JPS6027395A - フラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の対象、産業上の利用分野） 本発明は甘味を有する食品を製造する分野に使用される
。　更に具体的にはいわゆるＰ康食品を製造する分野に
使用される。

不発、明は、オウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａ
ｃｉｄｉｕｍ　・　ｓｐ、ＦＥＲＮ−ＰＮｏ、４２５７
　、ＡＴＣＣＮｏ、２０５２４菌）に菌体内転移酵素を
生成させ、この菌体内転移酵素であるフラクトシルトラ
ンスフェラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ）を利用して蔗糖から蔗糖にフラクトースが１
〜３個結合したｌ−ケスドース（１−Ｋｅｓｔｏｓｅ）
、ニスドース（ｎｙｓｔｏｓｅ）を主成分とすルア　ラ
フｌ−オリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏ−ｏ　ｌ　ｉｇｏ糖）を
製造するフラクトオリゴ糖の製造方法に関する。

蔗糖（シュクロース）にフラクトース（Ｆｒｕｃｔ。

ｓｅ）がβ−１，２結合したイヌリン型のフラクトオリ
ゴ糖、即ちｌ−ケスドース、ニスドースは、植物１例え
ばタマネギ、ニラ、キクイモ、カラスムギ等に含有され
ており、料理におけるまろやかな甘味料として使用され
ているが、単独の甘味料剤としては使用されていない。

微生物の生産する転移酵素を利用してのオリゴ糖生産に
関してはサイクロデキストリン・グルコサイル・トラン
スフェラーゼによるグルコ・オリゴ糖（商品名；カップ
リングーシュガー）があり、又パラチノース等について
も研究されている。しかし、オウレオバシディウム属の
フラクトシルトランスフェラーゼ含有菌体による蔗糖か
らフラクトオリゴ糖、即ちｌ−ケスドース、ニスドース
の生成については未だ提案されていないがアスペルギル
ス・オリーゼ（Ａｓｐ、ｏｒｙｚａｅ）等によるニスド
ースについては研究報告がある。

本発明者は、オウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａ
ｃｉｄｉｕｍ　＊　ｓｐ、　ＦＥＲＮ−ＰＮｏ、４２５
７　、　ＡＴＣＣＮｏ２０５２４菌）を、炭素源として
蔗糖のみを使用した培地で培養すると培養初期において
蔗糖は、グルコース〆 とフラクトースに分解されずに蔗糖の６０％以りが蔗糖
にフラクトースがβ−１，２で結合した１−ケスドース
、ニスドースになり、培養経過時間と共にフラクトオリ
ゴ糖は減少してグルコース、フラクトースが増加してき
、フラクトースの増加につれてフラクトースの２量体、
３＠体、即ちイヌロビオース、イヌロトリオースが増加
し、９６時間以上ではフラクトオリゴ糖は微量になるこ
とを見出した。

更に詳しくは、木発明者はオウレオバシディウム属によ
る多糖即ちプルラン又はβ−１，，３−１，６グルカン
の生合成酵素の研究を目的としており、培養培地中のグ
ルコース、フラクトースの増加は本菌による’＋１８性
インベルターゼと判断し、培養初期に検出されるグルコ
ースが蔗糖からフラクトオリゴ糖が生成するときに副成
するグルコースであることには気付かなかった。

また分析手法として培養培地中の糖をペーパークロマト
、還元糖で調べているために非還元糖であるフラクトオ
リゴ糖は検出できなかった。

本発明の動機は、多糖即ちプルラン又はβ−１，３−１
，６グル力ン培養時に培養培地に生成する糖、詳しくは
マンニトールを培養経時的に調べるために高速液体クロ
マト（ＨＬＰＣ）で培養培地を分析した際、三糖、四糖
が検出されるピーク位置に未知軸のピークを検出したこ
とである。

この糖を液体クロマト、ゲルクロマトで分別し足間した
結果、フラクトオリゴ糖であることが明らかになった。

第１図に木菌の培養初期における培養培地を高速液体ク
ロマトで分析した結果を示す。

更には木菌は炭素源として蔗糖を使用すると、他の培地
組成条件を変動しても培養初期には必ず培養培地にフラ
クトオリゴ糖を検出した。

この木実からオウレオバシディウム属菌が蔗糖からフラ
クトオリゴ糖を生成する転移酵素であるフラクトシルト
ランスフェラーゼを生成することを見い出し本発明を成
すに至った。

更には、このフラクトシルトランスフェラーゼは菌体内
酵素であることが明確になった。

この事は蔗糖を炭素源としてオウレオバシディウム属菌
を培養し、培養培地から菌体を物理的に分離することに
より極めて容易に目的とする酵素が生産できることを示
し、更には蔗糖溶液に分離菌体を一定力価添加すること
により蔗糖からフラクトオリゴ糖が容易に生産できるこ
とである。

更には菌体内酵素であるために固定化菌体として連続的
に蔗糖からフラクトオリゴ糖を生産できるものである。

（発明の構成） 本発明は、オウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃ
ｉｄｉｕｍ　＠　ｓｐ）の液体培養で得られた培養菌体
または菌体を含む培養液を、蔗糖（シュクロース）溶液
に添加または接触反応させて該菌体内に含有されている
菌体内転移酵素であるフラクトシルトランスフェラーゼ
で蔗糖を１−ケスドースとニスドースを主成分とするイ
ヌリン型のフラクトオリゴ糖に変えるフラクトオリゴ糖
あ製造方法である。　本発明で用いるオウレオバシディ
ウム属は、ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、４２５７　、　ＡＴＣＣ
Ｎｏ、　２０５２４菌として既に登録されている。

この菌体を液体培養して、培養菌体または菌体を含む培
養液を得る。

培養液の、培養培地組成として米糠０．１〜１重１４％
　、ヒタミ７Ｇ０．０１〜０．４重量２、蔗糖０．５〜
５重量２を使用し、２４時間以上通気攪拌培養するとβ
−１，３−１，８グルカンを含有するフラクトシルトラ
ンスフェラーゼが活性な菌体を含む培養液が得られる。

このオウレオバシディウム属　を蔗糖を炭素源として液
体培養すると、主として菌体内にフラクトシルトランス
フェラーゼ酵素、更に詳しくは蔗糖を供学体および受容
体として蔗糖にフラクトースを１分子づつ蔗糖のフラク
トースにβ−１，２結合で転移する酵素、即ち下記の転
移反応式を触媒する酵素で１反応生成物であるフラクト
オリゴ糖も蔗糖の受容体となり、フラクトースが１分子
多く結合したフラクトオリゴ糖になる。

この場合、いずれも必ず１モルのグルコースが生成され
る。

２（Ｇ−Ｆ）十酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ＋Ｇ Ｇ−Ｆ＋Ｇ−Ｆ−Ｆ十酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ＋ＧＧ−Ｆ
は蔗糖　Ｇ−Ｆ−Ｆは１−ケスドースＧはグルコース　
Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆはニスドースである。

オウレオバシディウム属は、蔗糖を炭素源として液体培
養すると、培養培地中の蔗糖を、フラクトオリゴ糖部ち
ｌ−ケスドース、ニスドース等に変化させると同時に菌
体内に転移酵素、即ちフラクトシルトランスフェラーゼ
酵素を含有した菌体ができ、るため、菌体を粗酵素とし
て利用できる。

しかし、炭素源として、フラクトース、グルコース、澱
粉等を使用する場合はフラクトシルトランスフェラーゼ
は菌体内に含有されない。

表１は炭素源を蔗糖のみとし、他の培地組成を変えて培
養した際の培養培地の糖組成と菌体中のフラクトシルト
ランスフェラーゼ活性を示している。

表１ 炭素源　蔗糖　蔗糖　蔗糖 窒素源　米糠　粉末酵母　粉末酵母 ビタミンＣ硝酸ソーダ 又は 酢酸亜鉛 Ｐ　、　Ｈ５，５５，５８，０〜８．５温度　２５−３
０　’０　２５−３０　’０　２５−３０　”０フラク
トシルトランスフエラーゼ活性 十＋＋ −Ｌ澄液中の糖組成 この表に示したように、フラクトシルトランスフェラー
ゼ活性は、炭素源として蔗糖を使用する場合に菌体内に
含有され、培養条件を変えてもフラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性は変わらない培養して得られたフラクトシ
ルトランスフェラーゼ活性菌体は、培養液から物理的に
分離して菌体として使用するか、又は菌体含有培養液の
状態で使用する２通りの方法があるが、表１の培養条件
ｌで木菌を培養した場合は培養培地から菌体を分離して
使用する事なく菌体を含む培養液をそのまま使用するこ
とが、より合理的であることを示し、ている。

即ち蔗糖、米糠、ビタミンＣの培地組成で培養した場合
は、培養液中にβ−ｔ、３−ｔ、ｅグルカンが生産され
ており、β−１，３−１，８グルカンは蔗糖またはフラ
クトオリゴ糖とのゲル形成が非常に強いために、フラク
トシルトランスフェラーゼ活性菌体を含むβ−１，３−
１，８グルカン培養液に蔗糖を加えて本酵素反応を行な
うとβ−１，３−１，Ｅｌグルカン特有のなめらかなゼ
リー状のフラクトオリゴ糖含有液が製造でき、濃縮など
の操作を必要とせずきわめて単純な操作でフラクトオリ
ゴ糖含有液が製造できる。

なお、このゲル形成はプルラン等微生物多糖にはみられ
ない物性であり、β−１，Ｆ−１，ｆｔグルカンにのみ
特有な物性である。この方法で製造されたフラクトオリ
ゴ糖含有液は、そのままジャム、ゼリーに使用でき、更
には甘味剤として２次加工してもβ−１，３−１，８グ
ルカンの物性により２次加工品に艶や、なめらかさ、伸
び等の特徴を保持させることができる。

この培養液を、蔗糖（シュクロース）溶液に添加または
接触反応させて該菌体内に含有されている菌体内転移酵
素であるフラクトシルトランスフェラーゼで蔗糖な１−
ケスＩ・−スとニスドースを主成分とするイヌリン型の
フラクトオリゴ糖に変える。

変化させる蔗糖と液体培養液との混合比は爪柾％で培養
液１に対して蔗糖が０．５以−ヒ、好ましくは１．０以
上である。　その反応条件は、基質濃度Ｂｒ１ｘ８０以
下、温度５０〜６５℃、ＰＨ５，０〜８．０、基質であ
る蔗糖１ｇに対して酵素力価が５Ｕ以上である。

次に菌体内酵素の作用特性について説明する。

上記方法で得られたフラクトシルトランスフェラーゼ活
性酵素含有菌体の酵素作用特性は至適ＰＨ５，０〜６．
０、至適温度５５〜６０℃である。

その結果を第２図に示す。

第２図の条件下では菌体内に含有されていると推定され
る異種酵素、即ちインベルターゼ、イソメラーゼの活性
は検出されないことが明らかとなった。

基質である蔗糖の特異性は、蔗糖を供与体および受容体
として２モルの蔗糖から１モルのグルコースと１モルの
１−ケスドースを生成する反応を触媒し、生成したフラ
クトオリゴ糖は蔗糖の受容体となり、更にフラクトース
が１分子多いフラクトオリゴ糖が生成される。

基本反応式は次の様に示すことができる。

２（Ｇ−Ｆ）十酵素→（Ｇ−Ｆ−Ｆ）＋ＧＧ−Ｆ−Ｆ＋
Ｇ−Ｆ十酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ＋Ｇ更に蔗糖を供与体と
して受容体がフラクトースの場合はフラクトースの２量
体、即ちイヌロビオースとグルコースを生成する。

この反応は以下の通りである。

Ｇ−Ｆ＋Ｆ十酵素→Ｆ−Ｆ＋Ｇ Ｇ−Ｆは蔗糖　Ｆはフラクト−ス Ｇはグルコース　Ｆ−Ｆはイヌロビオースである。また
フラクトース以外の受容体となりうる糖を調べた結果を
表２に示す。

表２ この事は本酵素の転移特性を利用すると受容体の糖を変
えることにより種々のフラクト−オリゴ糖を製造できる
０■能性な示している。

次に菌体内酵素の力価測定について説明する。

酵素製造に於て、生産された酵素の力を具体的に計測す
る物権が必要であり、通常力価、即ち（ｕ）で表示する
のが一般的である。

フラクトシルトランスフェラーゼは、蔗糖２モルから１
モルの１−ケスドースと１モルのグルコースを生成する
反応を触媒する。

従ってこの酵素反応が生成する範囲内、即ち庶糖のみを
基質として本酵素を作用させ、ニスドースを検出しない
初期反応で生成するグルコースを定量することにより１
本酵素の転移力価（ｕ）を表示することができる。

以下に明示した反応条件でグルコース量を定量してフラ
クトシルトランスフェラーゼの力価（Ｕ）として表示し
た 即ち、ｌ・マイクロモル・グルコース／　１　分＝　ｌ
　ｕとした。

基質として結晶枯製蔗糖を使用し、その濃度５０％（Ｗ
／Ｖ）、ＰＨ５，５〜５．７温度５５〜８０’１ｍ！、
反応時間３０分、攪拌１００　ｒ、ｐ、■で反応させ、
生成するグルコースをミクロソモギー法または高速液体
クロマト法で定量した。（高速液体クロマトの場合はピ
ーク面積より算出した。） 使用した高速液体クロマト装置は島滓製作所製ＬＣ−４
Ａ、使用カラムは、５ｃＲ−１ｏＩＮとポンダバック・
カーボハイドレイト・アナリシス（Ｂｏｎｄａｐａｋ　
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　テあ
る。ミクロソモギ一定量値と高速液体クロマト法分析値
に差がないことが明らかになったので１分析は主として
高速液体クロマト法で測定した０表３に力価測定条件と
反応式を示す。

表３ 酵素基質反応と酵素力価測定法 １ｔｔ ２Ｇ１　２Ｆ−Ｇ＋　２Ｆ”ｌ−λＦ十Ｇ庶蔗糖　ｌ−
ケスドース　グルコース 受容体 ’Ｊ　：　１ｕ＝　Ｉｅマイクロモル・グルコース／分
基質濃度　蔗糖５０％ 温度　５５〜６０”Ｏ ＰＨ５、６〜５．７ 反応時間　３０分 グルコースの定量　ミクロソモギー法 高速液体りロマト法 この反応によって、蔗糖は５０％以上フラクトオリゴ糖
に変換される。

この転移率が可能になったのは、 第１に菌体内転移酵素即ち、フラクトシルトランスフェ
ラーゼの力価が高く、しかも異種酵素であるインベルタ
ーゼ、イソメラーゼがないこと及び生産が容易にできる
こと、第２に菌体を酵素として利用できることと反応温
度が６０°Ｃと高く、反応濃度もＢｒ１ｘ７０でも良い
ことである。

本酵素の反応特性は蔗糖を供与体および受容体として供
与体の蔗糖のフラクト−スを受容体の蔗糖のフラクトー
スにβ−１，２結合で転移すると同時に、供与体のグル
コースを遊離することであり、更には反応生成物である
フラクトオリゴ糖が蔗糖の受容体となりうることである
。

この様にして蔗糖にフラクトースが１〜３個結合したフ
ラクトオリゴ糖が生成される。

蔗糖を供与体として、受容体になり得る糖にはフラクト
ースがあり、この場合反応生成糖は、フラクトースの２
♀一体、即ちイヌロビオース（ｉｎｕｌｌｏｂｉｏｓｅ
）とグルコースである。

この反応を利用するとフラクトシルトランスフェラーゼ
反応で生成するグルコースを異性化酵素でフラクトース
に異性化すると、フラクト−スはフラクトシルトランス
フェラーゼによって蔗糖、ｌ−ケスドース等と反応し、
フラクトースの２艮体、３徹体、即ちイヌロビオース（
ｉｎｕｌｌｏｂｏｓｅ）、イヌロトリオース（ｉｎｕｌ
ｌｏｔｒｉｏｓｅ　）とグルコースとを生成し、蔗糖な
８０％以上のフラクトオリゴ糖に変えることができる。

この酵素反応は次の通りである。

蔗糖　酵素 ２（Ｇ−Ｆ）子苗体内酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ＋ＧＧ＋イソメ
ラーゼーー　Ｆ Ｆ十Ｇ−Ｆ子苗体内酵素−→Ｆ−Ｆ十ＧＦ＋Ｇ−Ｆ−Ｆ
十菌体子苗素→Ｆ−Ｆ−Ｆ＋ＧＧ−Ｆは蔗糖　菌体内酵
素はフラクトシルトランスフェラーゼ　Ｇ−Ｆ−Ｆはｌ
−ケスドースＧはグルコース　Ｆはフラクトース Ｆ−Ｆはイヌロビオース Ｆ−Ｆ−Ｆはイヌロトリオースである。

具体的には蔗糖にフラクトシルトランスフェラーゼとイ
ソメラーゼ（異性化酵素）を同時に作用させるか、又は
フラクトシルトランスフエラー・ゼの作用後にイソメラ
ーゼを作用させることにより蔗糖を８０％以−Ｆ、フラ
クトースを含むフラクトオリゴ糖に変えることが実用的
に可能である。

」−記フラクトース以外に受容体になりうる糖は、ｌ−
ケスドース、ニスドース、ラフィノース（Ｒａｆｆｉｎ
ｏｓｅ）　、フラクトース（Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）等
で分子内にシュークロース結合、即ちグルコース、フラ
クトースがαｌ−２β結合が必要条件である。

このように１種々の糖が蔗糖を供与体としてフラクトシ
ルトランスフェラーゼの受容体になる。

これらの反応を表４および表５で表わす。

表４ 種菌　液体培養（培地組成） 培養時間（２４〜７２時間） ↓　菌体を含む培養液 菌体　（β−１，３−１，８グルカンを０．Ｈ以上含有
）表５ 種菌−ｍ−→　液体培養（培地組成） 培養時間（２４〜９８時間） 培養−電液　□↓ （実施例） 本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例１ ４０１の水道水に米ヌカ８０ｇ、ビタミン０８０ｇ、蔗
糖２Ｋｇを加え、これらを溶解した後カセイソーダでＰ
Ｈを５．５に調整し、１．２　Ｋｇ／ｃｒｎ’、＋１５
°Ｃで２０へ間加圧殺菌した。冷却後３リツトル正角フ
ラスコで静置培養した種菌１．５〜２．０１を接種し、
仕込量の１／２（ｖ／ｖ）の通気量で、温度２５℃テ１
０　Ｏｒ　ｐ　ｍで攪拌しながら通気培養した。

培養経過時間と共にβ−１，３−１，６グルカンの生産
濃度が増加し、０．３〜ｏ、４５％になる。

この培養で得られた４８蒔間培養液は、β−１，３−１
，８グルカンを含有しく含イ’ｕｊｃ０．３％以上）フ
ラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する菌体を含む
。このｊ８養液１文にグラニユー糖ＩＫｇを添加し温度
５５℃、ＰＨ６，０、１０Ｏｒ、ｐ、ｍ　テ攪拌し、酵
素反応を行なった。

この場合、β−１，３−１，［ｆグルカンの特性（蔗糖
と混合すると粘性が増大し、シェリー状になる性質）か
ら蔗糖液がジェリ〜状になるため（具体的にはみかけ粘
度が５００ＣＰ７２０℃以上になる）酵素反応速度は低
下するが、１６〜２０時間でオリゴ糖含有星（１−ケス
ドース、ニスドース）６０％以−ヒのオリゴ糖液が得ら
れ、これをｌｏｏ’ｃで１０分間殺菌してオリゴ糖液を
得る。

表６にその糖組成を示す。

得られたオリゴ糖液は、なめらかなシェリー状で、みか
けの物性は卵白に似ているが、粘度はＢｒ１ｘ５０の蔗
糖液が１５〜１１３ＣＰ７２０℃であるのに対してβ−
１，３−１，６グルカンが０．１５％混合されることに
より蔗糖濃度が同一で、その相対粘度は５５０〜ｅｏｏ
ｃＰ／２０℃になる。

表６の糖組成分析は高速液体クロマト（島津製、ＩＣ−
４Ａ型）で分析した結果であり使用カラトは５ＣＲ−１
０１Ｎとポンダパックーカーボハイドレイト・アナリシ
スである。

反応最終液オリゴ糖の各糖組成合計の構成糖、即ちグル
コースとフラクトースのモル比率はｌ：１であり、ｙ種
酵素の作用、即ち異性化酵素の作用は検出されない。

また、グルコースとフラクト−スのモル比率はｌ：１で
あることは本測定法による糖組成比率が正しいことを意
味している。

なお、上記培養液を２４時間毎に分取して遠心分１１１
１［：　（１００００ｒｐｍ／３０ｍ１ｎ）処理して菌
体を分離し、これを水洗した後乾燥して菌体内フラクト
シルトランスフェラーゼカ価を測定した。

また、菌体を含む培養培地でも同様にして力価を測定し
た。その結果を表７に示す。

゛　７ （鵠ピを凄ｉ停ンｇｒ　ブ１イｉ＠）＃Ｊ！ｍａｍ　／
ｋ　ｎ　＜ａ　ｔｔＭ＋イ）ゝ１≧ハイＣ−培”　ＰＨ
／１ｕｔｒ９＞　／９ｒＣＭＷ＠＠Ｉ／ＩＬＪ＊＠ｆｔ
）／１〔Ｑ＝ｊ５　／ｋｎｏｂ呪皿− ０８，８０ ２４６’、４　１０．０　２７２０　２７２００　４０
０００　８８４８　８．２　１５．６　２９９８４８７
３７　８２ＱＯＯ５７７’２　５．９　１９．．８　３
００θ　５９５１９　１２４（１００４８１１０５，８
２８，２２５０４８５８０４１Ｅｉ４０００　４０木２
２００００ 本７２時間で蔗糖添加 １８４１１９間経過毎の菌体内酵素力価（Ｕ）、即ちフ
ラグトシルトランスフェラーゼは、はとんど変化しない
が、１１０時間前後では低下してくる。

これは酵素が細胞外に可溶化してきたと考えられ同時に
１ｌｌ１１定した細胞外フラクトシルトランスフェラー
ゼ　が増加していることにより推定される。

培養培地中の蔗糖は培養時間２４時間でほとんどがフラ
クトオリゴ糖に変化するが、９６時間以−Ｆになると７
ラクトオリゴ糖は減少し、グルコース、フラクトースが
主成分の糖になる。

糖組成の変化を表８に示す。

表８ 培養経過時間 実施例２ １愛の水道水に５００ｇの蔗糖を加えて５０％庶糖溶液
を作り、ｐｏｅ、ｏに調整した後、基質蔗糖に対して実
施例１で得られた培養液を使用し、転移酵素力価（ｕ）
を蔗糖１ｇ当り５，１０．４０（ｕ　）添加して、５５
℃で１０Ｏｒｐ１００ｒｐ拌反応させ、各時間毎にオリ
ゴ糖成生率を高速液体クロマトで測定した。

グルコースの測定値はミクロソモギー法とも良く一致し
た。その結果を表９に示す。

表９ 酵素反応液の糖組成（重ψ％） ０．、ゆ−―−−１−−−−−−―−−−−−■―−−
―■■―■−■■−−■−４１１１１１″ｉ添加力価　
反応　ＧＧＦＧト賭ＧＦ、　ＧＦ５Ｆ　Ｆｉ／　ｇ　ｒ
＊、　１８　ＦＡｔ　Ｂ−一一−−−−−−−−−−−
−４ＯＡ　２　２Ｂ、８１０．４３２．Ｇ　２９．Ｇ　
ｏ、’ｓ　＋、３Ａ　２０　３５．４　６．７　１０．
１１８．４２０．１　２．５４２２．５１０　Ｂ　４　
２０．Ｑ　Ｉ’１．４　’）３．０　１Ｔ、ＯＯ，６Ｂ
　２０　２’７．９　Ｂ、＠２１，１３９．６０．２　
１．２０ｓ１０Ｂｒｉｘ７０　２４　２ｂ、０　１０．
Ｑ　３０．Ｑ　３０．Ｑ　１．Ｏｏ、６なお、Ｇはグル
コース、ＧＦはシュークロースＧＦはｌ−ケスドース、
ＧＦはニスドース、Ｆｔよフラクトース、Ｆはイヌロビ
オースである。

蔗糖の高濃度に於ても、即ちＢｒ１ｘ？Ｑでフラクトシ
ルトランスフェラーゼ反応が進む事は、工業化において
重要である。

また、添加酵素量と反応時間を調整することによりｌ−
ケスドースを４０％以上とするオリ′：ｉ糖液とニスド
ースを３９％以上とするオリゴ糖液を任意に製造するこ
とができる。

第３図にその反応曲線を示す。

又、基質濃度が低い場合はフラクトース含有量が増加し
、イヌロビオースが生成されるが、この反応は菌体内に
含有されていると推定されるイソメラーゼ、インベルタ
ーゼの作用によるのか、フラクトシルトランスフェラー
ゼ酵素の作用特性であるのかの２つが考えられるが１本
発明者は低基質濃度におけるフラクトシルトランスフェ
ラーゼの反応特性によるものと考えている。

この反応で得られたオリゴ糖液の液体クロマト分析結果
を第４図に示す。

なお、低濃度基質（蔗糖）における本酵素の反応結果を
第５図に示す。

本酵素の反応は、加水分解反応と相違して基質が高濃度
でも反応することが特徴である。即ち水分３０％の濃度
でもオリゴ糖が得られる。このことは、本酵素を使用し
て蔗糖からオリゴ糖を工業的に製造する重要な条件であ
る。

酵素反応終了液は１００’Ｃで１０分間加熱殺菌して製
品とするか、又は目的に応じて濾過、脱色して製品とす
る。

実施例３ ４０文の水道水に硝酸ナトリウム４００ｇ　、粉末酵母
４００ｇ、第１リン酸ソーダ４０ｇ、蔗糖８Ｋｇを加え
、溶解後カセイソーダでｐｎｅ、ｏに調整して１．２Ｋ
　ｇ　／　ｃ　ｍ”の圧力を加え１１５℃で２０分間加
圧￥：ｌ菌し、冷却後３０″Ｃで３文三角フラスコで静
置Ｊ’？；　ａした種菌１．５〜２．０文を接種して通
気培養した。

培養経過時間毎に菌体を遠心分Ｉｔ　（３０００ｒｐｍ
／１５分）して菌体を分取し、その力価を測定した。そ
の結果を表１０に示す。

ＬＱ 培養経過　ＰＨ菌体Ｆｌｋ　ｕ／ｇｒ　ｕ／ｍｌ　Ｔ、
ｕ／＋ｍ１ｗ？ｎｌｌ　ｉ度止力匹猛限襲１−−−−一
一一−ｏ、ｅ、ｏｏ　−−− ２４Ｂ、０　２．４　１１３０　１２．３３　３９．４
８４８　５．８　３．４２　１４７８　３５．４０　８
＋、＋５７２　５．８　４．０４　１４３４　Ｂ５．４
０　１２３．３３１１０　５．８　７．８０　７８０　
１０４．０　’　１８３．２８本培養培地の場合は、菌
体のみ増加しβ−１，３−１，６グルカンは全く生産さ
れていないので、菌体のみを７ラクＩ・シルトランスフ
ェ°ラーゼ酵素として使用する方法として適している。

又、培養培地い細胞外酵素と゛してフラクトシルトラン
スフェラーゼが検出され細胞外フラクトシルトランスフ
ェラーゼ酵素として利用可能であるがフラクトシルトラ
ンスフェラーゼ以外の他の酵素、即ちインベルターゼ、
イソメラーゼ等が含有されており、蔗糖の分解、グルコ
ースの異性化によるフラクトースの生成等でフラクトシ
ルトランスフェラーゼには蔗糖からのフラクト−オリゴ
糖生成率が低下する欠点があるために好ましくは菌体の
みを分離し゛Ｃフラクトシルトランスフェラーゼとして
利用することが望ましい。

菌体分離は通常の遠心分離または濾過により分取するこ
とができ乾燥操作後菌体を使用する。

こうして得られたフラクトシルトランスフェラーゼ活性
を有する菌を実施例２と同様の蔗糖溶液に接種し酵素反
応を行なった結果、゛実施例２と同様な結果が得られた
。

【図面の簡単な説明】

第１図はオウレオバシディウム属の培養初期における培
養培地を高速液体クロマトで分析した図、 第２図はフラクトシルトラ〉・スフェラーゼ活性酵素含
有菌体の酵素作用特性を示す図、第３図は基質（蔗糖）
に対し、フラクトシルトランスフェラーゼカ価を変動さ
せた時のフラクトオリゴ糖の生成率を示す図、 第４図は表９の酵素反応糖液の糖組成をペーパークロマ
ト分析したもので、Ｇ＝ニブルコースＧＦ＝シュクロー
ス、ＧＦ＝１−ケスドース、ＧＦ＝ニイストース、ＧＦ
＝１−フラクトフラノサイの酵素を添加し、各々４時間
、２０時間、反応したことを示している。 第５図は、基質（蔗糖）濃度が低い時のフラクトオリゴ
糖またはフラクトース生成率を示す図、なお、反応時間
は６０分間である。 第６図は表９の酵素反応糖液の液体クロマト分析を示す
。使用装置は島津製作所製、ＬＣ−４Ａ型で、使用カラ
ムはｌ０ＩＮである。 なお、ピーク（ｊ）　＝＝ニブルコースピーク■＝シュ
クロース、ピーク■；ｌ−ケスドース、ピーク■＝ニス
ドースを示し、ｌ−ケスドース、ニスドース含有廣は６
０％以上である。 第７図はフラクトオリゴ糖液からゲル濾過、即ちバイオ
ゲルＰ２と液体クロマトを併用してＧＦにニスドース）
を純粋に分離し、分離したニスドースのメチル化、アル
ジトールアセテート分析のガスクロマトグラムである。 第８、及び第９図はＧＦにニスドース）、イヌリン、レ
バン、シュークロースをメチル化したものの重クロロホ
ルム溶液の１３Ｃ−ＮＭＲを示す。 この結果、フラクトオリゴ糖のフラクトースはイヌリン
型結合、即ちβ、１．２結合をしていることを示してい
る。 第３図 Ｚ 第５図 第４図 一一＝− 一へｄＧ− 第６図 り 表９ｒ＋　１Ｏ８４，１０８２１）　／ＩＪ４＄７ｏマ
ド漕４ケ第７図 ■１ １１０　１００　９０　８０　７０　６０　５０　Ｐ、
Ｒ１第９図 手続補正書 昭和５８年１ｚ月２２日 昭和５８年　特許願第　１３４６６１　号２、発明の名
称 フラクトオリゴ糖の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　宮崎県日向市高砂町８２ 氏名　篠　原　智 ４、代理人　〒８３０　０９４２−３２−８７１１６、
補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明の欄」 ７、補正の内容 明細書第２０ページ　第１行目及び第１３行目の通気攪
のつぎに「拌」追加する番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）オウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｉｄ
   ｉｕｍ・ｓｐ）を液体培養で培養して培養菌体または菌
   体を含む＠養液を得、この培養菌体または菌体を含む培
   養液を蔗糖（シュクロース）溶液に添加または接触反応
   させて該菌体内に含有されている菌体内転移酵素である
   フラクトシルトランスフェラーゼで蔗糖を１−ケスドー
   ス（１−Ｋｅｓｔｏｓｅ）とニスド−ス　（ｎｙｓｔｏ
   ｓｅ　）を主成分とするイヌリン型のフラクトオリゴ糖
   （Ｆｒｕｃｔｏ−ｏ１ｉｇｏ糖）に変えるフラクトオリ
   ゴ糖の製造方法。
2. （２）液体培養の培養培地組成として米糠、ビタミンＣ
   １庶糖を含み、２４時間以上通気攪拌培養したβ−１，
   ３−１，８グルカンを含有するフラクトシルトランスフ
   ェラーゼが活性な菌体な含む培養液である特許請求の範
   囲第１項記載の７ラクトオリゴ糖の製造方法。
3. （３）反応させる蔗糖と液体培養液との混合比は重量％
   で培養液１に対して蔗糖が０．５以上である特許請求の
   範囲第１項記載のフラクトオリゴ糖の製造方法。
4. （４）反応条件は、基質濃度Ｂｒ１ｘ８０以下、温度５
   ０〜６５℃、Ｐ　Ｈ５，０〜８．０、基質である蔗糖１
   ｇに対して酵素力価が５ｕ以上である特許請求の範囲第
   １項、第２項または第３項記載のフラクトオリゴ糖の製
   造方法。