JPS6029475B2 - 固定化酵素膜及びその製造方法 - Google Patents
固定化酵素膜及びその製造方法Info
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- JPS6029475B2 JPS6029475B2 JP53119256A JP11925678A JPS6029475B2 JP S6029475 B2 JPS6029475 B2 JP S6029475B2 JP 53119256 A JP53119256 A JP 53119256A JP 11925678 A JP11925678 A JP 11925678A JP S6029475 B2 JPS6029475 B2 JP S6029475B2
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- B01D69/14—Dynamic membranes
- B01D69/141—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes
- B01D69/142—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes with "carriers"
- B01D69/144—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes with "carriers" containing embedded or bound biomolecules
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素膜及びその製造方法に関し、特に酵
素負荷量が大きく高活性で安定な固定化酵素膜及びその
製造方法に関する。
素負荷量が大きく高活性で安定な固定化酵素膜及びその
製造方法に関する。
従来、生体内における医学的に重要な物質である糖類、
コレステロール等その他の溶液中の徴量成分等を選択性
よく定量する方法として、固定化酵素膜を用いた分析法
が種々提案されている。
コレステロール等その他の溶液中の徴量成分等を選択性
よく定量する方法として、固定化酵素膜を用いた分析法
が種々提案されている。
これらの方法は、酵素のもつ基質特異性及び高い触媒活
性を利用して多成分液中の徴量成分の検出に有効な手段
となっている。しかしながら、これらの方法においては
、酵素の固定化方法に問題があり、未だ広く実用化され
ていない。従釆報告されている酵素を膜状又は膜に固定
化する方法としては、（１’酵素をポリアクリルアミド
ゲルで包括する方法〔Ｎａｔｍｅ，ｖｏ１２１４９８６
（１９６７）参照〕、■アルブミン等の不活性蛋白質を
マトリックス剤として混合し、これを架橋剤で架橋する
方法〔ＢｉｏｔｅＣｈ皿ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎ
ｇｎｅｅｎｎｇ，ＶｏｌＩ５３５９（１９７３）参照〕
、‘３｝炉紙又はセロフアンに酵素を吸収させ、これを
グルタルアルデヒドで架橋する方法 〔 Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｌｎｅｅｒｉｎ
ｇ ，ｖｏｌ１５３５９（１９７３）参照〕、■イオン
交換性のセルロースに酵素をイオン結合させる方法〔Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｌｎｅｅ
ｒｉｎｇ ， ｖｏｌ１３ ，（１９７１）参照〕、｛
５｝コラーゲン繊維の溶液に酵素を加え、電解槽に入れ
て通電し、電極上に酵素を包括したコフーゲン膜を亀着
させる方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔひ ， Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃｓ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍ皿ｉｃａ
ｔｉｏｎ，ｖｏｌ．４７５１（１９７２）参照〕、（６
｝多孔質有機高分子膜に酵素を物理化学的に固定化する
方法（特開昭５２−１７総計号公報参照）及び（７ー２
枚の膜の間に酵素ゲルをサンドイッチする方法（特関昭
５２−５５６９１号公報参照）等がある。
性を利用して多成分液中の徴量成分の検出に有効な手段
となっている。しかしながら、これらの方法においては
、酵素の固定化方法に問題があり、未だ広く実用化され
ていない。従釆報告されている酵素を膜状又は膜に固定
化する方法としては、（１’酵素をポリアクリルアミド
ゲルで包括する方法〔Ｎａｔｍｅ，ｖｏ１２１４９８６
（１９６７）参照〕、■アルブミン等の不活性蛋白質を
マトリックス剤として混合し、これを架橋剤で架橋する
方法〔ＢｉｏｔｅＣｈ皿ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎ
ｇｎｅｅｎｎｇ，ＶｏｌＩ５３５９（１９７３）参照〕
、‘３｝炉紙又はセロフアンに酵素を吸収させ、これを
グルタルアルデヒドで架橋する方法 〔 Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｌｎｅｅｒｉｎ
ｇ ，ｖｏｌ１５３５９（１９７３）参照〕、■イオン
交換性のセルロースに酵素をイオン結合させる方法〔Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｌｎｅｅ
ｒｉｎｇ ， ｖｏｌ１３ ，（１９７１）参照〕、｛
５｝コラーゲン繊維の溶液に酵素を加え、電解槽に入れ
て通電し、電極上に酵素を包括したコフーゲン膜を亀着
させる方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔひ ， Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃｓ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍ皿ｉｃａ
ｔｉｏｎ，ｖｏｌ．４７５１（１９７２）参照〕、（６
｝多孔質有機高分子膜に酵素を物理化学的に固定化する
方法（特開昭５２−１７総計号公報参照）及び（７ー２
枚の膜の間に酵素ゲルをサンドイッチする方法（特関昭
５２−５５６９１号公報参照）等がある。
しかしながら、｛１｝の方法は、酵素を多量に固定化で
きるが、強度が不十分で基質及び生成物の拡敵が悪いと
いう欠点がある。■の方法は、酵素負荷量は大きいが、
やはり強度が不足し又蛋白質であるため微生物に対する
耐性が不十分である。又、【３’の方法は、手軽ではあ
るが、酵素負荷量が十分でなく、又強度を上げるため膜
を厚くすると基質等の拡散が悪くなり、薄くすると強度
が不十分である。■及び｛５｝の方法も手軽であるが、
酵素と担体の結合が弱〈担体から酵素が容易に脱離する
。■の方法は、上記の欠点を補った方法であるが、多孔
質膜の孔の中に酵素を十分入れることができず、又、空
隙率も十分でないため酵素負荷量が不足するという欠点
がある。又、（７｝の方法は、酵素負荷量が多く欠点も
少ないが、薄い二枚の膜の間に酵素ゲルをサンドイッチ
するため製造方法が煩雑で製造費用が高くなるという欠
点がある。本発明は、このような現状に鑑みてなされた
ものであり、その目的は、上記の欠点を解消し、酵素負
荷量が大きく高活性で安定かつ高強度の固定化酵素膜及
びその製造方法を提供することである。本発明は上記目
的を達成するため次の構成をとるものである。
きるが、強度が不十分で基質及び生成物の拡敵が悪いと
いう欠点がある。■の方法は、酵素負荷量は大きいが、
やはり強度が不足し又蛋白質であるため微生物に対する
耐性が不十分である。又、【３’の方法は、手軽ではあ
るが、酵素負荷量が十分でなく、又強度を上げるため膜
を厚くすると基質等の拡散が悪くなり、薄くすると強度
が不十分である。■及び｛５｝の方法も手軽であるが、
酵素と担体の結合が弱〈担体から酵素が容易に脱離する
。■の方法は、上記の欠点を補った方法であるが、多孔
質膜の孔の中に酵素を十分入れることができず、又、空
隙率も十分でないため酵素負荷量が不足するという欠点
がある。又、（７｝の方法は、酵素負荷量が多く欠点も
少ないが、薄い二枚の膜の間に酵素ゲルをサンドイッチ
するため製造方法が煩雑で製造費用が高くなるという欠
点がある。本発明は、このような現状に鑑みてなされた
ものであり、その目的は、上記の欠点を解消し、酵素負
荷量が大きく高活性で安定かつ高強度の固定化酵素膜及
びその製造方法を提供することである。本発明は上記目
的を達成するため次の構成をとるものである。
すなわち、本発明の固定化酵素膜は、薄い繊密な層とそ
れより厚い多孔質層が一体に形成された膜から成り、か
つ該多孔質層の内部に酵素が固定されたことを特徴とす
るものであり、又、本発明の固定化酵素膜の製造方法は
、薄い織密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成さ
れた膜に酵素溶液を注入して酵素を該多孔質層に内蔵さ
せ「次にこれを架橋剤溶液に浸債することを特徴とする
ものである。本発明の固定化酵素膜について説明すると
、第１図は本発明の固定化酵素膜の断面図であり、１は
酵素を実質上浸透しないが、ガス及び液体を浸透できる
薄い繊密な層（以下単に均質層又はスキン層という。
れより厚い多孔質層が一体に形成された膜から成り、か
つ該多孔質層の内部に酵素が固定されたことを特徴とす
るものであり、又、本発明の固定化酵素膜の製造方法は
、薄い織密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成さ
れた膜に酵素溶液を注入して酵素を該多孔質層に内蔵さ
せ「次にこれを架橋剤溶液に浸債することを特徴とする
ものである。本発明の固定化酵素膜について説明すると
、第１図は本発明の固定化酵素膜の断面図であり、１は
酵素を実質上浸透しないが、ガス及び液体を浸透できる
薄い繊密な層（以下単に均質層又はスキン層という。
）であり、２は所望量の酵素を内蔵するに足る多孔性を
有するスポンジ層（以下単に多孔質層又はスポンジ層と
いう。）であり、各孔はスポンジ層内で相互に蓮通し、
この孔に酵素は架橋により固定される。そしてスキン層
１及びスポンジ層２は一体的に、好ましくは同質の素材
から形成されて不均質の膜（以下単に不均質膜という。
）を構成し、スポンジ層には酵素が固定され、固定化酵
素膜３を形成する。スキン層は酵素反応により増加又は
減少されそして測定される低分子量物質（イオン性物質
を含な）を浸透する性質を有する。本発明における不均
質膜は、逆巻透艇として−般に知られており、その製造
方法及び構造は既知であり、例えば、次の文献等に記載
されている。
有するスポンジ層（以下単に多孔質層又はスポンジ層と
いう。）であり、各孔はスポンジ層内で相互に蓮通し、
この孔に酵素は架橋により固定される。そしてスキン層
１及びスポンジ層２は一体的に、好ましくは同質の素材
から形成されて不均質の膜（以下単に不均質膜という。
）を構成し、スポンジ層には酵素が固定され、固定化酵
素膜３を形成する。スキン層は酵素反応により増加又は
減少されそして測定される低分子量物質（イオン性物質
を含な）を浸透する性質を有する。本発明における不均
質膜は、逆巻透艇として−般に知られており、その製造
方法及び構造は既知であり、例えば、次の文献等に記載
されている。
‘ａ｝ Ｓ．Ｍａｎｉｉｋｉａｎ．Ｓ．ＷｅｂａｎｄＪ
．Ｗ．ＭｃＣｕｔｃｈｑｎ，Ｐｒｏｃ．ｌｓｔ ｌｎｔ
．ＳＭｍｐ．ｏｎ Ｗａｔｅｒ Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉ
ｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇのｎ，Ｄ．Ｃ．（１９６５）｛ｂ
）Ｇ．Ｔ．Ｇｉｔｔｅｎｓ，Ｐ．Ａ．Ｈｉｔｃｈｃｏｃ
ｋ，Ｄ．Ｃ．Ｓａｍｍｏｎａｎｄ ○．Ｅ．Ｗａｋｌｅ
ｙ；Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ，ｖｏｌ１８３６９（１
９７０）本発明における不均質膜の材料としては、アセ
チルセルロース、エチルセルロース、プロピオン酸セル
ロース及び酪酸セルロース等のセルロース誘電体、脂肪
族及び芳香族ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリベン
ゾイミダゾール、アクリロニトリル系共重合体、ポリカ
ーボネート、ポリエステル、ポリアミノ酸樹脂その他、
所謂逆疹透膜を形成できる材料であればいずれも適用す
ることができる。
．Ｗ．ＭｃＣｕｔｃｈｑｎ，Ｐｒｏｃ．ｌｓｔ ｌｎｔ
．ＳＭｍｐ．ｏｎ Ｗａｔｅｒ Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉ
ｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇのｎ，Ｄ．Ｃ．（１９６５）｛ｂ
）Ｇ．Ｔ．Ｇｉｔｔｅｎｓ，Ｐ．Ａ．Ｈｉｔｃｈｃｏｃ
ｋ，Ｄ．Ｃ．Ｓａｍｍｏｎａｎｄ ○．Ｅ．Ｗａｋｌｅ
ｙ；Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ，ｖｏｌ１８３６９（１
９７０）本発明における不均質膜の材料としては、アセ
チルセルロース、エチルセルロース、プロピオン酸セル
ロース及び酪酸セルロース等のセルロース誘電体、脂肪
族及び芳香族ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリベン
ゾイミダゾール、アクリロニトリル系共重合体、ポリカ
ーボネート、ポリエステル、ポリアミノ酸樹脂その他、
所謂逆疹透膜を形成できる材料であればいずれも適用す
ることができる。
特に望ましいものとしては、酵素と親和性のあるセルロ
ース誘導体例えばアセチルセルロース及びポリアミド等
を挙げることができる。不均質膜の厚さは、１〜１００
０仏ｍ程度望ましくは３０〜３００仏ｍとするのが適当
である。又、この不均質膜中における均質層の厚さは、
０−０１〜１０仏ｍ程度望ましくは０．１〜３仏ｍとす
るのが適当である。この均質層には少なくともｌｍｍ以
上の孔蓬の孔はなく酵素分子を通すことはない。均質層
かれ多孔質層の方向に向い各種の大きさの孔があり、そ
れらは均質層を離れるほど大きくなり、多孔質層の表面
でその孔径は約１００〜約５０仇ｍ程度となり、酵素溶
液はこの大きい孔の閉口部から内部の孔内に自由に入る
ことができる。又、不均質膜の空隙率は、製膜条件によ
りある程度変えられるが、通常５０〜９０％程度とする
のが適当である。不均質膜中への酵素の注入はｔ一般に
行なわれている浸債法により行なうことができるが、本
発明においては、この注入が加圧炉過法により容易かつ
効率的に行なうことができる。すなわち「本発明によれ
ば、逆惨透膜の性質を利用し、酵素は不均質膜中に加圧
注入され多孔質層の孔（空隙）を満すが、均質層を通過
することなく不均質膜中に均一に炉過内蔵される。加圧
炉週に当っては、酵素を単独又は安定剤等の他の溶質が
混合した水溶液に溶し、これを加圧して不均質膜中に炉
過注入する。この方法は、本発明におけるような不均質
膜によってはじめて利用できる方法であり、単なる一般
の多孔質膜又は紙のように繊維状の物質からなる多孔質
体では、孔が膜の一の端面から他の端面まで貫通してお
り、しかも、通常は表、菱がなくどちらの面も同一状態
にあるため、炉過によって酵素を注入内蔵させることは
できない。注入するときの酵素水溶液の酵素濃度は任意
であるが、一般に０．１〜５０の９／叫程度とするのが
望ましい。又、加圧するときの圧力は、大気圧以上で、
不均質膜が圧密化したり破れたりしない限り任意である
が、望ましくは０．２〜ＩＭＰａ（ＩＭＰａは約０．１
ｋ９／洲に相当）とする。炉過時間は、酵素溶液の濃度
に左右されるが、通常５分以上１餌時間以内で行なわれ
る。又、加圧炉過時の温度は、酵素が失活しない温度範
囲とし、望ましくは０〜４０℃程度とする。本発明にお
いて、不均質膜中に内蔵された酵素は、不均質膜を架橋
剤溶液と接触させることにより架橋され膜中で固定化さ
れる。
ース誘導体例えばアセチルセルロース及びポリアミド等
を挙げることができる。不均質膜の厚さは、１〜１００
０仏ｍ程度望ましくは３０〜３００仏ｍとするのが適当
である。又、この不均質膜中における均質層の厚さは、
０−０１〜１０仏ｍ程度望ましくは０．１〜３仏ｍとす
るのが適当である。この均質層には少なくともｌｍｍ以
上の孔蓬の孔はなく酵素分子を通すことはない。均質層
かれ多孔質層の方向に向い各種の大きさの孔があり、そ
れらは均質層を離れるほど大きくなり、多孔質層の表面
でその孔径は約１００〜約５０仇ｍ程度となり、酵素溶
液はこの大きい孔の閉口部から内部の孔内に自由に入る
ことができる。又、不均質膜の空隙率は、製膜条件によ
りある程度変えられるが、通常５０〜９０％程度とする
のが適当である。不均質膜中への酵素の注入はｔ一般に
行なわれている浸債法により行なうことができるが、本
発明においては、この注入が加圧炉過法により容易かつ
効率的に行なうことができる。すなわち「本発明によれ
ば、逆惨透膜の性質を利用し、酵素は不均質膜中に加圧
注入され多孔質層の孔（空隙）を満すが、均質層を通過
することなく不均質膜中に均一に炉過内蔵される。加圧
炉週に当っては、酵素を単独又は安定剤等の他の溶質が
混合した水溶液に溶し、これを加圧して不均質膜中に炉
過注入する。この方法は、本発明におけるような不均質
膜によってはじめて利用できる方法であり、単なる一般
の多孔質膜又は紙のように繊維状の物質からなる多孔質
体では、孔が膜の一の端面から他の端面まで貫通してお
り、しかも、通常は表、菱がなくどちらの面も同一状態
にあるため、炉過によって酵素を注入内蔵させることは
できない。注入するときの酵素水溶液の酵素濃度は任意
であるが、一般に０．１〜５０の９／叫程度とするのが
望ましい。又、加圧するときの圧力は、大気圧以上で、
不均質膜が圧密化したり破れたりしない限り任意である
が、望ましくは０．２〜ＩＭＰａ（ＩＭＰａは約０．１
ｋ９／洲に相当）とする。炉過時間は、酵素溶液の濃度
に左右されるが、通常５分以上１餌時間以内で行なわれ
る。又、加圧炉過時の温度は、酵素が失活しない温度範
囲とし、望ましくは０〜４０℃程度とする。本発明にお
いて、不均質膜中に内蔵された酵素は、不均質膜を架橋
剤溶液と接触させることにより架橋され膜中で固定化さ
れる。
具体的には、酵素を内蔵した不均質膜を架橋剤溶液に浸
債する方法、該不均質膜に架橋剤溶液を噴霧又は被覆す
る方法及びスポンジ層の側から該膜に架橋剤溶液を加圧
注入する方法のいずれか又はこれら方法を組合せた方法
により実施される。本発明における酵素の架橋剤として
は、グルタルアルデヒド及びジアルデヒドデンプン等の
ジアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート及びト
リレンジィソシアネート等のィソシアネート化合物、ビ
スジアゾベンジジン、Ｎ，Ｎ′ーポリメチレンビスョー
ドアセトアミド及びＮ，Ｎーェチレンビスマレィミド等
を使用することができる。
債する方法、該不均質膜に架橋剤溶液を噴霧又は被覆す
る方法及びスポンジ層の側から該膜に架橋剤溶液を加圧
注入する方法のいずれか又はこれら方法を組合せた方法
により実施される。本発明における酵素の架橋剤として
は、グルタルアルデヒド及びジアルデヒドデンプン等の
ジアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート及びト
リレンジィソシアネート等のィソシアネート化合物、ビ
スジアゾベンジジン、Ｎ，Ｎ′ーポリメチレンビスョー
ドアセトアミド及びＮ，Ｎーェチレンビスマレィミド等
を使用することができる。
この中でも特に望ましいのは、グルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒド類である。これらの架橋剤は、固定化
される酵素の１０〜１００川音の量で用い、又、架橋剤
溶液の濃度は１〜２の重量％とすることが望ましい。又
、架橋反応時間は、架橋剤溶液の濃度にもよるが、通常
１５分〜２４時間とし、その時の温度は、酵素が失活し
ない温度すなわち、室温〜一１０ｑｏの範囲が適当であ
り、望ましくは０〜５℃の範囲が良い。本発明に用いら
れる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びウリカ
ーゼ等のオキシダーゼ類、ウレアーゼ、クレアチニナー
ゼ、グルタミナーゼ、ベニシリナーゼ、カタラーゼ、パ
ーオキシターゼ、インベルターゼ、ムタロターゼ、アミ
ラーゼ、パパイン及びトリプシン等のプロテアーゼ及び
グルコースアィソメラーゼ等がある。
うなジアルデヒド類である。これらの架橋剤は、固定化
される酵素の１０〜１００川音の量で用い、又、架橋剤
溶液の濃度は１〜２の重量％とすることが望ましい。又
、架橋反応時間は、架橋剤溶液の濃度にもよるが、通常
１５分〜２４時間とし、その時の温度は、酵素が失活し
ない温度すなわち、室温〜一１０ｑｏの範囲が適当であ
り、望ましくは０〜５℃の範囲が良い。本発明に用いら
れる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びウリカ
ーゼ等のオキシダーゼ類、ウレアーゼ、クレアチニナー
ゼ、グルタミナーゼ、ベニシリナーゼ、カタラーゼ、パ
ーオキシターゼ、インベルターゼ、ムタロターゼ、アミ
ラーゼ、パパイン及びトリプシン等のプロテアーゼ及び
グルコースアィソメラーゼ等がある。
又、これらの酵素は、単独又は二種以上混合して固定化
することも可能である。すなわち、例えば、コレステロ
ールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼとカタラーゼ及びインベルターゼと
グルコースオキシダーゼ又はムタロターゼ等がある。本
発明の間定イＱ酵素膜は、その製造方法が容易であるば
かりでなく、‘１１酵素負荷量が大であり、■酵素が多
孔質層中に固定化されるため、外部の物理、化学及び生
物学的刺激に対して安定であり、‘３’膜は薄いにもか
かわらず強度が大きく、更には、｛４１長寿命かつ高活
性である等の優れた性質を有している。
することも可能である。すなわち、例えば、コレステロ
ールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼとカタラーゼ及びインベルターゼと
グルコースオキシダーゼ又はムタロターゼ等がある。本
発明の間定イＱ酵素膜は、その製造方法が容易であるば
かりでなく、‘１１酵素負荷量が大であり、■酵素が多
孔質層中に固定化されるため、外部の物理、化学及び生
物学的刺激に対して安定であり、‘３’膜は薄いにもか
かわらず強度が大きく、更には、｛４１長寿命かつ高活
性である等の優れた性質を有している。
次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら
によりなんら限定されるものではない。
によりなんら限定されるものではない。
実施例 １２髭のアセチルセルロ−ス（米国イーストマ
ンコダック社製、３９．８％のアセチル基含有）、４舷
のアセトン及び３雌のホルムアミドを混合し、キャステ
ィング液を調製した。
ンコダック社製、３９．８％のアセチル基含有）、４舷
のアセトン及び３雌のホルムアミドを混合し、キャステ
ィング液を調製した。
このキャスティング液約１０ｇを清浄で平滑なガラス坂
上にベーカー型のアプリケーターを用いて厚さ約７５山
ｍの厚さにキヤストした。次いで、３０秒間溶媒を蒸発
させた後、４００の冷水中にガラスごと膜を浸潰しゲル
化させ不均質膜を得た。この膜は、その均質層の厚さが
ｌＡｍであり、膜全体としての空隙率は８０％であった
。この膜から直径４７肋の円盤を切り取り、試料とした
。次に、グルコースオキシダーゼ（西ドイツ国べーリン
ガー・マンハィム社製、比活性７０１Ｕ／の９）をｐＨ
６．８の０．８の０．１モルリン酸緩衝溶液に溶解し、
酵素濃度１０の９／地の酵素溶液（ｐＨ６．０）を調製
した。
上にベーカー型のアプリケーターを用いて厚さ約７５山
ｍの厚さにキヤストした。次いで、３０秒間溶媒を蒸発
させた後、４００の冷水中にガラスごと膜を浸潰しゲル
化させ不均質膜を得た。この膜は、その均質層の厚さが
ｌＡｍであり、膜全体としての空隙率は８０％であった
。この膜から直径４７肋の円盤を切り取り、試料とした
。次に、グルコースオキシダーゼ（西ドイツ国べーリン
ガー・マンハィム社製、比活性７０１Ｕ／の９）をｐＨ
６．８の０．８の０．１モルリン酸緩衝溶液に溶解し、
酵素濃度１０の９／地の酵素溶液（ｐＨ６．０）を調製
した。
この溶液を上記不均質膜中にスポンジ層側から加圧（０
．９ＭＰａ）炉過し、グルコースオキシダーゼを注入内
蔵させた。次に、このグルコースオキシダ−ゼを内蔵し
た不均質膜にグルタルアルデヒドの２重量％溶液（ｐＨ
６．８の０．１モルリン酸緩衝溶液）５机上を０．別仲
ａの加圧下に浸透させ、次に該腰を前記溶液１０の‘に
浸潰して４℃に３時間保持して架橋反応を行ない、グル
コースオキシダーゼを固定化した。
．９ＭＰａ）炉過し、グルコースオキシダーゼを注入内
蔵させた。次に、このグルコースオキシダ−ゼを内蔵し
た不均質膜にグルタルアルデヒドの２重量％溶液（ｐＨ
６．８の０．１モルリン酸緩衝溶液）５机上を０．別仲
ａの加圧下に浸透させ、次に該腰を前記溶液１０の‘に
浸潰して４℃に３時間保持して架橋反応を行ない、グル
コースオキシダーゼを固定化した。
このようにして得られた膜は、０．５１Ｕ／汝の活性を
有しおり、又、リン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．８
）中に保管した後の残存活性は８０％であった。比較例 ナイロン製多孔質膜（米国ミリポア社製、ナイロン膜の
厚さ１３０仏ｍ、孔径１山ｍ、空隙率８０％）を用いた
以外は、実施例１と同様にしてグルコースオキシダーゼ
の固定化を行なったところ、この膜の活性は０．１１Ｕ
／めであった。
有しおり、又、リン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．８
）中に保管した後の残存活性は８０％であった。比較例 ナイロン製多孔質膜（米国ミリポア社製、ナイロン膜の
厚さ１３０仏ｍ、孔径１山ｍ、空隙率８０％）を用いた
以外は、実施例１と同様にしてグルコースオキシダーゼ
の固定化を行なったところ、この膜の活性は０．１１Ｕ
／めであった。
実施例 ２
不均質膜を酵素溶液に２４時間浸潰して酵素を注入した
以外は、実施例１と同様にして固定化酵素膜を得た。
以外は、実施例１と同様にして固定化酵素膜を得た。
この膜の活性は０．２１Ｕ／ｃ鰭であった。実施例 ３
グルタルァルデヒド５の‘を加圧下に酵素を内鼓した不
均質膜に浸透させた以外は実施例１と同様にして固定化
酵素膜を得た。
グルタルァルデヒド５の‘を加圧下に酵素を内鼓した不
均質膜に浸透させた以外は実施例１と同様にして固定化
酵素膜を得た。
この膜の活性は０．２１Ｕ／ｃ鰭であった。以上、実施
例１〜３及び比較例の結果から、本発明による固定化酵
素膜の活性が良好であり、したがって高い酵素負荷量が
得られ、この効果は加圧炉過により酵素及び／又は架橋
剤溶液を注入する場合に特に優れていることがわかる。
例１〜３及び比較例の結果から、本発明による固定化酵
素膜の活性が良好であり、したがって高い酵素負荷量が
得られ、この効果は加圧炉過により酵素及び／又は架橋
剤溶液を注入する場合に特に優れていることがわかる。
実施例４〜１１
次に、不均質膜、酵素及び架橋剤の種類並びに固定化条
件を変え、実施例１と同様の操作により固定化酵素膜を
形成し、それらの膜の活性を調べた。
件を変え、実施例１と同様の操作により固定化酵素膜を
形成し、それらの膜の活性を調べた。
その結果を次表に示す。
なお使用した酵素は西ドイツベーリンガー マンハィム
社製であった。表表 ｘ２種の酵素の総活性 第２図は本発明の固定イ蛇酵素膜を使用した電気化学的
測定装置用酵素電極装置の垂直断面図である。
社製であった。表表 ｘ２種の酵素の総活性 第２図は本発明の固定イ蛇酵素膜を使用した電気化学的
測定装置用酵素電極装置の垂直断面図である。
第２図において、陽極４は絶縁性材料よりなるカラムの
底部端より突出し、電解液９で満たされた絶縁性容器８
の中央部に設けられる。陰極５はカラムの周囲にまかれ
る。陽極４及び陰極５は導線により直流電源に接続され
る。絶縁性容器８の上端は耐食性板で封止され、その底
端は固定化酵素膜６で封止され、０−リング７により固
着される。該装置の固定化酵素膜を試料溶液に接触させ
ると、試料溶液中の基質は固定化酵素膜中の酵素と選択
的に反応して試料溶液中の酸素を消費する。
底部端より突出し、電解液９で満たされた絶縁性容器８
の中央部に設けられる。陰極５はカラムの周囲にまかれ
る。陽極４及び陰極５は導線により直流電源に接続され
る。絶縁性容器８の上端は耐食性板で封止され、その底
端は固定化酵素膜６で封止され、０−リング７により固
着される。該装置の固定化酵素膜を試料溶液に接触させ
ると、試料溶液中の基質は固定化酵素膜中の酵素と選択
的に反応して試料溶液中の酸素を消費する。
電解液９と試料溶液との間の平衡状態が変化して、陽極
４と陰極５との間を流れる電流を変える。したがって、
試料溶液中の基質の量は電流の変化を測定することによ
り分析される。この装置は酸素電極と固定化酵素膜６と
の組合せに基づく酵素電極装置の例であるが、池種の電
極との組合せにおいても、本発明の固定イＱ酵素膜６は
、電解液９における変化を測定する系が前記と異なる以
外は同様に作用する。次に実施例１の固定化酵素膜を第
２図に示すクラーク型酸素電極の作用面にゴム製○−リ
ングにより固着して酵素電極装置を製作し、これ１００
ｍｐ／ｄ‘（リン酸塩緩衝液ｐＨ６８）のグルコース溶
液中におき、１９秒後に定常状態になったところでグル
コース溶液の酸素消費を測定した。この実験をグルコー
ス溶液の濃度を変えて５秒後に定常状態になったところ
で測定した。第３図はグルコース溶液の濃度と酸素消費
との関係を示すグラフである。第３図からみて、未知の
濃度の試料グルコース溶液の濃度測定は正確であり、迅
速分析が可能である。これに対して従来法によりポリア
クリルアミドゲルより作成された固定化酵素膜（厚さ７
５山ｍ）を、障壁膜として厚さ１０〃ｍのポリフルオロ
カーボン膜を介して作用面に取付けた酵素電極袋題では
定常状態に達する迄６０秒を要し、応答時間が長いこと
が認められた。以上述べたように、本発明によれば、酵
素負荷量が大きく高活性で安定な固定化酵素膜を低価格
で提供することができ、したがって、本発明は、酵素電
極等の医療用分析計のセンサーとして応用範囲の広い有
用なものである。
４と陰極５との間を流れる電流を変える。したがって、
試料溶液中の基質の量は電流の変化を測定することによ
り分析される。この装置は酸素電極と固定化酵素膜６と
の組合せに基づく酵素電極装置の例であるが、池種の電
極との組合せにおいても、本発明の固定イＱ酵素膜６は
、電解液９における変化を測定する系が前記と異なる以
外は同様に作用する。次に実施例１の固定化酵素膜を第
２図に示すクラーク型酸素電極の作用面にゴム製○−リ
ングにより固着して酵素電極装置を製作し、これ１００
ｍｐ／ｄ‘（リン酸塩緩衝液ｐＨ６８）のグルコース溶
液中におき、１９秒後に定常状態になったところでグル
コース溶液の酸素消費を測定した。この実験をグルコー
ス溶液の濃度を変えて５秒後に定常状態になったところ
で測定した。第３図はグルコース溶液の濃度と酸素消費
との関係を示すグラフである。第３図からみて、未知の
濃度の試料グルコース溶液の濃度測定は正確であり、迅
速分析が可能である。これに対して従来法によりポリア
クリルアミドゲルより作成された固定化酵素膜（厚さ７
５山ｍ）を、障壁膜として厚さ１０〃ｍのポリフルオロ
カーボン膜を介して作用面に取付けた酵素電極袋題では
定常状態に達する迄６０秒を要し、応答時間が長いこと
が認められた。以上述べたように、本発明によれば、酵
素負荷量が大きく高活性で安定な固定化酵素膜を低価格
で提供することができ、したがって、本発明は、酵素電
極等の医療用分析計のセンサーとして応用範囲の広い有
用なものである。
第１図は本発明の固定化酵素膜の断面図、第２図は本発
明の固定化酵素膜を使用した電気化学的測定装置用酵素
電極装置の垂直断面図、第３図は本発明の固定化酵素膜
（実施例１）と酸素電極とを絹合せた測定装置により測
定したグルコース濃度と酸素消費との関係を示すグラフ
である。 第１図中１・・・・・・均質層、２・・・・・・酵素を
固定したスポンジ層、３・・・・・・固定化酵素膜、第
２図中４・・・・・・陽極、５・・・…陰極、６・・・
・・・固定イＱ酵素膜、７・・・…○−リング、８……
絶縁性容器、９……電解液。多／図 第２図 多Ｊ図
明の固定化酵素膜を使用した電気化学的測定装置用酵素
電極装置の垂直断面図、第３図は本発明の固定化酵素膜
（実施例１）と酸素電極とを絹合せた測定装置により測
定したグルコース濃度と酸素消費との関係を示すグラフ
である。 第１図中１・・・・・・均質層、２・・・・・・酵素を
固定したスポンジ層、３・・・・・・固定化酵素膜、第
２図中４・・・・・・陽極、５・・・…陰極、６・・・
・・・固定イＱ酵素膜、７・・・…○−リング、８……
絶縁性容器、９……電解液。多／図 第２図 多Ｊ図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 薄い緻密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成
された膜から成り、かつ該多孔質層の内部に架橋された
酵素が固定されたことを特徴とする固定化酵素膜。 ２ 薄い緻密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成
された膜が逆滲透膜である特許請求の範囲第１項記載の
固定化酵素膜。 ３ 薄い緻密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成
された膜に酵素溶液を注入して酵素を多孔質層に内蔵さ
せ、次にこれを架橋剤溶液に浸漬することを特徴とする
固定化酵素膜の製造方法。 ４ 薄い緻密な層とそれより厚い多孔質層が一体に形成
された膜に酵素溶液を加圧ろ過状態で注入する特許請求
の範囲第３項記載の固定化酵素膜の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53119256A JPS6029475B2 (ja) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | 固定化酵素膜及びその製造方法 |
| CH876279A CH642105A5 (de) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Enzym-immobilisierungsmembran, verfahren zur herstellung derselben und verwendung der membran in einer elektro-chemischen messvorrichtung. |
| DE19792939443 DE2939443A1 (de) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Membranen mit immobilisierten enzymen, ihre herstellung und verwendung |
| US06/080,026 US4307195A (en) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Immobilized enzyme membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53119256A JPS6029475B2 (ja) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | 固定化酵素膜及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5545357A JPS5545357A (en) | 1980-03-31 |
| JPS6029475B2 true JPS6029475B2 (ja) | 1985-07-10 |
Family
ID=14756816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53119256A Expired JPS6029475B2 (ja) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | 固定化酵素膜及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4307195A (ja) |
| JP (1) | JPS6029475B2 (ja) |
| CH (1) | CH642105A5 (ja) |
| DE (1) | DE2939443A1 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3029153A1 (de) * | 1980-07-31 | 1982-03-04 | Siemens AG, 1000 Berlin und 8000 München | Verfahren zur herstellung einer gaspermeablen polymermembran fuer analysengeraete und nach diesem verfahrrn hergestellte membram |
| EP0069869B1 (en) * | 1981-07-10 | 1985-09-11 | Gambro Lundia AB | A membrane and an arrangement for the removal of a substance from a solution |
| US4415666A (en) * | 1981-11-05 | 1983-11-15 | Miles Laboratories, Inc. | Enzyme electrode membrane |
| US4581336A (en) * | 1982-04-26 | 1986-04-08 | Uop Inc. | Surface-modified electrodes |
| US4484987A (en) * | 1983-05-19 | 1984-11-27 | The Regents Of The University Of California | Method and membrane applicable to implantable sensor |
| AU3062184A (en) * | 1983-06-10 | 1985-01-04 | Washington Research Foundation | Biochemical detection and/or treatment process |
| DE3406562A1 (de) * | 1984-02-23 | 1985-08-29 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München | Membran fuer die inaktivierung von heparin in blut und blutfraktionen, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und verfahren zur inaktivierung von heparin in blut und blutfraktionen |
| US4693985A (en) * | 1984-08-21 | 1987-09-15 | Pall Corporation | Methods of concentrating ligands and active membranes used therefor |
| JPS6178397A (ja) * | 1984-09-22 | 1986-04-21 | Kao Corp | 酵素及び微生物の反応方法 |
| JPS61111687A (ja) * | 1984-11-02 | 1986-05-29 | Nitto Electric Ind Co Ltd | 酵素固定膜及びその製造方法 |
| JPH0617889B2 (ja) * | 1984-11-27 | 1994-03-09 | 株式会社日立製作所 | 生物化学センサ |
| JPS6283885A (ja) * | 1985-10-08 | 1987-04-17 | Nitto Electric Ind Co Ltd | 酵素固定膜及びその製造方法 |
| US4795704A (en) * | 1985-10-11 | 1989-01-03 | Sepracor, Inc. | Multiphase asymmetric membrane reactor systems |
| DE3707054A1 (de) * | 1987-03-05 | 1988-09-15 | Akzo Gmbh | Verfahren zum herstellen einer zweischichtmembran |
| US4956289A (en) * | 1987-03-16 | 1990-09-11 | Brunswick Corporation | Thin film membrane enzyme reactor and method of using same |
| US5001048A (en) * | 1987-06-05 | 1991-03-19 | Aurthur D. Little, Inc. | Electrical biosensor containing a biological receptor immobilized and stabilized in a protein film |
| US5192507A (en) * | 1987-06-05 | 1993-03-09 | Arthur D. Little, Inc. | Receptor-based biosensors |
| DE3812442A1 (de) * | 1988-04-14 | 1989-10-26 | Fraunhofer Ges Forschung | Einrichtung zur enzympraeparation |
| JPH01301096A (ja) * | 1988-05-30 | 1989-12-05 | Tachibana Seisakusho:Kk | シート状素材のカッティング装置及びカッタ |
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| US5028657A (en) * | 1988-07-18 | 1991-07-02 | Industrial Research Technology Institute | Use of plasma to immobilize protein on polymeric surfaces |
| US5118404A (en) * | 1989-04-28 | 1992-06-02 | Nec Corporation | Enzyme electrode and a method of determining concentration of an analyte in a sample solution |
| JPH02131594U (ja) * | 1990-03-15 | 1990-11-01 | ||
| US5804048A (en) * | 1996-08-15 | 1998-09-08 | Via Medical Corporation | Electrode assembly for assaying glucose |
| US6475382B2 (en) | 2000-12-19 | 2002-11-05 | Co2 Solution Inc. | Treatment unit for treating a fluid and method thereof |
| CA2353307A1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-01-13 | Carmen Parent | Appareil et procede pour le traitement des effluents gazeux |
| WO2003080225A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-10-02 | Ionics, Incorporated | Upw treatment and system with organic nitrogen removal |
| CA2405635A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-03-27 | C02 Solution Inc. | A process and a plant for the production of useful carbonated species and for the recycling of carbon dioxide emissions from power plants |
| US9540631B1 (en) * | 2004-09-14 | 2017-01-10 | Peter T. Pugliese | Immobilized glucose oxidase for use in oral hygiene |
| CN105980846B (zh) * | 2014-02-21 | 2018-12-07 | 宝生物工程美国有限公司 | 包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱及其制造和使用的方法 |
| US11598747B2 (en) * | 2017-12-13 | 2023-03-07 | Sentient Technologies, Inc. | Blood pH measurement using electrolyte separation layer |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US3539455A (en) * | 1965-10-08 | 1970-11-10 | Leland C Clark Jr | Membrane polarographic electrode system and method with electrochemical compensation |
| US3542662A (en) * | 1967-04-18 | 1970-11-24 | Du Pont | Enzyme electrode |
| US3705084A (en) * | 1970-03-18 | 1972-12-05 | Monsanto Co | Macroporous enzyme reactor |
| US4033822A (en) * | 1975-11-07 | 1977-07-05 | Gregor Harry P | Enzyme-coupled ultrafiltration membranes |
| US4033817A (en) * | 1975-11-07 | 1977-07-05 | Gregor Harry P | Pressure-driven enzyme-coupled membranes |
-
1978
- 1978-09-29 JP JP53119256A patent/JPS6029475B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-09-28 DE DE19792939443 patent/DE2939443A1/de not_active Withdrawn
- 1979-09-28 US US06/080,026 patent/US4307195A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-09-28 CH CH876279A patent/CH642105A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH642105A5 (de) | 1984-03-30 |
| US4307195A (en) | 1981-12-22 |
| JPS5545357A (en) | 1980-03-31 |
| DE2939443A1 (de) | 1980-04-03 |
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