JPS6035110B2 - 担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水不落・性８−１・３−グルカンのビーズ状
ゲルからなる固定化酵素、アフィニティークロマトグラ
フィーまたはゲル炉週などに用いられる担体に関する（
以下、単に坦体と略称することがある）。

担体の材料として一般に使用されている物質としては多
糖類がある。

すなわち、セルロース、デキストラン、澱粉、アガロー
ズおよびこれらの誘導体等である。この固定化酵素およ
びアフィニティークロマトグラフィ−としてカラムに充
填して使用するのに理想的な担体としては、０１水に不
溶であること、■化学的、微生物学的に安定であること
、｛３｝機械的に硬いこと、【４｝親水性であること、
【５ー化学的に十分な官能基があること、｛６｝酵素や
りガンドと結合し易いこと、｛７｝球状であり液が流れ
易いこと、似非特異的吸着性がないこと、｛９１安価で
あること等である。

以上の条件を完全に満足するものは、現在までのところ
皆無であるが、比較的好ましいものはアガローズゲルで
ある。

しかし、この物質の欠点は、【１｝酸、塩基に不安定で
ある。■高温に耐えられぬ、【３｝圧縮性がある為、大
容量の充填高さを持つカラムの製造に不適であるという
ことである。本発明者らは、これらの欠点を克服するた
め鋭意努力の結果、水不溶性３−１・３−グルカンが上
記の性質を比較的よく有していること、とくに、該８−
１・３−グルカンをビーズ状ゲルに成形したものが固定
化酵素およびアフィニティークロマトグラフィーの担体
として使用された場合、実験例として後述するように者
るしく優れた流速特性を示し、さりこゲル炉過法などの
担体としても極めて優れた性質を有することを見出し、
本発明を完成した。すなわち本発明は粒径が約５〜１０
００仏である水不溶性８−１・３−グルカンのビーズ状
ゲルからなる担体に関する。

本発明で使用される水不溶性８−１・３−グルカンとし
ては、たとえばアルカリゲネス属またはアグロバクテリ
ウム属の菌が生産する多糖類、具体的にはアルカリゲネ
ス・フェカリス・パール・ミクソゲネス菌株１に雛によ
り生産される多糖類（ＡｇｎＣｕｌｔｍａＩ Ｂｉ。

’〇ｇｉＣａＩ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ。１・３０・
ｐａ袋１９６（１９６６）、アルカリゲネス・フヱカリ
ス・パール・ミクソゲネス菌株１に雛の変異株ＮＴＫ−
ｕ（ＩＦＯ １３１４０）により生産される多糖類（特
公昭４８−３２６７３）（以下ＰＳ−１と称する）、ア
グロバクテリウム・ラジオバクター（ＩＦＯ１３１２７
）およびその変異株Ｕ−１９（ｍ０１３１２６）により
生産される多糖類（特公昭４８−３２６７４）（以下Ｐ
Ｓ−２と称する）、生薬夜苓に含まれるパキマン、褐藻
類の成分であるラミナラン、あるいは、酵母の細胞壁成
分であるグルカン等が挙げられる。

ビーズ状ゲルの成形の方法としては、たとえば特公昭４
８一４４８６５に記載と同様の方法や水不糟性Ｂ−１・
３−グルカンのアルカリ水溶液を、水と自由には混和し
ない有機溶媒に滴下、分散させ、その後有機酸により中
和する方法が好ましい。

これら８一１・３ーグルカンを溶解させうるアルカリ水
溶液として、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化バリウム、ロダンナトリウム、ロダンカリウ
ム、塩化カルシウム、水酸化リチウム、アンモニアなど
が使用し得る。その際用いられる水不溶性８−１・３−
グルカンの濃度は、得られるビーズの平均粒径に影響を
与える。通常０．５〜１０％の範囲で適宜に選ばれる。
一般にＢ−１・３−グルカンの濃度を低めると、粒径の
大きなビ−ズが得られる。水不瀞性Ｂ−１・３−グルカ
ン溶液を水と自由には混和しない有機溶媒中に分散させ
る方法としては、蝿洋下に滴下するのが好ましい。

滴下に要する時間は、水不溶性６−１・３−グルカンの
加水分解を生じぬ範囲内であれば特に制限はないが、一
般には１０〜９び分が適当である。また、この場合、必
要に応じて有機溶媒に界面活性剤を添加してもよい。界
面活性剤としては非イオン性界面活性剤が一般に好まし
いが、これに限定されるものではない。添加する界面活
性剤の濃度は、通常有機溶媒に対し０．１〜２０％、好
ましくは０．２〜１０％（重量／体積）である。使用さ
れる有機溶媒としては、水と自由には混和しないもので
あればいかなるものでも可能であるが、代表例としては
、たとえばベンゼン、トルェン、キシレン等の芳香族炭
化水素およびその誘導体、クロロホルム、四塩化炭素、
ジクロルェタン、ｎ−へキサン、シクロヘキサン等の脂
肪族炭化水素およびその誘導体、ジヱチルェーテル、イ
ソプロピルェーテル等のエーテル類、酢酸エチル、酢酸
ブチル等のェステル類、ｎーブタノール、イソプタノー
ル等のアルコール類等が挙げられる。水不潟性Ｂ−１・
３ーグルカンを上記有機溶媒に分散させる際、澄拝速度
が得られるビーズの粒径に著るしい影響を与える。

一般に櫨梓速度を大にすると粒径の小さなビーズが得ら
れる。分散された水不溶’性８−１・３−グルカンをゲ
ル化する方法としては分散液に水と自由には混和しない
有機溶媒に可溶な酸を添加するのが適当である。

このような酸としては有機酸たとえば、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、安息香酸等が好ましい。このようにして得
られた水不溶性８−１・３ーグルカンのビーズ状ゲルの
大き丸ま、製造条件によって異なるが一般には約５〜１
０００仏の範囲である。

本発明のビーズ状ゲルをゲル炉過用の担体として使用す
る場合は、その粒径は一般に小さい方が分離能は優れて
いるが、圧力損失等を考慮に入れると、その粒径は、好
ましは約５〜５００〆、より好ましくは約３０〜１５０
仏である。

本発明のビーズ状ゲルを使用するゲル炉過法は、それ自
体公知のゲル炉過法をそのまま適用することができる。

たとえばカラムに水不溶性８一１・３ーグルカンのビー
ズ状ゲルを充填し、適当な緩衝液を用いて、一定の流速
にてカラムを洗浄した後、試料を含む前記と同じ緩衝液
の一定量をカラムに添加後、一定の流速にて上記緩衝液
を用いて試料の溶出を行ない、溶出液はたとえばフラク
ションコレクタ−により分取することにより行われる。
この方法によって蛋白質や多糖類などの混合物の分離お
よび分子量の決定に応用することができる。また、本発
明のビーズ状ゲルを固定化酵素、アフィニテイークロマ
トグラフィーなどの担体として使用する場合、粒径が小
さい方が酵素やりガンドとのカップリング量は大きくな
るが、カラムとして使用する場合を考えると、やはり圧
力損失等が問題になることよりその粒径は、好ましくは
約３０〜５００仏、より好ましくは約３０〜３００山で
ある。

固定化酵素あるいはアフィニティークロマトグラフィー
用の担体ーリガンド結合物を調製するには、たとえば特
顔昭５０一１２７１９７（特関昭５２一５０３７３号公
報参照）に記載された方法が適用できる。すなわち水不
溶性８−１・３−グルカンのビーズ状ゲル１客を水２舷
費こ懸濁し、ハロゲン化シアン０．１〜３客を含む水２
庇客を加え、０〜５０ｑｏの任意の温度に於て燈枠しな
がら反応液のｐＨを、２Ｎの水酸化ナトリウム溶液を滴
下することにより、ｐＨｉｌまで該ビーズ状ゲルが溶解
しないように（約０．５ｐＨ単位／分の速度で）上昇さ
せ、ｐＨｉｌに１５分間保つことにより、活性化反応を
完了させる。反応終了後、固形物を源取し１０伍客の水
で洗浄することにより、活性化された８−１・３−グル
カンのビーズ状ゲルが得られる。得られた活性化ビーズ
状ゲルは水及びアルカリ溶液に不溶、加熱非凝固性で且
つ親水性があり、カラムに充填して使用する際に充分な
流速が得られるような大きさと強度をもつビーズである
。次に、該活性化ビーズ状ゲルと第一級または第二級の
アミノ基を有する物質、たとえば酵素、蛋白質、ベプタ
ィド、アミノ酸、酵素の基質あるいはィンヒピター、抗
原、抗体、ホルモン等とを、好ましくは弱アルカリ性の
水溶液中、約０〜５０００の任意の温度において反応さ
せることにより担体−リガンド結合物を得ることができ
る。

以下に本発明を実験例および実施例によってさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらによって限定されるもの
ではない。

実験例 ｍ 後記実施例１で得られたＰＳ−１のビーズ状ゲルを
使用し、固定化酵素およびアフィニティークロマトグラ
フィーの担体としての適用性について検討した。

ｍ−‘ｉ｝ 前記ビーズ状ゲルを内径２１．１柳少のカ
ラムに高さ５劫伽充填し、水を定量ポンプにより流し、
流速と圧力損失の関係を求めた。

その結果は第１表に示すとおりである。第１表 第１表に示す結果より明らかなように該ビーズ状ゲルは
流速特性に優れ、クロマト担体として極めて適している
。

‘１｝−｛ｉｉ｝ ビーズ状ゲルを活性化するにはたと
えばビーズ状ゲル１３３Ｍ（粉末ＰＳ−１、５タ相当）
に蒸留水１００の‘を加え、懸濁液を得た。

一方ＢｒＣＮ５夕を蒸留水１００羽‘に溶解した。両者
を合わせ弧−ＮａＯＨにてＰＨを徐々に上げ、最後はｐ
Ｈｉｌにて１５分間保ち活性化ＰＳ−１ゲルを得た。こ
れをガラスフィルターで炉過し、ケーキを５００の‘の
蒸留水で洗浄した。

この生成物を使用し、カラムクロマトグラフィー実験下
で高流速を維持できる可能性を調べる目的で圧力損失を
測定した。

生成物を内径１９．５側め、高さ２２９肋のクロマトカ
ラムに充填した。種々の流速にて水を定量ポンプにより
流し、カラムの高さと圧力損失について測定した。その
結果は第２表に示すとおりである。

第２表 この結果よりビーズは非常に硬く非圧縮性であり、第２
図（図中、圧損は充填高さを１のに換算した値として示
されれている）に示されるように現在最も多く使用され
ているアガローズゲルに比べても流速特性に優れ、クロ
マト担体として極めて適していることを示している。

ｔｌ）−｛ｉｉｉ｝ 次に活性化ＰＳ−１のビーズ状ゲ
ルを用いる固定化酵素の調製法の例を挙げる。

得られた活性化ＰＳ−１のビーズ状ゲル１２６の‘（Ｐ
Ｓ−１粉末５のこ相当）およびキサントモナス・シトリ
（ＩＦＯ斑３５）の生産するＱーアミノ酸ヱステルヒド
ロラーゼ（特関昭４７−２５３８８）５０．９双９（Ｃ
ＭＣ処理凍乾品）の蒸留水５０の‘溶解液を混合し、ｐ
Ｈ８．０、０．２Ｍーリン酸緩衝液５０の上および蒸留
水２４Ｍを加え、５℃、ｐＨ８の条件下で２脚時間耀拝
した。

反応後炉過し、ケーキを０．２Ｍ−グリシン溶液、０．
８Ｍ−食塩水、蒸留水にてそれぞれ洗浄し固定化酵素を
調製した。加えられたタンパクの９５％が固定化された
。

また酵素活性をＤ−フェニルグリシンメチルェステルの
加水分解速度を基準にして側定したところ、その９０％
が固定化された。■ ＰＳ−１のビーズ状ゲルを用い、
ゲル炉過について検討した例を挙げる。内径２６側めの
ガラス製カラムに後記の実施例４で得られたＰＳ−１の
ビーズ状ゲルを４１５側充填し、０．１Ｍ−ＫＣＩ含有
０．０９Ｍートリス一日ＣＩ緩衝液（ｐＨ７．５）を用
い、一夜３０の‘′ｈｒの流速にてカラムを洗浄した。

ここに第３表に示す試料３雌を含む上言己緩衝溶液１の
‘を添加後、３０叫／ｈｒの流速にて上記緩衝液を用い
、試料の溶出を行った。

港出液は３私ずつフラクションコレクタ一により分取し
、２８０ｍＡの吸光度を測定した。但し、試料がデキス
トランの場合は、フェノール硫酸法により分析した。結
果は第３表に示すごとく、試料は分子量順に熔出される
ことにより、この物質は分子筋能力のあることが証明さ
れた。分子量と分配係数の関係は、第３図に示されるよ
うに該ＰＳ−１ゲルの場合、球状タンパク質による排除
限界分子量は１．１×１ぴである。第３表 実施例 １ ＰＳ−１（本文参照）粉末９のこ純水２７０泌を加え灘
辞しスラリーを得る。

これにＩＮ−ＮａＯＨ３０の‘を加えるとＰＳ−１は溶
解し、ＰＳ−１の水酸化ナトリウム水溶液が得られた。
２ク客のビーカーに、トルェン１２００柵【、界面活性
剤ヱマレックスＣ−３０６夕（日本ェマルジョンＫ．Ｋ
．製、ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油誘導体）を加え
、スクリュー型燈梓翼にて８０仇ｐｍの速度で潤梓下に
上記ＰＳ−１の水酸化ナトリウム水溶液を室温にて滴下
した。

このようにして得られたＰＳ−１分散液をトルェン２０
００のとおよび酢酸１００の‘からなる液に８０仇ｐｍ
の速度で燈拝しながら加え、約１時間蝿拝を続けた。約
３時間静層することにより生成したゲルは沈澱した。デ
カンテーションによって溶媒を除去し、得られた沈澱を
純水２そにて５回洗浄するとｐＨ‘ま中性となり、また
有機溶媒は完全に除去され、ＰＳ−１ゲル２４０の上を
得た。得られたゲルの粒径を測定したところ３０〜５０
仏 ４．０％ ５０〜１００仏 ４２．８％１００〜２０
０山 ３６．８％２００〜３００仏
１６．４％であり、各々の形状はビーズ状であ
った。

得られたビーズ状ゲルの顔微鏡写真を第１図（図中、ス
ケールの８目盛が１００叫こ相当する）に示す。実施例
２実施例１と同様の方法で、ＰＳ−１粉末１０夕、純
水１４０の‘、州−ＮａＯＨ６０机上より得られたＰＳ
−１の水酸化ナトリウム水溶液を、トルェン１２００叫
、ェマレツクスＨＣ−３０、６．７夕に雌拝数８００ｒ
ｐｍで分散させ、トルェン２０００■‘、酢酸１００私
からなる溶液に加え、担体として適した粒径５０〜１５
０仏のビーズ状ゲル２０畝‘を得た。

実施例 ３ 実施例１と同様の方法で、界面活性剤としてェマレック
スＨＣ−４０、６夕を使用し裾体として適した粒径５０
〜２５０〃のビーズ状ゲル２６５地を得た。

実施例 ４実施例１と同様の方法で、界面活性剤として
ェマレックスＨＣ−２０、６夕を使用し、粒径３０〜１
５０仏のビール状ゲル２８０の‘を得た。実施例 ５ 実施例１と同様の方法で、界面活性剤としてェマレツク
スＣ−４０、６夕（日本ェマルジョンＫ．Ｋ．製、ポリ
オキシェチレンヒマシ油誘導体）を使用し、粒径１５〜
１００仏のビーズ状ゲル３１２叫を得た。

このものは坦体として使用できるものであった。実施例
６ 実施例１と同様の方法で、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ
６０、６夕を使用し、担体として適した粒径１５〜２０
０仏のビーズ状ゲルを得た。

実施例 ７ 実施例１と同様の方法で、分散嬢としてトルェンの代り
にベンゼンを使用し、担体として適した粒径１００〜３
００仏のビーズ状ゲル２４０の‘を得た。

実施例 ８実施例１と同様の方法で、凝拝数を１２０仇
ｐｍで行ない、担体として使用可能な粒径２０〜１００
仏のビーズ状ゲル２２３奴を得た。

実施例 ９ 実施例１と同様の方法で、中和剤として酢酸の代りにギ
酸を使用し、担体として適した粒径４０〜２００仏のビ
ーズ状ゲル２５０肌を得た。

実施例 １０ パキマン粉末３のこ純水９０肌を加え蝿拝しスラリ−を
得た。

これに成一ＮａＯＨＩＯ地を加えるとパキマンは溶液状
となった。１〆容のビーカーにトルエン５００の【、エ
マレツクスＨＣ−３０、２夕を加え８０仇ｐｍの速度で
蝿投下に、上言己パキマンの水酸化ナトリウム水溶液を
室温にて滴下した。

このようにして得られたパキマン分散液を、トルェン２
０００の‘、および酢酸１００のとからなる液に加え約
１時間蝿杵を続けた。

生成したゲルはデカンテーションによって溶媒を除去し
た沈澱を水洗した。粒径５０〜３００〃のパキマンゲル
８０の‘を得た。このものは担体として適していた。実
施例 １１ 実施例１と同様の方法で凝拝数を２１０びｐｍで行ない
、挺体として適した粒径５〜５０一のビーズ状ゲル２８
０の‘を得た。

実施例 １２ 実施例１と同様の方法で縄梓数を４０仇ｐｍで行ない粒
径２００〜１０００山のビーズ状ゲル２００の‘を得た
。

このものは担体として使用できるものであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＳ−１のビーズ状ゲルの顕微鏡写真を、第２
図は活性化ＰＳ−１のビーズ状ゲルの流速特性を、第３
図はタンパク質分子量選択曲線をそれぞれ示す。 物図 第２図 多３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粒径が約５〜１０００μである水不溶性β−１・３
   −グルカンのビーズ状ゲルからなるリガンド結合または
   ゲル濾過用担体。