JPS603480B2 - クレアチニンおよびクレアチンの定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素を用いるクレアチニンおよびクレアチンの
定量法に関するものである。

体液中のクレアチニンおよびクレアチンの定量は賢疾患
、筋肉疾患、甲状腺機館冗進症等の診断の有用な情報を
提供するものである。

従来よく用いられたクレアチニンの定量法はアルカリ性
ピクリン酸を用いるャツフェ法である。この方法はクレ
アチニンに特異的な反応を示さないので、体液中の他の
物質の影響を受けるため正確なクレアチニン基を求め得
ないし、また強アルカリを用いたり、ビクリン酸が反応
容器や分析機を汚染させ測定誤差の原因になる、また自
動分析機に適応させた場合には他の測定項目に影響を与
える等の取扱い上、問題が多かった。一方、クレアチン
は酸性で加熱してクレアチニンに変え、生じたクレアチ
ニンを上記のヤツフェ法で測定し「酸性加熱前のクレア
チニン量との差からクレアチン量を推定する方法である
。

このためクレアチン定量法は誤差を生じやすくト磯作が
繁雑な欠点がある。このような従来の定量法の欠点を解
決するために、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（以下
ＣＲＨと略称する）およびクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼ（以下ＣＡＨと略称する）およびザルコシンデヒド
ロゲナーゼ（以下ＳＤＨと略称する）を絹合せて作用さ
せるクレアチニンおよびクレァチンの定量法が提案され
ている（袴関昭５２−１１７６９４号、特関昭５２−１
５６６９５号へ 特関昭５３一１１０９１号）。

ところが、この定量法では反応が４ステップであって繁
雑である。

本発明者等は操作が簡単で、しかも正確度の高いクレア
チニンおよびクレアチンの定量法を見出すために、種々
鋭意検討したところ、ＣＲＨ，ＣＡＨ、ザルコシンオキ
シダーゼ（以下ＳＯＤと略称する）、ベルオキシダーゼ
（以下ＰＥＯと略称する）および特定の色原体を用いる
と所期の目的が達成されることを見出し本発明に到達し
た。

すなわち本発明は試料にクレアチニンアミドヒドロラー
ゼ（ＣＲＨ）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＣＡ
Ｈ）およびザルコシンオキシダーゼ（ＳＯＤ）の三酵素
を粗合せて作用させ「生成する過酸化水素にベルオキシ
ダーゼ（ＰＥＯ）および（ｉ）４−アミノアンチピリン
と下記一般式（１）で表わされるフェノール性化合物「
（ｉｉ）４ーアミノアンチピリンと下記一般式（ロ）で
表わされるァニリン誘導体、又は（肌ジェチルアニ１」
ンまたはジメチルアニリンと３−メチル−２ーベンゾチ
アゾリノンヒドラゾンを作用させ、生じた発色体を測定
することにより、クレアチニンおよびクレアチンクレア
チンを定量することを特徴とするクレアチニンおよびク
レアチンの定量法である。一般式（１）： （但し、Ｘはハロゲン基、Ｙは水素原子「ハロゲン基、
低級アルキル基、又は低級アルコキシ基「 Ｚは水素原
子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。

）一般式（Ｄ）： （但し〜Ｒ，は水素原子、低級アルキル基「低級ァルコ
キシ基、Ｒ２，Ｒ３は低級アルキル基、低級ァルコキシ
基しアセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスル
ホン酸基を含む低級アルキル基を示す。

）本発明の測定腺理は下記に示す通りである。

■ 酵素反応クレアチニン十日２０ＣＲＨ クレアチン
クレァチン十舷ＯＣＡＨ ザルコシン＋尿素 ザルコシン＋弦○十０２ＳＯＤ グリシン＋ＨＣＨＯ＋
は０２舷 発色反応 日２０２十色源体 ＰＥＯ 発色体 すなわちクレアチニンをＣＲＨでクレアチンに変え、生
じたクレアチンをＣＡＨでザルコシンと尿素に変え、ザ
ルコシンをＳＯＤでグリシンとホルムアルデヒドと過酸
化水素に変える酵素反応と、この過酸化水素を色原体と
ベルオキシダーゼの存在下で反応させて発色させる発色
反応とからなり「そして生じた発色体の可視部吸光度を
測定して、目的とするクレアチニンを定量することがで
きる９上記反応において「ＣＲＨを用いないで酵素反応
を進行させるクレアチンの定量を行なうことができる。

また試料中に存在するクレアチニンの量を知りたいとき
には、上記反応においてＣＲＨを用いて酵素反応を進行
させて得たクレアチニンの量からＣＲＨを用いないで酵
素反応を進行させて得たクレアチンの量を差し引くこと
によって得られる。本発明では酵素反応は発色反応と同
時に行なってもよく、また別々に、つまり酵素反応を行
なってから発色反応を行なってもよい。

本発明ではＳＯＤにより生成した過酸化水素にベルオキ
シダーゼと発色体を作用させるが、カタラーゼを用いる
場合に比べ、１ステップ反応（一試薬系）が可能であり
、反応が早いので反応時間が短かくてすむ。

本発明に使用するＣＲＨはいかなる起源のものでもよい
が、たとえばシユウドモナス属、フラボバクテリウム属
、アルカリゲネス属、アルスロバクター属等に属する微
生物が産生するＣＲＨがある。

本発明に使用するＣＡＨはいかなる起源のものでもよい
が、たとえばシュウドモナス属「フラボバクテリウム属
等に属する微生物が産生するＣＡＨがある。

また本発明に使用するＳＯＤもいかなる起源のものでも
よいが、たとえばコリネバクテリウム属、ミクロコッカ
ス属、アルスロバクター属等に属する微生物が産生する
ＳＯＤがある。

さらに本発明に使用するＰＥＯは動植物、微生物等いか
なる起源のものでもよいが、好ましくは西洋ワサビ由来
のＰＥＯである。

本発明の色原体としては、（ｉ）４−アミノアンチピリ
ンと一般式（１）：（但し、×はハロゲン基、Ｙは水素
原子、ハロゲン基、低級アルキル基、又は低級アルコキ
シル基、Ｚは水素原子、スルホン酸基又はカルポキシル
基を示す。

）で表わされるフェノール性化合物、（ｉｉ）４ーアミ
ノアンチピリンと一般式く〇）：（但し、Ｒ，，Ｒ４は
水素原子、低級ァルキル基、低級アルコキシル基、Ｒ２
，Ｒ３は低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、
アセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスルホン
酸基を含む低級アルキル基を示す。

）で表わされる化合物、（ｉｉＤジェチルアニリンまた
はジメチルアニリンと３−メチル−２−ペンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンを用いる。−匁史式（１）で表わされる
フェノール性化合物としては、例えばｐ−クロルフェノ
ール、ｐーブロムフエノール、２，４−ジクロルフエノ
ール、２，４ージブロムフエノール、２，４ージクロル
フェノールスルホネート等がある。

一般式（０）で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジェチルアニリン、Ｎ，Ｎージェチルーｍ−トルイ
ジン、ｍーメトキシーＮ，Ｎージメチルアニリン、Ｎー
エチルーＮ−（３ーメチルフエニル）−Ｎーアセチルエ
チレンジアミン、ソジウムーＮーエチル−Ｎ一（３ース
ルホプロピル）メタトルイジン、ソジウム−Ｎーエチル
−Ｎ−（２ーヒドロキシ−３ースルホプロピルナ３，５
ージメトキシアニリン等がある。

本発明に使用する定量試薬は上記酵素および／または色
原体を溶解させた緩衝液である。

本発明では過酸化水素の発色を妨害する検体中のアスコ
ルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯと
略記する）を作用させることによって除去することがで
きる。

この場合、ＡＳＯは他の酵素反応に先だって作用させて
も、また他の酵素反応と共役させて同時に作用させて除
去してもよい。ＡＳＯは植物由釆のもの、好ましくはカ
ボチャ、キュウリ由来のものがある。本発明に従えば測
定系にＣＲＨ，ＣＡＨ，ＳＯＤおよびＰＥＯの酵素を用
い、簡単操作で、感度よく、共存物質の影響を受けずに
、特異性高く正確に体液中のクレァチニンおよびクレア
チンの定量が可能となり、臨床検査の診断分野において
極めて有意義である。

さらに本発明ではＳＯＤを用いることにより、ＳＤＨを
用いる方法に比べて、１ステップ反応が可能で非常に簡
便である。

またＰＥＯを用いることにより、カタラーゼを用いる方
法に比べて、１ステップ反応（一試薬系）が可能であり
、反応が早いので反応時間が短かくてすむ。

次に本発明を実施例により説明する。

実施例 １ 血清中のクレアチン量を下記試薬を用い、下記方法によ
り定量した。

１試薬 ＣＲＨ ２０山単位ＳＯＤ
５０〃ＰＥ０
２０〃４ーアミノア
ンチピリン ２のｏｐーク。

ルフエノール １０のタＡＳＯ
ＩＯ■単位０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０） 全量１０のと２ 測定法血清または
クレアチン標準液ｌｏｏ一夕をとり、これに上記試薬１
机を添加し、３７０で１ぴ分間反応させた後、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を２の上添加し、波長５１
Ｍｍで吸光度を測定した。

血清中のクレアチン量は既知濃度のクレアチン標準液と
比較することにより求めた。

第１図に検量線を示す。

実施例 ２ 血清中のクレアチニン量を下記試薬を用い、下記方法に
より定量した。

１試薬 ＵＲＨ ４０３単位ＣＡＨ
２００がＳ○
Ｄ ５０がＰＥ
○ ２０が４ーアミ
ノアンチピリン ２雌ジエチルアニリン
２の９ＡＳＯ
ＩＯＮ単位０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０） 全
量１０の上２ 測定法血清またはクレアチニン標準液５
８科そをとり「 これに上記試薬１の上を添加し「３７
Ｇでｉ８分間反応させた後、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５４８）を２のと添加し、波長５５仇ｍで吸光度を測
定した。

上記試薬からＣＲＨを除いた試薬で同様の操作を行ない
、その吸光度を求め、先に求めた吸光度から差し引いた
。

血清中のクレアチニン量を既知濃度のクレアチニン標準
液と比較して求めた。

第２図に検量線を示す。

上記試薬を用いて血清中のクレアチニン濃度を求め、従
来のャツフェ反応法と比較した。

その結果を第１表に示す。なお、ャッフェ反応法とは試
薬にピクリン酸および水酸化ナトリウムの溶液を加え、
活性メチレンの反応により生じた紅色の化合物の吸光度
を測定する。

標準液を同様にして操作して５１則ｍの波長で比色し、
試料中の濃度を求める方法である。第１表（雌〆ａＺ） 本発明方法は従来のャッフェ法と比較して、特異的な反
応を用いるものであり、正確な測定を行なうことができ
る。

比較例 １ 実施例２におけるｐークロルフヱノールをフェノールに
代えて「実施例２と同様にクレァチニンの定量を行なっ
た。

第３図に検量線を示す。

第２図および第３図から明らかなように「本発明ではフ
ェノールを用いる場合に比して、感度が高い。

実施例 ３ 血清中のクレアチニン量を下記試薬を用いも下記方法に
より定量した。

１試薬 Ａ ＣＲＨ ４０山単位Ｃ
肌 ２０蝉位〃ＳＯＤ
５０〃ＡＳＯ
ＩＯＯ〃０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０） 全量１ｏｗ‘Ｂ ＰＥ０
３０単位０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０） 全量１０の‘Ｃ ジメチルアニリン
２．５ムク３ーメチルー２ーベンヅチ
アゾリノンヒドラゾン
０．２５帆ＩＭ酢酸 全量ｌ
ｏｗ‘２ 測定法血清またはクレアチニン標準液５０ム
〆をとり、これに上記試薬ＡＩの【を添加して、３７℃
で１５分間反応後、試薬ＣＩの‘、次いで試薬＄１のＺ
を順次加えて、３７０で５分間反応させた後、波長５９
仇ｍで吸光度を測定した。

上記試薬ＡからＣＲＨを除いた試薬Ａ′を用い、同機の
操作を行なし、吸光度を求めた。

先に求めた吸光度から、この吸光度を差し引くことによ
り、血清中のクレアチニン量を既知濃度のクレアチニ．
ン標準液と比較して求めた。第４図に検量線を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法により測定したクレアチンの検量線
を示す。 第２図は本発明方法により測定したクレァチニンの検量
線を示す。第３図は比較方法により測定したクレアチニ
ンの検量線を示す。第４図は本発明方法により測定した
クレアチニンの検量線を示す。第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料にクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチ
   ンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼ
   の三酵素を組合せて作用させ、生成する過酸化水素にペ
   ルオキシダーゼおよび（i）４−アミノアンチピリンと
   下記一般式（I）で表わされるフエノール性化合物、（
   ii）４−アミノアンチピリンと下記一般式（II）で表わ
   される化合物、又は（iii）ジエチルアニリンまたはジ
   メチルアニリンと３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
   ヒドラゾンを作用させ、生じた発色体を測定することを
   特徴とするクレアチニンおよびクレアチンの定量法。 一般式（I）：▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｘはハロゲン基、Ｙは水素原子、ハロゲン基、
   低級アルキル基、又は低級アルコキシ基、Ｚは水素原子
   、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。 ）一般式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒ＿１は水素原子、低級アルキル基、低級アル
   コキシ基、Ｒ＿２，Ｒ＿３は低級アルキル基、低級アル
   コキシ基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
   はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。 ）