JPS6030295B2 - 白血球減少症治療剤の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は硫酸アンモニウム塩析法及びジェチルアミノェ
チルセルロース（以下ＤＥＡＥセルロースと略記する）
、トリェチルアミノェチルセルロ−ス（以下ＴＥＡＥセ
ルロースと略記する）によるアニオン交換クロマトグラ
フ法又はコカナバリンＡを化学的に結合したアガロース
によるアフイニテイークロマトグラフ法により、人羊水
から人の正常は骨髄細胞の分裂を促進する白血球減少症
治療剤（以下治療剤と記載する。 ）を製造する方法に関する。本発明の目的は抗原抗体反
応を生じることなく人体に反復して投与でき、かつ人の
正常な骨髄細胞の分裂を促進する効果を有する治療剤を
人羊水から容易に製造する方法を提供することにある。 白血球減少症とは白血球が血液１側３ 当り４０００以
下に減少している疾病である。この白血球減少症は感染
症による骨髄細胞の増殖の低下又は骨髄に起る変化等種
々の原因により惹起される疾病であって骨髄性白血病と
は全く異なる疾病である。そして白血球減少症の患者に
対しては、骨髄の細胞の分裂の促進物質を投与すれば、
白血球の増加を期待することが出来る。更に近年制癌剤
が目ミーましい進歩をとげ有効な化学療法剤が出現した
が、そのほとんどの共通した欠点は、造血臓器に対する
障害、特に白血球の減少をきたすので患者に長期間これ
らの制癌剤を継続的に投与することは出来ないのが現状
である。白血球の減少を阻止する目的で従釆各種の医薬
品が製造されそれらの薬剤を示せばグリチルリチン、シ
ステイン・グリシンを含む薬剤、Ｑ−Ｍｅｒｃａｐｔｏ
ｐｍｐｉｏｎｙｌ−ｇｙｃｉｎｅ及びセフアランチンな
どの薬剤がある。しかしこれらの薬剤の効果についての
薬理的な作用は明らかでなく又その効果は充分とは云え
ない。又従来正常な骨髄細胞の分裂を促進する物質とし
ては、Ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍ山ａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
（以下ＣＳＦと記載する）が知られて、これについての
詳細な説明は「医学のあゆみ」、９９蓋４１〜５０頁１
９７３軒こ記載されているが、この様な物質は広く生体
由来の各種材料中に存在している。すなわち人の胎児細
胞及び健細胞の培養液中に見い出されると報告されてい
る。しかしながらこれらのＣＳＦが見出されている人由
来のこれらの材料については、実際の工業上の利用は不
可能である。更に尿中にはＣＳＦが存在するとの報告が
あるが、本発明者らが報告に塞いて正常人の尿を採取し
、羊水と比較してＣＳＦの活性を測定したが尿のＣＳＦ
は羊水の活性に比して非常に低く、原尿に近い状態では
ＣＳＦの活性を測定することは不可能であった。又、人
リンパ球の培養液中にＣＳＦが認められるという報告が
あるが、この場合はＣＳＦを生成させるために培地中に
Ｐｈれｏｈｅｍａ難ｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）を加えな
ければならず植物由来の糖蛋白質を加えることから、こ
のものを渚地より分離除去する操作を加えなければなら
ない不都合がある。又末梢血からとったｌｅｕｋｏｃｙ
に（白血球）の培養液にＰＨＡを加えなくてもＣＳＦが
得られるという報告もあるが、実験的にはともかく、工
業的には人の血液より分離した白血球の保存、調製が困
難であり、末梢血の白血球は通常の培地では増殖しない
ので、継続的に調製することは困難である。又血清中に
もＣＳＦが存在するという報告もあるが、その活性は羊
水に比して低く血清を材料としてＣＳＦを調製するとい
う報告はない。更に人以外の各種動物の培養細胞の培養
液中にもＣＳＦ活性が認められているが、このＣＳＦを
薬剤として使用する場合ＣＳＦは高分子蛋白様物質であ
ることが知られているので、抗原性が異っているおそれ
があり、そのためのアレルギー、アナフイラキシー反応
が懸念され人に投与することは望ましくない。一方、人
又は動物の羊水を原料として種々の医薬品を製造する従
来の方法には次の様なものがある。すなわち牛羊水にメ
チオニンやグリシンを添加して整髪料の一成分として使
用すること（米国特許第３７３３４０２号）、人羊水に
砂糖やグルコース、アミノ酸などを添加して誕生直後の
未熟児にミルクの代りに与えること（フランス医薬品特
許第３８４４号）又牛などの羊水中のムコ多糖類を養毛
剤として使用すること（英国特許第１１９８００５号）
等がある。又牛羊水の脱蛋白物を血清の透析あるし、は
限外炉過の代替物として使用しうろことく西ドイツ共和
国特許第９６１６５６号）、などがあるが、人羊水中に
骨髄細胞の分裂に有効な成分が含まれている点について
報告された例はない。本発明者らは人の白血球減少症治
療剤として人に投与したとき抗原抗体反応等の副作用を
生じることなく、人に投与し得る医薬品を製造する研究
を行なった、その結果人羊水中にＣＳＦが含まれている
ことを見出し、これを簡単かつ高濃度で分離する方法を
完成した。 本発明は、人の羊水を遠心分離して不溶物を除去し、得
られた上清を透析膜からなる一端を封じた管に入れ、蒸
留水に対して透析し、得られた透析内液に硫酸アンモニ
ウム粉末を加えて溶解し、飽和度４０％で沈殿せず飽和
度７０％で沈殿する分画を分別し、得られた分画に蒸留
水を加えて溶解し、得られた溶液を前記と同じ方法で蒸
留水に対して透析して硫酸アンモニウムを除去し、得ら
れた透析内液をＤＥＡＥセルロース又はＴＥＡＥセルロ
ースを充填したカラムに通液し、有効成分を吸着せしめ
、のち０．０５１〜０．１５モル塩化ナトリウムを含む
ｐＨ７．０の０．１モルトリス塩酸穣衡液を該カラムに
通液し、溶出する分画を分別するか、もしくはコンカナ
バリンＡを結合させたアガロースを充填したカラムに通
液し、有効成分を吸着せしめ、のち１．１ミリモルから
６０ミリモルの濃度のＱ−メチル−Ｄ−グルコシド又は
Ｑ−メチル−Ｄ−マンノシド及び１モルの塩化ナトリウ
ムを含むｐＨ７．０の０．０２モルリン酸ナトリウム緩
衡液を該カラムに通液し、溶出する分画を分別し、更に
これを蒸留水又は希釈りん酸緩衡塩類溶液に対して透析
し、得られた透析内液を無菌炉過するか又はこの無菌炉
過液を無菌的に凍結乾燥することを特徴とする白血球減
少症治療剤の製造法の発明である。 次に本発明の方法について詳述する。本発明に使用する
羊水は正常分娩又は帝王切開によって出産した人のいず
れから得たものでもよい。羊水の採取量が多いこと、及
び羊水への血液の混入が少し・ことから帝王切開により
出産した人の羊水を用いることが望ましい。微生物の繁
殖、それにともなう腐敗を防ぐため主水はできるだけ速
やかに凍結し、治療剤を製造するまで保存することが望
ましい。治療剤の製造に際しては凍結していた羊水を解
凍し、解凍した羊水を冷却遠心機により３０００〜１５
００仇．ｐ．ｍで３０分間遠心し、羊水中に含まれてい
る不溶物を除去する。この様にして得られた羊水の上清
を透析膜からなる一端を封じた管に入れる。使用する透
析膜は市販品であり、例えばビスキング社製のＳｅａｍ
ｌｅｓｓＣｅｌ側ｏｓｅＴｕｂｉｎｇ等である。次いで
羊水上清を入れた透析膜よりなる管を蒸留水中に浸潰し
、１餌時間透析し、更に透析外液を交換し、同様の方法
で更に１独特間透析する。透析中に細菌の増殖を防止す
るために液温を低く保持することが望ましい。透析終了
後透析内液の量を測定し、容器に移し、燈拝しながら飽
和度の４０％に相当する量の粉末硫酸アンモニウムを加
えて熔解する。透析内液は希薄な塩類及び蛋白質等を含
有する溶液であるから透析内液を飽和するのに必要な硫
酸アンモニウムの量は水のそれとほぼ等しく透析内液１
００の‘を飽和するのに必要な硫酸アンモニウムの量は
０℃において６９．７夕、２５℃において７６．７夕で
ある。硫酸アンモニウムを溶解するときの透析内液は室
温でも又低温でもよいが、液温を一定に維持することが
必要である。本発明の方法を実施するにあたり、透析内
液を２ｙＣに保持したとすれば、透析内液１００の

【当
り２４．３夕の粉末硫酸アンモニウムを加えて溶解し、
飽和度４０％の透析内液を得る。 次いで遠心分離し、上清液を分取し、更に粉末硫酸アン
モニウムを加えて溶解し、飽和度７０％の透析内液を得
る。即ち前記と同様に上清液を２５ｑｏに保持したとす
れば、上清液１００机【当り更に２０．５夕の粉末硫酸
アンモニウムを加えて溶解し、飽和度７０％の溶液を得
る。次いで沈殿物を遠心分離し、飽和度４０％で沈殿せ
ず、飽和度７０％で沈殿する分画を得る。得られた沈殿
物を蒸留水に溶解し、前記と同様の方法で透析し、沈殿
物の溶液中に含まれている硫酸アンモニウムを除去する
。次にＤＥＡＥセルロース又はＴＥＡＥセルロースを用
いたクロマトグラフ法により有効成分の吸着及び溶出を
行なう。最初に用いた羊水１００叫当りＤＥＡＥ又はＴ
ＥＡＥセルロース（生化学工業製）粉末を２夕の割合で
使用する。ＤＥＡＥ又はＴＥＡＥセルロース粉末を、粉
末１夕当り１００叫の割合で０．１規定塩酸水溶液に分
散し、室温で３淵ご間凝拝し、のち吸引炉過器を用いて
炉過し、炉紙上に集める。蒸留水で充分洗浄し、のちセ
ルロース粉末１夕当り１００肌の割合で０．１規定水酸
化ナトリウム水溶液に分散し、以下同様に炉過、洗浄す
る。洗浄したＤＥＡＥ又はＴＥＡＥセルロースを、セル
ロース粉末１夕当り１．５その割合でＰＨ７．０の０．
１モルトリス塩酸綾衡液に分散し、のちカラムに充填す
る。このカラムに前記透析内液を１０〜６０ｍ‘／分の
速度で通液し、有効成分をＤＥＡＥ又はＴＥＡＥセルロ
ースに吸着せしめる。 その後、０．０５モルの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．
０のトリス塩酸綾衡液を２０〜８０のと／分の速度で通
液し、カラムを洗浄して０．０５モル以下の塩化ナトリ
ウムを含むトリス塩酸緩衝液で溶出する分画を除去する
。洗浄液量はカラムに充填したセルロース粉末１夕当り
１００〜１５０肌‘が望ましい。又はセルロース粉末を
０．０５モルの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．
１モルトリス塩酸緩衡液に分散し、カラムに充填し、次
いで前記透析内液をカラムに通液し、カラム通過液を廃
棄し、有効成分のカラムへの吸着と不要分画の除去とを
同時に行なうこともできる。次に０．０５１モルから０
．１５モルの任意の濃度で塩化ナトリウムを含む前記ト
リス塩酸綾衡液を２０〜８０泌／分の速度でカラムに通
液し、該セルロースに吸着した有効成分を溶出せしめる
。 綾出剤の量は羊水１００の‘当り１００〜１５０の上が
望ましい。この様にして得られた分画を前記と同様の方
法で蒸留水又は希釈したりん酸緩衝塩類溶液に透析し、
透析内液を血液と等張にして無菌炉過し、無菌的に容器
に充填し、液状の治療剤を製造するか、又は無菌炉過し
、無菌的に凍結乾燥し、無菌的に包装し、粉末状の治療
剤を製造する。前記ＤＥＡＥ又はＴＥＡＥセルロ−スの
代りにコンカナバリンＡを化学的に結合せしめたアガロ
ース（ファルマシア・ファインケミカル製）を用いて有
効成分を含有する分画を分別することもできる。 この場合、市販の該アガロース１の【当り１０の‘の割
合で１モルの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０
２モルりん酸ナトリウム緩衡液に分散し、のちカラムに
充填する。このカラムに前記透析内液を１０〜６０の‘
／分の速度で通液し、有効成分を吸着せしめる。その後
１．０ミリモルの濃度ではーメチルーＤーグルコシド又
はＱーメチルーＤ−マンノシドを含む前託りん酸ナトリ
ウム綾衡液を２０〜８０の上／分の速度で通液し、カラ
ムを洗浄して１．０ミリモル以下の濃度のＱ−メチルｍ
Ｄ−グルコシド又はＱ−メチル−Ｄーマンノシドを含む
綾衡液により溶出する分画を除去する。洗浄液の量は該
カラムに充填した該アガロース１奴当り１５〜２０の‘
の割合が望ましい。次に１．１ミリモルから６０ミリモ
ルの任意の濃度でＱーメチル−Ｄーグルコシド又はＱ−
メチル−Ｄ−マンノシドを含む前記りん酸ナトリウム緩
衝液を２０〜８０の‘／分の速度で該カラムに通液し、
有効成分をカラムから溶出せしめる。 溶出剤の量は使用した羊水１００の【当り１００〜１５
０叫の割合が望ましい。このようにして得られた分画を
前記セルロースを用いたときと同様に処理して治療剤を
製造する。このようにして得られた治療剤を使用に際し
て、液状の治療剤はそのまま、粉末状の袷療剤は滅菌水
に溶解し、静脈注射により患者に投与される。 本発明の方法において硫酸アンモニウムの飽和度を４０
〜７０％、溶出剤の塩化ナトリウムの濃度を０．０５１
〜０．１５モル及びＱーメチルーＤーグルコシド又はＱ
−メチル−Ｄ−マンノシドの濃度を１．１ミリモルから
６０ミリモルにしたのは次の試験１、２、３及び４の結
果よりその分画に正常の骨髄細胞の分裂を促進する成分
を含有することが判明したからである。〔試験１〕 正常な骨髄細胞は培地及び血清を含む軟寒夫中では増殖
せず従ってコロニー又はクラスターを形成しない。 しかしながら塔地及び血清を含む軟寒天中に骨髄細胞の
分裂を促進する因子（ＣＳＦ）を加えるとこの因子に感
受性のある細胞は、軟寒天中にコロニー又はクラス夕−
を生じる。そしてこのコロニー数及びクラスター数は存
在するＣＳＦ活性に比例することからＣＳＦ活性を測定
することが出来る。実施例１と同様の方法で得た硫酸ア
ンモニウムの飽和度が４０％で沈殿せず７０％で沈殿す
る分画から製造した試料（試料２）及び硫酸アンモニウ
ムの飽和度４０％で沈殿する沈殿物（試料１）、飽和度
７０％における上清液（試料３）を実施例１と同様の方
法で透析を行い無菌炉適し、無菌的に凍結乾燥し、それ
らの粉末各３．０収９を１５％牛胎児血清添加ＭｃＣｏ
ｙｓ＊培地１．０の‘にそれぞれ溶解し、これらの試料
についてＣＳＦ活性を次の様な方法で測定した。 活性を測定しようとする試料を０．１５肌‘ずつ直径３
側のプラスチックシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に３枚
ずつ分注した。 ２倍濃度のＭｃＣｏｙ′ｓ虫塔地（Ｆｌｏｗ社製）６．
３７の‘の牛胎児血清２．２５羽を混合し、その混合物
を４１００の温水中に無菌的に保持した。 一方０．６％（重量／体積）となるように寒天（Ｎｏｂ
ｌｅ−ＡｇａｒＤＩＦＩＣＯ社製）を再蒸留水に分散さ
せ、１２０３０、１５分間加圧して溶解し、これを４１
００の温水に浸債する。次にＣ５７ＢＬ系マウス（６〜
１２週令）の大腿骨を無菌的に劇出し、大腿骨の一方の
切口から、１５％牛胎児血清添加ＭｃＣｏｙｓ弘培地２
の‘を注射器を用いて注射針から噴出させ骨髄細胞を得
た。 この細胞の懸濁液を駒込ピペットで３〜４回蝿拝し細胞
をシングルセルとした。氷冷して静暦し、０．１の‘を
とり、チュルク氏試薬０．１のとを加え、有核細胞を血
球計算盤を用いて計測を行なった。計測後細胞数を７．
６〜８．０×１び／の‘となるように１５％牛胎児血清
添加ＭｃＣｏｙ′ｓ弘培地で調整した。先に調製した０
．６％寒天溶液を６．３７の【とり、先に調製した牛胎
児血清を含む２倍濃度のＭｃＣｏｙ′ｓ弘培地８．６２
泌に加えた。更に上記細胞懸濁液を４１℃に１硯砂間保
持し、のちその０．１５の上を加え細胞が均一となるよ
うに分散させ、のち、細胞を含む寒天液を先の検体を分
注したシャーレに各１の‘分注し、均一にシャーレ内で
混合し、室温に放置し、寒天を固化させ、のち１００％
湿度５％炭酸ガスを含む細胞培養装置で３７０で７日間
培養し、生じるコロニー（細胞数５の固以上）及びクラ
スター（細胞数２０〜５の固）数を計測し、この数の合
計によってＣＳＦ活性の指標とした。上記方法を用いて
調製した試料１、２、３のＣＳＦ活性を測定した。 結果は表１の通りである。なお対照としては試料を加え
ない１５％牛胎児血清添加ＭｃＣｏｙｓ５Ａ培地を用い
た。表１ 以上の結果から試料２のＣＳＦ活性が最も高く、この分
画中にＣＳＦが含有されていることが判明した。 なお前記以外の分画、例えば硫酸アンモニウムの飽和度
３０〜８０％、３０〜６０％、４０〜６０％、５０〜８
０％等によって得られる分画中にも有効成分が含まれて
いるが、これらの分画中の有効成分の量は少し、か又は
不純物が含まれているので望ましくない。〔試験２〕 試験１と同様の方法で得られた１００の‘の試料２を前
記のように塩酸及び水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した
２夕のＤＥＡＥセルロースを充填したカラム（２×３０
肌）に１０のと／分の速度で通液し、有効成分を吸着さ
せ、このカラムをＰＨ７．０の０．１モルトリス塩酸緩
衝液５００の‘で洗浄した。 このカラムを通過した洗液を試料４とし、更に０．０１
モル、０．０５モル、０．１モル、０．１５モル、０．
２０モルの濃度で塩化ナトリウムを含む上記緩衡液各２
００の‘を２０机／分の速度でカラムに通液し、溶出し
た各分画をそれぞれ試料５、６、７、８、９とした。こ
の試料４〜９を実施例１と同様の方法で蒸留水に対して
透析し、のち凍結乾燥し、各試料１の９を１５％牛胎児
血清添加ＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ培地１心にそれぞれ溶解し
、これらの試料についてＣＳＦ活性を前記試験１と同様
な方法で測定した。その結果は表２の通りである。 なお対照としては試料を加えない１５％牛胎児血清添加
ＭｃＣｏｙｓ弘培地を用いた。 表２ 以上の結果より試料７及び８に高いＣＳＦ活性を認めた
ので、溶出液の塩化ナトリウム濃度を０．０５１〜０．
１５モルと定めた。 これ以外の塩化ナトリウム濃度たとえば０．０２〜０．
２モルの塩化ナトリウム濃度でもＣＳＦ活性が認められ
たが、これらの分画では不純物が多く含まれるのが望ま
しくない。〔試験３〕試験１と同じ方法で得られた１０
０叫の試料２を、試験１と同様に処理した２夕のＴＥＡ
Ｅセルロースを充填したカラム（２×３０伽）に１０凧
【／分の速度で通液して有効成分を吸着させ、このカラ
ムをＰＨ７．０の０．１モルトリス塩酸穣衡液５００の
上で洗浄した。 このカラムを通過した洗液を試料１０とし、更に０．０
１モル、０．０５モル、０．１モル、０．１５モル、０
．２モルの濃度で塩化ナトリウムを含む上記緩衡液各２
００肌を２０叫／分の速度でカラムに通液し、溶出した
各分画をそれぞれ試料１１、１２、１３ １４、１５と
した。この試料１０〜１５を実施例１と同様の方法で蒸
留水に対して透析し、のち凍結乾燥し、各試料１の９を
１５％牛胎児血清添加ＭｃＣｏｙ′ｓ弘培地１の‘にそ
れぞれ溶解し、これらの試料についてＣＳＦ活性を前記
試験１と同様の方法で測定した。その結果は表３の通り
である。なお対照としては試料を加えなし、培地を用い
た。表 ３ 以上の結果より試料１３及び１４に高いＣＳＦ活性を認
めたので、溶出液の塩化ナトリウム濃度を０．０５１〜
０．１５モルと定めた。 これ以外の塩化ナトリウム濃度たとえば０．０２〜０．
２モルの塩化ナトリウム濃度でもＣＳＦ活性がみとめら
れるが、これらの分画では不純物が多く含まれるので望
ましくない。〔試験４〕試験１と同じ方法で得た１００
の‘の試料２を、コンカナバリンＡを化学的に結合させ
たアガロース２０肌を充填したカラム（１．５×３０肌
）に１０の‘／分の速度で通液し、有効成分を吸着させ
、このカラムをｐＨ７．０の１モル塩化ナトリウムを含
む０．０２モルリン酸ナトリウム緩衝液３００柵で洗浄
した。 このカラムを通過した洗液を試料１６とし、更に１ミリ
モル、３０ミリモル、６０ミリモル、９０ミリモル及び
１２０ミリモルの濃度でＱ−メチル一Ｄ−グルコシドを
含む前記緩衡液各３００凧【を、２０の‘／分の速度で
カラムに通液し、溶出した各分画をそれぞれ試料１７、
１＆ １９ ２０及び２１とし、この試料１６〜２１を
実施例１と同様の方法で蒸留水に対して透析し、のち凍
結乾燥し、各試料１の９を１５％牛胎児血清添加ＭｃＣ
ｏｙ′ｓ５Ａ培地１の‘にそれぞれ溶解し、これらの試
料ついてＣＳＦ活性を前記試験１と同様の方法で測定し
た。その結果は表４の通りである。なお対照としては試
料を加えない渚地を用いた。表４以上の結果より試料１
８及び１９にＣＳＦ活性を認めたので溶出液のＱ−メチ
ル−Ｄ−グルコシド濃度を１．１ミリモル〜６０ミリモ
ルと定めた。 これ以外のＱーメチル−Ｄーグリコシド濃度たとえば０
．１ミリモルから９０ミリモルの濃度でもＣＳＦ活性が
みとめられるが、これらの分画では不純物が多く含まれ
るので望ましくない。または一メチル−Ｄ−グルコシド
を用いる代りにＱ−メチル−Ｄ−マンノシドを用い試験
４と同様な方法で試験した結果、ｏ−メチル−Ｄ−マン
ノシドの濃度１。１ミリモル〜６０ミリモルの範囲の分
画に高いＣＳＦ活性を認めた。 本発明者らは治療剤の効果を試験するため、次の様な動
物試験を行なった。治療剤の成分は人由来の高分子蛋白
質を含んでいるから、本発明の方法によって得られた治
療剤を直接動物に投与すれば、抗原抗体反応を生じ、治
療剤を反覆投与することができず、治療剤の効果を試験
できない。 そこでまず本発明者らは試験に使用するマウスと同種の
ＣＳＦ活性を有することが知られているマウスの腎臓細
胞から動物試験用治療剤を製造し、これのＣＳＦ活性を
測定する（試験５）とともにこれをマウスに投与し、急
性毒性量及び有効投与量を試験した（試験６）。そして
動物試験用治療剤と本発明の方法によって得られた治療
剤とを用いてＣＳＦ活性を測定し、それぞれのＣＳＦ活
性の測定結果からこれらの間の関係を試験した（試験７
）。次に試験７で求めた治療剤と動物試験用治療剤との
ＣＳＦ活性の関係から試験６で求めた動物試験用治療剤
の有効投与量を補正し、治療剤の有効投与量を決定した
。〔試験５〕４匹のＣ５７ＢＬ系マウスの腎臓を無菌的
にとり出し、のち、ハサミを用いて細切した。 生理食塩水に０．２５％（重量／体積）の濃度でトリプ
シン（Ｄｉｆｃｏ社製）を熔解した溶液６０机上を、先
に細切した腎臓に加え、３７０で３０分間、静置し、の
ち上清を取り、細胞懸濁液を得る。この細胞懸濁液を１
２０仇．ｐ．ｍで１０分間遠心し、上情をすて沈澱した
細胞に１０％仔牛血清を含むＥａ舞ｅ′ｓ培地（日水製
薬製）を加え、１×１ぴ個／机との濃度になるように細
胞懸濁液を調製し、直径１０伽のシャーレ５枚に各１０
の‘を分注し、３７０で１００％湿度、５％炭酸ガス濃
度の培養器で３日間培養し、のち更にリン酸綾衡塩類溶
液（カルシウム、マグネシウムを含まない）でシャーレ
‘こ単層を形成している細胞を２回洗浄し、のちマウス
血清１０％を含むＥａｇｅ′ｓ培地を各シャーレ１０の
‘を加え、更に３日間培養を行い、その培地をとり、１
５０仇．ｐ．ｍで２０分間遠心を行い上清を５０の上集
める。この上清を３その脱イオン水に対し４℃で一晩透
析を行い、のち透析内液の液量を測定し、硫酸アンモニ
ウムを加え、飽和度４０％で沈澱せず飽和度７０％で沈
澱する分画を分別した。この沈澱に１０の‘の蒸留水を
加えて溶解し、この溶液を蒸留水に対して透析し、硫酸
アンモニウムを除去した。 ＤＥＡＥセルロースを３夕を用い、前記試験２と同機の
方法により試料２２「 ２３、２４、２５２０２７を得
た。これらの試料を蒸留水に透析し、のち凍結乾燥し、
各試料１の夕を１５％牛胎児血清添加ＭｃＣｏＹｓ弘培
地１の‘に溶解し、各試料についてＣＳＦ活性を前記試
験１と同様の方法で測定した。その結果を表５に示す。
なお対照としては試料を加えない１５％牛胎児血清添加
ＭｃＣｏｙｓ５Ａ塔地を用いた。 ・表５ この結果から塩化ナトリウム濃度０．０５１〜０．１５
モルで溶出する分画である試料２５及び２６のＣＳＦ活
性が高いことが判明した。 従ってこの分画を集めて蒸留水に対して透析し、無菌炉
過し、動物試験用治療剤を得た。〔試験６〕 試験５と同様な方法により調製した動物試験用治療剤に
ついてＬｉｔｃｈｆｉｅｌｄとＷｉｌｃｏｘｏｎの方法
（Ｊｏ皿ａｌ ｏｆ Ｐｈａ皿ａｃｏｌｏ戦 ａｎｄ
Ｅｘｐｅｎｍｅｎｔａｌｍｅｒａｐｅｕｔｉｅｓ、９碇
篭、９９頁、１９４９年）により急性毒性試験をＣ５７
ＢＬ系マウスに対する腹腔内投与で行なった。 その結果、この動物用治療剤の急性毒性量（ＬＤ５ｏ）
は３８００雌／ｋ９であった。このようにして得られた
急性毒性量に基づき、有効投与量を決定するために次の
試験を行なった。６週令のＣ５７ＢＬ系マウス８０匹に
、１匹当り制癌剤サィトシンアラビノシド０．２％（重
量）水溶液０．５の【（この投与量はＬ−１２１０を用
いた動物試験で有効と認められている。 最近の新築、２３案、６８頁、１９７２王）を連続１０
日間腹腔内に注射したのち、マウスを無作為に１０匹ず
つ８群に分け、翌日より第１群には滅菌生理食塩水を１
匹１日当り０．５叫、第２群には放射線による白血球減
少症治療剤であるセフアランチン０．００２％（重量）
水溶液０．５の【（この投与量は人の白血球減少症に対
して用いられている投与量をマウスの体重に換算したも
のである。化研生薬社のセフアランチン使用書による）
、第３群〜第８群には、それぞれ急性毒性量の１／２５
０、１′１０止 １′５０、１／２５ １／ｉ ｌ／３
の量の前記動物試験用治療剤水溶液各０．５の‘を連続
７日間腹睦内に注射した。そしてその翌日に各群のマウ
スの末梢血液中の白血球を常法により測定し、授与前の
各群マウスの末梢血液中の白血球数と投与後のそれとの
比から白血球数増加率を算出して各種薬剤の効果を試験
した。その結果を表６に示す。表 ６ ※ １０匹の平均値 表６から明らかなように、現在白血球減少症治療剤とし
て市販されているセフアランチン投与群の白血球数の増
加率は投与前のそれよりもわずか約１０％増加したのみ
であるのに対し、動物用治療剤を投与した群の中で第４
〜第７群では白血球数の増加率が高い値を示した。 即ち、これらの群の白血球数の増加率はセフアランチン
群のそれよりも１．１５〜１．２倍以上高い値を示した
。従ってこれらの群に投与した動物試験用の治療剤の量
、即ち３８〜７６０の９／体重ｌｋ９／日が有効な投与
量である。次に本発明の方法により得られた沿療剤と前
記試験６で用いた動物試験用治療剤とのＣＳＦ活性の関
係を求めるために次の試験を行なった。〔試験７〕実施
例１と同様の方法で製造した粉末の治療剤および試験５
と同様の方法で製造した粉末の動物試験用治療剤を、Ｍ
ｃＣｏｙｓ班培地に、それぞれ塔地１の‘当り０．５、
１．０、１．５、２．０の９の量で添加した８種の試験
培地、なにも添加しない渚地（対照）の合計９種の培地
を調製した。 これらの試料０．１の上をシャーレに取り、試験１と同
様な方法でＣＳＦ活性を測定した。そしてこのＣＳＦ活
性の測定を１０回反覆し、その平均値を表７に示す。表
７表７の結果から治療剤および動物試験用治療剤の培地
１机【当り０．５〜２．０の９の範囲の添加量ＸとＣＳ
Ｆ活性Ｙとの間の回帰直線を求めると、前者についてＹ
＝１４９０Ｘ−３０、後者についてＹ＝８４０×−１０
となる。 この直線の懐きの大小は、治療剤および動物試験用治療
剤が骨髄細胞の増殖に付与する程度の強弱を示すから、
袷療剤は動物試験用治療剤よりも１．７７倍その増殖付
与効果の高いことが判明した。この試験結果から、本発
明の方法によって得られた治療剤は、動物試験用治療剤
の１／１，７７の量で動物試験用治療剤と同等の効果を
示す。従って試験６において、動物試験用治療剤につい
て求めた有効投与量３８〜７６０の９／体量ｌｋ９／日
の１／１．７７の量、即ち２１．５〜４３０収９／体重
ｌｋ９／日が治療剤の有効投与量である。一方、前記Ｌ
ＭｈｆｉｅｌｄとＷｉｌｃｏｘｏｎの方法により、実施
例１と同様の方法によって得られた治療剤の急性毒性試
験をＣ５拍Ｌマウスに対し腹腔内投与で行なった。 その結果、治療剤の急性毒性量（ＬＤ弧）は４１００の
９／ｋ９であった。従って本発明の方法により得られた
治療剤の有効投与量（秘／体重ｌｋ９／日）は急性毒性
量の約１／９．５〜１／１．９１である。本発明の方法
によって得られる治療剤は、何らの副作用もなく連続的
に人に投与することが可能であり、現在市販されている
同効の医薬品の１．２倍もの白血球数の増加をもたらし
、すぐれた効果を有している。 実施例 １ 帝王切開により出産した１０人より約２その羊水を採取
して、凍結保存した。 解凍後、３００比．ｐ．ｍの回転数で２び分間遠心して
、上清を更に１５００仇．ｐ．ｍの回転数で３０分間遠
心して、上清を一端を封じた透析チューブ（ビスキング
社製）に入れ、２０その蒸留水に浸潰し、氷室内（４℃
）で１幼時間透析し、透析外液を廃棄し、新しく蒸留水
２０夕に浸潰し、同様の方法で１観音間透析した。得ら
れた透析内液】．８そをビーカーに移し、４℃に保持し
、粉末硫酸アンモニウム（試薬特級）４０６．８９を壇
拝しながら、徐々に添加し、全量添加後更に１段テ間縄
拝し、硫酸アンモニウムを熔解した。次いで冷却遠心機
にて４℃に保持して１５００仇．ｐ．ｍの回転数で３び
分間遠心し、沈澱を除去した。得られた上清をビーカー
に入れ、４℃に保持し、再度損拝しながら粉末硫酸アン
モニウム３３６．６夕を徐々に添加し、溶解した。前記
と同様な方法によって遠心し、上清を除去し、硫酸アン
モニウムの飽和度が４０％で沈澱せず飽和度が７０％で
沈澱する分画を得た。この沈澱に蒸留水約５００の【を
加えて完全に熔解し、前記と同一の透析膜からなる袋に
入れ、蒸留水１００夕を満した金属容器中で、４℃で冷
却しつつ、１幼時間透析した。この透析操作を２度くり
返した後、透析内液を、０．１規定の塩酸及び水酸化ナ
トリウム水溶液、蒸留水で洗浄し、そしてＯ．１モルト
リス塩酸緩衡液−７．０で緩衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ース（生化学工業製）４０夕を充填したカラム（直径６
肌、長さ５０弧）に流速４０の‘／分で通液し、有効成
分を吸着せしめ、カラム通過液を廃棄する。次に０．０
５モルの塩化ナトリウムを含む０．１モルトリス塩酸穣
衡液ｐＨ７．０４．０そを同様の方法で通液し、通過液
を廃棄する。０．１５モルの塩化ナトリウムを含む０．
１モルトリス塩酸緩蜜液ｐＨ７．偽幻２そを前記と同様
の方法で通液し、港出した分画約２夕を前記と同一の透
析膜からなる袋に入れ、蒸留水２００夕を満たした金属
容器中で、４℃に冷却しつつ、１独特間透析した。 この透析操作を２度くり返し、得られた透析内液を加圧
滅菌したメンブランフィルタータイプＴＭ−４（東洋炉
紙）を装着したミリポア炉過装置（日本ミリポァリミテ
ッド製）を用いて無菌源過し、無菌的に凍結乾燥し、粉
末１．８夕を得た。この粉末を４００の９ずつ無菌的に
アンプルに充填し、密封し、粉末状の治療剤４本を得た
。使用に際してはこの治療剤を滅菌した生理食塩水１０
地に溶解し、患者に静注して投与する。実施例 ２ 約６ケ月間に帝王切開により出産した６０人より得た約
１０その凍結羊水を用いたこと、透析外液として蒸留水
１００夕を用いたこと及び透析内液１０．０夕に添加す
る粉末硫酸アンモニウムの量をそれぞれ２２６０夕と１
８７０夕とした以外は実施例１と同機の方法で硫酸アン
モニウムの飽和度４０％で沈澱せず飽和度７０％で沈澱
する分画を得た。 この沈澱に蒸留水約２夕を加えて、完全に溶解し、実施
例１と同一の透析膜からなる袋に入れ、蒸留水２００そ
を満した金属容器にて４℃に冷却しつつ、１餌時間透析
した。この透析操作を２度くり返し後、透析内液を、０
．１規定塩酸及び水酸化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗
浄し、０．０５モルの濃度で塩化ナトリウムを含む０．
１モルトリス塩酸級衡液で緩衡化した２００夕のＴＥＡ
Ｅセルロース（生化学工業製）を充填したカラム（１０
×１００伽）に４０泌／分の速度で通液し、有効成分を
吸着せしめ、通過液を廃棄する。次に０．１５モルの濃
度で塩化ナトリウムを含む０．１モルトリス塩酸穣衡液
ｐＨ７．庇約１０夕を前記と同様の条件でＴＥＡＥセル
ロースカラムに通液し「渚出した分画約１０そを実施例
１と同一の透析膜からなる袋に入れ、蒸留水１０００夕
を満した金属容器中で４℃に冷却しつつ、１網時間透析
した。この透析操作を２度くり返し、得られた透析内液
を実施例１と同様な方法で凍結乾燥し、粉末約９．２夕
を得た。この粉末を１．８夕ずつ無菌的にアンプルに充
填し、密封し、粉末状の治療剤５本を得た。使用に際し
ては、この治療剤を滅菌生理食塩水に溶解し、患者に静
注して投与する。実施例 ３ 帝王切開により出産した１５人より得た約３その羊水を
用いたこと、透析外液として蒸留水３０〆を用いたこと
及び透析内液３．０のこ２度添加する粉未硫酸アンモニ
ウムの量をそれぞれ６７８．０夕と５６１．０夕とした
以外は実施例１と同様の方法で硫酸アンモニウムの飽和
度が４０％で沈澱せず、飽和度７０％で沈澱する分画を
得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 人羊水を蒸留水に対して透析し、この透析内液に硫
   酸アンモニウム粉末を加えて溶解し、飽和度４０％で沈
   殿せず飽和度７０％で沈殿する分画を分別し得られた分
   画に蒸留水を加えて溶解し、該溶液を更に蒸留水に対し
   て透析して硫酸アンモニウムを除去し、得られた透析内
   液をジエチルアミノエチルセルロース又はトリエチルア
   ミノエチルセルロースを充填したカラムに通液し、有効
   成分を吸着せしめ、その後０．０５１〜０．１５モル塩
   化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．１モルトリス塩酸
   緩衝液を該カラムに通液し、溶出する分画を分別するか
   、もしくはコンカナバリンＡを結合させたアガロースを
   充填したカラムに通液し、有効成分を吸着せしめ、その
   後１．１ミリモルから６０ミリモルの濃度のα−メチル
   −Ｄ−グルコシド又はα−メチル−Ｄ−マンノシド及び
   １モルの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０２モ
   ルリン酸ナトリウム緩衡液を該カラムに通液し、溶出す
   る分画を分別し、この分画を蒸留水又は希釈リン酸緩衡
   塩類溶液に対して透析し、得られた透析内液を無菌濾過
   するか又はこの無菌濾過液を乾燥することを特徴とする
   白血球減少症治療剤の製造法。