JPS60258121A - 生きた組織や細胞のマイクロカプセル及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生きた組織又は個々の細胞のマイクロカプセル
化に関する。

（従来の技術〕 生物学的に活性な巨大分子、組織及び個々の細胞をマイ
クロカプセル化して、栄養素や酸素等の低分子量物質は
透過させるが蛋白質や細胞等の高分子量物質は透過させ
ない半透膜中に保護された状態でそれらを生きたま＼に
しておくためにさまざまな試みがなされて来り０シかし
ながら、これらの試みはどれも上記半透膜中に入ｎた組
織や細胞が動物の体内で２〜３週間を越える期間生存出
来るマイクロカプセルを提供するのに成功しておらず、
糖尿病のような臓器移植の必要な病気の治療におけるそ
のような製品の利用をひどく制限している結果となって
いる。

１９６４年発行のサイエンス誌、１４６巻、５２４〜５
２５頁のティー・エム・ニス・チャンの「半透性マイク
ロカプセル」をこ於いて、赤血球溶血物及びウレアーゼ
の半透性ポリアミド（ナイロン）膜によるマイクロカプ
セル化が記載されている。血人中に注入された場合これ
らのマイクロカプセルは余り長期間生き続けることは出
来なかった。微生物細胞や生存しつる赤血球細胞を含有
する半透性マイクロカプセルの製造法が文献、即ち、ケ
ー・モスバック及びアール−モスバックによるＡｅｔａ
Ｃｈｅｍ、　８ｅａｎｄ、、　２０　、１９６６　、２
８０７−２８１２．並びにＣａｎ、　Ｊ＋Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ＋　４４　＋
１９６６．１１５−１２８　に掲載されたティ・エム・
ニス・チャン、Ｌフ拳シー・マツキントラシュ及びニス
・ジー傘メーソンの「半透性水性マイクロカプセル」中
に報告されている。上記のチャン等の論文は臓器交換治
療法に於いてカプセル化細胞の注入を利用する可能性に
ついて言及した最初のものである。

次に行なわれた意義ある改善は微生物細胞や酵素の固定
にゲル状のアルギン酸カルシウムやアルギン酸アルミニ
ウムを利用することであったＯこれらの細胞は極度に穏
やかな条件下で固定されたので、それらの生命を維持す
ることが出来た０この研究はヴイ・ハツケル、ジエイ優
クライン、アール・メグレット及びエフ・ワグナ−のＦ
ｌｕｒｏｐ。

Ｊ、　Ａｐｐｌｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、、　１　、
１９７５　、２９１−２９６並びにＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｓｒｉｎｇ＋　
１９　＋１９７７．３８７〜３９７のエム・キールシュ
タン及びンー・バッグによる「微生物細胞、細胞器官（
５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｏｒｇａｎ＠１ｌｓＩＩ）及
び酵素のアルギン酸カルシウムゲルによる固定化」中に
記載されている。

しかるのち、生きた組織や細胞がポリリジンで被覆され
たアルギン酸塩の液滴中に固定化された（　Ｊ、　Ｐｈ
ａｒｍ、　８ｅｌ、　７０　、１９８１　、３５．１−
３５４の工）・リム及びアール−ディー・モスによる「
生きた細胞や組織のマイクロカプセル化Ｊ）ｏ上記細胞
は最高２ケ月まで培地内で生き続けたが、上記ポリリジ
ン膜の生体内に於ける適合性を試験する実験は何ら記載
されていない。は望同じ頃、１９８０年発行のサイエン
ス誌、２１０巻、９０８〜９０９頁のエフ・リム及びエ
イーφエム１サンによる［生物学的人工膵臓としてのマ
イクロカプセル化ランゲルハンス島」中に糖尿病の動物
の病状を是正するためにマイクロカプセル化ランゲルハ
ンス島を使用することが始めて報告されたｏしかしなが
ら、アルギン酸塩製内部芯材から成り、その上にポリリ
ジンの被覆とポリエチレンイミン製外側膜を施したマイ
クロカプセルは、このポリエチレンイミン製外側膜の生
物学的適合性が悪いので、移植してから２〜３週間以内
に動物の体により拒絶されたＯ 後者のマイクロカプセルの形成方法はエフ拳すＡ（７）
７．ｌ’１ノ”特許明細書第４・°゛′・８８３号“０
も６８載　１１．。

されている。この明細書中に記載されているように、細
分した生きた組織をアルギン酸ナトリウムを含有する水
性媒体９に懸濁し、この懸濁液を上記組織を包み込むた
めの大きさの液滴に形成し、この液滴をアルギン酸カル
シウムへの転換によりゲル化して互いに分離した形状保
持性の予備カプセルを形成し、ポリエチレンイミンから
成る耐久性のある半透膜を上記予備カプセルのまわりに
形成してから、上記のアルギン酸カルシウムのゲルをイ
オン交換により膜内で液化する。上記特許の実施例３に
はこれらのマイクロカプセルの糖尿病のラットへの注入
が記載さｎでいる〇 上記リムのアメリカ特許において、ポリリジンのような
蛋白質又はポリペプチド架橋剤は体内で直ちに影響を受
けて膜が急速に破壊する結果になるが、哺乳動物の体内
で容易には消化されない架橋剤、例えばポリエチレンイ
ミンはより長時間存続する膜になることが示されている
。このリムのアメリカ特許の実施例１には半透膜を形成
するためにポリエチレンイミンとポリリジンとを使用す
ることが開示され、上述のリム及びサンの文献にはその
ようなマイクロカプセルは２〜３週間を越えるような生
体内寿命を備えていないことが示されている。

上記リムのアメリカ特許になったアメリカ出願の親出願
であるア、ｌ　ＩＪ力特許出願番号９５３．４１３号（
放棄）はボＱ　ＩＪリジン単独で膜形成用ポリマーとし
て使用した実施ｆｌＪ　１を含んでいる０試験管内試験
結果は示されているが、生体内での研究については何ら
具体的に記載されていない。この実施例には再液化工程
は示されていない。

上記リムのアメリカ特許はマイクロカプセルをアルギン
酸ナトリウムの溶液中に浸漬することによりマイクロカ
プセルを処理して、元のま＼では　・マイクロカプセル
をかたまらせる傾向を与える遊離アミノ基を固定するの
が望ましい場合もあることを示している。この特許の実
施例１及びその親出願の実施例１はいずれもマイクロカ
プセルのアルギン！！１液中への浸漬を記載している。

生体内寿命を与えるために実施されるこれらの工程に関
して上記リムの特許が教示している点は、ポリリジンは
生体内に容易に攻撃にさらされるのでポＩＪ　ＩＪレジ
ン使用を避けて、哺乳動物の体内で容易に消化され゛な
いポリマー、即ちポリエチレンイミンをその代りに使用
すべきであるということである。しかしながら、ポリエ
チレンイミンは肉芽腫を引き起して生体から炎症灰石が
起ることになるイミノ基を含有しているので、ポリマー
を破壊してしまう。従ってポリエチレンイミンは生物学
的適合性を有さず、上述のリム及びサンが上記マイクロ
カプセルを用いて得、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
　。

１９８２．３３巻、１１ｈ５．５６３−５６４頁におい
てツエ等によって確認された結果から明らかなように、
上記マイクロカプセルは２〜３週間を越える期間の臓器
交換治療法に有効ではない。

アメリカ特許明細書第４，３５２，８８３号にはポリエ
チレンイミンの代りに、それよりずっと高い生物学的適
合性を有するポリリジンを膜として用いることの可能性
が言及されている。ポリリジンはプラスに帯電され、プ
ラスに帯電した表面が細胞の生長にとって優れた基質と
なることが知らｎている。ポリリジンの膜で起るような
、マイクロカプセルの表面での細胞の生長は半透性のカ
プセル壁を非透過性のカプセル壁に変えてカプセル化し
た組織が死んでしまう結果になる。上記リムの特許はか
たまりを防止するためにポリリジン製カプセルをアルギ
ン酸ナトリウムで処理することを記載しているが、ポＩ
Ｊ　ＩＪレジンけを用いた場合には長い生体内寿命を持
つ製品を得ることが出来ないことも開示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、動物の体内に移植可能で、糖尿病のように臓器
移植の必要な病気の長期治療に有効なマイクロカプセル
の開発が必要なのは明らかである〇〔問題点を解決する
ための手段〕 本発明により、リムの報告とは違って、生きた細胞もマ
イクロカプセル化可能で、細胞を生物学的適合性を有す
るマイナス帯電した物質の外表面を有する生物学的適合
性を有する半透膜中にカプセ・・化することにより得ら
れる＝イク・カプセ・・ｉ′が長期間の生体内活性を有
するという驚くべき発見がなされた〇 従って本発明は生物学的適合性を有するマイナス帯電し
た表面を持った生物学的適合性を有する半透膜中にカプ
セル化した生存しつる組織又はばらばらにした細胞を含
む、哺乳動物の体内に移植するのに好適な生物学的適合
性を有するマイクロカプセルを提供する０本発明は生き
た細胞のマイクロカプセル化に適用するのに特にすぐれ
ているが、酵素、免疫蛋白質及び活性炭粒子等のどんな
所望の巨大分子状芯材料でもマイクロカプセル状にする
ことが可能である。巨大分子状芯材料は、小サイズの分
子は透過させて該芯材料と接醜させるが、該巨大分子及
び有害とな−る危険性を持った大きな分子は透過させな
い、生物学的適合性を持った半透膜で囲繞されている。

本発明に於いて、生きた組織、ばらばらにした細胞又は
生物学的活性を有する物質等の芯材料はヒドロゲルの形
態で生物学的適合性を有する半透膜でカプセル化される
◇カプセル化すべき材料を、該材料に対する一時的な保
護環境を形成するために可逆的にゲル化可能な水溶性物
質を含有する生理学的適合性を有する媒体中に懸濁する
Ｏこの媒体を上記カプセル化すべき材料を含む液滴に成
形し、例えば温度ｓ　ｐ）ｌ又はイオン環境条件を変え
てゲル化して好ましくははゾ完全な球状の予備カプセル
を形成し、非球形カプセルから形成されたマイクロカプ
セルに比べて全体として物理的強度を改善しているｏし
かるのち、得られた予備カプセルを処理して上記形状保
持性予備カプセルのまわりに調節された透過性を有する
膜を形成する０この膜の半透性は栄養素や酸素は芯材ま
で流入させ、代謝生成物を芯材から外側に流出させるが
、芯材自体をマイクロカプセル中に保持するＯこの半透
膜の生物学的適合性は上記のような物質を芯材側へ通過
させたり外側へ通過させたりするので、マイナス帯電の
外表面がその表面上に細胞が生長するのを阻止しながら
炎症や他の有害な体の応答をひき起すことはない０従っ
てこの膜は長期間、特に３〜６ケ月又はそれ以上半透性
を維持し有効である。

上記予備カプセ２しは、入れられた媒体中の条件が変わ
ることによってゲル化されて形状保持性のかたまりを形
成するどんな非毒性且つ水溶性の物質からでも形成する
ことが出来、そしてか＼る物質は容易にイオン化可能で
陽イオン基を形成する複数の基を含んでいる０このよう
な基が存在することによりカプセルの表層が架橋可能で
あるから、逆の電荷を有する多官能基を含むポリマーに
接触させた場合耐久性のある膜を形成する。

条件の、変化にさらされた場合にゲル化して形状保持性
のかたまりを形成することが可能で、酸性の多糖類成分
と反応することが出来るアミノ基含有ポリマーにより永
久に架橋又は硬化することが可能な種類の、天然又は合
成多糖類ガムから上記予備カプセルを形成するのが好ま
しい。上記ガムがアルギン酸アルカリ金属、特にアルギ
ン酸ナトリウムであるのが最も好ましい。勿論、他の水
溶性ガム類も使用可能である。

上記予備カプセルはアルギン酸ナトリウム水溶液の０．
滴を塩化カルシウム水溶液中へ押出すことによりアルギ
ン酸ナトリウムから形成することが可能である。先に指
摘した通り、上記予備カプセルははゾ球形であるのが好
ましく、はゾ完全な球状の予備カプセルは粘度が少くな
くとも約３０七ンチボイズのアルギン酸ナトリウム水溶
液を用いる事により形成可能であることが判明した。こ
の下限未満の粘度ではリムのアメリカ特軒明細書第４．
３５２，８８３号のように「近似球状の”８ｐｈｅｒｏ
ｉｄａｌ”Ｊと表現しうる不規則な形状を上記予備カプ
セルが持つことになる。この点に関して、上記アメリカ
特許の図面は完全な球形は示しておらず、むしろ幾分不
規則な形状を示している。完全に球状のカプセルは広い
範囲の粘度を有するアルギン酸ナトリウム溶液から得る
ことが出来るが、この粘度の上限は溶液を硬化媒体の中
へ押し出す能力によって主として決められる。通常、ア
ルギン酸すトリウム水溶液の粘度は約１．０００　ｃｐ
ｓを越えないものとする。

上記予備カプセルのまわりに耐久性のある半透　１１：
。

膜を形成するのは、ゲル化したガムの表層中の遊離酸基
とアミノ基を含む生物学的適合性を有するポリマーとの
間のイオン反応を、代表例として、選択したポリマーの
希゛水溶液中で実施するのが好ましい。

使用可能な生物学的適合性を有する架橋性ポリマーには
ポリリジンやそれ以外のポリアミノ酸類が含まれる。ポ
リエチレンイミンやその他の含イミンポリマー類はそれ
らが生物ｉ的適合性を有しない点を鑑み膜形成用として
不適であることが知られている。

上記ポリアミノポリマーの分子量は所望の透過度に依り
広く変動可能で、高い分子量のものは透過度が大きくな
る。代表的な例として、この分子量は約１１，０００〜
約４００，０００の範囲であるが、約１１．０００〜約
ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏが好ましい。ポリリジン又は他
のポリアミノ酸を用いると、マイクロカプセル自体は生
物学的適合性を有するが、既に述べたように長期間生存
させるには不適当なプラス帯電の表面を有するマイクロ
カプセルが出来ることになる・ 本発明においては、ボＩＪ　ＩＪリジンら上記半透膜を
形成するのが好ましい０ボＩＪ　１７ジンを使用する本
発明のこの好適な実施態様ではポＩＪ　ＩＪリジン分子
量が約１０．０００〜約ａ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、好ましく
は約１５．０００〜約２５，０００、特に約１７．００
０ダルトンであることが必須である。リムによって具体
的に開示されたような約ａａｏｏｏの分子量を有するポ
リリジンポリマーは余りにも多孔質、即ち、透過性が大
きすぎて、抗体さえも貫通してしまうような膜を形成す
ることになってしまう。上記範囲の低い方の分子量を用
いると多孔度が落ちる（低分子量のカットオフ）が栄養
素の芯材中への進入は十分許す膜を形成する。約１０．
０００未満の分子量　□はマイクロカプセル壁を形成す
ることが出来ないので不適当である。本発明の好ましい
実施態様では、ポリリジンの膜は約１５０，０００ダル
トン以下の分子量カットオフ（ｅａｔ　ｏｆｆ　）　、
好ましくは６７．０００ダルトン以下のカットオフを持
つものである。これは仮にマイクロカプセルの透過度が
時間の経過と共に変動しても、″ 吻適当な安全性の幅を与えることが出来るからである。

本発明の上記好適実施例の他の重要な特徴はカプセルと
ポリリジンとの反応が起る時間の長さである＠構造強度
や柔軟性の面でカプセルの体内への注入を可能にするの
に十分な耐久力を与える厚さの膜を形成するには少くな
くとも約６分間ないし約９分間の反応時間が必要である
ことが判明した。リムのアメリカ特許出願第９５３，４
１３号の実施例１には２分間の反応時間が示されている
が、これは注入を可能にする強度や柔軟性を持ったカプ
セルを形成するには粘体に不適当である。この反応時間
であると、上記ツエ等の文献において説明されているよ
うに、非常にもろい膜しか形成し得ない。

従って、使用する生物学的適合性を有する架橋性ポリマ
ーとしては特定の範囲の分子量を有するポリリジンが好
ましい０先に言及した通り、所望の多孔度を達成するに
は上記ボＩＪ　ＩＪレジンリマーの分子量を約１０．０
００〜約３０，０００の狭い範囲、好ましくは約１７，
０００に調節しなければならない。

やはり先に述べたように、長期間の生体内寿命を達成す
るには、生体内注入を可能にするのに十分な構造強度及
び柔軟性を備えかつ生体内に於いて構造上の一体性を保
つのに十分な量の生物学的適合性を有するポリマーを含
有する膜を形成するのに十分な時間、上記ポＩＪ　ＩＪ
リジン反応させることが重要である。普通、そのような
膜を得るには少くなくとも６分、一般に約９分以下の反
応時間が必要である。反応時間が６分未満であるとカプ
セル壁の薄い非常にもろいカプセルしか出来ず、反対に
反応時間が約９分を越えるとカプセル壁が厚くなり、柔
軟性の劣った、より高い強度のカプセルが出来る０反応
時間を約６〜約９分にすると、最適強度及び柔軟性を有
するカプセルを得ることが出来る。

驚くべきことに、予備カプセルと反応させるために使用
したポＩＪ　ＩＪリジン溶液の実際の強度は、約０．０
５重量％を越える濃度レベルの場合、カブ　ｉ′セル壁
の厚さに影響を与えない。

ポリアミノ酸との反応により上記予備カプセルのまわり
に形成された半透膜は次に非毒性の、生物学的適合性を
有する、水１＠性ポリマー状物質により処理される。こ
のポリマー状物質は、代表例として上記マイクロカプセ
ルを該ポリマー状物質の水溶液中に懸濁することにより
、有隙アミ７基と反応して膜のまわりにマイナス帯電の
外側皮膜を形成することが出来る。この外側皮膜を形成
するために用いる物質は上記予備カプセルを形成する際
に用いたものと同じもの、好ましくは多糖類ガム、より
好ましくはアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸ア
ルカリ金属であるのが望ましい。

上記マイクロカプセル上に外側皮膜を形成するためにポ
リビニルアルコールやポリ（β−ヒドロキシ酪酸）等の
塩基反応性基を含む他の生物学的適合性を有するポリマ
ー状物質も使用可能である。

そのようなポリマー状物質の分子量は例えば約１０’〜
約１０６　の範囲である。

生物学的適合性を有する水溶性ポリマー状物質は上記半
透膜の外側にあるアミノ基と反応して外側皮膜を形成す
る。この外側皮膜は上記半透膜の多孔度をそのま＼に維
持しながら上記ポリアミノ酸の層を覆い、マイナス帯電
の表面を形成する〇本発明の好適な実施態様において用
いた長い反応時間によって上記ポリリジン膜の表面上の
多数のアミノ基により、上記マイナス帯電の外側ポリマ
ー皮膜は生体内に於ける分解や剥離に対して耐久性を有
するので、上記プラス帯電した表面が体内環境に直接さ
らされることはない〇 リムはマイクロカプセルをアルギン酸ナトリウム溶液で
処理することを開示しているが、これはマイクロカプセ
ルがかたまるのを防止するために行なわれている０リム
の特許に記載された反応時間では、本発明の好ましい実
施態様で形成されるような耐久力のあるアルギン酸塩の
外側皮膜を形成するには不十分な数の未反応アミノ基し
か残っていないので、上記リムの特許中で用いられたり
エン酸塩溶液による液化１穐中に上記アルギン酸塩が急
速に洗い流されてしまう。

上記ポリアミノ酸のマイクロカプセルを上紀生物学的適
合性を有する塩基−反応性物質で処理することによって
半透膜の全体としての生物学的適合性を保持することが
出来、細胞の生長を阻止するマイナス帯電の外表面が形
成される。従って、上記の処理は半透膜に長期間その透
過性即ち効力を維持させている。

上記マイクロカプセルの形成１；引き続いて、基材料用
懸濁媒体の再液化が該芯材を液化する条件を再現して行
われる。これは多価陽イオンを除去するイオン交換、例
えば、リン酸塩緩衝食塩水又はクエン酸塩緩衝液中に浸
漬することにより達成することが出来る０この再液化工
程は拡散抵抗を減少させるために有益であるが、有効な
製品を得るためには必ずしも必要不可欠なものではなく
、この工程を省いても良い。これは、まだ内部が液化さ
れていないマイクロカプセルに入れて移植した（ラット
又はマウスの）ランゲルハンス島も糖尿病の動物の血糖
値を正常化するのに有効であることが知られているから
である。しっかりと元の形状を保ったゲル芯材が移植か
ら１年も経過した糖尿病の動物から回収されたマイクロ
カプセル中に見つかっているので、驚くべきことに上記
アルギン酸カルシウムのゲルから成る芯は体内では再液
化しない〇 本発明の方法は生きた組織、その多細胞分画又は個々の
細胞、例えば、ランゲルハンス島、肝臓細胞、赤血球細
胞及び他の生物学的活性物質をカプセル化するために用
いることが出来る０得られるマイクロカプセルは、組織
が生きている間哨乳動物の体に該組織の特定の生理学的
機能を与える目的で、上記哺乳動物の体内の適当な場所
に移植可能である。この移植は簡単な注入により実施で
きるから、手術は必要でない〇 上記マイクロカプセルの芯材は生きた組繊細胞とこの組
織を生きたま＼にして正常な代謝を行なわせるのに十分
な栄養素の水性媒体を含有している＠従って、細胞は生
きており、生理学的に活性であって、代謝を進行するこ
とが出来る〇上記芯材をカプセル状に包み込んでいる、
生物学的適合性を有する半透膜はイオ・反応した生物　
′）′学的適合性を有する物質の相互に浸入した層から
成っている。この半透膜全体の膜厚は通常約５〜約２０
μｍである０マイクロ力プセル自体の直径は約５００〜
約２，０００　ｐｍ　の範囲であるが、ランゲルハンス
島を芯材として含有するマイクロカプセルの場合通常約
７００〜約１，０００μｍの範囲である。

上記生物学的適合性を有する半透膜はヒドロゲルの状態
であって少くなくとも約２０重量％の総水分を上記膜構
造中に含んでいるが、この水分はアミノ酸の分子量によ
り約９５重量％まで変わり得る。

本発明に従って提供されるマイクロカプセルは生物学的
適合性を有し、上記リム特許の教示している事とは反対
に、ラット中１年までもの長期間生存可能である〇 上記先行技術の教示している事と違って、本願の発明者
等はポリリジン系半透膜中にマイクロカプセル化した、
上述の通り特定の重要条件を選択することにより驚くほ
ど長い期間生存しつるランゲルハンス島を提供可能であ
ることを見い出した。

本発明のマイクロカプセルが長期間有効であることは上
記リムの特許に於て予測された結果と完全に相反してい
る０先に述べた通り、リムはポリリジン並びにその類似
蛋白質及びポリペプチドは体内で急速に分解されるので
ポリエチレンイミンのような容易には消化されない物質
を使用するのを勧めると述べている。しかしながら、こ
のような物質は体内でわずか２〜３週間しか生存するこ
とが出来ないマイクロカプセルしか提供しない。

従って、上記リムの特許の内容からは、この特許の教示
している事に従って、本発明で達成されたように生体内
寿命を劇的に伸ばすことが可能であることは全く予期し
得ない。

本発明の製品に関して観察された生体内寿命は十分なも
のであり、当業界に於ける輝かしい進歩である。人体を
用いた臨床試験はまだ実施されていないが、マイクロカ
プセル化したランゲルハンス島を使用する糖尿病の長期
間治療の可能性はラットを用いて得た生体内試験結果に
より実証されている。

本発明の特に好ましい実施態様において、生きた細胞を
ポＩＪ　ＩＪリジンアルギン酸塩から成る半透性ヒドロ
ゲル中にマイクロカプセル化する０最初に上記細胞をア
ルギン酸ナトリウム溶液として生理食塩水中に均一に懸
濁する。人間を含む動物の血糖値を調節することによる
糖尿病の治療に上記マイクロカプセルを使用する場合、
上記生きた細胞は動物の膵臓から得たランゲルハンス島
の形態をとる。

上記細胞を含む球状の液滴は注入ポンプ／エアジェツト
押出し機のような液滴製造機によりアルギン酸ナトリウ
ムの水溶液から形成され、塩化カルシウムのような硬化
液内にゲル化された球状体として集められる。このゲル
化した球状体をポリリジンで被覆してから、アルギン酸
ナトリウムの外側皮膜をその上に施す。さらに、トのマ
イクロカプセルを等張クエン酸ナトリウム又は他の便利
なイオン交換媒体中に懸濁して、マイクロカプセル内の
アルギン酸塩を再液化して細胞を移動可能な状態に戻す
。先に述べたように、所望によりこの工程を省略するこ
とが出来る。

生化学的に不活性であるが生物学的適合性を有するアル
ギン酸塩から成る外表面は最高約９５重量％までの水分
を含むマイナス帯電のヒドロゲルである。この膨潤した
ゲル表面と水性の生物学的環境との間の低い界面張力は
蛋白質相互間の作用を最小限にする０若しこの界面張力
が高いと、強い蛋白質−ポリマー間作用によりひどい炎
症反応が表われることがある。このヒドロゲル膜の生物
学的適合性は移植した場合にカプセルが長期間生存し続
ることにつながる。表面がポリエチレンイミンから成る
マイクロカプセルはこの特性を持っているとは思われず
、従って生体により拒絶されて強い炎症反応を起すので
、上記マイクロカプセルの生体内での有用な寿命を大幅
に限定している０殆んどのヒドロゲルが持っている柔ら
かいゴム状の均一性は周囲の組織に対する摩擦による刺
激を減少してそれらに生物学的適合性を与える上でも貢
献している。

上記ゲルの再液化を実施する場合は、その前に　１例え
ばグルタルアルデヒドを用いてさらに架橋を促進して上
記マイクロカプセルの強度を増強することも可能である
。

本発明に於いては、生物学的適合性を有する外表面がア
ルギン酸ナトリウムで構成されているのは必ずしも必須
条件ではなく、上記外表面が生物学的適合性を有しマイ
ナスに帯電していることが必要不可欠である。生物学的
適合性を有する外表面を形成している材料のマイナス帯
電基、通常、水酸基又はカルボキシル基とポリリジン上
のプラス帯電アミノ基との間に結合が起る。

従って、長期間の生体内寿命を有しているので代謝を進
行することの可能な生きた組織の移植に特に好適な生物
学的適合性を有するマイクロカプセルが本発明により得
られる。生体内への移植に特に有用であるが、本発明の
マイクロカプセルはさまさまな試験管内用途にも使用可
能である〇このような試験管内用途にはその場所（Ｉｎ
　５（ｔｕ　）で又は培地内で代謝生成物を得るために
マイクロカプセル化したランゲルハンス島細胞又はその
他の組繊細胞を使用することやエタノールやペニシリン
等の生化学品や蛋白質を製造するための効率の良い生物
学的反応器としてマイクロカプセル化した微生物細胞を
用いることがある。

以下、実施例により本発明を説明するＯ実施例１ 本実施例はランゲルハンス島のマイクロカプセル化を説
明するためのものである。

培養したラットのランゲルハンス島（媒体０．２４中２
　Ｘ　１０”のランゲルハンス島を含むもの）を１．５
％　（ｗ／’ｗ）ノフルキン酸＋　ト’Ｊ　ラムｉ（粘
１ｆ　：５１　ｃｐｓ　）　２−として生理食塩水中に
懸濁した０注入ポンプ／″Ｌアジ工ツト押出機より２２
−ゲージ針を通してランゲルハンス島を含む球状の液滴
を形成し、これを１．５％（ｗ／Ｗ）の塩化カルシウム
溶液中に集めた。上澄液（ｓｕｐ＠ｒｎａｔａｎｔ　）
を傾斜法により除去し、ランゲルハンス島を含むゲル化
した球状のアルギン酸塩液滴を希ＣＨＥ８　（２−シク
ロヘキシルアミ／エタンスルホン酸）と１．１％の塩化
カルシウム溶液で洗浄したＯ 上澄液を吸引除去してから、ゲル化した液滴を分子量１
７，０００の０．０５％（ＦＡ）ポリリジン中で６分間
インキュベートした。

上澄液を傾斜法によって除去した後で、ポＩＪ　ＩＪリ
ジンプセルを希ＣＨＥＳ　、１．１％塩化カルシウム溶
液及び生理食塩水′で洗浄した。洗浄したボＩＪ　ＩＪ
リジンプセルを０．０３％アルギン酸ナトリウム溶液３
０−中で４分間インキュベートして、マイナス帯電した
アルギン酸塩とプラス帯電したポリリジンとの間のイオ
ン反応により最初のポリリジン膜上にアルギン酸塩から
成る外側膜を形成させた。

得られたマイクロカプセルを食塩水及び０．０５Ｍクエ
ン酸塩緩衝液で６分間洗浄し、内側のアルギン酸カルシ
ウムを再度液化してから、最後に食塩水で洗浄した。得
られたマイクロカプセルは完全な球形であり、それぞれ
１〜２個の生きたランゲルハンス島を含有しているのが
判明した。このマイクロカプセルの直径は７００±５０
μｍ、カプセル壁厚は約５μｍであった。このマイクロ
カプセルを３７℃で栄養素を含む媒体中に懸濁した〇マ
ウス、牛及び犬の膵臓からのランゲルハンス島を用いて
実験を繰り返して同様のマイクロカプセル化製品を形成
した。

実施例２ 本実施例はマイクロカプセル化したランゲルハンス島の
生存性を示すためのものである。

潅流試験により、実施例１の手順に従って作成したマイ
クロカプセル化うットランゲルノ１ンス島からインシュ
リンの分泌度はカプセル化していないランゲルハンス島
からのインシュリンの分泌度と同等であるのが判明した
。グルコース濃度を５０哩から３．００岬に上げた時、
両方の群のランゲルハンス島からのインシュリンの分泌
が２相に生起しくｂ％ｐｈａｓｉｅ　ｒ＠５ｐｏｎｓ＠
ｏｆ　１ｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｌｒａｇｅ　）、インシュ
リンの分泌度が上がった。

このようにグルコースが高濃度で存在した場合にインシ
ュリンの量が増加することは上記細胞の生存性及び機能
がマイクロカプセル化の全工程を通じて維持されたこと
を和実に示すものであった０３７℃で培地中に２ケ月保
存した後でも、上記　）マイクロカプセル化ランゲルハ
ンス島が形態学的にみでも機能面から見ても元のま＼で
あるのが観察された。

実施例３ 本実施例はマイクロカプセル化ランゲルハンス島の糖尿
病のラットへの注入を説明するためのものである。

血糖値が３７０〜４７０１ｄＬ　の範囲の複数の糖尿病
のラットを、分子量が２５，０００ダルトンのボＩＪ　
ＩＪリジン用いた以外実施例１に記載したようにマイク
ロカプセル化した約３Ｘ１０”のラットランゲルハンス
島で治療した。上記マイクロカプセルは注射器に取り付
けたカニユーレを用いて注入することにより腹腔内へ導
入した。

マイクロカプセル化していないランゲルハンス島及びア
メリカ特許第４．３５２，８８３　（リム）に記載され
たように作成したポリリジン−ポリエチレンイミン膜で
マイクロカプセル化したランゲルハンス島を対照として
用いた０血糖値を一週間当り２回調べて血糖値が低下し
た期間を決定した。得られた結果を次の表−■に示す。

表　−■ 膜なし　１　（Ｎ−４） 表−■の結果から明らかな通り、本発明の生物学的適合
性を有するポＩＪ　ＩＪリジンアルギン酸塩から成る膜
で包んだランゲルハンス島は、糖尿病のラットが正常な
絶食血糖値を示すことにまって証明されたように、最高
５２週間も生存した０これに反して、リム特許のポリリ
ジン−ポリエチレンイミンカプセル膜に包まれたランゲ
ルハンス島は　□３週間未満の生存期間しか示さなかっ
た。

実施例４ 本実施例はマイクロカプセル化したランゲルハンス島の
多回注入の効果を示すためのものである。

高血糖症（３００ＩＩＰ／ｄＬを越える血糖濃度）に戻
ってから、分子量２５．０００ダルトンのポＩＪ　’Ｊ
リジン用いて実施例１の手順に従って作成したポＩＪ　
ＩＪジン−アルギン酸塩でマイクロカプセル化したラン
ゲルハンス島を再度注入して糖尿病のラットの血糖値を
最初に注入した時より長期間正常化した以外実施例３の
手順を同様に繰り返し、糖尿病のラットの血糖値をわず
か２回注入するだけで６ケ月を越える期間正常化するこ
とが出来た。

これに反して、ポリリジン−ポリエチレンイミンでマイ
クロカプセル化したランゲルハンス島を２−３週問おき
に５回注入したが糖尿病の動物の血糖値を僅か３ケ月し
か正常化出来たのにすぎなかった（Ｎ−８） 実施例５ 本実施例はマイクロカプセル化したラットのランゲルハ
ンス島を糖尿病のマウスに注入することを示すためのも
のである。

ランゲルハンス島の数を少＜　Ｌ／（１０００個のラッ
トランゲルハンス島）、糖尿病のマウスを用い、再液化
工程を省略した以外実施例３の手順をそのま＼繰り返し
た。ポリリジンーポリエナレンイミンのマイクロカプセ
ルは対照として用いなかった０糖尿病のマウスの血糖値
を１回の注入（腹腔内）で２ケ月を越える期間正常化出
来たので、異種間移植（即ち異る種類の間での移植）が
可能であることを示した。さらに、こわらの結果はカプ
セル内のゲルの再液化が必要不可欠のものではないこと
を示している。

実施例６ 本実施例は移植後に回収したマイクロカプセル化ランゲ
ルハンス島の生存性を示すものであるＯ実施例３で治療
した糖尿病のラットの数匹から移植後３．５及び１２ケ
月経過した時点でマイクロカプセル化ランゲルハンス島
を回収した０これらのマイクロカプセルの大部分は依然
として物理的に元のま＼であって、培地中で高いグルコ
ース濃度に対応して回収されたランゲルノ）ンス島から
インシュリンが分泌されたことで証明されるように、イ
ンシュリン分泌能を有する生きたランゲルハンス島を含
んでいた０ 実施例７　（。

本実施例は肝臓細胞のマイクロカプセル化を示すもので
ある。

ランゲルハンス島の代りにマウス胎児の肝臓細胞を用い
１こ以外実施例１の手順を同様に繰り返した。トリパン
宵に染色されないことや組織学的研究により証明された
ように、生きた肝臓細胞を含有するカプセルが得られた
。各カプセル中に肝臓細胞が数千個含まれているのが観
察された。

実施例８ 本実施例はポリビニルアルコールをマイクロカプセルの
外表面として用いることを示すものである。

外側皮膜を形成するためにアルギン酸ナトリウム溶液の
代りにポリビニルアルコールの１．０％（ｗ、／’ｗ）
　’Ｊン酸塩緩衝食塩水溶液を用いた以外、実施例１の
手順をそのま″＞繰り返した。ポリビニルアルコールは
カプセル膜の透過性を余り変えなかった０ ポリビニルアルコールは生物学的適合性を有する水溶性
ポリマーであることが知られており、人工血管用抗血栓
性皮膜のように、多くの外科的療法において使用されて
来ている。従って本実施例で作成したマイクロカプセル
が、実施例１の手順により製造したマイクロカプセルに
類似する血糖低下作用を糖尿病の動物において示すこと
が予想される。

実施例９ 本実施例はマイクロカプセルの外表面としてポリ乳酸（
ｐｏｌｙｌａｃｔｉｅ　ａｃｉｄ　）を用いることを示
すものである。

アルギン酸ナトリウム溶液の代りに外側皮膜形成用とし
てポリ乳酸の０．１％（Ｗ／Ｗ）緩衝食塩水を用いた以
外、実施９１１の手順をそのま＼繰返した。

ポリ乳酸をまず希水酸化ナトリウム溶液に溶解し、　□
次いで塩酸で中和した。そのように作成したマイクロカ
ブ七Ｉし中でのランゲルハンス島の生命が維持されたこ
とはトリパン青による染色で証明された。ポリ乳酸は現
在縫合材として臨床に用いられている生物学的適合性を
有するポリマーである。

従って、本実施例で作成したマイクロカプセルが実施９
’ｌｌ　１の手順により製造したマイクロカプセルに類
似した血糖低下作用を糖尿病の動物に対して示すことが
予想される。

実施例１０ 本実施例は球状のアルギン酸カルシウムから成る液滴の
作成方法を示すものである。

さまざまな濃度（従ってさまざまの粘度）のアルギン酸
ナトリウム溶液を注入ポンプ／エアジェツト（２２−ゲ
ージ針）により１．５％（η〜）の塩化カルシウム硬化
溶液中へ押出し、形成されたゲル状の液滴を集め、それ
らの物理的形状を観察した。結果を次の表−扉に示す。

表　−■ Ｌ、Ｓ　５１　１００ １．４　４３　１００ １．３　３６　１００ １．２　３０　１００ １．１　２５　２５ １．０　２０　０ ０．９　１６　、　０ ０．７　１１　０ ０．３　４　０ 全てのアルギン酸ナトリウム濃度に於いて、得られた液
滴は「近似球状（“８ｐｈｅｒｏｉｄａｌ”）」として
広い意味では表現出来るが、表−］からアルギン酸ナト
リウムの濃度が１．２％（ｗ／ｗ）以上、即ち、粘度が
３０　ｃｐｓ以上の場合に限り、完全な球状体が形成さ
れることが明らかである。

実施例１１ 本実施例は限界範囲外の条件を用いた場合のマイクロカ
プセルの製造を示すものである。

ランゲルハンス島を除外し且つポリリジンの分子量を変
更した以外、実施例１の方法をそのま＼繰り返した。ｉ
ｏ、ｏｏｏ〜３０，０００ダルトンの範囲外の分子量を
有する複数のボＩＪ　ＩＪリジン用いた。

対照として上記範囲内の分子量を有するポＩＪ　ＩＪリ
ジン用いたマイクロカプセルも作成した。

４．０００ダルトンの分子量を有するポリリジンの場合
耐久力のあるマイクロカプセルを得ることが出来ず、得
られたカプセルは再液化工程で溶けてｔ、よう。よヵ５
ゎヵ１９．．。ｅ−Ｐｔ４０．。。。、９０．。ｏｏ　
”・□・及び４００．０００のボＩＪ　ＩＪリジンらそ
れぞれ形成したマイクロカプセルは分子！　１７，００
０のポリリジンを使用して得た対照マイクロカプセルに
比べてもろく、牛血清アルブミン及びヘモグロビンを透
過したので６７．０００ダルトンより大きな分子量のカ
ットオフを有するものであった。

得られた結果を次の表−■に示す。

実施例１２ 本実施例はマイクロカプセルの強度を増強させる方法を
示すものである。

ポリリジンによる被覆工程の直後又はクエン酸塩による
洗浄工程の直前にマイクロカプセルを６０秒未満０．０
１％（ｗ／ｗ）グルタル酸アルデヒドと接触させた以外
、実施例１，８及び９の手順をそのま＼繰り返した。未
架橋材料と比べて、得られたマイクロカプセルは物理的
に（微小ピンセットを用いて）破壊するのがより困難で
あり、ヘパリン液中で分解するのがより難しかった。

〔発明の効果〕

本開示内容を要約すると、本発明は長期間生籾学的適合
性と生命を維持出来る生きた組織や細胞の新規なマイク
ロカプセル、及び糖尿病のような臓器移植の必要な病気
の治療にそのようなマイクロカプセルを使用することを
提供するものである〇本発明の範囲内に於て変更が可能
である０特許出願人　コノート　ラボラトリーズ　リミ
テッド代　理　人　若　林　忠

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　動物の体内へ移植するのに好適な生物学的適合
   性を備えたマイクロカプセルにして、巨大分子状の芯物
   質及び該芯物質を囲撓し、マイナスに帯電した生物学的
   適合性を持つ外表面を有しかつ小サイズの分子は透過さ
   せて該芯物質と接触させるが該芯物質は透過させない生
   物学的適合性を有する半透膜とから成ることを特徴とす
   るマイクロカプセル。 （２）前記芯物質が酵素、免疫蛋白質、微粒子状活性炭
   又は生存しつる組織である特許請求の範囲第１項に記載
   のマイクロカプセル。 （３）前記芯物質がランゲルハンス島、肝臓組織又はそ
   れらの個々の細胞である特許請求の範囲第１項に記載の
   マイクロカプセル。 （４）前記半透膜がプラス帯電した基を有するポリマー
   状物質とマイナス帯電した基を有するポリマー状物質と
   の間のイオン反応により形成されたヒドロゲルであり、
   該両ポリマー状物質が形成されたヒドロゲル膜の内外表
   面を形成している特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
   １項に記載のマイクロカプセル。 （５）前記プラス帯電した基がアミノ基であり、前記マ
   イナス帯電した基がカルボキシル基又は水酸基である特
   許請求の範囲第４項に記載のマイクロカプセル。 （６）約５００〜約２０００μｍの直径を有し、動物の
   体内へ移植するのに好適なマイクロカプセルにして、代
   謝を進行することの可能な一種又は　、１それ以上の生
   存しつる、健康な、生理学的に活性の組繊細胞から成る
   芯及び該芯を囲撓し生物学的適合性を有する半透膜とか
   ら成り；該半透膜は組織に対する栄養素及び該、組織の
   代謝生成物に対しては透過性であるが免疫系蛋白質に対
   しては非透過性であり、約１５０，０００　ダルトン以
   下の分子量カットオフを有し、約ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ〜
   約３０，０００の分子量を有するポリリジンポリマーと
   マイナス帯電した外表面を形成するためのマイナス帯電
   した基を有するポリマー状物質との間のイオン反応によ
   って形成されたヒドロゲルであり、該ポＩＪ　ＩＪジン
   ポリマー膜が動物の体内へ該マイクロカプセルを注入す
   るのを可能にし且つ３ケ月を越える期間該動物の体内に
   注入されたま＼でも該マイクロカプセルを正常な状態に
   保持し核組織細胞の代謝を進行させるのに十分な耐久力
   を有することを特徴とするマイクロカプセル。 （７）前記組繊細胞がランゲルハンス島である特許請求
   の範囲第６項に記載のマイクロカプセル。 （８）前記ポリリジンポリマーの分子量が約１５．００
   ０〜約２５，０００である特許請求の範囲第６項又は７
   項に記載のマイクロカプセル。 （９）前記ポリリジンポリマーの分子量が約１７．００
   ０である特許請求の範囲第８項に記載のマイクロカプセ
   ル。 翰　約７００〜約１，０００μｍの直径を有し、前記半
   透膜の厚さが約５μｍである特許請求の範囲第６〜９項
   のいずれか一項に記載のマイクロカプセル０ Ｑｌ）　！￥ｆＩ記半透膜が約６７．０００ダルトンの
   分子量カットオフを持つ特許請求の範囲第６〜ｌＯ項の
   いずれか一項に記載のマイクロカプセル。 Ｑ３　前記芯が前記組繊細胞を維持して正常な代謝を行
   なわせるのに十分な水性栄養液も含有している特許請求
   の範囲第６〜１１項のいずれか一項に記載のマイクロカ
   プセル。 （１３１１［１記マイナスに帯電した基がカルボキシル
   基又は水酸基である特許請求の範囲第４〜１２項のいず
   れか一項に記載のマイクロカプセル。 ■　前記マ゛イナスに帯電した基を有するポリマー状物
   質がアルギン酸塩、ポリビニルアルコール及びポリ乳酸
   より成る群から選択される特許請求の範囲第１３項に記
   載のマイクロカプセル。 Ｑ！９　半透膜内に芯材をカプセル化する方法にして、
   ａ）可逆的にゲル化可能で遊離酸基を有する水　′（Ｓ
   性ポリマー状物質の水溶液中に該芯材を入れ；ｂ）得ら
   れた溶液を液滴に形成し；ｃ）液滴をゲル化して夫々分
   離した形状保持可能な予備カプセルを作成し；ｄ）咳予
   備カプセルと遊離アミノ基を含むポリマーを接触させる
   ことにより該予備カプセルの表面層中の酸基との間にイ
   オン反応を生起させて咳予備カプセルの周囲に半透膜を
   形成し；ｅ）工程　ｄ）で形成したマイクロカプセルを
   、該マイクロカプセルの表面層の遊離アミノ基とイオン
   反らの可能な遊離したマイナス帯電の基を含有する生物
   学的適合性を有するポリマー状物質に接触して、該マイ
   クロカプセル上に咳生物学的適合性を有する物質の外側
   被膜を形成する工程から成ることを特許とする方法。 （ＩＱ　前記生物学的適合性を有するポリマー状物質が
   遊離酸基を含む多糖類ガムから成る特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法〇 同　前記多糖類ガムがアルギン酸ナトリウムであリマー
   状物質が遊離水酸基を有するポリビニルアルコール又は
   遊離酸基を有するポリ乳酸である特許請求の範囲第１５
   〜１７項のいずれか一項に記載された方法。 ＯＩ　前記可逆的にゲル化可能の水溶性物質がアルギン
   酸ナトリウムから成り、前記生物学的適合性を有するポ
   リマー状物質もアルギン酸ナトリウムから成る特許請求
   の範囲第１５〜１７項のいずれか一項に記載の方法。 翰　前記可逆的にゲル化可能の水溶性物質がアルギン酸
   ナトリウムから成り、工程　ａ）で使用するアルギン酸
   すｌ−ＩＪウム水溶液の粘度がはり球状の予備カプセル
   を形成するのに少くなくとも　□十分である特許請求の
   範囲第１５〜１９項のいずれか一項に記載の方法。 Ｑυ　前記アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度が少くな
   くとも３０　ｃｐｓである特許請求の範囲第２０項に記
   載の方法。 （イ）前記半透膜中のゲルを工程・）の後で再び液化す
   る特許請求の範囲ｌＫ１５〜２１項のいずれか−項に記
   載の方法。 （ハ）　前記遊離アミノ基を含むポリマーが分子量約１
   ０．０００〜約３０，０００ダルトンのポリリジンであ
   り、接触工程　＠）を、予備カプセル上に十分な耐久力
   を有するポリマーの被膜を形成し、得られるカプセルの
   動物体内への注入を可能にするように、十分な時間実施
   する特許請求の範囲第１５〜２２項のいずれか一項に記
   載の方法。 （２）前記芯物質が工程　ａ）で前記水溶液中に細かく
   分割懸濁された状態になっている生きた組織から成る特
   許請求の範囲第２３項に記載の方法。 （ハ）　前記生きた組織がランゲルハンス島から成り、
   従って前記マイクロカプセルが該マイクロカプセルを移
   植した糖尿病の動物の体内の血糖値を調節するのに使用
   可能な特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 弼　前記ポＩＪ　ＩＪリジン分子量が約１５，０００〜
   約２５．０００ダルトンである特許請求の範囲第２２〜
   ２５項のいずれか一項に記載の方法〇（５）工程　ｄ）
   に於ける接触を厚さ約５μｍのボＩＪ　ＩＪジン層を形
   成するのに十分な時間実施する特許請求の範囲第２２〜
   ２６項のいずれか一項に記載の方法。 弼　工程　ｄ）に於ける接触をボＩＪ　ＩＪリジン溶液
   を約６〜約９分間接触させることによって実施する特許
   請求の範囲第２２〜２７項のいずれか一項に記載の方法
   。 翰　前記ポリリジン水溶液の濃度が少くなくとも約０６
   ０５重量％である特許請求の範囲第２８項記載の方法。 （７）巨大分子状の芯材をアルギン酸ナトリウム水溶液
   中に懸濁し、得られたアルギン酸すｌ−ＩＪウム液を液
   滴にし、多価陽イオンとのイオン交換により該液滴をゲ
   ル化することによる形状保持の可能なカプセルを形成す
   る方法にして、該アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度が
   少くなくとも３０センチポイズであって、該形状保持可
   能なカプセルかはゾ完全な球状であることを特徴とする
   方法。 、３．、□、□ゆイカフカ４カフ９．つ４イオ７−、、
   あ、）特許請求のｌ１ｌｉｌｉ囲第３０項記載の方法。 Ｃ３２前記液滴を塩化カルシウム水溶液中に押し出すこ
   とによってゲル化する特許請求の範囲第３０項又は３１
   項に記載の方法。 （至）前記アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度が１．０
   ００センチボイズ以下である特許請求の範囲第３０〜３
   ２項のいずれか一項に記載の方法。