JPS6025117B2 - 菌体酵素の固定化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は菌体酵素（酵素を菌体内に蓄積し、その菌体自
体を酵素剤として用いることができる菌体）から、粒状
の固定イは酵素を製造する方法に関するものである。

園定イは酵素は近年その反復使用性、安定性の増大によ
る長期使用が可能となる事や、粒状化する事によりカラ
ム等に充填し連続的酵素反応が可能である事による経済
的利点を認められ、種々の方法が考案されている。本発
明者等は、菌体酵素に着目し、これを粒状化した上菌体
内に酵素を固定出釆れぱ、酵素だけを分離して不溶性担
体に固定化するよりも経済的であるし、又上記の様に工
業的に連続反応が可能となるため、反応時間の短縮（装
置の縮小化）、製品の着色防止等の精製工程の簡素化等
が可能と考え、研究した結果本発明を完成した。

例えば菌体酵素であるグルコース・ィソメラ−ゼはそれ
自体は通常数ミクロンの大きさの菌体として販売されて
おり、かつ圧縮性であるためカラム等に充填して使用す
ることは不可能であり工業的にはバッチ（鞄ｔｃｈ）方
式にて使用されている。

バッチ方式にて異性化糖（Ｈｉ亀ＦｍｃｔｏｓｅｓＭｏ
ｐ）を作る場合、経済性を考慮し反応時間は２４〜４８
〜こも達する。そのため製品の着色が起りまた大規模な
装置が必要である。そこでもし菌体酵素があるグルコー
ス・ィソメラーゼをカラム等に充填し連続的に反応出来
れば反応時間は短縮され、従って着色度も減少し装置も
小型化する。そこで本発明を具体的に説明すると、まず
菌体酵素を高分子凝集剤水溶液中に添加し凝集され。菌
体酵素を例えばグルコース・ィソメラーゼ生産菌例えば
ストレプトマイセス・フェオクロモゲヌス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｐｈａｅｏｃｔｒｏｍｏ鉾ｎ瓜）徴工研
菌寄 Ｎｏ．２２１号ストレプトマイセス・フラジユ （Ｓｔ．ｆｒａｄｉａｅ） 徴工研菌寄 肘．２２０ ストレプトマイセス・アルプス （Ｓｔ．ａｌｂｕｓ） ＡＴＣＣ ２１１３２ の菌体、アルファ一・ガラクトシダーゼ生産菌例えばモ
ルチエレラ・ビナケア・ヴアリアソト・ラフイノースユ
ーテイライザー （ｍｏｍｅｒｅｌｌａｖｉｎａｃｅａｖａｒ．ｒａｍｎ
ｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ）ｌＡＭ１８０１１ アプシディア属しフレクサ・ファン・ティゲム（ａ戊ｉ
ｄｊａｒｅｆｌｅｃａｖａｎＴｉｅ鱗ｅｍ）ｍ０粥７４
の菌体等がある。

なお、糸状菌、放射菌以外の菌体酵素を使用する場合は
良好な結果が得られない。

高分子凝集剤としては、キトサン、アルギン酸等分子量
数千以上の高分子物質であるが、好適な例はキトサンで
ある。

キトサンは「かに」や「えび」の甲ら中のキチンより作
られる無毒性の分子量１０万〜４０万程度の高分子物質
であり、通常蛋白質を凝集させ、蛋白質の固収又は炉過
性の向上等の目的で使用されている。キトサンの濃度は
通常０．２〜１．５％、好ましくは０．７〜１．２％で
ある。又菌体酵素はアセトン等により脱水し乾燥した物
が望ましいが、乾燥しなくても差支えない。温度は常温
で良く凝集塊は添加後１〜２分で生成する。この凝集塊
はキトサンの濃度が高い時は塊整数センチメートルもの
大きさに達し、この様に塊が大きすぎる時には、例えば
ホモジナィザー等で分割し適当な粒径にする。次に必要
があれば凝集物溶液と凝集塊を炉過等の方法で分離し、
適当な有機溶媒中に凝集塊を入れ、さらに架橋剤を添加
して良く鷹拝し、架橋反応を行う、この場合有機溶媒と
してはアセトン又はアセトン水溶液が好適な例である。
その理由はアセトンが架橋剤と菌体の反応を促進するか
らである。例えばアセトンを使用しないでグルタルアル
デヒドを用いて、水溶液中で、架橋反応させた場合反応
の要する時間は数倍となる。一方アセトン水溶液中で架
橋反応させた場合水はキトサンの溶解液を増大させるた
め、架橋剤と高分子凝集物の反応を促進させるという効
果がある。架橋剤としては高分子凝集物例えばキトサン
のアミノ基や蛋白質中の活性基と反応が起りやすいグル
タルアルデヒド、イソシアナート化合物（例えばへキサ
メチレン、ジィソシアナート）が良い。安井橋剤濃度は
０．０３〜１．０夕／夕−ｃｅｌｌ（Ｄひ）で良く望ま
しくは０．０６〜０．６夕／タｃｅｌｌ（Ｄび）である
。

架橋反応の温度、時間はァセトン又はアセトン水溶液中
で０〜２５ｑｏ、１３６〜１２０分で良いが望ましくは
１０〜２０℃、３び分〜６０分である。架橋反応終了後
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．劫寸近）、蒸留水等で洗
浄し、アセトンにより脱水乾燥又は別の適当な方法で乾
燥する。この様にして出来た固定イは酵素は球形または
粒状で適度な強度をもっている。グルコース・ィソメラ
ーゼを上記方法にて固定化した場合、見掛けの活性回収
率（粒状となっているため拡散抵抗値のため真の活性で
はない）は３０〜５０％である。又上記固定化法におい
て高分子凝集物溶液中にアルブミン等の水溶性蛋白質を
添加すると活性の回収率は２０〜３０％上昇し粒子の強
度も増大し好ましいことを見出だした。上記固定化法に
おける固定化作用を推定するにまず高分子凝集物の作用
により菌体が凝集し（イオン的結合と推定する）次に変
節橋剤とキトサンのアミノ基、菌体構成蛋白質中の活性
基、酵素蛋白質中の活性基等が反応し、架橋構造を作る
事により固定化されるものと思われる。

これまでに菌体自体を架橋反応させ固定化する事は公知
であるが（例えば袴開昭５０一１４０６８０）高分子凝
集物を作用しないで固定化した場合は粒状になりにくい
かまたは粒状にあったとしてもその割合が少なくカラム
に充填して連続的に基質溶液を通液することが困難であ
る。前記の様にして粒状化する事は工業的に多大の利益
が有る。例えばグルコース・ィソメラーゼを前記の様に
して固定化し内径２．０弧のジャケット付カラムに充填
し、温度６５ｑｏ、基質（グルコース）濃度４の重量％
（比重１．１８）、空間速度（Ｓ．Ｖ．）半０．５で通
液したところ、実施例に示す如く２１日間ほとんど異性
比率の低下は認められず、反応液の着色の度合もバッチ
法に較べ、１′６〜１／１０に減少した。またバッチ法
の場合熱安定化剤としてＣｏイオンを添加する必要があ
るが、本発明による固定化酵素を使用しカラム法にて異
性化糖を作る場合には必ずしもＣｏイオンを必要としな
い。

Ｃｏイオンは毒性が有り、工業的に異性化糖製造時には
イオン交≠鰯樹脂等で除去しているのが現状である。し
かるに本発明の様にＣｏイオンを添加せず異性化出釆れ
ば工業的利益は多大である。以上は主に繭体酵素として
グルコース・ィソメラーゼ、高分子凝集物としてキトサ
ンを使用する場合について述べたが、他の菌体酵素「例
えばビート糖蜜（氏ｅｔｍｏｌａｓｓｅｓ）中のラフィ
ノース分解に、工業的に使用されている菌体酵素Ｑ−ガ
ラクトシダーゼ」や他の高分子凝集剤を使用して本発明
法により粒状団定イ技酵素を作り得る事は明らかである
。

その結果反復使用性（持続性）の増大反応時間の短縮等
により工業化する場合の経済性が向上する。なお、例え
ばモルチェレラピナケャの含有する酵素Ｑ−ガラクトシ
ダーゼによるラフィノース分解の至過ｐＨは約４．０で
あるが本発明の方法によって固定化された菌体酵素は至
過ｐＨがこれよりも上昇する傾向がある。

このことはビート糟蜜中の庶糖が低いｐＨによって加水
分解されるのを防ぎながらラフィノースのみを効率よく
分解るために非常に大きな効果となる。これは本発明の
方法だけによって可能であり、単に菌体を凝集させるの
みとか架橋剤のみで固定化した場合には得られない効果
と考えられる。また、本発明の園定イは酵素を使用した
場合基質溶液中に存在するィンヒビターの作用が軽減さ
れるという効果もある。

０ 則ち、阻害物質である重金属イオン、例えばＣｕ十
十等は高分子凝集剤とキレート結合により結合し阻害作
用が軽減される。

また、架橋剤で架橋させることなく、凝集物をカラムに
充填し、基質溶液を通液した場合は架橋した場合に比較
して凝集物の強度が弱いため短期間のうちに凝集物が破
砕され、基質溶液が通らなくなってしまう。

しかしながら本発明ではこのようなことは見られず長期
に渡って通液できるのは架橋剤が凝集剤、菌体酵素の菌
体および菌体内酵素と反応することにより酵素が強固に
固定化されるためと考えられる。また、高分子凝集物に
よる凝集を行うことなく架橋剤で菌体酵素を架橋した場
合は形態が菌体そのままであるため、菌体が微細である
こと、圧縮性であることなどにより、カラムに、固定化
した菌体酵素を充填し、これに基質溶液を連続的に通液
することはほとんど不可能である。

しかしながら本発明によれば高分子凝集物が菌体酵素と
反応することによって菌体がブロック状に強固に凝結し
、これに架橋が行われるため、非常に安定性のある固定
イは酵素が得られる。実施例 １ 菌体酵素として市販の凍結グルコース・ィソメラーゼ含
有菌体約９２夕をアセトンいて脱水乾燥した菌体４０夕
を１．０％のキトサン溶液（ｐＨ４．６）１そ中に燈拝
しながら添加した。

１〜２分後菌体は凝集し粒径数センチメートルに達した
、これをホモシナイザーにて粒径数ミリメートルまで細
かくしサラン網にて炉適した。

生じた粒状のグルコース・イソメラーゼ含有菌体を５０
％アセトン水溶液中に入れ、さらに２５％グルタルアル
デヒド溶液８５の‘を加え、１７０で８０分縄拝しなが
ら架橋反応を行った。反応終了後炉過し、反応物を水道
水で１回、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗
浄し固定化酵素１２８．７夕（Ｗｅｔ）を得た。活性の
回収率は３６．２％（粒状で測定）、４２．９％（すり
つぶしして測定した場合）であった。上記の固定化グル
コース・イソメラーゼ６１．０夕を内径２．０肌のジャ
ケット付カラム（ｃｏｌｕｍｎ）に 夕つめ（氏ｄ ｖ
ｏｌ ９２の【）６５００にて下記の基質溶液を通液し
異性化率、通液速度を糠度計により測定した。

結果を図一１に示す。基質溶液 グルコース ４０Ｗ／
Ｗ（％）ＭｇＳ。

４ ５の皿 ＺＰＨ
８．２０通液条件は図に示す通りである。

図一１に示す様に２１日間の異性化率の減少はほとんど
僅かである。

従って、固定化グルコース・ィソメラーゼの反復使用性
（持続性）は飛躍的にＺ増大した事が判る。又異性化反
応がバッチ法で２０時間で終了するよう凍結菌体酵素を
添加し、（１２夕−凍結菌体酵素／２００夕・グルコー
ス）異性化した時の着色の度合を４２肌山にて光学密度
（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉ〇）を測定し次式により算
出した。１０００×０．Ｄ． 糠液色価（ＡＩ．）＝１．２ｘＢｘ／１００ｘＩＢｘ：
プリツクス１：セル長さ（肌） ＯＤ：光学密度 比較表を表−１に示す 表−１ 注 ２肌ｒ反応後酵素を遠心分離し同酵素を反復使用し
た。

表−１より着色の度合が大約１／６〜１／１０に減少し
ている事が判る。

なお活性の測定は、グルコ−ス濃度ＩＭ、ＣＯＳｏ４濃
度０．０００８Ｍ、ＭｇＳｏ４濃度０．００５Ｍ、の燐
酸塩０．０９Ｍ（ｐＨ７．２）の溶液に一定量の酵素を
入れ（総量１００夕）振溢しながら、７０℃で、２０分
間反応させ生じたフルクトースを測定した。この測定法
は以下同様に測定した。実施例 ２ 実施例１においてグルタルアルデヒドのかわりにｐート
ルイレンジイソシアナートｉｏ凧【を加え３０分間架橋
反応を行い反応溶媒をァセン５００の‘とする以外は実
施例１と同様にして固定化グルコース・ィソメラーゼを
得、さらにアセトンで脱水後風乾して乾燥固定化グルコ
ース・ィソメラーゼ６０．７夕を得た。

活性の回収率は４６．３％（粒状のまま測定したので見
掛上）であった。上記固定化グルコース・ィソメラーゼ
４０夕を実施例１と同様に異性化反応を行った。その結
果を図一２に示す。実施例 ３実施例２においてｐ−ト
ルィレンジィソシアナート１０叫のかわりに２５％グル
タルアルデヒド１０の【、ｐートルイレンジイソシアナ
ート５の【を加えること以外、実施例２と同様にして乾
燥固定化グルコース・ィソメラーゼ５９．５９を得た。

活性の回収率は４４．３％（見掛上）であった。又実施
例２と同様４０夕をカラムにつめ異性化テストを行った
がその結果を図一３に示す。実施例 ４ 乾燥グルコース・ィソメラーゼ含有菌体３０夕を０．７
％のキトサンと０．３％のアルブミン（卵）また０は０
．３％のコラーゲンを含んだ溶液１そ中に蝿拝しながら
添加し、粒径数ミリメートル程度に菌体酵素を凝集させ
た。

実施例１と同様に炉過し、グルタルアルデヒド（２５％
溶液）６０の上を含んだアセトン５００叫中に入れ、燈
拝しながら１７ｑ０で、１．０時夕闇反応させた。対照
としてアルプミンまたはコラーゲンを含まない１．０％
キトサン液を使用して同様に処理した。活性の回収率を
下表に示す。

※ すりつぶして活性を測定したので粒径による影響は
ない。

上表よりキトサン溶液中に水溶性の蛋白質、アルブミン
、やコラーゲンを添加すると活性の損失が少ない。

しかも粒子の強度が増加することが認められた。異性化
率の経時変化は図−４に示した。実施例 ５ 架橋反応時の溶媒の効果。

実施例１と同様にして得られたグルコース・イソメラー
ゼ固定化菌体酵素と、架橋反応時の溶媒を水のみ又はア
セトンのみを用いて行って得られた固定化菌体酵素の比
較を下表に示す。これによれば前記の様に５０％アセト
ン水溶液が最も効果がある事が判る。なお下表は実施例
１と同様の方法でカラムに固定化菌体酵素を充填し、２
１日間ぶどう糖液を通液し異性化反応を行った結果であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第３図は本発明に基いてそれぞれ異なる架
橋条件で製造した固定化グルコースィソメラーゼをつめ
たカラムにグルコース溶液を通液したときの異性化率の
経時変化を示す図、第４図は本発明に基いて水性蛋白質
を含む高分子凝集物水溶液を使用して製造した固定化グ
ルコースィソメラーゼをつめたカラムにグルコース溶液
を通液したときの異性イＧ率の鰹時変化を示す図である
。 第１図第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌体自体を酵素材として用いるいわゆる菌体酵素を
   高分子凝集剤水溶液中で凝集させ、菌体酵素の凝集物を
   適当な粒径に分割しまたはすることなく、また高分子凝
   集剤水溶液中から菌体酵素の凝集物を分離しまたは分離
   することなく、有機溶媒又は有機溶媒水溶液と混合して
   、次いでこれにグルタルアルデヒド又はイソシアナート
   化合物又はこの両方を添加して架橋反応を行わせること
   を特徴とする菌体酵素の固定化法。 ２ 菌体酵素が放射菌又は糸状菌に属する菌体生産の菌
   体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 菌体酵素がグルコース・イソメラーゼ生産菌の菌体
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 菌体酵素がα−ガラクトシダーゼ生産菌の菌体であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 高分子凝集剤がキトサンである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ６ 有機溶媒又は有機溶媒水溶液として、アセトン又は
   アセトン水溶液を使用する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ７ 菌体自体を酵素剤として用いる所謂菌体酵素を高分
   子凝集剤と水溶性蛋白質とを含む水溶液中で凝集させ、
   菌体酵素の凝集物を適当な粒径に分割し又は分割するな
   く、また当該水溶液から菌体酵素の凝集物を分離し又は
   分離することなく、有機溶媒又は有機溶媒水溶液と混合
   し、次いでこれにグルメルアルデヒド又はイソシアナー
   ト化合物又はこの両方を添加して架橋反応を行わせるこ
   とを特徴とする菌体酵素の固定化法。 ８ 菌体酵素が放射菌又は糸菌状に属する菌体生産の菌
   体である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 菌体酵素がグルコース・イソメラーゼ生産菌の菌体
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０ 菌体酵素がα−ガラクトシダーゼ生産菌の菌体で
   ある特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１ 高分子凝集剤がキトサンである特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 １２ 有機溶媒又は有機溶媒水溶液として、アセトン又
   はアセトン水溶液を使用する特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 １３ 水溶性蛋白質がアルブミン又はコラーゲン又かこ
   の両方である特許請求の範囲第７項記載の方法。