JPS60256379A - ウイルスの濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、流体からウィルスを濃縮するため′）　の
新規な方法に関する。さらに詳しくは、この発明は汚物
及び生物学的流体からウィルスを濃縮するための新規で
簡単な方法に関する。

〔従来技術〕

流体からのウィルスの濃縮は一般に大容量の流体から行
われ、この目的は、可能な数の組織培養プレートを用い
て日常的方法によシウイルスを容易に計数することが可
能な小容量の流体を得るととである。水から種々のウィ
ルスを濃縮するための幾つかの方法が示唆されている。

濃縮のための公知の方法から次の方法を挙げることがで
きる。

すなわち、アルギン酸膜濾過、プロタミン沈澱、水抽出
（ｈｙｄｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　）、２層分離、限
外濾過、水酸化アルミニウム吸着、ポリ電解質吸着、及
び吸着溶出法による濾過とそれに続く有機凝集である。

最も頻繁に使用されるのは最後に記載した方法であって
、この方法においては溶出段階が塩基性蛋白質性溶液、
例えばグリシン緩衝液、トリプトースホヌ７エートブロ
ス（ｔｒｙｐｔｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｒｏｔｈ
　）、トリグチカーゼソイプロス（ｔｒｙｐｔｌｃａｓ
ｅ曵 ｓｏｙ　ｔｒｏｔｈ）、ウシ胎児血清、及び牛肉エキス
の使　）用を含む。最後に記載した溶出剤はＵＳ　ＥＰ
Ａマニーアル−フォア・ピロロジー（ＵＳＥＰＡ　ｍａ
ｎｕａｌ　ｆｏｒｖｓｒｏｌｏｇｙ）（ペルグ及びサフ
ァーマン、１９８３）を用いる実験室研究において最も
頻繁に使用されるものである。

牛肉エキスを用いる方法は、吸着−溶出法の後の有機凝
集法において牛肉エキス３％を使用する方法から成る。

しかしながら、種々の市販の肉牛エキス製品は、ｐＨ３
，５で有機凝集体を形成するその性質のために、ウィル
ス再濃縮の異る収量を達成する。このタイプの市販製品
は製造工程において必要な特別の処理にかけられ、この
ために有機凝集のために不適当なものとなる。

赤血球細胞を用いるウィルスの小規模濃縮も報告されて
おシ、この方法は赤血球凝集相互作用又は受身赤血球凝
集のいずれかに基礎を置く。血球凝集は、接種された胚
化卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ　ｅｇｇ）からの液を試
験するため、ミキソウイルスの検出のために広く使用さ
れている。ウィルスの血球凝集性はまた、ウィルスのグ
ルーグ又はサラグループを記述する場合に有用であるこ
とが証明されている。

幾らかの血液凝集ウィルスは吸着のために最適でない条
件下で赤血球から溶出するので、比較的単純な技法でウ
ィルス懸濁液を精製しそして濃縮することが示唆されて
いる。多くのウィルスが４℃において全赤血球（ｗｈｏ
ｌｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）に吸着されそして３７
℃において溶出し、そしてこの逆方向も生ずる。しかし
ながらこの方法は、非常に少量の液体を処理する場合に
のみ使用することができる。さらに、水量の差が、浸透
圧の観点から、全赤血球の使用に対抗する。血球溶解及
び血球凝集性の喪失のためである。

受身血球凝集測定は最初ウィルス抗体を検出するために
使用され、そして後で種々のウィルス抗原及びそれに対
する抗体に拡張された。試験抗原は一般に粗ウィルス標
品、例えば組織培養ホモジネート及び感染性尿液（ｉｎ
ｆｅｃｔｉｖｅ　ａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｆｌｕｉｄ）で
あった。血球凝集終点とウィルス粒子の絶対数との量的
関係を測定する試みは確定的になっていない。さらに１
全赤面球の血球溶解のため、ウィルスの大規模濃縮のた
めには一般的に使用することができない。上に挙げた特
定の方法のそれぞれが有する種々の欠点のほかに、濃縮
されるべき異るウィルスに高い親和性を有する新たな吸
着側斜が次々と見出され、そして特定のウィルスについ
て示唆される。これらすべての公知方法の主たる欠点の
１つは、ウィルス濃縮効率が変化することである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明は、ウィルスを濃縮するための簡単な方法を提
供することを目的とする。この発明の他の目的は高い効
率でウィルスを濃縮するための簡単な方法を提供するこ
とである。この発明の他の目的は広範囲のウィルスを濃
縮するための簡単な方法を提供することである。

〔問題点を解決するだめの手段〕

従ってこの発明は、液体汚物及び生物学的流体会　から
ウィルスを濃縮する方法であって、（ａ）　前記ウィル
ス含有流体を動物赤血球ゴースト細胞を含んで成る吸着
剤マトリクスと接触せしめ： （ｂ）　段階（、）において得られてマトリクスを酸性
化することによって、前記動物赤血球ゴースト細胞上に
吸着されたウィルスの沈澱を分離し；そして （ｃ）　段階（ｂ）において得られた沈澱を段階（ｂ）
におして一般的であるーよシ高い−を有する溶液により
溶出し、そしてウィルス濃縮物を得る：段階を含んで成
る方法からなる。吸着剤マトリクスは粒状固体粒子又は
連続フィルムのいずれの形で存在することもできる。粒
状固体粒子の場合、吸着剤マトリクスはカラム中のべ、
ドとして又はカートリッジとして存在することができる
。さらに、ガラス又はグラスチックビーズのごとき適当
な支持体上に被覆された形で吸着剤を使用することも予
想される。吸着剤の粒子サイズは広範囲でよく、一般に
１〜２０ミクロンの範囲が好ましい。

脳。

メンプランのごとき連続フィルムの形で動物赤血球ゴー
スト細胞を使用するのが特に好ましい。

この発明の好ましい態様に従えば、動物赤血球ゴースト
細胞上に吸着された沈澱したウィルスの溶出は６５よシ
高い−の緩衝液によシ行われる。

この方法においてウィルス濃縮の効率は最高となる。最
も好ましい緩衝液は声が約７．５のリン酸緩衝塩（ＰＢ
Ｓ）溶液である。

この新規な吸着剤マトリクスの利点を次のように挙げる
ことができる。

Ｏウィルス濃縮の高収量が達成される。

０赤面球ゴースト細胞が非常に安定であシ、そしてこの
ために劣化することなく多数回の吸着−溶出サイクルに
耐える。

０吸着マ）　ＩＪエクス広範囲のウィルスを濃縮するた
めに使用することができる。

従来技術の試みと異シ、赤血球ゴースト細胞を用いるこ
の発明の方法には血球溶解の危険が含まれない。赤血球
ゴースト細胞は容易に調製される。

この簡単な調製方法はＫａｂａｔにより〔エクスペリメ
ンタルーイムノケミストリー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｙｓｔｒｙ）、Ｔｈｏｍａｓ　
Ｐｕｂ、社、第２刷、１９６１．１１０頁〕に記載され
ている。この方法は、血球溶解の後、４℃にてＣ０２で
飽和した大容量の蒸留水から赤血球ゴースト細胞を集め
ることから成る。得られたものを次に遠心分離しく好ｉ
　：　１ｏ、ｏｏｏのナトリウムエチルマーキュリ−チ
オサリチレートを含有する塩溶液中に懸濁し、そして冷
蔵庫に保存する。ゴースト細胞の固定は３チのホルムア
ルデヒド及びリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）（０，０１Ｍ
）Ｖｃよシ達成する。この比率は１：５：５（ＩＡの赤
血球ゴースト細胞＋５ｊのホルムアルデヒド＋５にのＰ
ＢＳ　）とする。この混合物を連続振とうしながら３７
℃にて一装置く。固定した後、ゴー７ト細胞を再度遠心
分離し、塩溶液（０８５重量％）で洗浄して過剰のホル
ムアルデヒドを除去する。微生物的損傷を防止するため
にナトリウムアジドのごとき防腐剤をコ゛−ヌト細胞ス
トックに加える。赤血球ゴースト細胞を使用する直前に
塩溶液で再度洗浄する。

この発明の方法は広範囲の温度において、好１しくは４
℃〜３７℃の温度範囲において行うことができる。この
知見は、吸着剤表面上での蛋白質の展開が吸熱反応であ
るために温度の上昇が吸着を増加するＣＺｉｔｔｌｅ　
Ｃ，Ａ、、１９５３、アトパンシス・イン０エンチモロ
ノ−（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）４４：３１９）という従来技術の記載と対立する。

動物赤血球ゴースト細胞の濃度は広範囲に選択すること
ができ、好ましくは４〜３０容量チの範囲である。４％
未満では濃縮効率のわずかな低下が生ずるようであり、
他方３０％よシ濃くしても濃縮効率の改良は得られない
。

この発明の方法は、なんらの特別の装置を必要とするこ
となく非常に簡単に実施することができる。この発明の
動物赤血球ゴースト細胞法を用いる吸着−溶出サイクル
は次の段階を含む。

段階１゜ 所定濃度の動物赤血球ゴースト細胞を収容する翳　試験
管に、既知量のウィルス／バクテリオファージを接種す
る。溶液の−は６．０〜７．５の間にある。

以下余白 段階２゜ ０、１　Ｎ　ＨＣノの溶液を用いてサンプルの−を３．
５に低下させ、そして混合物を約１０分間振とりする。

混合物を約１０分間遠心した後、動物赤面球棄てる。

段階３゜ 段階２において得られた沈澱は動物赤血球ゴースト細胞
をその上に吸着されたウィルスと共に含有する。この沈
澱を攪拌下で約ｐＨ７，５のＰＢＳに再懸濁する。

以後に、モデルとしてバクテリオファージφＸ−１７４
、ＭＳ−２及びｆ２を用いて、例によシこの発明を説明
するが、この発明がこれらのファー・ゾに限定されるも
のでないことを明確に理解すべきである。周知の通シ、
これらのウィルスは高価でなくそして不利な周囲条件に
耐性を有しその増殖が急速であるため、水中の腸内ウィ
ルスの研究のためのモデルとして頻繁に使用される。こ
れらはまた、ウィルス性汚染示指物としても使用される
。この発明は次の例の詳細に限定されないこと、及びこ
の発明はその本質的属性を逸脱することなく他の特定の
形態で具体化され得ることは当業者にとって明らかであ
シ、そしてそれ故にこれらの例はあらゆる観点において
例示的であυそして非限定的である。

実験の部 吸着−溶出サイクルに関する段階において７アージを測
定した。

（ａ）　動物ゴーヌト赤血球細胞を含有するサンプルに
ウィルス／ファージを接種した直後。

（ｂ）　遠心分離後ｐＨ３，５の上清相〔上記段階（２
）〕から採取。

（ｃ）沈澱にＰＢＳ溶液を加えそして均一に分散させた
後、−約７．５において段階（３）から採取。

同時に平行して、動物赤血球ゴースト細胞を用いないで
塩溶液中ファージを用いて対照実験を行った。バクテリ
オファージを、それが低張溶液中で受けるかもしれない
浸透圧ショックから保護するため、すべての実験を塩溶
液中で行った。表中に示される結果は重量％として表示
され、次の様にして計算した。

ａ″と標記される段階１のファージカウントは０チ吸着
を示し、そして次の式： として与えられ、他方溶出は次の式： ｃ×１００ で与えられる。式中すは段階２の上清相中のファージカ
ウントであり、そしてＣは段階３の懸濁液中のファージ
カウントである。

下記の例の表に示す結果は上記の式に従って計算したも
のである。

例１ それぞれ５ｍｌの蒸留水及び５−の塩溶液（０，８５％
）中メンプランの形の！５％ブタ赤血赤面−スト細胞の
混合物２種類を、感染水中に存在する３種類のバクテリ
オファージφＸ−１７４、ＭＳ−２及びｆ２の吸着−溶
出サイクルのために使用した。得られた結果を、対照と
して牛肉エキス（３重量％）及び塩溶液を用いた結果と
共に次の第１表に示す。

以下余白 上の第１表に示される結果から次の結論を導くことがで
きる。

（１）吸着及び溶出効率は、塩溶液中又は蒸留水中の上
記すべてのファージについて実質上１００チであるが、
３％牛肉エキスについてはそうではない。

（２）吸着及び溶出の効率はＰＨ（３，５〜７．０の範
囲）によって影響されず、３％牛肉エキスを用いて得ら
れた結果と対照的である。

（３）３％牛肉エキスを用いて得られた吸着及び溶出効
率は牛肉エキスの供給源に強く依存するが、この発明の
動物赤血球ゴースト細胞を用いる方法においてはそうで
ない。

旦又 ５ｄの塩溶液（０，８５％）中メンプランの形のブタ赤
血球ゴーヌト細胞の１３容量チ混合物をポリオウィルス
ＬＳＣ〜１株の吸着−溶出のために使用した。結果を次
の第２表に要約し、そして種々の供給源から得られた３
％牛肉抽出液、及び対照として塩溶液を用いた結果と比
較する。

第１表に与えられた結果から橢びかれるのと同じ結論が
第２表の結果から明らかである。吸着及び溶出は牛肉エ
キス（３ヴ）の供給源に強く依存し、他力これらは、こ
の発明の方法を用いる場合種々のファージについて実質
的に一定である。

例３ ３種類の温度、すなわち４℃、２４℃及び３７℃におい
て、この発明の方法により、３種類のバクテリオファー
ジを用いて吸着−溶出サイクルを行った。結果を次の第
３表に要約する。

以下余白 上記の結果から、４℃〜３７℃の温度箱Ｈにおいて、こ
の発明の方法による吸着−溶出結果は実質上一定であシ
、塩溶液を用いる場合はそうではないことが明らかであ
る。

例４ 異る動物赤血球ゴースト細胞濃度を用いて実験を行った
。一定ＰＨ（３，５）の０，３５容量チの塩溶液中所定
濃度の動物赤血球ゴーヌト細胞を用いて、３種類のバク
テリオファージψＸ−１７４、ＭＳ−２及びｆ２によυ
、吸着−溶出サイクルを行った。

得られた結果を次の第４素に示す。

この結果は、４容量％〜３２容量裂の範囲の濃度につい
て、吸着効率は７８．８％〜１００チの範囲にあること
を示す。

以下余白 月旦 この発明を用いる幾つかの実験を、生物学的流体すなわ
ち尿に対する吸着−溶出サイクルについて行った。次の
ウィルス株、すなわちポリオウィルスＬＳＣ−１、エコ
ウィルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）　６、エコウィルス７
及びコクサラキーウィルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　−ｖ
ｉｒｕｓ）　Ｂ　５を決定した。５　ｍ／、量の尿を、
この明細書中に記載した方法にょシ調製した１５容量係
のブタ赤血球ゴースト細胞のメンプランに通した（実験
Ａ）。同量５ｄの尿を用い、しかしブタ赤血球ゴースト
細胞を用いないで実験Ａと同じ条件下で比較試験（実験
Ｂ）を行った。吸着−溶出の結果を次の第５表に示す。

以下余白 上記の表の結果は、ブタ赤血球ゴースト細胞を用いて得
られる有利な効果を明瞭に示し、尿からのウィルスの吸
着−溶出サイクルは実質上１００％である。

例に の発明を用いる幾つかの実験を他の生物学的液体である
脳を椎液（Ｃ８Ｆ）について行った。この実験において
は、５ｍｌのＣ８Ｆを、この明細書に記載した方法によ
シ１５容量％ブタ赤血球ゴースト細胞のメンプランを用
いた（実＠Ａ）。比較試験を、膜を用いないで同じ条件
下で行った（実験Ｂ）。

次の第６表に吸着−溶出サイクルの結果を示す。

Ｖ、下余白 第６表 脳を椎液（Ｃ８Ｆ）からのウィルスの吸着−溶出Ａ　９
１．７　１００　９８．２　１１４　９８．９　１０２
Ｂ　７　１０４　０　１１８　０　１１１例７ １５容量チのブタ赤血球ゴースト細胞のメンプランを用
いて塩溶液中に存在する下記のウィルスを決定する吸着
−溶出についての結果を下記の第７表に示す。すなわち
、エコウィルス７、コクサッギーウィルスＢ−５、エコ
ウィルス６、ロタウィルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）　（
５Ａ−１１）　、及びポリオウィルスＬＳＣ−１を用い
た。

以下余白 例８゜ ヘキシルアミン基（シアノダンプロミドに連結：を有す
るアガロース及び赤血球ゴースト細胞を含有するカラム
（高さ１０　ｃｍ　）を用いて実験を行った。ウィルス
としてφＸ−１７４ｆｆｉ用いた。

この結果を次の第８表に示す。

第８表 ヘキシルアミン基を有するアガロース及び赤血球ゴース
ト細胞を含有するカラム上でのφＸ−１７４の決定 実験屋　吸着（％）　溶出（係） １　７５　９４ ２　８２　９０ ３（赤血球ゴー　１８　９８ スト細胞を用 いない対朋） 上記の表から明らかな通り、実験３（赤血球ゴースト細
胞を用いｒＪい対照）においては非常に貧弱な吸着が生
じ、他方この発明を用いる場合実質上完全な吸着及び溶
出が生ずる。

この発明はさらに、ウィルスを決定するための公知のキ
ットと組合わせて使用して好結果を得ることができる。

この目的はキットの感度を上げることである。ロタウィ
ルス・エリザ・キット（デンマーク、ダコバッツによシ
製造される）がよく知られており、この場合一般に、１
ｄ当り１０’ＰＦＵ（７’ラーク形成ユニツト）よシ高
濃度のロタウィルスの検出が可能であった。１０　ＰＦ
ＵＡＬ１未満の濃度についてはロタウィルス決定感度は
非常に低い。前記エリザキットを使用するに先立ってこ
の発明のウィルス濃縮を用いることにより、最初に１０
　ＰＦＵＡ未１Ｌそしてｌ０ＰＦ坂佃未満でさえあった
濃度を高精度で検出することができる。

エリザキットを用いるロタウィルス５Ａ−１１（モンキ
ー由来）の決定において得られた結果を要約する。ザン
プルは１０　ＰＦＵ／ｆｎ１未満の深度を有する。１０
　ＰＦ碌佃に稀釈し、２種類のＰＨ値すなわち３．５及
び７．２において決定を行った。実験１及び２は濃縮を
用い、３汲び４は濃縮を行わなかった。

第９表 赤血球ゴースト細胞による濃縮と組合わせてエリサキッ
トを用いるロタウィルス５Ａ−１１の決定 ＰＨ実験番号 １２３４ （濃縮）　（未凝緬） １　３．５　−　−−　−　− ２７．２　士　士　−− ３３，５−−−−− ４７，２−−−−− 上記の第９表から明らかな通シ、この発明の濃縮を伴う
実験においてはｐＨ７，２において、エリサキットによ
り陽性決定が得られたが、濃縮を行わない場合には決定
が得られなかった。

特許出願人 テクニオン　リサーチ　アンド ディベロップメント　ファンディションリミティド 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 己

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体汚物及び生物学的流体からウィルスを濃縮する
   方法であって、 （、）　前記ウィルス含有流体を動物′赤血球ゴーヌト
   細胞を含んで成る吸着剤マ）　ＩＪクスと接触せしめ； （ｂ）　段階（、）において得られたマ）ＩＪクスを酸
   性化することによって、前記動物赤血球ゴースト細胞上
   に吸着されたウィルスの沈澱を分離し；そして、 （ｃ）　段階（ｂ）において得られた沈澱を段階（ｂ）
   において一般的であるーよシ高い−を有する溶液によシ
   溶出し、そしてウィルス濃縮物を得る；段階を含んで成
   る方法。 ２、段階（Ｃ）における溶出を６．５よシ高い−の緩衝
   液によシ行う特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、吸着剤マトリクスが連続フィルムとして存在する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記フィルムがメンプランの形である特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ５、前記吸着剤マトリクスが粒状固体物質の形で存在す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、前記粒状固体物質の粒子サイズが１〜２０ミクロン
   の範囲にある特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記吸着剤マ）　ＩＪクス中の動物細胞赤血球の濃
   度が４〜３０容量チの範囲にある特許請求の範囲第１項
   〜第６項のいずれか１項に記載の方法。 ８．４℃〜３７℃の範囲の温度において実施される特許
   請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法
   。 ９、動物赤血球ゴースト細胞が支持体上に被覆されてい
   る特許請求の範囲第５項又は第６項に記載の方法。 １０、前記支持体がガラスピーズ又はゾラヌチックビー
   ズから選ばれる特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、動物赤血球ゴースト細胞を防腐剤で処理すること
   によシその微生物的損傷を防止する特許請求の範囲第１
   項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。 １２、前記防腐剤がナトリウムアジドである特許請求の
   範囲第１１項記載の方法。 １３、前記生物学的流体が尿である特許請求の範囲第１
   項〜第１１項のいずれか１項に記載の方法。 １４、前記生物学的流体が脳を髄液である特許請求の範
   囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の方法。 １５、ウィルスの決定のために使用されるキットと共に
   適用される特許請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか
   １項に記載の方法。