JPS6034188A - キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 - Google Patents
キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法Info
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- JPS6034188A JPS6034188A JP58142321A JP14232183A JPS6034188A JP S6034188 A JPS6034188 A JP S6034188A JP 58142321 A JP58142321 A JP 58142321A JP 14232183 A JP14232183 A JP 14232183A JP S6034188 A JPS6034188 A JP S6034188A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アルコール発酵法は回分法、連醸法および連続法に分け
られるが、バクテリヤ及び野生酵母による汚染が少いと
いう点で工業的には回分法が広く行われている。速醸発
酵、連続発酵によるアルコールの生産法としては、いく
つかの方法があるが、熟成醪より遠心分離器で酵母を回
収し再使用するメルボイ法では、バクテリヤの汚染に対
しては、Ｉ）ｌ（を低くしたり抗生物質の添加で防止し
ているが、野生酵母の汚染に対しては有効な防止方法が
なかった。最近連続発酵法り改良法として固定化酵母に
よる方法が研究され実施されつつあるが、この方法にお
いても供給糖液が完全に殺菌されている場合は、バクテ
リヤおよび野生酵母の汚染はなく、適当な温度、栄養で
発酵を長期間継続することが出来る。しかし供給糖液を
熱殺菌等で殺菌しない場合は細菌汚染を防止する目的で
供給糖液を酸でｐＨ２，８〜４．２に調整して発酵させ
ることによって、３０日から６０日間は正常に発酵を続
けることが出来るが、長期間連続発酵すると供給糖液中
に生存する各種野生酵母は順次繁殖し始め遂には固定化
粒内まで汚染し、本来のアルコール酵母の働きを妨害す
るため、アルコール収率及びアルコール発酵速度が低下
するという問題点を有する。
られるが、バクテリヤ及び野生酵母による汚染が少いと
いう点で工業的には回分法が広く行われている。速醸発
酵、連続発酵によるアルコールの生産法としては、いく
つかの方法があるが、熟成醪より遠心分離器で酵母を回
収し再使用するメルボイ法では、バクテリヤの汚染に対
しては、Ｉ）ｌ（を低くしたり抗生物質の添加で防止し
ているが、野生酵母の汚染に対しては有効な防止方法が
なかった。最近連続発酵法り改良法として固定化酵母に
よる方法が研究され実施されつつあるが、この方法にお
いても供給糖液が完全に殺菌されている場合は、バクテ
リヤおよび野生酵母の汚染はなく、適当な温度、栄養で
発酵を長期間継続することが出来る。しかし供給糖液を
熱殺菌等で殺菌しない場合は細菌汚染を防止する目的で
供給糖液を酸でｐＨ２，８〜４．２に調整して発酵させ
ることによって、３０日から６０日間は正常に発酵を続
けることが出来るが、長期間連続発酵すると供給糖液中
に生存する各種野生酵母は順次繁殖し始め遂には固定化
粒内まで汚染し、本来のアルコール酵母の働きを妨害す
るため、アルコール収率及びアルコール発酵速度が低下
するという問題点を有する。
そこでアルコールを無蒸煮の糖液を用いて連続発酵法に
より収率良く得るためには、野生酵母を殺す事が必要と
なり、このような特性を備えだキラーアルコール酵母を
造成することが重要な７課題となる。
より収率良く得るためには、野生酵母を殺す事が必要と
なり、このような特性を備えだキラーアルコール酵母を
造成することが重要な７課題となる。
本発明の目的は新型のアルコール発酵能の強いキラーア
ルコール酵母を用いることによって、発酵過程で糖液中
の野生酵母を殺し、野生□、酵母の影響をなくすことに
より発酵速度を低下させｒに収率良くアルコールを製造
する方法を提供することＫある。
ルコール酵母を用いることによって、発酵過程で糖液中
の野生酵母を殺し、野生□、酵母の影響をなくすことに
より発酵速度を低下させｒに収率良くアルコールを製造
する方法を提供することＫある。
近年サツカロミセス属の中に相手の酵母を殺す作用のあ
るものが知られ、キラー酵母と呼ばれている。そしてキ
ラー酵母の実用化は、アンドニー ヴアン レーペンフ
ック（Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ
） ４４ 、５９−７７（＋ ９７８）に記載されて公
知のに、キラー酵母を用いて、清酒ｆワインの製造にお
いて行われてきたが、糖液を原料とするアルコールの製
造にはまだ応用されていない。なぜならば糖液によるア
ルコール発酵は清酒やワインよりも発酵温度が高く３０
℃以上で行われるため、該温度ではに、キラー酵母は活
性を示さないからである。
るものが知られ、キラー酵母と呼ばれている。そしてキ
ラー酵母の実用化は、アンドニー ヴアン レーペンフ
ック（Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ
） ４４ 、５９−７７（＋ ９７８）に記載されて公
知のに、キラー酵母を用いて、清酒ｆワインの製造にお
いて行われてきたが、糖液を原料とするアルコールの製
造にはまだ応用されていない。なぜならば糖液によるア
ルコール発酵は清酒やワインよりも発酵温度が高く３０
℃以上で行われるため、該温度ではに、キラー酵母は活
性を示さないからである。
そこで本発明者らはに、キラー酵母より高温でしかも至
適１）Ｈの低い前記文献に記載されて公知のに２キラー
酵母のアルコール発酵能への影響を試験シ、アルコール
製造に該キラーアルコール酵母を用いた場合のキラー活
性の持続性等について研究した結果、広範囲？野生酵母
に対して殺菌効果のあるに２キラートキシンを有し、ア
ルコール発酵能の強いに２キラーアルコール酵母を発明
するに至った。
適１）Ｈの低い前記文献に記載されて公知のに２キラー
酵母のアルコール発酵能への影響を試験シ、アルコール
製造に該キラーアルコール酵母を用いた場合のキラー活
性の持続性等について研究した結果、広範囲？野生酵母
に対して殺菌効果のあるに２キラートキシンを有し、ア
ルコール発酵能の強いに２キラーアルコール酵母を発明
するに至った。
本願のに２キラーアルコール酵母はサツカロミセス セ
ルビシェ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）に属するアルコール酵母とＫｌキラー酵母と
の細胞融合により造成されるが、Ｋ２キラープラスミド
の受容菌、としてのアルコール酵母は例えばサツカロミ
セス セルビシｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） ＩＦＯＯ２２４，ＩＦＯＯ２＋６
およびその耐塩性変異株Ｍ １１１株が挙げられ、特に
Ｍ１１１株は高発酵能及び耐塩性を有するため受容菌と
して優れている。
ルビシェ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）に属するアルコール酵母とＫｌキラー酵母と
の細胞融合により造成されるが、Ｋ２キラープラスミド
の受容菌、としてのアルコール酵母は例えばサツカロミ
セス セルビシｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） ＩＦＯＯ２２４，ＩＦＯＯ２＋６
およびその耐塩性変異株Ｍ １１１株が挙げられ、特に
Ｍ１１１株は高発酵能及び耐塩性を有するため受容菌と
して優れている。
またんキラープラスミドの供与菌としてのに！キラー酵
母は例えばサツカロミセス セルビシェ（３ａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＣＹＣ７
３８。
母は例えばサツカロミセス セルビシェ（３ａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＣＹＣ７
３８。
１００１．１８８５．１３８７．１４２８株およびサッ
カ・ｏミセ、ｌ（ディアスタテイカス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ） ＮＣＹＣ７１
３株が挙げられ、特に前記んキラー酵母である１３８７
株とサツカロミセス セルビシエ１０２０株よυ造成し
た核融合欠損’Ｒ異ヲ持つサツカロミセス セルビシエ
５１７０株は、Ｋｌキラープラスミドのみをアルコール
酵母に導入するため特に有効である。上記のアルコール
酵母Ｍｌｌ１株およびに２キラ一酵母５１７０株より造
成したキラーアルコール酵母はキラーアルコール酵母
サツカロミセス セルビシｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋｇ−Ｍ １１１株
（微工研菌寄第７０７１号）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託しである。
カ・ｏミセ、ｌ（ディアスタテイカス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ） ＮＣＹＣ７１
３株が挙げられ、特に前記んキラー酵母である１３８７
株とサツカロミセス セルビシエ１０２０株よυ造成し
た核融合欠損’Ｒ異ヲ持つサツカロミセス セルビシエ
５１７０株は、Ｋｌキラープラスミドのみをアルコール
酵母に導入するため特に有効である。上記のアルコール
酵母Ｍｌｌ１株およびに２キラ一酵母５１７０株より造
成したキラーアルコール酵母はキラーアルコール酵母
サツカロミセス セルビシｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋｇ−Ｍ １１１株
（微工研菌寄第７０７１号）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託しである。
従来のアルコール発酵酵母と本願のんキラーアルコール
酵母トのアルコール発酵における炭酸ガス減量の比較、
アセトアルデヒドおよび酢酸エチルなどの副生物生産の
比較実験より、アルコール発酵能および副生物生産にお
いて４、本願のキラーアルコール酵母と従来のアルコー
ル酵明細書の浄書（内容に変更なし） 母との間に差は見られないことが、第１図および第１表
から明らかである。
酵母トのアルコール発酵における炭酸ガス減量の比較、
アセトアルデヒドおよび酢酸エチルなどの副生物生産の
比較実験より、アルコール発酵能および副生物生産にお
いて４、本願のキラーアルコール酵母と従来のアルコー
ル酵明細書の浄書（内容に変更なし） 母との間に差は見られないことが、第１図および第１表
から明らかである。
第１表 造成味に２−ＭＩＬＬ株と親株を用いた場合の
生成アルコール及び副生物の比較 法にに２−キラー酵母による糖液中での野生酵母の殺菌
を試み、以下の様な実験結果２得た。
生成アルコール及び副生物の比較 法にに２−キラー酵母による糖液中での野生酵母の殺菌
を試み、以下の様な実験結果２得た。
げ）キラーアルコール酵母を使用した回分発酵における
生存野生酵母数の変化は、全糖１５チ。
生存野生酵母数の変化は、全糖１５チ。
ｐＨ４，２に調整した糖蜜醪に先のアルコール酵母Ｍ１
１１株又はキラーアルコール酵母に、−ＭＩＩＩ株をｌ
Ｏ′コＡｔ植菌し、さらに薬剤（シクロヘギシミド）耐
性を与えた野生酵母ＭＣＡ株をＩ Ｏ”ｉＡｔ 、 Ｉ
Ｏ”コ／ｍｌおよび１０’ｙ／ｍｌそれぞれ追加植菌
し、３０℃にて培養し野生酵母ＭＣＡ株の生菌数を縞時
的に測定したところ、アルコール酵母Ｍ１．．１１株と
野生酵母ＭＣＡ株との混合系では、野生酵母ＭＣＡ株は
各濃度で増殖したのに対し、キラーアルコール酵母に、
−Ｍｌｌ１株とＭＣＡ株との混合系では、野生酵母Ｍ、
ＣＡ株は各濃度で減少し、キラートキシンの効果を示し
た。（第２図参照）（ロ）固定化キラーアルコール酵母
を使用した連続発酵における生存野生酵母数の変化は、
アルコール酵母Ｍ１１１株およびキラーアルコール酵母
に、−Ｍｌｌ１株のそれぞれのアルギン酸アルミニウム
包括固定化酵母を充填、率４０、チでリアクターにつめ
、滞留時間１０時間で、全糖１５％、ｐＨ４２に調整し
°た糖蜜を供給し、３０℃で発酵を行ない、定常状態に
なったところで、野生酵母ＭＣＡ株ｆ １０’ ニア／
ＩＩ／、１０’コ／ｍｅ又は１０６コ／ｍｌになる様植
菌し、その後の流出液中の野生酵母Ｍｏ’Ａ株の生１４
１１赦の変化を測定すると、アルコール酵母Ｍ１１１株
固定化リアクターでは野生酵母ＭＣＡ株を１０’コ／ｖ
ｔｌ植菌した場合１４・４・時開後でも１０８コ／ｍｅ
残存したのに対し、 キラーアルコール酵母に、、
−Ｍｉｌ１株固定化リアクターでは野生酵母ＭＣＡ株を
ｌＯコ／ｍｅ植菌した場合２４・時検出となった。
１１株又はキラーアルコール酵母に、−ＭＩＩＩ株をｌ
Ｏ′コＡｔ植菌し、さらに薬剤（シクロヘギシミド）耐
性を与えた野生酵母ＭＣＡ株をＩ Ｏ”ｉＡｔ 、 Ｉ
Ｏ”コ／ｍｌおよび１０’ｙ／ｍｌそれぞれ追加植菌
し、３０℃にて培養し野生酵母ＭＣＡ株の生菌数を縞時
的に測定したところ、アルコール酵母Ｍ１．．１１株と
野生酵母ＭＣＡ株との混合系では、野生酵母ＭＣＡ株は
各濃度で増殖したのに対し、キラーアルコール酵母に、
−Ｍｌｌ１株とＭＣＡ株との混合系では、野生酵母Ｍ、
ＣＡ株は各濃度で減少し、キラートキシンの効果を示し
た。（第２図参照）（ロ）固定化キラーアルコール酵母
を使用した連続発酵における生存野生酵母数の変化は、
アルコール酵母Ｍ１１１株およびキラーアルコール酵母
に、−Ｍｌｌ１株のそれぞれのアルギン酸アルミニウム
包括固定化酵母を充填、率４０、チでリアクターにつめ
、滞留時間１０時間で、全糖１５％、ｐＨ４２に調整し
°た糖蜜を供給し、３０℃で発酵を行ない、定常状態に
なったところで、野生酵母ＭＣＡ株ｆ １０’ ニア／
ＩＩ／、１０’コ／ｍｅ又は１０６コ／ｍｌになる様植
菌し、その後の流出液中の野生酵母Ｍｏ’Ａ株の生１４
１１赦の変化を測定すると、アルコール酵母Ｍ１１１株
固定化リアクターでは野生酵母ＭＣＡ株を１０’コ／ｖ
ｔｌ植菌した場合１４・４・時開後でも１０８コ／ｍｅ
残存したのに対し、 キラーアルコール酵母に、、
−Ｍｉｌ１株固定化リアクターでは野生酵母ＭＣＡ株を
ｌＯコ／ｍｅ植菌した場合２４・時検出となった。
（第３図参照）
（イ）の回分培養と比較するとａ母が常に増殖する連続
発酵の方がキラートキシンがより効果を示す事が明らか
にｋった。
発酵の方がキラートキシンがより効果を示す事が明らか
にｋった。
（ハ）固定化キラーアルコール酵母を使用した連続発酵
におけるｐＨおよび温度のキラートキシンに及ばず影響
は、３０℃にて、ｐＴ（３−２＋４、．２，５．２およ
び全糖１５％に調整した糖蜜を用い連続発酵を行ない、
ＭＣＡ株を植菌しその後の生菌数の変化′ｆｒ：調べた
結果％ＰＨ５，２の供給液を通液した場合に２−Ｍ１ｌ
１株固定化リアクターの方がＭ１１１株固定化リアクタ
ーＭｅＡ株の生菌数減少が著しく、低ｐＨ３，２でも４
・８時間後にＭＣＡ株は不検出となり、供給液のｐＨに
よって時間的に違いはあったが、一様に効果を示した。
におけるｐＨおよび温度のキラートキシンに及ばず影響
は、３０℃にて、ｐＴ（３−２＋４、．２，５．２およ
び全糖１５％に調整した糖蜜を用い連続発酵を行ない、
ＭＣＡ株を植菌しその後の生菌数の変化′ｆｒ：調べた
結果％ＰＨ５，２の供給液を通液した場合に２−Ｍ１ｌ
１株固定化リアクターの方がＭ１１１株固定化リアクタ
ーＭｅＡ株の生菌数減少が著しく、低ｐＨ３，２でも４
・８時間後にＭＣＡ株は不検出となり、供給液のｐＨに
よって時間的に違いはあったが、一様に効果を示した。
（第４４図参照）次に３５しにて連続発酵を行ない、野
生酵母ＭＣＡ株を１０６コ／ｍｌ植菌し野生酵母ＭＣＡ
株の生菌数の変化を調べた結果３５℃においても効果を
示した。（第５図参照） とｎと同じ現象は、前記アルコール酵母、Ｋ２キラーア
ルコール酵母および５１７０株以外のに２キラー野生酵
母においても認められた。
生酵母ＭＣＡ株を１０６コ／ｍｌ植菌し野生酵母ＭＣＡ
株の生菌数の変化を調べた結果３５℃においても効果を
示した。（第５図参照） とｎと同じ現象は、前記アルコール酵母、Ｋ２キラーア
ルコール酵母および５１７０株以外のに２キラー野生酵
母においても認められた。
以上の結果より本願のに２キラーアルコール酵母を使用
すれば従来のアルコール発酵至適条件である。ｐ ＴＩ
４．、 Ｑ〜５．０．３０℃よりも広範囲のｐＨでしか
も高温でのアルコール発酵が可能となり、特に野生酵母
の汚染のおそｎが多い連続発酵において有効であること
が明らかとなっ之。
すれば従来のアルコール発酵至適条件である。ｐ ＴＩ
４．、 Ｑ〜５．０．３０℃よりも広範囲のｐＨでしか
も高温でのアルコール発酵が可能となり、特に野生酵母
の汚染のおそｎが多い連続発酵において有効であること
が明らかとなっ之。
本発明はアルコール発酵能が強り、１−かもＫ ２キラ
ートキシン耐性およびに２キラートキシン生産能を有し
、該キラー株と同一のキラー形質を有するキラーアルコ
ール酵母 サツ力ロミセスセルビシエを用いて糖液より
アルコール′ｆ：製造する方法に関する。
ートキシン耐性およびに２キラートキシン生産能を有し
、該キラー株と同一のキラー形質を有するキラーアルコ
ール酵母 サツ力ロミセスセルビシエを用いて糖液より
アルコール′ｆ：製造する方法に関する。
本願方法は回分発酵、速醸発酵及び連続発酵のいずれの
方法にも適用できるが、野生酵母の汚染の多い速醸発酵
及び連続発酵法において特に有効であり、発酵温度２５
〜３８”ＣＩ！ましくは８０〜３５′Ｃの高温で、発酵
ｐＨ３，０〜５．２の広範囲のｐＨ下で、キラートキシ
ンを生産し、広範囲の野生酵母を殺し、良好なアルコー
ル発酵を持続できる。
方法にも適用できるが、野生酵母の汚染の多い速醸発酵
及び連続発酵法において特に有効であり、発酵温度２５
〜３８”ＣＩ！ましくは８０〜３５′Ｃの高温で、発酵
ｐＨ３，０〜５．２の広範囲のｐＨ下で、キラートキシ
ンを生産し、広範囲の野生酵母を殺し、良好なアルコー
ル発酵を持続できる。
これは当分野において画期的な効果である。
連続発酵においては本願のキラーアルコール酵母は、ア
ルギン酸塩、カラギーナン、ポリアクリルアミドおよび
ゲルタールアルデヒドなトチ固定化して使用することに
より、よい結果を得ることが出来る。
ルギン酸塩、カラギーナン、ポリアクリルアミドおよび
ゲルタールアルデヒドなトチ固定化して使用することに
より、よい結果を得ることが出来る。
本願方法で使用する原料糖液としては砂糖きび又はてん
菜糖などに由来するもの、殿粉質をアミラーゼ又は酸で
糖化したもの、木質物をセルラーゼ又は酸で糖化したも
のが挙げられる。
菜糖などに由来するもの、殿粉質をアミラーゼ又は酸で
糖化したもの、木質物をセルラーゼ又は酸で糖化したも
のが挙げられる。
次に参考例および実施例を挙げて本発明を説明する。
参考例 キラーアルコール酵母の造成
（イ）Ｋ２キラープラスミド供与菌の造成細胞融合法に
より、受容菌Ｍ１１１に供与菌に２キラープラスミドを
導入する際に、両者の核融合を極力抑え、Ｋ２キラープ
ラスミドを持つが、核にはアルコール発酵能の高いＭｌ
ｌｌの核のみを持つ株を造成することが必要である。
より、受容菌Ｍ１１１に供与菌に２キラープラスミドを
導入する際に、両者の核融合を極力抑え、Ｋ２キラープ
ラスミドを持つが、核にはアルコール発酵能の高いＭｌ
ｌｌの核のみを持つ株を造成することが必要である。
そこで、核融合欠損変異及び受容菌と区別できる遺伝標
識を持つに２キラープラスミド供与閑５１７０（遺伝子
型： ａ ｋａｒｌ −１，ｈｉｓ ４ （ＫＩＬ−に
２） （ＮＢＸ−０） ）の造成を以Ｆのノミ法で行な
った。まず、Ｋ２キラー（（Ｋｒ Ｌ−Ｋｌｌ） ）及
びヒスチジン要求性（ｈｉｓ４．）’ｉ持つａ接合型株
を得るために、サツカロミセス セルビシエ（８ａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） １０２
０（遺伝子：α、 ｈｉｓ ４ 、 ｋａｒｌ−１、（
ＫＩ Ｌ−０） （ＥＸＬ−０） ）とサツカロミセス
セルビシェ １３８７（遺伝子型： ａ ｕｒａ １
（ＫＩＬ Ｋ２） （ＮＨＸ Ｏ）をそれぞれ５Ｗ／
ＹＥＰＤ培地（２憾グルコース。
識を持つに２キラープラスミド供与閑５１７０（遺伝子
型： ａ ｋａｒｌ −１，ｈｉｓ ４ （ＫＩＬ−に
２） （ＮＢＸ−０） ）の造成を以Ｆのノミ法で行な
った。まず、Ｋ２キラー（（Ｋｒ Ｌ−Ｋｌｌ） ）及
びヒスチジン要求性（ｈｉｓ４．）’ｉ持つａ接合型株
を得るために、サツカロミセス セルビシエ（８ａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） １０２
０（遺伝子：α、 ｈｉｓ ４ 、 ｋａｒｌ−１、（
ＫＩ Ｌ−０） （ＥＸＬ−０） ）とサツカロミセス
セルビシェ １３８７（遺伝子型： ａ ｕｒａ １
（ＫＩＬ Ｋ２） （ＮＨＸ Ｏ）をそれぞれ５Ｗ／
ＹＥＰＤ培地（２憾グルコース。
２憾ポリペプトン、１俤酵母エキス）に４Ｉａ ｍ後、
３０℃１日静置培養し、各々の培養液１００、ｔｔｌｌ
ｆ５ｍｌｔＢｐＤ培地に一緒に加え、８０ ’Ｃ１日静
１１ｑ培養した。この培養液を無菌水で２回洗浄後、最
少培地（０，６７＜ ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎ Ｂ
ａ５ｅ Ｗｌｏ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ ２ ％グルコ
ース、２俤寒天）に塗布し、増殖してきたコロニーを交
雑法として選択し、胞子形成培地（０，５％酢酸カリウ
ム、２％寒天）に塗布し、３０℃３日間培養し胞子形成
させた。
３０℃１日静置培養し、各々の培養液１００、ｔｔｌｌ
ｆ５ｍｌｔＢｐＤ培地に一緒に加え、８０ ’Ｃ１日静
１１ｑ培養した。この培養液を無菌水で２回洗浄後、最
少培地（０，６７＜ ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎ Ｂ
ａ５ｅ Ｗｌｏ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ ２ ％グルコ
ース、２俤寒天）に塗布し、増殖してきたコロニーを交
雑法として選択し、胞子形成培地（０，５％酢酸カリウ
ム、２％寒天）に塗布し、３０℃３日間培養し胞子形成
させた。
次に４胞子形成した子のうをマイクロマニュピレータ−
で４分子分解し、ＹＢＰＤ平板で発芽させ、最少培地上
で増殖できないが、最少 １培地にヒスチジンを加えた
培地上で増殖出来る株をヒスチジン要求性株として選択
し、その中からａ接合型細胞を選択した。
で４分子分解し、ＹＢＰＤ平板で発芽させ、最少培地上
で増殖できないが、最少 １培地にヒスチジンを加えた
培地上で増殖出来る株をヒスチジン要求性株として選択
し、その中からａ接合型細胞を選択した。
以］二のようにして選択したａ接合型でＫｌ！キラー
ヒスチジン要求性をもつ株の中から、核融合欠損変異（
ｋａｒｌ−１）を持つ株を選択する為に、これらの株を
ロイシン要求性、カナノぐニン耐性及び呼吸欠損を有す
るα型株と交配シ、最少培地にロイシン、カナノくニン
及びグルコースのかわりにグリセリンを加えた培地上で
高頻度にコロニーが出現し、最少培地上でコロニー出現
頻度の極めて低い株を核融合欠損株サツカロミセス セ
ルビシエ５１７０（遺伝子型： ａ ｋａｒｌ−１ｈｉ
ｓ ４（ＫＩＬ−Ｋｇ） （Ｎｕｘ−ｏ） ）として選
択した。さらにこの株をに２キラ一感受性株を塗抹した
メチレングルーｏ、 ｏ ｏ ａ憾含有ＹＢＰＯ培地（
ｐＨ４２） に画線培養し、キラー活性を有することを
確認した０ 口）キラーアルコール酵母に２−Ｍｌｌｌの造成受容菌
のアルコール酵母であるサツカロミセス セルビシエＭ
１１１株と供与ＭＫ２キラー酵母 サツカロミセス セ
ルビシエ５１７０株をそれぞれＹＢＰＤ培地で培養後対
数増殖期の菌体を集菌水洗し友。両画体をそれぞれ２．
５ｔｓｌのソルビトール、トリス緩衝液（１Ｍソルビト
ール、 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−）１ａｌ、ｐＨ７，４
＋以下ＳＴ溶液と呼ぶ）に懸濁し、０．５ ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）ｔ”０．１＊ｆ？さらに２−メルカプ
トエタノール５０μｌ’ｆｒ：加え３０℃、１０分間培
養し、２．５ ｔｔｔｔのＳＴ温溶液洗浄し、さらに２
．５ａｌのＳＴ温溶液再懸濁した。５０μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡ （Ｐ）（７，５）及び１００μｌのＺｙｍｏ
ｌｙａｓｅ６０００（２，５Ｍｙ／）ｔｌｌ ）を加え
、３０℃、１５０分培養し、両画のプロトプラストをｆ
Ｊ４ Ｈし回収した。調製したプロトプラスト サツカ
ロミセス セルビシエＭｉｌ１株１に対してプロトプラ
スト サツカロミセス セルピシエ５１７０株１０ｆ：
ｒＭソルビトール＋ １０ ｍＭ Ｔｒｉｏ −Ｈｃｌ
、 １０ ｍＭ塩化カルシウムを含む溶液（以下ＳＴ
Ｏ溶液ト呼）） ０．５ ｍｌに懸濁した。３０６．１
５分培養後菌体を回収しＰＴＯ溶液（３５％ Ｐ Ｅ
Ｇ ４０００ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ 、ｌＱ
ｍ Ｍ ０ａ０１２ 、 ｐＨ７，４） ０．５ ｍｌ
に懸濁し３０℃。
ヒスチジン要求性をもつ株の中から、核融合欠損変異（
ｋａｒｌ−１）を持つ株を選択する為に、これらの株を
ロイシン要求性、カナノぐニン耐性及び呼吸欠損を有す
るα型株と交配シ、最少培地にロイシン、カナノくニン
及びグルコースのかわりにグリセリンを加えた培地上で
高頻度にコロニーが出現し、最少培地上でコロニー出現
頻度の極めて低い株を核融合欠損株サツカロミセス セ
ルビシエ５１７０（遺伝子型： ａ ｋａｒｌ−１ｈｉ
ｓ ４（ＫＩＬ−Ｋｇ） （Ｎｕｘ−ｏ） ）として選
択した。さらにこの株をに２キラ一感受性株を塗抹した
メチレングルーｏ、 ｏ ｏ ａ憾含有ＹＢＰＯ培地（
ｐＨ４２） に画線培養し、キラー活性を有することを
確認した０ 口）キラーアルコール酵母に２−Ｍｌｌｌの造成受容菌
のアルコール酵母であるサツカロミセス セルビシエＭ
１１１株と供与ＭＫ２キラー酵母 サツカロミセス セ
ルビシエ５１７０株をそれぞれＹＢＰＤ培地で培養後対
数増殖期の菌体を集菌水洗し友。両画体をそれぞれ２．
５ｔｓｌのソルビトール、トリス緩衝液（１Ｍソルビト
ール、 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−）１ａｌ、ｐＨ７，４
＋以下ＳＴ溶液と呼ぶ）に懸濁し、０．５ ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）ｔ”０．１＊ｆ？さらに２−メルカプ
トエタノール５０μｌ’ｆｒ：加え３０℃、１０分間培
養し、２．５ ｔｔｔｔのＳＴ温溶液洗浄し、さらに２
．５ａｌのＳＴ温溶液再懸濁した。５０μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡ （Ｐ）（７，５）及び１００μｌのＺｙｍｏ
ｌｙａｓｅ６０００（２，５Ｍｙ／）ｔｌｌ ）を加え
、３０℃、１５０分培養し、両画のプロトプラストをｆ
Ｊ４ Ｈし回収した。調製したプロトプラスト サツカ
ロミセス セルビシエＭｉｌ１株１に対してプロトプラ
スト サツカロミセス セルピシエ５１７０株１０ｆ：
ｒＭソルビトール＋ １０ ｍＭ Ｔｒｉｏ −Ｈｃｌ
、 １０ ｍＭ塩化カルシウムを含む溶液（以下ＳＴ
Ｏ溶液ト呼）） ０．５ ｍｌに懸濁した。３０６．１
５分培養後菌体を回収しＰＴＯ溶液（３５％ Ｐ Ｅ
Ｇ ４０００ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ 、ｌＱ
ｍ Ｍ ０ａ０１２ 、 ｐＨ７，４） ０．５ ｍｌ
に懸濁し３０℃。
２０分間培養し、ＳＴＯ溶液で１回洗浄後０．２耐のＳ
ＴＯ溶液に再懸濁した。
ＴＯ溶液に再懸濁した。
この懸濁液をＩＭソルビトールを含む最少寒天培地上に
塗沫し、工Ｍソルビトールを含む最少寒天培地を重層し
、３０℃、１週間培養し念。
塗沫し、工Ｍソルビトールを含む最少寒天培地を重層し
、３０℃、１週間培養し念。
コロニーの現われた最少寒天培地をＹＥＰＤ液体培地（
ＰＨ４２）中に寒天をつぶしながら加え、２５ｔＥ、２
日間培養した。この培養液１ ｇ／？をＹＥ、ＰＤ液体
培地（ｐＨ４２，）１００ｍｌに加え、さらにに２キラ
ー酵母 サツカロミセス セルピッ１５１フ０株の培養
液０．１ ｔｅｌを加え、２５℃、３日間培養した。こ
の培養液５０μｌｆ：Ｙ Ｂ Ｐ Ｄ培地（ｐＨ４２）
５ｇｔに加え、２５℃、２日間培養し、０．１ゴを最少
寒天培地上に塗沫し、３０℃、２日間培養し、増殖した
株を感受性株を塗沫したメチレンブルーｏ、ｏＯａ％合
有ＹＢＰＤ培地（ＰＨ４，，２）にレプリカしキラー活
性を有した株をキラーアルコール酵母 サツカロミセス
セルビシエに２−Ｍｌ １１株セして選択した。
ＰＨ４２）中に寒天をつぶしながら加え、２５ｔＥ、２
日間培養した。この培養液１ ｇ／？をＹＥ、ＰＤ液体
培地（ｐＨ４２，）１００ｍｌに加え、さらにに２キラ
ー酵母 サツカロミセス セルピッ１５１フ０株の培養
液０．１ ｔｅｌを加え、２５℃、３日間培養した。こ
の培養液５０μｌｆ：Ｙ Ｂ Ｐ Ｄ培地（ｐＨ４２）
５ｇｔに加え、２５℃、２日間培養し、０．１ゴを最少
寒天培地上に塗沫し、３０℃、２日間培養し、増殖した
株を感受性株を塗沫したメチレンブルーｏ、ｏＯａ％合
有ＹＢＰＤ培地（ＰＨ４，，２）にレプリカしキラー活
性を有した株をキラーアルコール酵母 サツカロミセス
セルビシエに２−Ｍｌ １１株セして選択した。
とれらの造成様と親株との諸性質の比較を第２表に示し
た。さらに、造成株すツ力ロミセスセルビシエに２−Ｍ
１ｌ１株は、供与菌のに２キラー酵母 サツカロミセス
セルビシエ５１７０株と同じ、Ｋ２キラープラスミド
（Ｌ−ｄｓＲＮＡ、 Ｍ −ａｓＦＬＮｔ）をもち３０
℃においてもキラー活性を有する株であるためアルコー
ル発酵特に野生酵母の汚染の多い連続発酵に利用すると
多大な効果を発揮する。
た。さらに、造成株すツ力ロミセスセルビシエに２−Ｍ
１ｌ１株は、供与菌のに２キラー酵母 サツカロミセス
セルビシエ５１７０株と同じ、Ｋ２キラープラスミド
（Ｌ−ｄｓＲＮＡ、 Ｍ −ａｓＦＬＮｔ）をもち３０
℃においてもキラー活性を有する株であるためアルコー
ル発酵特に野生酵母の汚染の多い連続発酵に利用すると
多大な効果を発揮する。
なお、上記の造成様は微生物の名称キラーアルコール酵
母 サツカロミセス セルビシエ（８ａｃｏｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ａｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ２−Ｍｌｌ１株
（微工研菌寄第７０７１号）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託しである。
母 サツカロミセス セルビシエ（８ａｃｏｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ａｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ２−Ｍｌｌ１株
（微工研菌寄第７０７１号）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託しである。
また、アガロースゲル電気泳動分析により受容菌のアル
コール酵母 サツカロミセス セルビシエＭｉｌ１株に
はＬ−ｄｓ ＲＮＡ 、 Ｍ−ｄｓ ＲＮＡのバンドは
なく、造成様サツカロミセス セルビシエに２−Ｍ１ｌ
１株には供与菌のキラー酵母サツカロミセス セルビシ
エ５１７０株と同一の分子量のＬ−ｄｓ几ＮＡ 、 Ｍ
−ａ ｓ ＲＮＡをもつことが確認された（以下余白、
次頁へ） 明細書の浄書（内容に変更なし） 第２表 造成様に２−Ｍ１ｌ１株の親株との諸性質の比
較 果 アルコール酵母 サツカロミセス セルビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ａｅｒｅｖｉａｉａｅ） Ｍｌ
ｌ１株とキラーアルコール酵母 サツカロミセス セル
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｏｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） Ｋ２−Ｍｉｌ１株とを各々培養し、固定化造
粒酵母を造り、１’１０６−容パイオリアククーに充填
し、全糖１５％、ｐＨ３，７に調製した加熱殺菌等を行
なわない糖蜜供給液を１１ ｌ／ｈｒ （τ＝ｌＱｈｒ
ｓ）通液し、８０℃で１００日間連続アルコール発酵を
行なった。
コール酵母 サツカロミセス セルビシエＭｉｌ１株に
はＬ−ｄｓ ＲＮＡ 、 Ｍ−ｄｓ ＲＮＡのバンドは
なく、造成様サツカロミセス セルビシエに２−Ｍ１ｌ
１株には供与菌のキラー酵母サツカロミセス セルビシ
エ５１７０株と同一の分子量のＬ−ｄｓ几ＮＡ 、 Ｍ
−ａ ｓ ＲＮＡをもつことが確認された（以下余白、
次頁へ） 明細書の浄書（内容に変更なし） 第２表 造成様に２−Ｍ１ｌ１株の親株との諸性質の比
較 果 アルコール酵母 サツカロミセス セルビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ａｅｒｅｖｉａｉａｅ） Ｍｌ
ｌ１株とキラーアルコール酵母 サツカロミセス セル
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｏｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） Ｋ２−Ｍｉｌ１株とを各々培養し、固定化造
粒酵母を造り、１’１０６−容パイオリアククーに充填
し、全糖１５％、ｐＨ３，７に調製した加熱殺菌等を行
なわない糖蜜供給液を１１ ｌ／ｈｒ （τ＝ｌＱｈｒ
ｓ）通液し、８０℃で１００日間連続アルコール発酵を
行なった。
その結果は第６図のようになり、アルコール酵母のバイ
オリアクタ〜の流出液中の野生酵母は４．０日間に全酵
母数の２０憾となり６０日ロア４．０％、８０日ロア９
０係に達し発酵歩合は２０日ロア８３％であったものが
順次低下し、６０日ロア７７％、８０日ロア６９憾に低
下した。
オリアクタ〜の流出液中の野生酵母は４．０日間に全酵
母数の２０憾となり６０日ロア４．０％、８０日ロア９
０係に達し発酵歩合は２０日ロア８３％であったものが
順次低下し、６０日ロア７７％、８０日ロア６９憾に低
下した。
一方、キラーアルコール酵母に２−Ｍ１ｌ１株のバイオ
リアクターの流出液の野生酵母数は全期間検出されず、
発酵歩合８３憾の高発醇歩合を長期間継続することがで
きた。
リアクターの流出液の野生酵母数は全期間検出されず、
発酵歩合８３憾の高発醇歩合を長期間継続することがで
きた。
このようにアルコール酵母Ｍｌｌ１株を使用した場合、
６０日でアルコール製造を中止しなければならないが、
キラーアルコール酵母に２− Ｍｉｌ１株を使うことに
より１００日以上、連続生産を行なうことができた。
６０日でアルコール製造を中止しなければならないが、
キラーアルコール酵母に２− Ｍｉｌ１株を使うことに
より１００日以上、連続生産を行なうことができた。
第１図は全糖２２．５ ％’ 、 ＰＨ５，’ １ 、
３０ ”（Ｅ （Ｄ条件下で造成法に２−Ｍ１ｌ１株と
親株（受容菌Ｍｌ１１株）の、糖蜜培地における発酵方
の比較を表わし、第２図はキラーアルコール酵母を使用
した回分発酵における生存野生酵母数の変化を表わし、
第３図は固定化キラーアルコール酵母を使用した連続発
酵における生存野生酵母数の変化を表わし、第４図ば３
０ ’Ｃ連続発酵におけるｐＨのキラートキシンへの影
響を表わし、第５図は３５し連続発酵におけるキラート
キシンの効果を表わし、第６図は無殺菌Ｍ蜜での連続ア
ルコール土量における野生酵母による汚染度、生成エタ
ノールおよび発酵歩合を表わす。 出 願 人 賓酒造株式会社 第１図 萌閉 第２図 す壱１時間 （時間） 第３図 −Ｏ−ゼト −０−Ｋ２−Ｍｌｌｌ郡印１定Ｉｌ−リア
クター−・−Ｍｉｌｌ 固オＪしりアクタ− 第４図 路１時開（時閉） 第５図 殆壜時間Ｃ問関） 第６図 昭し◆云閂闇 （臼） 手続補正書 昭和５８年１２月２１日 １、事件の表示 昭和５８年特許順第１４２３２１号２
、発明の名称 キラーアルコール酵母を用いたアルコール製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 代表者 大 宮 隆
３０ ”（Ｅ （Ｄ条件下で造成法に２−Ｍ１ｌ１株と
親株（受容菌Ｍｌ１１株）の、糖蜜培地における発酵方
の比較を表わし、第２図はキラーアルコール酵母を使用
した回分発酵における生存野生酵母数の変化を表わし、
第３図は固定化キラーアルコール酵母を使用した連続発
酵における生存野生酵母数の変化を表わし、第４図ば３
０ ’Ｃ連続発酵におけるｐＨのキラートキシンへの影
響を表わし、第５図は３５し連続発酵におけるキラート
キシンの効果を表わし、第６図は無殺菌Ｍ蜜での連続ア
ルコール土量における野生酵母による汚染度、生成エタ
ノールおよび発酵歩合を表わす。 出 願 人 賓酒造株式会社 第１図 萌閉 第２図 す壱１時間 （時間） 第３図 −Ｏ−ゼト −０−Ｋ２−Ｍｌｌｌ郡印１定Ｉｌ−リア
クター−・−Ｍｉｌｌ 固オＪしりアクタ− 第４図 路１時開（時閉） 第５図 殆壜時間Ｃ問関） 第６図 昭し◆云閂闇 （臼） 手続補正書 昭和５８年１２月２１日 １、事件の表示 昭和５８年特許順第１４２３２１号２
、発明の名称 キラーアルコール酵母を用いたアルコール製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 代表者 大 宮 隆
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 アルコール発酵能が強く、しかもに２キラー酵母と同一
のキラー形質を有するキラーアルコール酵母、サツカロ
ミセス セルビシエ（５ａｃｃｈａｒ。 ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用ｔｎテ、糖液
より７ ／Ｌ／ コールを製造する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142321A JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
| BR8403837A BR8403837A (pt) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Processo de manufatura de alcool pelo uso de levedo exterminador no alcool |
| PH31056A PH20106A (en) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Method of manufacturing ethanol by the use of killer ethanol yeast |
| FR8412188A FR2550221B1 (fr) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Procede de fabrication d'alcool a l'aide d'une levure alcoolique destructrice |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142321A JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034188A true JPS6034188A (ja) | 1985-02-21 |
| JPH043954B2 JPH043954B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=15312631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58142321A Granted JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6034188A (ja) |
| BR (1) | BR8403837A (ja) |
| FR (1) | FR2550221B1 (ja) |
| PH (1) | PH20106A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008062558A1 (en) * | 2006-11-20 | 2008-05-29 | Yamaguchi University | Thermotolerant ethanol-producing yeast and ethanol production method utilizing the same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212779A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 酵母 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57146571A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Killer yeast |
-
1983
- 1983-08-03 JP JP58142321A patent/JPS6034188A/ja active Granted
-
1984
- 1984-08-01 FR FR8412188A patent/FR2550221B1/fr not_active Expired
- 1984-08-01 PH PH31056A patent/PH20106A/en unknown
- 1984-08-01 BR BR8403837A patent/BR8403837A/pt unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212779A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 酵母 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008062558A1 (en) * | 2006-11-20 | 2008-05-29 | Yamaguchi University | Thermotolerant ethanol-producing yeast and ethanol production method utilizing the same |
| JP5051727B2 (ja) * | 2006-11-20 | 2012-10-17 | 国立大学法人山口大学 | 耐熱性エタノール生産酵母及びこれを用いたエタノール生産方法 |
| US8334122B2 (en) | 2006-11-20 | 2012-12-18 | Yamaguchi University | Thermotolerant ethanol-producing yeast and ethanol production method utilizing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH043954B2 (ja) | 1992-01-24 |
| FR2550221B1 (fr) | 1987-01-30 |
| FR2550221A1 (fr) | 1985-02-08 |
| BR8403837A (pt) | 1985-07-09 |
| PH20106A (en) | 1986-09-29 |
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