻撃すること
なく可溶性サツカライドへ加水分解する。得られた青色
液の色度は試料のアミラーゼ活性と直接比例する。

試薬： （１１基質：アミロースチバクロン（＾ｍｙｌｏｓｅ−
ＣｉｂａｃｒｏｎＲ）青色Ｆ３ＧＡ リン酸塩緩衝物、ｐＨ７，０，５０ μｍｏＬ　７錠 （２）希釈剤：　Ｎａ１ｌｚＰＯ４５０ｍ　Ｍ／壜（ｐ
Ｈ４，３）。

この希釈剤をその使用前に５００ｍｎ の蒸溜水中へ加えて希釈する（“′希釈剤溶液”）。

（３）標準物：チハクロン青色Ｆ３ＧＡ、４６０　Ｕ／
１のアルファーアミラーゼに対応 基質の一錠を１ｍｊ！の蒸溜水に溶かしてからこの溶液
を５分間３７℃に加熱することにより標準溶液（標準品
）（Ｓ）を調製した。次に０．０５ｍｎの上記の標準品
を加え攪拌してよく混合し、０００合物を正確に１５分
間だけ３７℃に恒温保持した。４ｍｌの希釈剤溶液を添
加することによって反応を停止させた。この混合物を約
３０００ｒｐｒｒｌで１０分間遠心分離した。

同様にして被検溶液（被検品）（Ｔ）を調製したが但し
標準品の代わりに被検試料の０．０５ｍｌ１を加えた。

最後に標準溶液（Ｓ）及び被検（Ｔ）溶液の調製と同様
に操作し、但し夫々の標準品０．０５ｍ’／及び被検試
料を用いずに操作して盲検溶液（盲検品）（ＴＢ）を調
製した。

上澄液中の盲検品（ＴＢ）の吸収値に対して被検品の吸
収値を６２０　ｎｍにおいてを測定した。

この測定値をＡ　（Ｔ）で表す。標準品（Ｓ）の吸収値
を６２０ｎｍにおいて蒸溜水に対して測定した。この測
定値をＡ　（Ｓ）で表す。

下式を用いてアルファーアミラーゼ溶液の活性度を計算
した： 上式中ＩＵ／Ｉ（国際単位）はｌｎ１分間当りの還元基
の１μ−当量に対応する。

旦■盈二検ｌ広 希釈酵素溶液のＯ，１ｍβと可溶性デンプン（２，Ｏｍ
Ａ！、酢酸塩溶液中１％ｗ／ｖ、ｐ）１６．５．５０ｍ
Ｍ、５ｍＭ　Ｃａ　”）及び０．５．５、ＩＯ及び１５
分間の間隔で分離された各試料（０，１ｍ６）とを混合
した。この混合溶液をり。

Ｎ、Ｓ、試薬”　（１，０ｍ６）中ヘビヘットによって
注入し、８分間９９°Ｃで加熱してから冷却させ盲検試
薬に対し５２０ｎｍにおいて吸収値を読み取った。アル
ドース（１■／　ｍ　ｊ２　）標準品を各試験において
使用した。

（注）＊ＤＮＳ試薬：水酸化ナトリウム水溶液（０，４
Ｍ）中の３．５−ジニトロサリチル酸（１■／ｃＩ１１
３）、酒石酸カリウムナトリウム・４Ｈｚｏ　（３００
■／ｃｍ３）。

ＤＮＳ試薬は使用時まで光を避けて貯蔵される。

精製アルファーアミラーゼＣＢ、スブチリス（Ｂ　、　
５ｕｂｔＮｉｓ）から誘導されたもの〕の蒸溜水（２ｍ
ｌり中１％（Ｗ／Ｖ）溶液とマヌコールエステル（Ｍａ
ｎｕｃｏｌ　ｅｓｔｅｒ　Ｅ／　ＲＥ）の蒸溜水（４ｍ
ｌ）中５％（Ｗ／Ｖ）溶液とを混合した。試料（−試料
１、未反応混合物）を採取した。

次に炭酸ナトリウムの１０％（ｗ／ｖ）溶液の添加によ
り上記混合物のｐＨを１０に上昇させた。

２０分間後に酢酸（１，０Ｍ）の添加によりｐＨを６．
５に下降させた。再び試料（試料２、反応混合物）を採
取した。

各試料１及び２をセファデクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　
Ｇ−２００のコラム上に負荷してからｐＨ６，’　５の
酢酸塩緩衝液（５０ｍＭ）を用いて溶出させた。

溶出フラクションについてアミラーゼ活性を検査した（
アミロクローム検査法）。

溶出曲線の形状から未反応混合物に比し少い溶出容積で
溶出した試料２（反応混合物）のアミラーゼ活性の一部
は接合物形成によりその分子量を増加したことを示した
。

例１に記載のようにしてアルファーアミラーセー接合物
を製造しこれをセファデクスＧ−２００上で分画させた
。接合物含有フラクション（１８−４６ｍｌ）をプール
し、遊離酵素含有フラクション（４６−６６ｍ＃）をも
プールした。両方のプール液と接合物製造に使用された
アルファーアミラーゼとをＤＮＳ−検査（可溶性基質）
及びアミロクローム検査（不溶性基質）に供し、各試料
についてＤＮＳ−活性／アミロクローム−活性の比を計
算した。

アルファーアミラーゼ出発原料についての上記の比をＲ
で表す。

結果： 上記の成績は次のことを示す。即ちＤＮＳ活性の１単位
当り、遊離酵素フラクション及びアルファーアミラーゼ
出発原料と比較して接合物フラクションは不溶性基質に
対し２．７倍だけ低い活性をもつことを示す。Ｒを越え
る比は接合物が形成されたことの証拠である。

蒸溜水中ｐｉｔ　７に調整されたマヌコールエステルＥ
／ＲＥの溶液（３％、１５ｍｌに対しＢ・リヘニフオル
ミス（Ｂ、Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｆｓ）から誘導され
た熱安定性アルファーアミラーゼ（１ｍβ中の酵素含量
４ｍｇ）の粗製液体製品（５ｍｌを加えた。水酸化ナト
リウム（１，ＯＮ）の滴下により１）Ｉ＋　を１０に上
昇させた。反応過程中でｐＨが下降するのでｐＨｌＯに
３回調節した。１５分間後に塩酸（１，ＯＮ）添加によ
りｐＨを６．５に低下させた。最終容積ば２５ｍｆｆで
あった。

この製品の一試料（５ｍｌ）をセファデクスＧ−２００
のコラムにかけてから塩化カルシウム（０，０５Ｍ）を
含有する酢酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）で？容出した。２
．０ｍｌ２のフラクションを集めてこれをアルファーア
ミラーゼ活性検査に供した。

接合物含有フラクションをプールし、これを蒸留水に対
し終夜透析することにより脱塩した。次ぎにこの溶液を
凍結乾燥した。凍結乾燥物の１２曙を４ｍｇの蒸留水に
とかし、２　ｍ　ｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加え
てｐｎを１２に上げてからこの溶液を終夜放置した。放
出されたプロピレングリコールを測定した。結果はマヌ
コニルエステルＥＺＲＥ中に最初に存在したいたプロピ
レングリコールの１０％を接合物が依然として含有する
ことを示した。

例４ 接合の４の酵素：アレルギネートエステル比の変化 マキサミル（Ｍａｘａｍｙｌ　）ＬＸ　６０００　（６
０％ｗ／ｖのグリセロールとＢ、ズブチリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　）から導かれたアルファーアミラー
ゼの７５ｍｇ／ｍ７！とを有する市販液状製品の商標名
〕の４　ｍ　ｆｔに対しマヌコールエステルＥ／ＲＥ（
０，４０，８０又は１２０ｍｇ＞を添加して溶液を得た
。反応時間１５分間をかけて接合反応を例１におけるよ
うに行った。

例１記載のようにしてＤＮＳ／アミクローム比を比較す
ることにより反応生成物の接合の程度を検した。

生成アルギネートエステルが高化であることは接合の指
標であるので上記の結果はアルキネ−１〜エステル対酵
素比の高いことが接合の達成に有利であることを証明し
ている。この場合にセファデクスによる分画化の以前に
反応混合物について試験を終了していることに注目すべ
きである。

例５ 蒸留水中のマヌコールエステルＥ　／　ＲＥ　溶液（５
％智／ｖ　、２５０ｍ７りを２５０　ｒｒｉ　ｊ２のマ
キザミルＬＸ−６０００（例４参照）に対し攪拌下に徐
々に加え水酸化ナトリウム（１，０Ｍ）の添加により溶
液のｐＨをｐＨｌＯに上昇させた。反応過程中にｐＨが
９．５に下降したのでｐＨｌ。

へ２回調整した。４５分間後に塩酸（１，０Ｍ）の添加
によりｐＨを６．５に調整した。最終容積は６００ｍ１
であった。

この製品の試料（１，９ｍｘ）をセファデクス（、−２
００のコラムにかけてから塩化カルシウム（０，０５Ｍ
）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出した。接合物
含有フラクション（複数）をプールして熱安定性試験（
例６参照）に使用した。

■−ニ −１四り１ニラソいと一旦接澄１塁１すｌ動延皿定マ牛
すミルＬＸ−６０００及びそれとマヌコールエステルＥ
／ＲＥとの接合物の相対的熱安定性を検するために０．
０５Ｍの塩化カルシウムを含有する大過剰量の蒸留水中
トウモロコシデンプン懸濁液〔３％（ｗ／ｖ））と酵素
とを混合し炭酸ナトリウムでｐｔ＋を６．５に８周節し
た。

この混合物を７０℃、８０℃及び９０℃に４０分間恒温
保持した。試料を取出してグルコースオキシダーゼ法に
よりグルコース含量を検査した。

遊離グルコース量は酵素製品の活性の尺度である。

結果＝　（７０℃における活性の百分率で表す）上記の
接合物は、マキサミルＬＸ６０００に比し接合物の高温
下の活性保有率が改善されていることを証明している。

例７ アミラーゼ接合物のｐｌ＋活性 アミラーゼ−アルギネートエステル接合物を製造しこれ
を例１記載の通りにセファデクス上で精製した。

出発原料（精製アルファーアミラーゼ）及びその接合物
を可溶性デンプン（５ｍＭのＣａＣｊ２　ｚ含有）の３
％（ｗ／ｖ）溶液と共に、各種ｐＨ値において、４０分
間８０℃に恒温保持した。グルコースオキシダーゼ法に
従い試料についてグルコース量を検した。

結果： 通常のアルファーアミラーゼと比較するとアルファーア
ミラーゼ接合物のｐｌ＋活性曲線は高いｐＨ値の方へ移
動している。

例８ プクノニリム何４会 マキシラクト（Ｍａｘｉｌａｃｔ　ＲＬＸ　５０００）
〔酵母クルイベロミセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ　）から誘導されたラクターゼの
グリセロール含有液状市販製品〕の５ｍｆに対し蒸留水
中６％１ｗ／ｖ）マヌコニＪレエステルＥ／ＲＥ？容液
の５　ｍ　Ｉｔを加えた。

この混合物を１０℃に冷やし１．０Ｍの水酸化ナトリウ
ムの添加によりｐＨ値を１０．２に上げた。

この混合物を１２分間攪拌してから１．０Ｍの塩酸添加
によりｐＨ５，２に下げ、０　、２　Ｍ　ＮａｚｌｌＰ
Ｏ４使用で最終的にｐＨ６，９５に調整した。

最終混合物の一試料を蒸留水で希釈（５Ｘ）Ｌ、セファ
ローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　Ｂ　（商標名）のコ
ラム（床容積３６．４ｍり上に負荷した。このコラムを
４℃でリン酸塩緩衝液ｐＨ７（０，１Ｍ）を用いて溶出
した。フラクションを集めてラクターゼ活性とアルギネ
ート含量（カルバゾール検査法）とについて検査した。

マキシラクトＬＸ５０００とナトリウムアルギネートと
の混合物についても又セファローズＢ分画化（アルギネ
ートエステル試験を除く）を行った。その結果次のこと
が示された： ラクターゼ活性を有するフラクションは単一のピークと
して溶出された；ナトリウムアルギネート（これはアル
カリ性条件下でアルギネートエステルから形成される）
はこの溶出態様を変えない；接合の後には酵素活性フラ
クションは２個の別個のピークを持つものとして溶出さ
れ、アルギネートもそうである；第１の活性部分ピーク
は最初のアルギネートのピークと一致するがこれは接合
物形成を示す；この結論は第２の活性部分ピーク（未接
合酵素）と第２のアルギネートのピーク（未接合アルギ
ネート）と一致しないことによって強調される。

例９ 挟入ラクターゼのｐＨ活性の測 各種のｐＨ値における相対的活性を次のものについて測
定した： 例８で得られた反応混合物； マキシラクトＬＸ５０００及びマヌコールエステルＥ／
ＲＥの未反応混合物。

測定結果をｐＨ６における活性度の百分率で表す： 上記の結果は接合製品がｐＨ値の高い方へ移動する傾向
をもつことを示している。

例１０ 人マキシラクトＬＸ５０００の熱安定性マヌコールエス
テルＥ／ＲＥ　（５００ｍｇ）を１５ｍｔｌのマキシラ
クトＬＸ５０００にとかした。

この混合物の一部を後の試験のために保留した。

残部を１０℃に冷やし、０．４ｍｍ！のＩＭのＮａＯＨ
を加えてｐｌｌを１０．３５へ上げた。１０分間攪拌後
に０．４ｍＡのＩＭのＩＩ（ｌ添加によりｐＨを６．７
５に下げ、０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ７、
ｏに調節した。

反応混合物（未精製）と未反応混合物とを共に蒸留水で
希釈して４４℃に恒温保持した。０．５．１０．１５．
２０及び３０分間の後に試料を取り、残留ラクターゼ活
性を測定した。

結果を０分間の恒温保持後の残留活性に対する百分率と
して表した数値を次表に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１水溶性で生物学的活性を保持する接合部において
   、該接合物が（１１第１級アミノ基を有する生物学的活
   性タンパク質又はグリコプロティン、（２）Ｄ−マヌロ
   ン酸及びＬ−グルロン酸、好ましくはアルギン酸のヘテ
   ロポリマー、及び（３）アルキレングリコール、好まし
   くは１．２−プロピレングリコールの残基（複数）を有
   し、この接合物が“アミドおよび任意にエステル結合を
   介して残基（１）に結合すると共にエステル結合を介し
   て残基（３）に結合する残基（２）″を有し、この接合
   物が該タンパク質又はグリコプロティンの生物学的活性
   を示すことを特徴とする上記の水溶性生物学的活性接合
   物。 （２）　タンパク質が酵素、好ましくは熱安定性アルフ
   ァーアミラーゼ、ラクターゼ、グルコアミラーゼ又は高
   アルカリプロテアーゼを包含するアルファーアミラーゼ
   である特許請求の範囲第１項記載の水溶性生物学的活性
   接合物。 （３）　水溶性で生物学的活性を保持ずろ接合物の製法
   において、第１級アミノ基含有の生物学的活性タンパク
   質又はグリコプロティンとＤ−マヌロン酸及びＬ−グル
   ロン酸のヘテロポリマーの水溶性アルキレングリコール
   エステルとを水性媒質中で混合し、媒質のｐ）ｌを９．
   ５〜１０゜５の充分で好適なｐＨ範囲に上昇させてエス
   テルのエステル基とタンパク質まアミノ基との部分的で
   不完全な反応を起こさせ、次いで該媒質のｐＨを好まし
   くは３〜９に下降させて反応を終結させることを特徴と
   する特許請求の範囲第１又は２項記載の水溶性生物学的
   活性接合物の製法。 （４）水性媒質中のアルキレングリコールエステルの最
   初の濃度が約１〜５％ｗ　／　Ｖ　ｓ好ましくは約３％
   ｗ　／　ｖである特許請求の範囲第３項記載の製法。 （５）酵素−基質反応を生起させる方法において、特許
   請求の範囲第２項記載の接合物と該接合物の酸素に対す
   る基質とを接触させることを特徴とする上記の方法。 （６）　未接合酵素に最適な温度よりも高い温度の下で
   接合物と基質とを接触させる特許請求の範囲第５項記載
   の方法。 （７）未接合酵素に最適なｐＩＩ値よりも高いｐｔｔ値
   において接合物と基質とを接触させる特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。