JPS60259961A - 血漿中の脂質結合シアル酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本願は米国出願番号５９−５．３１０号（１９８４年３
月３０日出願）の一部継続出願であり、その内容は本願
中に参考のために編記されている。

本発明は迅速で、経済的で、信頼性が高く、実験者の経
験と技量に頼るところの少ない、血漿又は血清中の脂質
結合シアル酸の定量法に関する。

血清中のシアル酸含量の上昇がガンの存在に対する１つ
の指標となることが多数の研究によって指摘されている
。

例えば、ダビットソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）等による米
国特許４，１４６．６０３号には、シアル酸含量の上昇
がガン特異的定量法に於いてその決定因子となるような
非常に複雑な一連の操作について、開示し特許請求を行
なっている。

マクベス（ＨａｃＢｅｔｈ）及びベケシ（Ｂｅｋｅｓ　
ｉ　）は而漿中の糖タンパク量を測定し、転移のない乳
ガンの場合にガラクトースとマンノースの値が上昇する
ことを発見した（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、２２：１１７
０−１１７６（１９６２））クロッペル（に１ｏｐｐｅ
ｌ）等は移植乳ガンで罹患したマウスに於いて、血清中
のシアル酸含有糖脂質量が２．５倍に増加し、ヒトのガ
ン患者に於いては’ｃ　ｈが２倍に増加することを報告
した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１、八ｃａｄ、Ｓｃ、　７
４：３０１１−３０１３（１９７７））　。その方法は
ガングリオ−シト（シアル酸含有糖脂質）のカラムクロ
マトグラフィによる分離を含むものであった。

また最低でも１ｄの全面が必要とされた。クロッペル等
は２４匹のガンに罹った犬のうちの９２％にシアル酸の
増加が見られることも報告したが、しかしながら、他の
疾患に罹った犬に於いて多数の偽陽性が観察された（Ａ
ｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ　３９：１３７７−１３８０（
１９７８））　。レングル、ジエイ（Ｌｅｎｇｌｅ、Ｊ
）は白血病ＡＫＲ／Ｊマウスに於いて血漿中とＴリンパ
球に脂質結合シアル酸が増加することを発見した（Ｎａ
ｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ、Ｉｎ５ｔ、６２：１５６５−１５
６７（１９７９））　、ボルトカリアン（Ｐｏｒｔｏｕ
ｋａｌ　１ａｎ）等によって、クロマトプレートによる
計量に引き続いてカラムクロマトグラフィによる分離精
製を行ないメラノーマ患者の血漿中と赤血球に脂質結合
シアル酸が増加することが発見された（Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

亜；９１６−９２０（１９７８））。シルバー（Ｓｉｌ
ｖｅｒ）等は苦しいガンと密接な関係を持って、血清中
のシアル酸の量がメラノーマ患者に於いて増加している
ことを報告したが、明らかにガンとわかる患者のうちの
３６％には血清中のシアル酸の上昇は観察されなかった
（Ｃａｎｃｅｒ　４１：１４９７−１４９９（１９７８
）；　ＣａｎｃｅｒＲｅＳ、　３９：　５０３６−５０
４２（１９７９））。ホーガンーリャン（ｌｌｏｇａｎ
−Ｒｙａｎ・）等は乳ガン患者に於いて血清中の総結合
シアル酸がガンの進行段階に応じて増加していくことを
発見した（Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ４１：５８７−５９
２（１９８０））　。

本発明が改良したところの１つの特異的方法は力トポジ
ス（ＫａｔＯｐＯｄｉＳ）等によって米国ガン学会年次
総会会報（静ｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａ目ｏｎ　ｆ
ｏｒ　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｎｕａｌ　
Ｍｅｅｔｉｎｇ　ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ）　２１巻、
抄録番号７２８．１９８０年３月、に発表されている。

要約すると、この方法では１００μρの血漿試料を６ｄ
のクロロホルム／メタノール混合物（２：１の容積比〉
で抽出し、脂質抽出弁をその容積の０．２部に当る水を
加えて分離し、その水相部分を蒸発乾燥させ残滓を水に
再溶解させる。

トリクロロ酢酸とリンタングステン酸によって脂質結合
シアル酸を沈澱させ上清を除去した後、その沈澱をスベ
ナルボルム（Ｓｖｅｎｎｃｒｈｏｌｍ）及びミエヂエン
（Ｈｉｅｔｔｉｅｎ）の方法によッテ測定する（ｓｖｅ
ｎｎｅｒｈｏｌｍ、シアル酸定量法、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ２４、ｐｐ、６０４−６１
１（１９５７））。

本発明が改良したところの他の特異的方法は、カトボジ
ス（Ｋａｔｏｐｏｄｉｓ）及びストック（Ｓｔａｃｋ）
によって開示されている（米国特許４，３４２．５６７
号）。この方法は前記の方法に類似しているが、前記の
方法が１００μρの試料を必要とするのに較べてこの方
法では、はんの５０μｐ程の試料が必要なだけである。

乾燥操作は省かれており、トリクロロ酢酸も使用しない
。リンタングステン酸単独で用いられる。この先行方法
は実質的に以下のステップから成っている。

１、ねじぶた付き培養試験管（１３Ｘ１００ｍｍ）に蒸
留水１５０λ（μｌを５００λハミルトンシリンジ（Ｈ
ａｍｉ　１ｔｏｎ　’ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて加える
。これに４４．７λの血漿（又は面清）をキャピラリー
ピペットｕｎｏｐｅｔｔｅ、　ＢｅｅｔＯｎ−Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ　５８４１）で加える。５秒間その中身を渦
動（Ｖｏｒｔｅｘ）Ｌ、砕氷中に試験管を移す。

２．３．Ｃ７！の冷却した（４℃〜５℃）クロロホルム
とメタノールの混合物（２：ＩＶ／Ｖ）を添加し３０秒
間混合物を渦動する。

３、この混合物にＯ，！Ｍ！の冷却蒸留水を添加して蓋
をし３０秒間にわたって試験管を繰り返し逆さにして中
身を混合する。

４、室温に於いて２５０Ｏｒｐｍで５分間試験管を遠心
し、上層の１−を同種の培養試験管に移す。

５、これに５０λのリンタングステン酸溶液＜１ｇ／ｍ
ｘ＞を添加し、混合後５分間室温にて静置する。

６　、２５０．Ｏｒｐｍで５分間遠心し上清を吸引部、
去する。

７．１ｄの水を加え沈澱の大きな塊が懸濁液中に見えな
くなるまで渦動する（約１分間）。

８、レソルシノール試剤を１＃＋１！添加し、混合し試
験管を沸騰水中に正確に１５分間保持する。

９．１５分間経過したら直ちに試験管を氷水バスに移し
１０分間放置する。

１０、該水冷却試験管に室温状態の酢酸ブチル：ｎ−ブ
タノール混合物（８５ニー　１５Ｖ／Ｖ）２ａｄ！ヲ添
加し、渦動し２５０　Ｏｒｐｍで５分間遠心する。

１１、抽出されてきた青色を５８０　ｎｍで読み取り、
ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を標準試料とし
て用いて誘導した標準曲線と以下の式を使って脂質結合
シアル酸（ＬＳＡ）の闇を測定する。

ＬＳＡ　＜Ｒ１Ｊ／１００ｒｒｄｌ血漿）＝（ｘ・１０
０．０００λ）／ （ｙ・４４．７λ・１０００） Ｘ＝標準曲線から読み取った試料のＮＡＮＡ量（γ）Ｖ
＝　［１ｍの上溝液÷上清液の全容積］この先行方法は
次のいくつかの点を含む多くの欠点をもっている。すな
わち、出発試料として正確に４４．７λが要求されるこ
と、試験管を逆さにして振る操作中に脂質結合シアル酸
が失われて最終測定値が低くなること、リンタングステ
ン酸による脂質結合シアル酸の沈澱が不完全であること
で、これは試料中の脂質結合シアル酸量が正□常値に較
べてほんの僅かしか増加して（１な（Ａような場合（例
えばガンの早期段階）には特に問題となること、リンタ
ングステン酸を添加した後５分間時たなければならず試
験の迅速化が望めな６Ａこと及び試験の経費が期待する
程安くな０ことである。

この先行方法を用いて様々な研究室で実験力＜ｆ−ｒな
われたが、それらの結果は大きく異なって（また。

表１には他の研究者によって得られた結果ｈ′１掲【ｆ
であり、正常人の試料を検査したときの検査値の変動性
が記述されている。

人−よ 木メＩＪ（λ１ヌ 本発明は以下に示す各段階を含むヒトの血漿試料又は血
清試料中の脂質結合シアル酸の定量法を提供するもので
ある。

ａ）所定量の血漿試料又は血清試料を蒸留水でその約４
倍の容量になるまで希釈する。

ｂ）実質的に均一になるまで適当な時間希釈した試料を
混合する。

Ｃ）この試料を０〜５℃に冷却する。

ｄ）この冷却試料に、当初の血清試料又は血漿試料の所
定量の６０倍量の０〜５℃に冷却した塩化低級アルキル
炭化水素及び低級アルキルアルコールの混合物（約２　
：　１　Ｖ／Ｖ）を添加する。

ｅ）試料中の物質が塩化炭化水素／アルコール混合物に
溶り込むまで適当な時間この混和物を混合する。

ｆ）当初の血清試料又は血漿試料の所定量の約１０倍量
の脱イオン蒸留水（約Ｏ〜５℃）で該混和物を希釈する
。

ｑ）実質的に透明な上層が形成されるまで適当な時間こ
の希釈混和物を処理する。

ｈ）透明な上層から一定量の上層を分離回収する。

ｉ）この分離回収した上層液に、脂質結合シアル酸を沈
澱させその沈澱脂質結合シアル酸を吸着させるのに有効
な量のタンパク質沈澱剤及び吸着物質の混合物を加える
。

ｊ）得られた混和物を混合する。

ｋ）その結果吸着された沈澱物を分離回収する。

ρ）適当量の蒸留水中にこの沈澱物を懸濁させる。

ｍ）この懸濁沈澱物中に存在する脂質結合シアル酸を測
定し、もって血清試料又は血漿試料中に存在する脂質結
合シアル酸を定量する。

脂質結合シアル酸を沈澱させるのに好適な混合物は約７
５重塁％のリンタングステン酸及び約２５重量％のシリ
カゲルを含むものである。

好ましくは、検査する血漿試料を１紙片又は円形１紙の
ような適当な支持体に吸着させ乾燥させる。

本発明は更に、被検者の血漿又は血清中の脂質結合シア
ル酸を定量しこ゛の値をガン患者か°ら得られた値と比
較することを含むヒトのガン診断方法及びそれに用いる
キットを提供する。

あるいはまた、本発明に係わる診断方法及びキットは被
検者の血漿又は血清中に存在する脂質結合シアル酸量を
定期的に測定し、以前にその被検者について測定した値
とこれらの測定値とを比較することによってその被検者
のガン進行状況を監視する目的で使用され得る。

１つの具体例に於いて、試料からの抽出とそれに引き続
いて行なわれるタンパク質沈澱剤を用いたその抽出物か
らの脂質結合シアル酸の沈澱を含むヒトの血漿又は血清
中の脂質結合シアル酸定量法の改良法が提供される。こ
の改良法はタンパク質沈澱剤と伴に混合物に於いて石英
質物質のような吸着物質を使用することである。

３、発明の詳細な説明 ヒトの血漿試料又は血清試料中の脂質結合シアル酸を定
量しこうして得られた値をガン診断の指標に用い得る。

最初の段階は検査する試料を得ることである。典型的に
は被検者から採血した全血に後述する方法を施し、この
全血から血漿又は血清を得る。この血漿又は血清を直ち
に試験に供しても良いし輸送又は貯蔵期間中ドライアイ
ス又はより経済的な市販の凍結剤と一緒にして断熱容器
に密閉し、例えば約４℃より低い温度であるような適当
な貯蔵温度にて保管され得る。しかしながらより好まし
くは、試料を適当な支持体の上に載せ乾燥させ、後述す
る測定法の一番初めにこの支持体に付着している乾燥試
料を再溶解させる。適当な支持物としては、測定に影響
を与えず試料が拡散し乾燥し得るどのような吸着剤、吸
湿性剤又は多孔質剤をも含み得る。例えば圧縮されたセ
ルロース材から作られている紙片又は円形紙のような様
々な形態の、紙又はニトロセルロースであるような天然
又は合成セルロース材のような血液測定分野に於いて公
知の多数の適当な支持体が使用され得る。様々の形態の
紙片又は円形紙、例えば、１紙、クロマトグラフィ紙又
は検体採取紙（ｓｐｅｃ　ｉｍＱｎ　Ｃ０１ｌｅＣｔｉ
Ｏｎ　ｐａｐｅｒ）が使用され得る。この例にはシュラ
イヒャー・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈ
ｕｅｌｌ）社製（ケーネ（Ｋｅｅｎｅ）　、ニュー　Ａ
ンプシｔ　−（Ｎｅｗ　ＨａｌｌｌｐＳｈｉｒｅ））の
ワットマン・グレード（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｇｒａｄｅ）
　５４及び＄９０３■Ｈがある。更に適当な支持物とし
ては、ガラス、綿のような天然繊維、並びにテフロン、
ナイロン、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポ
リオレフィン゛の合成材料のような繊維性の物質がある
。ガラス又は合成材料の場合には、例えば焼結、フリッ
ト状けｒｉｔｔｅｄ）又は多孔質支持体のように非繊維
状の形態に製造されたものでも使用され得る。試料は試
験管又は他の適当な試料容器の内側表面上で乾燥され得
る。

付は加えると、バイアルや試験管に収容された吸着剤パ
ウダーの形態でも適当な支持体として使用され得る。血
漿試料又は血清試料をこのような支持体上で乾燥させて
使用することにより、試料の安定性、輸送及び貯蔵の点
に於いて血漿自体に対して多大の利点を生じ、実際に検
査を行なう場所から遠く離れた場所に居る患者から採取
した試料を、本発明に係わる方法で検査することが可能
になる。このように支持体上で調製された試料は脂質結
合シアル酸濃度に著しい変化を起こさせることなく、例
えば船による輸送中又は貯蔵中に室温で１週間までは保
管できる。好適例に於いては、紙片は試料安定性を高め
るような溶液に浸す。この溶液として例えば、ｐＨ７〜
８のＮａＨＣＯ３溶液、１％アジ化ナトリウム溶液（Ｗ
／Ｖ）、０．０１〜１．０％ベンズアミジン塩酸塩溶液
（Ｗ／Ｖ）、０．００１〜０．０１％フェニルメチルス
ルフオニルフルオリド溶液（Ｗ／Ｖ）がある。更に、標
準既知試料は前記のいずれの方法を用いても調製され得
る。　′ 本発明に係わる方法に於ける最初の段階は所定用の血漿
試料又は血清試料を蒸留水で希釈づることである。希釈
溶液の容量は約２〜５倍、例えば最初の血漿試料容量の
約４倍である。つまり最初の血漿試料又は血清試料が小
試験管又は小容器に５０μ女入っている場合には蒸留水
を １５０μ９加えて２００μｐの希釈試料、すなわち最初
の試料の約４倍量の試料にする。もし最初の試料が紙又
は他の適当な支持体上で乾燥されているような場合には
、希釈容量はその試料の乾燥する前の容量をもとに決め
られる。つまり５０μρの血漿試料を支持体上で乾燥さ
せた場合には、再び加える蒸留水の量は１５０μρとな
り得る。

この希釈試料を実質的に均一な試料を得るまで、例えば
少なくとも５秒間、例えば渦動（Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）
によって混合する。この希釈混合物を例えば試料試験管
又は容器を砕氷中につけることによって約０〜５℃まで
冷却する。

容積比が約２：１である塩化低級アルキル炭化水素及び
低級アルキルアルコールの混合物を該冷却試料に添加す
る。この塩化炭化水素とアルコールの混合物は最初のす
なわち所定の血漿量の約６０倍であり、その温度は約Ｏ
〜５℃である。つまり最初の試料容積が５０μ夕である
場合は、添加する該混合物の量は約３７である。適当な
塩化炭化水素としてはクロロホルム、塩化メチレン、塩
化エチレン、塩化プロピレンであり、四塩化炭素とクロ
ロホルムが稈在好ましいものである。低級アルキルアル
コールとしてはメタノール、エタノール、プロパツール
、ｎ−ブタノール、イソプロパツール、イソブタノール
又はイソアミルアルコールを含み得る。しかしながら表
■が示すように、アルコール中の炭素数が多くなると総
シアル酸の抽出とは逆に脂質結合シアル酸を抽出する効
果が薄れる。別な言い方をすれば、アルコール中の炭素
数が多くなれば脂質に結合していないシアル酸の沈澱ｍ
が増加する。従ってメタノールが好ましい。なぜなら他
のアルコールは総シアル酸、すなわち脂質結合及び非結
合シアル酸並びに他の不純物をより多く抽出してしまい
、それ故検査の診断値を低いものにしてしまう。

この混和物を試料中に存在する物質が塩化炭化水素／ア
ルコール混合物に溶解するまでの適当な時間混合させる
。好ましくは、少なくとも２０秒間穏やかに断続的に渦
動し、さらに好ましくは、少なくとも１０秒間、３回の
中断を含んで穏やかに渦動し、その後少なくとも２０秒
間静置し、更に少なくとも１０秒間、３回の中断を含ん
で穏やかに渦動させる。不適当に又は余り激しく渦動さ
せると測定結果に影響を及ぼし得る。この混合物を１）
　Ｈ５〜６、約Ｏ〜５℃の脱イオン蒸留水で希釈する。

この加える脱イオン蒸留水の吊は所定量の血漿又は血清
の１０倍である。つまり、最初の血漿試料が５０μρの
場合は塩化炭化水素とアルコール混合物は３ｄで、添加
する水のｍは約Ｑ、　５ｄになる。

この希釈混合物を適当な時間混合する。例えば少なくと
も２０秒間断続的に穏やかに渦動し、さらに好ましくは
、少なくとも１０秒間、３回の中断を含んで渦動し、そ
の後少なくとも２０秒間静置し、更に少なくとも１０秒
間、３回の中断を含んで渦動させる。この段階に於いて
も不適当に又は余り激しく渦動させると測定結果に影響
を及ぼし得る。これを約２０００　ｒｌ）ＩＩＩ　（７
５０Ｘ　ｇ）より高速で少なくとも約２分間遠心し実質
的に透明な上層を得る。

一定量を実質的に透明な上層から分離回収し、好ましく
は上層を分離回収し下層は捨てる。回収する量は最初の
血漿試料の最に依る。つまり、最初の血漿容量が約５０
μρの場合、分離回収される上層の量は約１ｄになる。

この分離回収する量は試験管中の他の物質や界面を乱す
ことがなく多量の上層液が回収できるように決められる
。

分離回収した該上層液に、脂質結合シアル酸を沈澱させ
この沈澱脂質結合シアル酸を吸着させるのに有効な量の
タンパク質沈澱剤と吸着物質の混合物を加える。適当な
タンパク質沈澱剤としてはリンタングステン酸、１〜リ
クロロ酢酸、硫酸アンモニウム（例えばｐＨ４，０〜６
．０緩衝液中の飽和溶液）又はそれらの混合物（例えば
９０％リンクンゲス７ン酸、１０％トリクロロ酢酸）を
含む。適当な吸着物質としては、シリカ及びシリカゲル
のような石英質物質並びに酸化アルミニウムを含み、他
の結合物質を加えても加えなくても良い。タンパク質沈
澱剤と吸着物質の割合は乾燥重量にして約３：１である
。現在好ましいとされる混合物は約７５％のリンタング
ステン酸と約２５％のシリカゲル（乾燥重量にて）を含
み、加える量は上層液１ｄにつき約６０−８０　ｍｙで
ある。現在好ましいどされるシリカゲルはｊＶＩｃＢマ
ニファクチュアケミスト・インコーポレーション（Ｈａ
ｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ｉｎｃ、
、）製のグレード（Ｇｒａｄｅｓ）９５０及び６２（６
０−２００メツシユ）である。もう１つの好適混合物は
シリカゲルの代りに約２５％のＡｌ１　０　（７０’Ｊ
シ／Ｌｚ（Ｈｏｒｉｓｉｌ■）、３０−６０　メ３ ッシュ）を含むものである。該混和物を混合し、例えば
短時間（少なくとも３秒間）渦動し、生成した沈澱を例
えば約２０００　ｒｐｍより高速で少なくとも３分間遠
心して回収し、上清を捨てる。該沈澱物を操作し易い量
、例えば約１−の蒸留水に懸濁させ、この懸濁液中の脂
質結合シアル酸、従って血漿試料中の脂質結合シアル酸
の量を決定する。より明確には、沈澱の懸濁液に適量の
例えば１ｄのレソルシノール試剤を加え撹拌し、１５分
間沸騰させ、少なくとも約１０分間アイスバス中で冷却
し、約２０００　ｒｐｍで少なくとも２分間遠心し、レ
リルソノール試剤の２倍量、例えば２ｄの酢酸ブチルと
ｎ−ブタノール（８５：　１５Ｖ／Ｖ）の混合物を加え
、混合し、約２０００　ｒｐｍより高速で少なくとも５
分間遠心し、有機相を分離し、５８０ｎｍに置いて有機
相に抽出された青色を読み取り、同じ条件で公知のｎ−
アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）から誘導された標準
曲線と以下の式を用いて脂質結合シアル酸量を決定する
。

ＬＳＡ（ｍｙ／１００ｍ血漿） ＝＜ｘ・ｉｏ”μ女）／（Ｙ−Ｚμｐ・１０００）上式
中に於いて、Ｘ−標準曲線から読み取ったＮＡＮＡｍ　
（γ） ｙ−［分離回収した上層部の但÷上層液の全ｍ」、７−
所定の血漿又は血清試料のｍｌ例えば５０μρである。

本発明の様々な実施例に於ける試料の操作及び取扱いの
様々な段階のもの、例えば試薬の添加、冷却、混合、分
離回収、遠心操作、などは自動化され得る。例えばシリ
ンジ、運搬チューブ、遠心機、渦動機（ｖｏｒｔｅｘｅ
ｒ）又は他の混合装置等の試料操作を行なうことができ
る機器が適当に結合されている適当にプログラム化され
たロボット装置によって例えば自動化され得る。ジャケ
ットで覆われた運搬チューブ又は容器であって、ジャケ
ット部に、適当な温度に冷゛却維持されている冷媒液が
供給されているものを用いることによって試料や物質は
適当に冷却され得る。同様にして、シアル酸による光吸
収もロボット装置と適当につながっている適当にプログ
ラム化された測定装置、例えば分光度計で測定され得る
。同様にして、脂質結合シアル酸含量も測定機器と適当
に結合されている適当にプログラムされたコンピュータ
ー、例えばマイクロコンピュータ−を用いて光吸収から
直接計算し得る。前述のように自動化づることによって
、コストの低下と測定誤差の減少が達成され得る。

本発明は更に被検者の血漿又は血清中の脂質結合シアル
酸量を本明細書に記載の方法に従って測定し、この値を
ガン患者から得られたその値と比較づるか、そうでなけ
れば、同被検者に関して一定期間にわｌζつて得られた
値と比較することを含むヒトのガン診断方法を提供する
。

更に本発明は以下に示すようなものを含むガン診断用キ
ットを提供する。該キットに含まれるものとしては、例
えば支持体として試料検査用紙片又は円形試料検査用紙
で好ましくは試料安定化剤を浸み込ませたもの、例えば
既知量の対照試料及び標準ｎ−アセチルノイラミン酸を
浸み込ませて乾燥さＵ゛た支持体、クロル化炭化水素及
び低級アルキルアルコール混合物（２：１Ｖ／ｖ）、タ
ンパク質沈澱剤及び吸着物質の混合物、レソルシノール
試剤、ブヂル酢酸及びｎ−ブタノール混合物（８５：　
１５Ｖ／Ｖ）、脱イオン蒸留水及び試料用ピペットチッ
プがある。

最後に、本発明は例えばクロル化炭化水素と低級アルキ
ルアルコールの混合物を用いて試料から脂質結合シアル
酸を抽出し、その後タンパク質沈澱剤を用いてこれを沈
澱させることを含むヒト血漿又は血清中の脂質結合シア
ル酸の定量法の改良に係わる。

この改良点はタンパク質沈澱剤と混和させて吸着物質を
用いることであり、この吸着物質は脂質結合シアル酸を
沈澱させこれを該吸着物質に吸着させるのに有効な闇で
ある。

この改良点を実施することで該試験方法中のパラメータ
ーが広い範囲にわたって変動しても以前の方法に較べ、
本発明が優れた利点を提供するであろう。そしてまた本
明細書中の更に詳しい実施例がより一般的な方法の具体
例としては唯一好適なものであることが証明されるであ
ろう。

以下に述べる実施例は本発明の理解を助ける為になされ
、クレーム中に記載された本発明をどのような意味に於
いても限定しようと意図したものではないし、又そう解
釈してはならない。

血漿採取 液状ＥＤＴＡを含むバキュテインナー（Ｖａｃｕｔａｉ
ｎｅｒ、紫色ねし）（１５％ＥＤＴＡを含むベノジェク
ト・ラベンダー・ストッパー・デユープ）又は［Ｄ丁へ
でコートされたビーズを含むマイクｔコデインナーに全
血を採取する。このデユープを数回逆さにして混合した
後、ベンチ型臨床用遠心礪（Ｉ　ＥＣＨＮ−８−Ｉ　Ｉ
遠心機、デーモン／インターナショナル・イクウィプメ
ント・コーポレーション（Ｄａｍｏｎ／Ｔｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｅ　ｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、、）とＩ
ＥＣ臂９５８６本用ローター）を用いて２２０Ｏｒｐｍ
にて１０分間遠心する。分離された血漿の一部を直ちに
分析にまねずか又は−２０℃にて数ケ月間保存する。

実施例２ ５０μ女の血漿試料中の脂　結合シアル酸の定量実施例
１に従って調製した血漿試料５０μｐを適当な試験管又
は容器に取る。１５０μρの蒸留水を加え、この混合物
を５秒間渦動した後、この容器を砕氷中に移す。３戒の
クロロホルム・メタノール混合物（２：１）（４〜５℃
）を添加する。

クロロボルム、メタノール及び他の溶媒はマリンクロッ
ト・インコーポレーション（Ｍａｌ　ｌ　１ｎｃｋｒｏ
ｄｔＩｎｃ、、　）社の分析試薬（ＡＲ）グレードのも
のを用いた。この混合物を３回の中断を含み１０秒間渦
動しくボルテツクスージーニエ（ＶＯｒｔｆ！Ｘ−Ｇｅ
ｎ１ｅ）、サイエンティフィク・インダストリー・イン
コーポレーション（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、））、その４０秒後にもう１度、
３回の中断を含み１０秒間渦動した（渦動時間総計は２
０秒間である）。

ｐ　ｌ−１５〜６の脱イオン蒸留水（４〜５℃）０．５
ｄを加え、この混合物を３回の中断を含み１０秒間渦動
し、その４０秒後にもう１度３回の中断を含み１０秒間
渦動した。この接法試料を２５００＋’ｐｍにて５分間
遠心した。この上層液の１ｒｎｆ！、を別な試験管に移
し、これに７５％リンタングステン酸（ＡＲグレード、
シグマ）及び２５％シリカゲル（６０Ｆ２５４．ＭＣＢ
マニファクチュアケミスト・インコーポレーション（Ｍ
ａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＣｈ（４ｍ１ｓｔｓ、　Ｉｎ
ｃ、　）の乾燥粉末状混合物を６０〜８（Ｃｙを加えた
。該混合物を短時間渦動し、２０００　ｒｌｌｍより高
速で５分間遠心した。この上清を除去し、生成した沈澱
を短時間渦動し１ｄの蒸留水を加え、もう１度短時間渦
動した。０〜４℃のレソルシノール試剤１ｄを加えた。

これを渦動し１５分間沸騰水中に置いた。この後直ちに
氷水バス中に移し、５分間放置した。その後肢冷却試験
管を２０００　ｒｌ）ｍより高速で１〜２分間遠心した
。ブチル酢酸：ブタノールの混合物（８５：１５Ｖ／Ｖ
）２ｍを加え、渦動し２００　Ｏｒｐｍより高速で５分
間遠心した。抽出された青色を５８０　ｎｍで測定しく
モデル３４分光光度計、ベックマン・インストラメント
・インコーポレーション（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒ
ｕｉｎｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、））、ｎ−アセチルノイラミ
ン酸から誘導された標準曲線と以下の式を用いて脂質結
合シアル酸を定量した。

ＬＳＡ　（■／１００ｍ血漿）− （Ｘ・１０”μｌ／（Ｖ・５０μ受・１０００）上式中
に於いて、 Ｘ＝標準曲線から読み取ったＮＡＮＡ量（γ）ｙ−［１
ｍの分離回収した上層但／上層全量］である。

実施例３ 紙片の使用 １、ＯＸｏ、５Ｃｍ片状の血漿採取紙（シュライヒャー
・シ］−Ｉル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ
ｌｌ　＃９０３）を使用する。５０μ９の血漿をピペッ
トとチップを用いて該紙片」−に載せた。紙片を空気中
で５分間乾燥させ、分析用試験管に移す際に鋏で細かく
切断した。この試験管に栓をして次の操作まで室温で保
管した。これに１５０μΩの蒸留水を加え続いて実施例
２に記載の操作を施した。

実施例４ １文葛の調製 ０．１％のアジ化ナトリウム水溶液を調製した（　７　
インｐ　−（Ｆｉｓｈｅｒ）、３１６ＭＡ、精製品を使
用）。５０μρの該溶液を実施例３で用いた紙片に浸み
込ませた。これを熱風で乾燥させた。これに５０μ９の
血漿を分析前に載せた。分析に先立ってこの紙片は室温
に於いて相当期間保存可能であった。

１００ｍのメスフラス−１（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ　ｆ
ｌａｓｋ）ｋ−２ｇのレソルシノール（シグマ、＃Ｒ−
１０００＞を秤量し、蒸留水を目盛まで入れ、その溶液
を遮光ビンで冷蔵保存した。

１００ｍのメスフラスコにＣｕＳＯ４’５日２０を２．
４９７ｇ秤量し目盛りまで蒸留水を加えた。

レソルシノール試剤の調製 １００にのメスフラスコに以下のものを加えた。

ａ）２％レソルシノール保存液１０ｄ０ｂ）０．１Ｍ　
ＣｕＳＯ４０，２５ｄ（混合）。

Ｃ〉蒸留水９．７５ｍ（混合）。

ｄ　）　ｌ−Ｉ　Ｃρで１００ＩＲ１！、の目盛りまで
満たず。

これを混合し遮光容器に移し、０〜５℃で保存しｌこ。

実施例６ 対照試料の調製 既知ＬＳＡ濃度の試料５０μ女を実施例３で用いた紙片
に吸収させた。この紙片（１，０’ＸＯ，５ｃｍ＞を空
気中で５分間乾燥させ、分析用試験管に移ず際に鋏で細
かく切断した。この試験管に栓をして実施例２に記載の
操作を施すまで保存した。

実施例７ １ｍ９／ｄ！ｍ度のＮ−アセチルノイラミン酸く９８％
シグマ）を用いて標準ＮＡＮＡ溶液を作成した。５０μ
女の血漿の代りに該標準ＮＡＮＡ溶液５，１０及び１５
μｐを用いて同様の操作を行なった。

更に実施例２に記載の操作を行ないＬＳＡ含量を定量し
、標準曲線を作成し本発明の方法により定量された値と
の比較対照に使用し得た。

実施例８ 表■に於いて、米国特許４，３４２，５６７号及び本発
明の方法を用いて脂質結合シアルｌ１ｆｌをそれが正常
範囲と低量範囲にある場合について定量した結果を示し
た。この表から明らかなように、本発明の方法でめた値
の標準偏差は先行技術でめた値のそれよりも著しく小さ
かった。

コ 丈Ｊ１引旦 ■ ＬＡＳＡとガン患者に於ける腫瘍との間に相関関係のあ
ることが見いだされている（カトボジス−ｘ　？　（Ｋ
ａｔｏｐｏｄｉｓ　Ｎ、　）等Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒＣｈ、　１９８２）ＬＡＳＡの値を３４人のＣＬＬ
患者と、対照として悪性腫瘍のない１００人の患者につ
いて測定した。患者の病期（ステージ）はライ臨床病期
基準（Ｒａｉ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｓｔａｇｉｎｇ　ｃ
ｒｉｔｅｒｉａ）によって決められた。その結果を以下
に示した。

患者番号　平均値＋標準偏差　範　囲 ＜ｍｇ／ｄ　ｌ　）　（ｍｙ／ｄ　ｌ　）コントロール
　１００　１８．１±３．１　９−２１ステージ　０　
１１　１８．８±３．４　１４−２７ステージ　Ｉ　５
　２１．８±３．２　１７−２８ステージ　ｎ　１０　
２３．０±５．４　１７−３４ステージ　Ｉ［Ｉ／ＩＶ
　８　２６．６＋７．８　２０−４５１２名の患者につ
いて６ケ月間にわたって継続的に測定された。このうち
の９名についてＬＡＳＡ値と臨床状態は変化しなかった
。又１２名の患者のうちの３名についてはＬＡＳＡ値が
上がり、病状の悪化も見られた。更に１２名の患者のう
ちの２名については臨床的に明らかな病状の悪化に先立
つこと４〜６週間の時期にＬＡＳＡ値の上昇が見られた
。

これらの結果から、ＬＡＳＡ値が臨床上の病状悪化と相
関関係があり、ＣＬ　Ｌ患者の病状を監視する上で価値
のあることが示唆される。

実施例１０ 卵巣ガン患者のＣＡ−１２５、ＣＥＡ及びＬＳＡ悲覧１ ５名の卵巣ガン患者の血清を検体として用いて、ＣＥＡ
、ＣＡ−１２５及び脂質結合シアル酸（ＬＳＡ）の３つ
の腫瘍マーカーを継続的に測定した。ＣＥＡ及びＣＡ−
１２５抗原はそれぞれアボット・ラボラトリ−１Ｎｏ、
、シカゴ、イリノイ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｎｏ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ、）及びセン
トコ−拳マルバーンパ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｈａｌｖｅ
ｒｎ　Ｐａ、、）製の市販試薬を用いて測定した。ＬＳ
Ａは実施例２に記載の方法で測定した。診断時に５名の
患者から入手した検体の全てに於いてＬＳＡとＣＡ−１
２５の両者に高い値が見られた。ＣＥＡの値はどの検体
に於いても高くはなかった。５名の全ての患者に於いて
、手術及び代学療法の後ではＬＳＡ及びＯＡ、−１２５
が正常値まで低下していた。それらの治療後２年に亘る
追跡期間の間、病状が現われなかったこのうちの２名の
患者に於いては、この２つの値は正常値に維持されてい
た。

残り３名については病状が進行又は再発するのに伴ない
ＣＡ−１２５及びＬＳＡの両者の値ともに増加が見られ
た。そのうちの１名の患者については再発が臨床上明確
になる時期の約１ケ月前にＬＳＡ値の増加が見られた。

一方、０Ａ−１２５は再発が臨床上明確になった時点で
その値の増加が見られた。

以上の試料の範囲内では、ＬＳＡ及びＣＡ−１２５測定
は卵巣ガン患者の監視に有用であるように思われる。し
かしながら、ＣＥＡ測定は役に立たないように思われる
。ＬＳＡ及び０Ａ−１２５の値を組み合わせて使うと特
に有望な監視手段になると思われる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　以下の各段階： （ａ）所定量の血漿試料又は血清試料を該試料の所定量
   の約４倍まで蒸留水で希釈し、（ｂ）該希釈試料が実質
   的に均一な試料になるまで適当な時間該希釈試料を混合
   し、 （Ｃ）該混合希釈試料を約０〜５℃に冷却し、（ｄｉ！
   ａ度が約Ｏ〜５℃であり体積比が約２＝１である塩化低
   級アルキル炭化水素及び低級アルキルアルコールの混合
   物を該冷却試料に血漿試料又は血清試料の所定量の約６
   ０倍加え、 （ｅ）該試料中に存在する物質が塩化炭化水素とアルコ
   ールの該混合物中に溶解するまで適当な時間該混和物を
   混合し、 （ｆ）血漿試料又は血清試料の所定量の約１０倍量で温
   度が約０〜５℃の脱イオン蒸留水で該混和物を希釈し、 （ｌ実質的に透明な上層が形成されるまで適当な時間該
   希釈混和物を処理し、 （ｈ）このようにして形成された実質的に透明な上層か
   ら一定量の上層を分離回収し、（ｉ）脂質結合シアル酸
   を沈澱させその沈澱脂質結合シアル酸を吸着させるのに
   有効な量のタンパク質沈澱剤及び吸着物質の混合物を前
   記一定量の上層に加え、 （ｊ）得られた混和物を混合し、 （ｋ）その結果形成された吸着沈澱物を分離回収し、 （１）該沈澱物を適当量の蒸留水中に懸濁させ、（ｍ）
   懸濁沈澱物中に存在する脂質結合シアル酸量を測定し、
   もって血漿試料又は血清試料中の脂質結合シアル酸を定
   量する；を含むヒト血漿試料又はヒト血清試料中の脂質
   結合シアル酸の定量法。 （２、特許請求の範囲第１項に記載の（ａ）段階に於い
   て、試料の所定量が約５０μ女であり、それを約１５０
   μρの蒸留水で希釈することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の定量法。 （３）　特許請求の範囲第１項に記載の＜ｂ）段階に於
   いて、混合が少なくとも５秒間の渦動を含むことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （４）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｄ）段階に於
   いて、加える混合物の量が約３−であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項に記載の定量法。 （５）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｄ）段階に於
   いて、低級アルキルアルコールがメタノール、エタノー
   ル、プロパツール、ｎ−ブタノール、イソプロパツール
   、イソブタノール又はイソアミルアルコールであること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の定量法。 （６）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｄ）段階に於
   いて、低級アルキルアルコールがメタノールであること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の定量法。 （７）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｄ）段階に於
   いて、塩化低級アルキル炭化水素がクロロホルムである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法
   。 （８）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｅ）段階に於
   いて、混合が中断を含む少なくとも２０秒間の穏やかな
   渦動を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の定量法。 くっ）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｆ）段階に於
   いて、加える水の量が０．５７であることを特徴とする
   特許請求の範囲第２項に記載の定量法。 （１０）　特許請求の範囲第１項に記載の（０）段階に
   於いて、処理が中断を含む少な（とも２０秒間の穏やか
   な渦動とそれに続く少なくとも５分間の約２０００　ｒ
   ｌ）ｍより高速での遠心を含むことを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の定量法。 （１１）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｈ）段階に
   於いて、分離回収が下層から上層を採取することを含む
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法
   。 （１２）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｈ）段階に
   於いて、上層の一定量が約１−であることを特徴とする
   特許請求の範囲第２項に記載の定量法。 （１３）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｉ）段階に
   於いて、タンパク質沈澱剤がリンタングステン酸、トリ
   クロロ酢酸、硫酸アンモニウム又はそれらの混合物であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量
   法。 （１４）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｉ）段階に
   於いて、吸着物質が石英質物質であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （１５）　石英質物質がシリカ又はシリカゲルであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の定量法
   。 （１６）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｉ）段階に
   於いて、タンパク質沈澱剤と吸着物質の混合物中の乾燥
   重量比が約３＝１であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の定量法。 （１７）　混合物が乾燥重量基準で約７５％のリンタン
   グステン酸及び約２５％のシリカゲルを含むことを特徴
   とする特許請求の範囲第１６項に記載の定量法。 （１８）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｉ）段階に
   於いて、混合物が乾燥型ｉ）基準で約７５％のリンタン
   グステン酸及び約２５％のシリカゲルを含みその混合物
   の吊が約６０−８０　ｍｇであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１２項に記載の定量法。 （１９）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｊ）段階に
   於いて、混合が少なくとも３秒間の渦動を含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （２０）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｋ）段階に
   於いて、分離回収が約２０００　ｒｌ）ｍより高速で少
   なくとも３分間遠心することを含む特許請求の範囲第１
   項に記載の定量法。 （２１）　特許請求の範囲第１項に記載の（１）段階に
   於いて、適当量が約１ｄであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１２項に記載の定量法。 （２２）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｍ）段階に
   於いて、懸濁沈澱物に適当量のレソルシノール試剤を加
   え、混合し、１５分間煮沸し、アイスバス中で約１０分
   間冷却し、約２０００　ｒｌ）ｍより高速で少なくとも
   ２分間遠心し、ブチル酢酸とｎ−ブタノールの混合物（
   ８５：　１５Ｖ／Ｖ）を該蒸留水の約２倍量加え、混合
   し、約２００　Ｏｒｐｍより高速で約５分間遠心し、有
   機相を分離し、該有様相中に抽出された青色を５８０１
   ｍで測定し、同条件下でｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ
   ＡＮＡ）既知試料の測定から誘導した標準曲線と以下の
   式：％式％） ） ［式中、 Ｘ＝標準曲線から読み取ったＮＡＮＡｉ　（γ）ｙ＝（
   分離回収した上層量／上層全量）及びＺ−血漿試料又は
   血清試料の所定母を示す］を用いて脂質結合シアル酸量
   を測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の定量法。 （２３）　適当量のレソルシノール試剤が約１＃Ｉｉ！
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２２項に記載
   の定量法。 （２４）　特許請求の範囲第１項に記、載の（ａ）段階
   に於いて、検査用の血漿試料又は血清試料が紙又は弛の
   ｌＩｉ維状立状支持体で予め乾燥された形態であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （２５）　紙又は支持体が１紙片又は円形１紙であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （２６）　血漿試料又は血清試料がその上で乾燥してい
   る紙又は支持体が予め安定剤を含浸していることを特徴
   とする特許請求の範囲第２４項に記載の定量法。 （２７）　安定剤がｐＨ７〜８のＮａＨＣＯ３溶液、又
   は１％（Ｗ／Ｖ）アジ過ナトリウム溶液、又はｏ、ｏｉ
   ％〜１．０％（ｌｌＩ／ｖ）ペンスアミシン塩酸塩溶液
   又は０．００１〜０．０１　％　（Ｗ／Ｖ）７ｘ二ルメ
   チルスルホニルフルオリド溶液であることを特徴とする
   特許請求の範囲第２６項に記載の定量法。 （２８）　特許請求の範囲第１項に記載の定量法を用い
   て被検者の血漿試料又は血清試料中の脂質結合シアル酸
   量を測定し、該測定値とガン患者について得られた値と
   を比較することを含むヒトのガン診断方法。 （２９）　特許請求の範囲第１項に記載の定量法を用い
   て被検者の血漿試料又は血清試料中の脂質結合シアル酸
   量を定期的に測定し、該測定値と該被検者について以前
   に得られている値とを比較することを含むヒトのガン診
   断方法。 （３０）　検査試料を載せる為の適当な試ｍ＋支持体、
   既知量の対照試料及び既知量の標準ｎ−アセチルノイラ
   ミン酸がその上で予め乾燥している試料支持体、塩化低
   級アルキル炭化水素及び低級アルキルアルコールの混合
   物（２：１Ｖ／Ｖ）、タンパク質沈澱剤及び吸着物質の
   混合物、レソルシノール試剤、ブチル酢酸及びｎ−ブタ
   ノールの混合物（８５：　１５Ｖ／Ｖ）、脱イオン蒸留
   水及び試料用ピペットチップを含むガン診断用キット。 （３１）　検査試料用紙片又は検査試料用円形紙、既知
   量の対照試料及び既知量の標準ｎ−アセチルノイラミン
   酸がその上で予め乾燥している紙片又は円形紙、クロロ
   ホルム及び低級アルキルアルコール混合物（２：１Ｖ／
   Ｖ）、タンパク質沈澱剤及び吸着物質の混合物、レソル
   シノール試剤、ブチル酢酸及びｎ−ブチノールの混合物
   （８５：１５Ｖ／Ｖ）、脱イオン蒸留水及び試料用ピペ
   ットチップを含むガン診断用キット。 （３２）　紙片又は円形紙に安定剤が含浸されているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載のガン診
   断用キット。 （３３）　低級アルキルアルコールがメタノール、タン
   パク質沈澱剤がリンタングステン酸及び吸着物質がシリ
   カゲルであり、それらが乾燥重量基準で７５％のリンタ
   ングステン酸と２５％のシリカゲルの混合物を成してい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載のガ
   ン診断用キット。 （３４）　脂質結合シアル酸を試料より抽出しタンパク
   質沈澱剤で沈澱することを含むヒト血漿試料又はヒト血
   清試料中の脂質結合シアル酸の定量法に於いて、吸着物
   質をタンパク質沈澱剤と混和して使用し、該混和物量は
   脂質結合シアル酸を沈澱させ該脂質結合シアル酸沈澱物
   を吸着物質に吸着させるに有効な量であることを特徴と
   する定量法。 （３５）　特許請求の範囲第１項に記載の（ｄ）段階に
   於いて、塩化低級アルキル炭化水素がクロロホルム、塩
   化メチレン、塩化エチレン、塩化プロピレン又は四塩化
   炭素であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の定量法。 （３６）　適当にプログラム化されたロボッｉ〜装置を
   用いて自動的に操作されることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載の定量法。 （以下余白）