JPS6037985A - プラスミドｄｎａまたはその発現生成物の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミドＤＮＡおよびそれによる生成物の調
製方法に関する。

シラスミドＤＮＡは、たとえば、微生物の組換え遺伝子
操作において重要な手段となる。この操ｆ［の目的社、
細胞中に１外来のｆｏｒｅｉｇｎ　’遺伝物質（ＤＮＡ
　）會導入し、それを発現させて、細１ｊ＋ルア５（，
１本来的には１つまシ未改変の状態では製造しえない物
質、たとえば、酵素、抗原性物質、抗生物質、ホルモン
、抗ウィルスまたは他の生理的または生物的活性を有す
る物質を生産さすことである。

り１シ、単細胞生物中にプラスミド金おくと。

シラスミドのＤＮＡによシ、その生物の特性が＆（ヒま
たは転換されうる。たとえばテトラツーイク＋７ン抵抗
性遺伝子（ＴｅｔＲ）を担うシラスミドは、テトラサイ
クリンに感受性であった細胞を、抵抗性の細胞に形質転
換する。

プラスミドＤＮＡおよびそれの発現生成物を包含するバ
イオテクノロジーの工程において、選択された細胞中で
の染色体ＤＮＡに比してシラスミドＤＮＡが少量なので
、産業規模の生産が限定される。

たとえは、シラスミドが商業的に興味あルクローン化さ
れた遺伝子を担う時に、生成物の量は、主として、シス
テム中で用いうる、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の形状の
遺伝子（単または複数）のコピーの数で決められてし１
う。工程の効率は、生成物自体の構成に用いられるよシ
はむしろ生産者である生物の発育全維持するに消費され
ねばならない、添加された栄養分／原料の割合に、結局
は支配される。それで、従来法では、プラスミドと染色
体ＤＮＡとを分り、シラスミドＤＮＡのみを含有する細
胞を生成させようと試みられた。

本明卸１１１−および特許請求の範囲において、プラス
ミドとは、植物、かびまたは微生物のいずれの由来であ
れ、細胞中に存在する、小型の、増殖しうるＤＮＡ環の
いずれをも意味するとする。

プラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡとは、従来、臭化エチ
ジウム飽和の、閉環プラスミドと、直線状染色体フラグ
メントとのあいだの浮遊密層の差を用いることによるセ
シウムクロライド（Ｃｓ０１　）グラジェントによシ分
けられて来た。これは時間がかがシ、材料および装置の
点で費用がかさむ。シラスミドＤＮＡ抽出のための迅速
な手法がいくつか開発されたけれども、調製物中の染色
体材料の割合を大いに減少させても、一定して染色体不
合のプラスミドＤＮＡを与えるものはない。

この問題に対するひとつの解決法は、染色体ＤＮＡを崩
壊させた細胞中でプラスミドを増殖きすことである。ｕ
ｖｒＡ　ｐｈｒ細胞にＵＶを照射すると、これらの細胞
の小型プラスミドの増殖紫支える能力を損なわないで染
色体ＤＮＡを不活化することが分った。ＣＢａｎ（！ａ
ｒ＋　Ａ−＋　Ｈａｃｋ＋　Ａ−Ｍ−およびｗ、Ｄ。

Ｒｕｐｐ、　（１９７９）、−Ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ
ｌａｓｍｉｃｌ　−ｃｏｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓプラ
スミドコード蛋白質の同定のための簡単な方法”Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５７　：　６９２−６９５　）
。

もっともあシうる理由として、複製中の相対する２量体
に残されたギャップがｒｅｃＢ／ｒｅｃｏヌクレアーゼ
の標的として作用するゆえに、これらのエクシション−
（除、去）を欠損する’　ｍａｘｉ細胞１中の染色体Ｄ
ＮＡは崩壊さ八る［　、Ｃ！１ａｒＬ　Ａ、　Ｊ、＋（
１９７３）、　”　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｔｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｔｆ２．　ｃｏ
ｌｉ　ａｎｄ　ｏｔｂｅｒ　ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｋ。

ｃｏｌｉ　および他の細菌の組換え欠落変異株１、Ａｎ
ｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７
　：　６７−８６　Ｊ。

しかし、ＵＶ　／　ｍａｘｉ　ｔＵＩＩＩｆ！は日常的
に用いるには６個の主な欠点を示す。第１に、対象とす
る株（単または複数）にｐｈｒ変異を導入するかまたは
暗所で作業する（　ｐｈｒ遺伝子中の変異は光活性化ケ
なくすのに役立つべきはずのものであるから）。

第２に、暗所で作業するとしても、この技術をもつとも
効果的に用いるには、使用しようとするフ０ラスミド言
有株のそれぞれのダブル変異株（ｕｖｒ二ＯＡ　）　ノ
ｌｆＪ・ν築かまたは、対象とするシラスミドをそのよ
うなダブル変異株に転換する必要がある〇第３に、モ引
−２＋′ｌの湘１＋＋翻値帰事番σ）（招射か６ｄ−人
機会を最大にするために、ふつう薄いフィルム状にして
ＵＶ原にさらさねばならない。この必要条件は操作上の
困雛を生み、１度の実験で処理されうる培養物の容量は
減少する。

それで、本発明の目的は、従来法のこれらの欠点を克服
するか、少なくともある程度軽減することである。

本発明は、染色体ＤＮＡを実質的に含有しない、）０ラ
スミ１ＤＮＡおよびそれの発現生成物が濃縮された細胞
７ｉｌ−ｔＡ　Ｎする方法を提供する。この方法は、（
ａ）　プラスミドＤＮＡ　富有生物全用意し、そして（
ｂ）その生物を、有効量のイオン化照射にさらす ことを包含する。

この処理で、プラスミドの増殖を維持しうる非分裂細胞
全生成することになシうる。

シラスミドＤＮＡ含有生物は、微生物、かび、植物およ
び動物の細胞より選ひうる。細胞は、詰筐つだ形状で存
在しうる。しかし、液体培養物も用いうる。微生物細胞
は細菌細胞であシうる。泊１１田はＥ、　ｃｏｌｉ、　
ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ
　’！たは５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉよシ選択しうる。

修復および（または）組換えを欠除する組直細胞、つま
シ修復および（または）組換えのプロセスを行なおうと
する能力を遺伝的に欠如する細菌細胞が有利である。特
に有利なのは、Ｅ、　ｃｏｌｉのｒｅｃ　Ａ変異株およ
びＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび５
ｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓのｒｅｃ型変異株である。

本発明は、また、ガンマ−線照射の前、照射中またはあ
とで、化学剤音用いて標的細胞を処理することにより、
細胞の修復／組換えシステムを損傷するかまたは不活化
する方法を包含する。このことは、誘導された遺伝子障
害の存在しないいずれの細胞にも、本発明を適用するこ
とを可能とする。

本発明に準ターる方法の段階（ｂ）で用いられるイオン
化照射は、Ｘ−線またはガンマ−線の形を取シうる。恐
らくイオン化照射は、照射されたｒｅｃＡ細胞のＤＮＡ
中に直接的にギャップを生じ、それで、度に感受性とす
る。このことは、Ｌ　ｃｏｌｉのＵｖｒ”およびｕｖｒ
株について報告されたものに相当する［：　０１ａｒｋ
、　Ａ、　、Ｔ、ｌ　Ｏｈａｍｂｅｒｌａｉｎ＋　Ｍ、
　Ｂｏｙｃｅ＋　Ｒ，Ｐ。

およびＨｏｗａｒｄ−Ｆｌａｎｄｅｒｓ＋　ｐａｌ　（
１９７７）、’　Ａｂｎｏｒｍａｌ　ｍｅｔａｂｏｌ、
ｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅ
ｔｌｉｇｈｔ　ｏｆ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔｏｆ　Ｆ＋５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２、Ｆｉｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＫ１２の組換え能欠失変異株の、
紫外線に対する異常な代射反応１、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　１９　；　４４２−４５４；およびＫａｐｐ
、　Ｄ、　Ｓ、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｋ、　Ｏ，。

（１９７０）、’　Ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｒａｄｉａｔ
ｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｄａｍａｇｅ　ｉｎ　Ｆｉｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆｆ１ｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉにおよび照射による障害の修復’　、　
Ｊ、　ＢａＣｔ。

１ｏｎ）；４９−５４］。

イオン化照射はなるべくはガンマ−照射とする０ガｙマ
ー照射原はコバルト６０であシうる。照射量は、ＤＮＡ
　ｉＪ製物より実質的にすべての染色体物質を除くに十
分の量でありうる。約肌１から０・２５ｋＧｙの照射量
が有利である。たとえは０．２　ｋＧｙのガンマ−照射
を用いうる。

本発明の有利な特徴ば染色体ＤＮＡを実質的に含有しな
いデラスミｈ”ＤＮＡ’ｉ調製する方法を提供すること
で、この方法は、 （ａ）　細菌のと＝ｃＡ株を用意し、そして（ｂ）　ｒ
ｅｃＡ細菌に約０．１から０．２５　ｋＧｙのガンマ−
線照射を行なう ことを包含している。

本発明のさらに別の特徴として、プラスミドＤＮＡを調
製する方法は、さらに、 （ａ′）照射に先んじて、ｒｅｃＡ細菌をプラスミド収
量を増加さす処理に処すること、そして、プラスミｈＯ
収量増加処理は、抗生物質（単または複数）で細菌を処
理する仁とを を包含しうる。

抗生物質は、プラスミドのコピー数を増加さすのに用い
うる。抗生物質はスペクチノマイシンおよび類似のもの
およびそれらの混合物より選択しうる。

本発明のさらに別の特徴として、プラスミドは、 （ａ）（＋）　望む特性をコードするＤＮＡフラグメン
ト、および （１１）　シラスミドを含有する生物 を用意し、 （ｔ＋）　ＤＮＡフラグメントをシラスミド中にクロー
ン化し、 （Ｃ）　適当な受け入れ生物を組換えプラスミドで形質
転換するかまたはトランスフェクションし、（ｄ）　染
色体ＤＮＡを実質的に含有せずそしてシラスミドの増殖
を支持しうる分裂しない細胞全生成するように、有効量
のイオン化照射全プラスミド含有生物に与え、そして （ｅ）　処理された細胞を適当な培地中に維持すること
を包含している。

なるべくは、この方法は、さらに、形質転換段階（Ｃ）
のあとに、 （ａ′）細胞を望む濃度まで発育さすことを包含してい
る。

生産される発現生成物はＲＮＡおよび発現された蛋白質
を含有しうる。生成物は、酵素、抗生物質、抗ウィルス
剤、ホルモン治療剤および類似の用途に適当でありうる
。

特私有利な形態として、１（（１射段階（ｄ）および維
持段階（ｅ）は詰まった細胞の形状、っまシ固定化され
た細胞系で行ないうる。しかし、液体培養物も用いうる
。イオン化照射を用いることの利点はイオン化照射の透
過能力が、液体培養よシむしろ著しく大きい容量の、詰
まった細胞の処理を可能とすることであることは理解き
れるであろう。このことは、さらに、生成物の量も実質
的に増加させる要因となシうる。

それで、イオン化照射で選択された細胞の細胞染色体を
破壊し、それにより、それらの細胞中のプラスミドＤＮ
Ａを濃縮しその結果としてそのＤＮＡによる生成物を増
加芒すことを本質とする方法により、本発明方法が、プ
ラスミドＤＮＡおよびそのシラスミＦ　ＤＮＡによシコ
ードされる生成物の調製全可能としていることを理解さ
れるであろう。

それで、本発明方法は、プラスミドＤＮＡ中にクローン
化されてしまったなんらかの外来性遺区子とあわせてプ
ラスミドＤＮＡのみを含有する細胞を、産業規模で生産
することをｏＪ能とする。どのような由来のものであれ
、プラスミドにコードされた蛋白質を生産する処理細胞
の能力は、それで、実質的に改良される。

つまり、我々は、ガンマ−線照射ｒｅｃ　Ａ細菌に例示
されるような、イオン化照射処理されたｒｅｃ　Ａ細菌
、細菌細胞は、たかだか痕跡量の染色体ＤＮＡが未分解
に留まるよう外条件で、未傷害プラスミドＤＮＡの効率
的生産者となること荀発見したのである。ガンマ−線照
射法は、実質的に純粋なシラスミドを調製するだめの他
の方法に比していくつかの利点を有する。つまり、（１
）　照射きれた染色体ＤＮＡは内在するヌクレアーゼに
よシはとんど大部分分解されてしまうので、調製ＤＮＡ
には染色体ＤＮＡはほとんど混入しない。（２）染色体
【不活化するに紫外線を用いる時におこるような、宿主
細胞に、ｕｖｒ　ｚ異をおこすことはない。（３）操作
には容量および細胞密度の制限がないので、方法はきわ
めて簡単に実施しうる。（４）材料を容器から容器に移
す必要がない。さらに、ガンマ−線照射法で得られるシ
ラスミドＤＮＡの収量は、他の方法による収量に匹敵す
る。

本発明は、図面および実施例によりよシ完全に理解しう
るであろう。しかし、それらは、あくまで説明のためで
、上記した本発明の一般的特徴を一限定しない。

第１図は、ガンマ−線照射細胞よシの未消化シラスミｌ
’　ＤＮＡの電気泳動図を示す。トラック１゜２および
３　ｔｊ：　、　１（ｉｎｄ　ＩＩＩサイトにクローン
化された、５．１　ｋｂ（１）および４．３　ｋｂ（２
）および２．Ｏｋｂ（ａ）の大きさのトランスポゾンＤ
ＮＡのフラグメントを含有するｐＢＲ３２２である。す
べてＦｉ、　ｃｏｌｉＤ（）　１２１０よシ抽出された
。トラック３は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＨＢ　ｉ　Ｑ　ｌより抽出きれたＩ）Ｊ３Ｒ
３２５である。

Ｌ−直線状ＤＮＡ　；　Ｃｏｏ−共有結合的に閉じた環
状ＤＮＡ　；　００−開環ＤＮＡである。矢印はトラッ
ク１のみに用いられる。

第２図は、ガンマ−線照射細胞からのプラスミドの制限
酵素消化物である。説明してみると、トランク１および
７はλ。１８５７　Ｈｌｎｄ　ｌ［プラスΦＸ　１７４
　Ｈａｅ　ＩＩＩ　：　（２）　ｐＢＲ３２５：　ＴＮ
　３４０５ＢｃｏＲＩ　、　Ｐｓｔ　：　（３）　Ｐｓ
ｔ　Ｉ　、　Ｈｉｎｄ　ＩＩ　：　（４）　Ｐｓｔ　Ｉ
　；（５）　ＫｃｏＲＩ　ｒ　Ｈｉｎｄ　ｎ［；　（６
）　ＫｃｏＲＩで、Ｅ、　ｃｏｌ、ｉＨＢ　１０１よシ
抽出のプラスミドＤＮＡである。

つぎの実施例用いた細菌株およびプラスミドはつぎのよ
うである。

細菌株およびプラスミド 細菌株 Ｅ、　ｃｏｌｉＫｌ　２ ＨＢ　１０１　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ｔｈｉ　１ａｃＹ　ｈ
ｓｄＲｅｎｄＡ　ｒｅｃＡ　ｒｐｓＩ、２０　ａｒａ−
１４ｇａｌＫ２　ｘｙｌ−５ｍｔｌ−１ｓｕｐＭ４Ｊ　
５−３　ｍｅｔ　ｐｒ。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｗｐ２ ＤＧ１２１０　（ｔｒｐ）ｒｅｃＡ 株誘導物 プラスミド ＲＰＩ　Ｋｍｉ’ｔ、　ａｂ”＋　Ｔ（！Ｒ，Ｔｒａ＋
（ＪａｃｏｂｙおよびＪａｃｏｂ＋ １９７７、参照、４） ｐＥＲ）２２　０１）Ｒ−ＴｃＲ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ
、　１９７９゜参照、８） ｐＢＲ３２５０ｎＲ，ＯｂＲ，ＴｃＲ（Ｐｒｅｎｔｋｉ
等。

１９８１　、Ｅｅｆ、　６） ａＴｎ３４０５は最近発見された潜在性トランスボーズ
性要素である（　ＲａｄｆｏｒｄおよびＲｅａｎｎｅｙ
＋未刊）う 例 プラスミドを有するＥ、　ｃｏｌｉ　ｒｅｃＡ株誘導物
（上表のＨＢ　１０１またはＤ（）　１２１０　）の１
夜培養物の１　ｍｌ試料を、ゾラスミケの維持を確実に
するためのアンピシリン（１００μＩ）を含有するニュ
トリエントグロスのｉｏｙ苑に接種した。

６７℃で６時間揚ってからスペクチノマイシンを加えて
最終濃度１００μｇ／ｍｌとしたっこの培養物をさらに
６時間振った。この方式でｔよ、プラスミド収量が増加
するので、スペクチノマイシンの添加で、少なくとも１
個の未傷害（小型）プラスミドがガンマ−照射を生きの
びるという確率の増加する利点がある。さらに別のオリ
点は、未傷害のままの染色体が照射処理を生き残ったと
しても、蛋白質合成が阻害されるならば、増殖すること
はあシえぬことであるう ついで培養物は６０ＣＯ−γ線（照射成０．４５　ｋＧ
ｙ／時）で６０分処理し１時間振とうし、ついで２　ｍ
ｌのサイクロセリン含有ニュトリエントゾロスを加えて
、最終サイクロセリン濃度１００μｇ／ｍｌとした。余
分のグロスを補なうと発育は促進するがサイクロセリン
が細胞を溶解させたつ培養物はついで３７℃で１夜振と
うした。翌朝、プラスミドＤＮＡは０ｕｒｒｉｅｒおよ
びＮｅ５ｔｅｒの迅速法［０ｕｒｒｉ　ｅ　ｒ。

Ｔ、　Ｏ，およびＥ、　Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９７
６）’　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｖａｌｅｎｔ
ｌｙ　ｃｌｏＳｅｄ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｈｉｇｈｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｒｉ
ａ共有結合的により閉じられた高分子量ＤＮＡの細菌よ
りの分離１Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７６　：　４
３１−４４１　〕。１１２ｍの培養物よりの細胞は卓上
遠心機中でペレットとし、洗い、２　ｍｌのＴＪｌｉｉ
　８緩衝液（５Ｑ　ｍＭのＴＲ工Ｓ。

２０１１ＩＭ　（１）ＥＤＴＡ　、　ＰＩ（８，０）中
にＭ　ｊｌｆｆｌｊ　？ｉ　ａせた。婆らに遠心および
再懸濁企及後し、プロテアーゼＥ（Ｓｉｇｍａ、　Ｔｙ
ｐｅ　ＸＩＶ　）　（５１１１Ｆ／／　ｍｌ、１時間自
己消化）　ノ２　Ｕ　ＯｐＨｔ加ｋ、ライｆ２００ｐｌ
ＪノＩ　Ｇ　％ＳＤＳを加えた。この混合物は６７℃で
４５分放置し、それから１００μｌの２ＭのＮａ、ＯＨ
を加えた。

この混合物はおだやかに倒立をくシ返す方法で１５分か
くはんし、２００μｌの２ＭのＴｒｉｑｐ！（７，０を
加えて−を下げた。３００μｌの５ＭのＭａｉｌも添加
した。この溶液は３　％　Ｍａｉｌと平衡させたフェノ
ールの３　ｍｌと混合した。倒立さす方法で５分かくは
んした。２０００ｇで１０分遠心して、水相を吸い出し
た。水相には、５ＭのＮａ１ｌの５００μｌおよび冷エ
タノールの２．５容景とあわせて、３Ｍの酢酸ナトリウ
ムの６８０μｌｋ加えた、混合物を振シ、少なくとも２
時間マイナス２０℃に放置した。ついで、プラスミドＤ
ＮＡは２０００Ｆで１０分卓上遠心することによりペレ
ットとなしえた。ペレットは７０％エタノールで洗って
残存フェノールを除き、水に古懸濁させた。

制限および他の酵素はＪ３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ（オーストラリア）より入手し、製造者の指
示に従って用いた。アガロースゲル電気泳動け、１％サ
シマリーンｒル中、８０ボルトで６から５時間行なった
っ 試験菌のがンマー照射に対する感受性を評価するために
、それの後対数期に、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｘ　１２株ＤＧ
　１２１０、ＨＢｌｏｌお、ｔ：びＪ５−６にガフー’
？−線を序々に照射（０，４５ｋ（）ｙ　７時）した。

予期されたように、二９株は野生株より著しく感受性で
あった。たとえば、１５分でＤＯ１２１０の生存率は、
Ｊ５−６細胞の［３，０２５％であった５０．１カら０
．２５　ｋＧｙ　、　ｆｃ　トエｆｆ：０．２　ｋＧｙ
　（ＤＪｆ　ンマー線照射で、ｒｅｃＡ細胞よシのＤＮ
Ａ調製物よりの染色体のほとんどすべてケ除くのに十分
であるっ第１図で、ガンマ−線照躬卸１菌よりの未消化
ＤＮＡ調製物に染色体パン１が認められない。トランク
１−４をみよ。そして、制限ヌクレアーゼで処理された
調製物に染色体性′スメアｓｍｅａｒ　’認めえない。

第２図のトランク２−６葡春よ。調製物中には著量のＲ
ＮＡが残ったが、これはりボヌクレアーゼ処理により容
易に除かれた。０ｓＯｌグラジエントと異なシ、強くコ
イルしたＤＮＡに対する選択性はないので、直線状およ
び開環状のプラスミドも少量存在しうるのであろう。第
１図のトランク１および２をみよっ 我々の実験に用いた１０ｒｎ！および１００ｍ／培養試
料共に、常に、Ｉ）ＢＲ３２５およびＴ）Ｂ　３２２の
誘導物を用いるオリジナル培養物１ｍｌについて１μＩ
のＤＮＡを与えた。これは培養物の１リツトルについて
約１ｒｎｇの値に対応し、従来法で達成される収量に匹
敵する。

ガンマ−線照射ｒｅＱＡ細胞より抽出されたプラスミｒ
；ａｎＮｈが照射によシ許答をれえぬほどの傷害を受け
ているかどうかみるために、１）ＢＲ３２５：Ｔｎ　３
４０５　ＤＮＡ’（ｉ＝ｍ々の制限ヌクレアーゼで、単
独かまたは組合わせて消化し、アガロースゲル上の電気
泳動にかけたつ第２図の結果がボずように、プラスミド
プロフィールは、未照射細胞よシのそれ（示してはない
）と同じであった。これらのデータは、プラスミドまた
はトランスポゾンＤＮＡのいずれにも、欠失、重複また
１他の配列の異常化のなかったことを示す。

ガンマ−線照射細胞よりのプラスミドＤＮＡ　を桟状は
、ニックトランスレーションの調製に具合よぐ用いえた
。また、がンマーｍ個射＃Ｉ施よシ分離したｐＢＲ３２
５ＤＮＡを、我々は、アンピシリン選択によシ、ＨＢ　
１０１を形質転換するのに用いたつ形質転換の頻度は、
従来の０ｓＯ１法で調製したＤＮＡを用いた場合と同じ
であった。照射されたプラスミドかもとの抵抗性表現型
を維持したことは、関連遣云子に損傷のなかったことを
示す。

プラスミドの分子量の増加と共にガンマ−線照射に対す
るプラスミドの標的としての大きさは増加するが、本発
明方法を用いて効率よく増殖させうる、プラスミドの大
きさの上限は、この目的で日常的に試験をしている専門
家は容易に決定しうるう我々の実験で用いた最大のレプ
リコンは、ｐＢＲ３２５：　Ｔｎ　６４０５、計算され
た大きさは約１１キロベース対のＤＮＡである。

本発明のガンマ二線照射法は、上記引用の５ａｎｃａｒ
等のＵＶ’ｍａｘｉｃｅｌｌ’法に比していくつかの利
点を有する。ガンマ−線は透過する性質を有するので、
ＵＶ法と異なシ薄いフィルム状の細胞に照射しなくても
よい。それでＵＶ処理よりも実施が容易でｈｂ、ＵＶ法
に比して、失敗の経験も少ないっ重要なこととして、細
胞は薄いフィルムとして照射される必要がないので、は
とんど任意の容量の細菌培養物を用いうる。本質的に叫
−の制限因子鉱、処理しようとする培養物に応じうるガ
ンマ−線照射原の容量である。さらにガンマ−線照射の
効果は細胞の密度で制限されないので、液体培養物より
はむしろ詰まったベレツトの形状とした細胞にガンマ−
線を照射することができろうこの濃度要因で、支障なく
処理されうる細胞の数は数桁上昇する。

別の利点は、取シ扱いおよび操作の容易な点で、方法自
体が単純なことである。細胞の処理のすべてはひとつの
容器中で行ないうる。細胞を溶解する時点において大部
分の染色体ＤＮＡは除かれてしまっているので、フェノ
ール抽出中、処理系の負担が過大となることはなく、ｒ
ラナン状の処理困。

難な水相も生じないので、小宕量中で多数の細胞を溶解
させうる。さらに、上記引用の５ａｎｃａｒ等の’　ｍ
ａ、ｘｉ−ｃｅｌｌ　’法と同様に、ガンマ−線照射技
術は、シラスミドでコードされたＲＮＡおよび蛋白質の
研究に容易に用いうるう Ｂ、　ｃｏｌｉをプラスミドの宿主に用いて本発明の方
法を示したが、二重型変異株を入手しうる細菌ならいず
れも用いうる。本発明方法を具合よ〈実施するにはｒｅ
ｃ変異細胞が望ましいが、理由は、野生型（非変異）細
胞はしばしば、照射で誘導された傷害を修復するからで
ある。ｒｅｃＡ遣云子生成物捷たは類似の遺伝子生成物
がそのような修復に関与している。しかし、この技術は
、一般的に任意の型の非変異野生型細胞忙も適用されう
る。

たとえば、グレオマイ／ン、ニトロフラン抗生物質のよ
うな適当な化合物の存在でのガンマ−照射のような条件
で、ｒｅｃ＋細胞内においてさえも、または、イオン化
照射につづいて染色体ＤＮＡを崩壊しうるｐｏｌＡ変異
株に対してさえも、プラスミドを選択的に増殖さぜまた
は梶現させうる。

例２ この例で、ガンマ−線照射細菌よシブラスミドでコード
された蛋白質レベルするのに本発明方法を用いる例を示
す。この例ではガンマ−線の蛋白質の発現への効果も調
べ、そして正常発育の細菌と蛋白質レベルを比較してみ
るう シラスミドクローン化ベクターｐＢＲ３２５勿ｆｉ有す
るＢ１５ｃｈｅｒ１ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１Ｑ　
１を照射のための試験生物に選択した。シラスミドｐＢ
Ｒ３２５は対テトラサイクリン、対クロラム　フェニコ
ールおよび対ペニシリンの６種の抵抗因子を有した。

ペニシリン抵抗性は、抗生物質のβ−ラククム環を切断
することによりペニシリンを不活化するβ−ラクタマー
ゼ（β−１ａｃ　）酵素の生殖で媒介されるっβ−１ａ
ｃは、構成性酵素として、特別のインジューサーなしで
生成するので、生成酵素の量は、遺伝子のコピー数に正
比例するはつであるっそれで、ｒｅｃ　Ａ細胞でありそ
してガンマ−細胞抜術技術に適当であるｗ、　ｃｏｌｉ
　ＨＢ　１０１　ｐＢＲ３２５に、種々のレベルのガン
マ−線照射を与えた後のβ−１ａＣ活性’ｔ［べてみた
。インタクトの細胞を用いると細胞壁の透過性のような
要因で酵素活性がマスクされることがありうるので、丸
こでの細胞でなくむしろ細胞の溶解物を試験したつそれ
で溶解時のβ−１ａｃを測定でき、未処理細菌による発
育および細胞分裂の影響が除かれる。

β−１ａｃの活性は、溶解物を既知量のナトリウムベン
ジルペニシリンとインキュベートし、混合物中の活性ペ
ニシリンを生物試験することによシ測定した。溶解物−
ペニシリン抵抗性はグロスで系列希釈し、Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕＦ３のようなペニシリン感受性
試験菌を加えて、ペニシリンの存在なだしかめた。試験
管中の発育は、Ｍ、　１ｕｔｅｕｓのＭ、工、Ｃ０以下
までペニシリンが不活化されたこと全示した。

きらに正常およびガンマ−線照射培養物の細胞密度およ
び溶解物の全蛋白質濃度を測定したＯＫ、　ｃｏｌｉ　
ＨＢ　１０１　ｐＢＲ５２５細胞は、０，４２ｋＧｙ　
７時の照射量で１．２，５．１５および６０分間ガンマ
−線処理した。ｐ＋、　ｃｏｌｉ　；ｒ　５−３培養物
全対照とした。溶解物を調製するには、１０　＋ｕ６の
培養物を遠心し、ペレツト′ｆｆ：６ｍｌ！の無菌食塩
水に再懸濁場せ、ラインゲームを０．１μｊｉ／ｍｌに
加え、そして超音波処理したつ アッセイはつぎのように実施したつ溶解物をペニシリン
溶液と混合し、インキュベートし、溶方・ｒ物／ヘニシ
リン混合物をクロロホルム抽出し、ついでニュトリエン
トグロスで系列希釈した。各グロスには感受性Ｍ、　１
ｕｔｅｕＳを添加したつフィルター滅菌溶解物を加えイ
ンキュベーションするよｐ前に、ペニシリンはグロス中
で希釈しておいた。

詳細な方法を下記する。

ｔ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢｌ　０１　（ｐＢＲ３２５含
有）を９０分発育させて対数期とし、１０倍に希釈しく
ニュトリエントゾロス使用）、２５マイクログラム／リ
ツトルのクロラム　フェニコールとインキュベートした
。細胞は０．４２　ｋｅｙ　７時で１．２．り。

１５および６０分ガンマ−線照射した。培養物は暗所に
放置し、２時間６７℃で振とうし、２０００μＩｌ／ｍ
ｌのＤ−サイクロセリンの２　ｍｌを加えたニュトリエ
ントゾロスを加えた。培養物は振Ｄｆｔ。

がら６７℃に１夜放置した。

ｐＢＲ３２５を有するＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＩＢ　１０１
の禾処理細胞およびシ醪巳１ｉ　Ｊ　５−３は１夜培養
物の１０培希釈物の対数期９０分培養物であった。

２、細胞ね５遠心し３　ｍｌの無菌食塩水に再懸濁させ
た。５６０　ｎｍおよび６００　ｎｍで光学密度を測定
した。

６、すべての培養物には’ＩＯｍｙ／ｍｅの６０μｌラ
イソずイムを加えた。細胞壁はこわれるよシもむしろ弱
化した。超音波破壊器（セツティング３、ハイパワー、
４ミクロン）で６０秒処理して、培養物のそれぞれを溶
解させた。氷上で行ない、溶解物はすぐに水中に詰めた
つ ４、５０μｇの溶解物を、１０００単位および２００単
位／ｍｅのナトリウム　ベンジルペニシリンの６００μ
ｌに加えた。６７℃で１時間放置したつ ５、ついで混合物は、２分間おきに７にルテンクスかく
はんすることを、１０分に及んでくりかえす方法で５０
０μｌのクロロホルムで抽出した。ナトリウム　ペンシ
ルペニシリンはクロロホルムニハ難溶である。クロロホ
ルムは遠心して分は水相を取り出し６８℃に１０分おき
、残存クロロホルムを揮散させた。

６、　ペニシリンは４００単位／　ｍｌよ９２倍希釈で
１０段階用意した。各希釈物の１　ｍｌに１０　ｐｌＪ
の無菌溶解物を加えた。６７℃で１時間インキュベート
し、ついで６８℃に１０分おき、ついで１４゜１ｕｔｅ
ｕｓのグロス培養物の６０μｌを各希釈物に加えた。

Ｚ　娠りながら６７℃で１夜試験管をインキュベートし
た。発育を初記録した５発育したら、ニュトリエント寒
天上に培養物を画線し、微生物がＭ、　１ｕｔｅｕｓで
あることを確かめた。

８、Ｌａｅｒｎｍｌｉの方法に従って１５チ非連続的ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動した。

アッセイの結果は表１に示す。表１から明らかのように
、最大のβ−１ａｃ活性は、ガンマ−線５分照射の培養
物であった。この培養物での細胞当７ｃシの活性は、細
胞密度を評価するための吸光１１１１を用いて細胞数を
調整してみると、未処理培養物の１５から６０俤の範囲
にあった（表２）っ全蛋白質の測定 濾過された細胞の溶解物の全蛋白質濃度をＬｏｗｒｙ法
で測定したつ溶解物のあいだの変動はほとんどなかった
（表６）つ　じかし、Ｌｏｗｒｙ法は、機能的、インタ
クトの蛋白質とポリ−オリゴペプチドのような蛋白質分
解生成物とのあいだを区別しないっ フ０ラスミドコード蛋白質がガンマー−ｍａｘｊ細胞中
に生産されている唯一の蛋白仙であることは第３図に示
される。ここで、０．４５　ｋＧｙ　７時の６０分照射
を受けた細胞ケ用いて新しい蛋白質の合成荀調べた。細
胞は、Ｈｉｎｄ　［１ツーイトに５．２　ｋｂ対のＤＮ
Ａのクローン化挿入物を有するプラスミドｐＢＲ３２２
を含有する’Ｅ、、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１である。

この図上には、β−ラククマーゼ１．２個の潜在性ポリ
ペプチド２および有槻水銀リアーゼ９がコードされてい
る。

ガンマ−ｍａｘｉ　−Ｎ１１Ｉ胞処理のあとの新しい蛋
白ＪＲを、 表　１ チューブ　１　２　６　４ ペニシリン濃度　４０００　２０００　１０００　５０
０し竺■ＨＢ　１０１細胞十 シラスミドｐＢＲ３２５のが ンマー糾照射溶解物 ガンマ−線照射時１）ｔｊ（分） ５ ０ 未照射のＥ；、　ｃｏｌｊ　ＨＢ　１０１細胞＋ｐＢＲ
３２５ 未照射のに、ｃｏｌｉ　Ｊ５−６　− ベニ７１Ｊン対照 ＋二発育 ｍ＝発育なＩ ５６　７　８　９　１０１１ ２５０　１２５６２　５１　１６　８　４１／２＋＋＋
＋十 ＋十＋＋十　＋　→− 表　２ 培養物の光学密度 １分　０．９０６　０．７９３ ２１　０．９８９　０．８９３ ５Ｎ　１．０３３　０．９３１ １５　Ｎ［１，８７００，８４６ ３０＃　１．１６４　１．０７３ Ｊ−５３０，９５００，８４９ ＨＢ　１０１ ｐＢＲ３２５１，４０２１，２８８ 表　６ Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質濃度の測定 Ａ”５７５　Ａ”７５０ １．０ダ／　ｍｌ蛋白質 標準　０．４８０　０．６０６ Ｊ５−５　０．０８２　（Ｊ、１４９ ＨＢ　１０１　１）ＢＲ３２５０，０６３０，１２５ガ
ンマ−線照射 １分　０．０６８　０．１３１ ２Ｎ　０．０５１　０．１０９ ５！　０．０５５　０．１２１ １５＃　０．０７２　０．１３３ ５０１　０．０７０　０．１３１ 手続補正書 昭和５９年８月１０日 特許庁長官殿 ■、事件の表示 １１１＋和５９年特、：′１Ｍ第　８００１６　け３、
補正をする者 小１′１との関係　’１．’ｒ３′Ｆ出願人（）所 氏　名　ｒンテツク　オーストラリア　リミテッド（名
　ｆ＋；） ４、代理人 ５、補１１−命令のロイＪ 昭和５９年７　月３１［」 ６、補正により増加する発明の数 １　面　−へ 図面のＩ′ｌ□、■）（内容に襄更ｊｚＬ）　’、ニー
ｊ＋１、’１．１０明細書第３７頁第１９行から同第３
８頁第３行の「４、図面の簡単な説明」を次の゛通り訂
正する。

「４、図面の簡単な説明 第１図は生物の形態を表わす写真であって、ガンマ−線
照射細胞よりの未消化シラスミドＤＮＡの電気泳動図を
示す。

第２図は生物の形態を表わす写真であって、ガンマ−線
照射細胞からのシラスミＶの制限酵素消化物を示す。

第６図は生物の形態を表わす写真であって、ガンマー−
＋１＋ａｘｌ細胞中に生産されて℃・るプラスミドコー
ドタンパクが唯一のものであることを示す。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　（ａ）　プラスミドＤＮＡ−含有生物を用意し
   、そして （ｂ）その生物にイオン化照射の有効量を照射すること を包含する、染色体ＤＮＡ　’ｉ実質的に含有しない、
   プラスミドＤＮＡ　、またはそれの発現生成物が濃縮さ
   れた細胞の調製方法。 （２）７°ラスミドの増殖を維持しうる、分裂しない細
   胞を生成させる段階である、上記（１）項記載の方法。 （３）　プラスミドＤＮＡ　＠有生物葡、微生物、かひ
   、植物および動物の細胞よシ選択する、上記（２）項記
   載の方法。 （４）細胞が詰まった細胞の状態で存在する、上記（３
   ）項記載の方法。 （Ｒ＋　−ｆうｘ　９　ｋ’　ｎＮＡ　＋’；４に／Ｉ
   ：’ｋｒｆ＋１ｌＪｉ１蘭％ｒ句會１−スー上記（４）
   項記載の方法。 （６）細菌が修復しそして（または）組換えすることを
   欠如する菌株である、上記（５）功記載の方法。 上記（６）項記載の方法。 （３）細菌に約０．４から０．５　ｋｅｙ　／時のガン
   マ−線照射を約１から６０分のあいだ照射する、上記（
   ６）項記載の方法。 （９）　（ａ’）細菌の修復および（またね、）組換え
   を欠如する株を、照射に先立ち、シラスミド収量全増加
   さす処理に処することｒさらに包含する、上記（６）項
   記載の方法。 （１１プラスミドのコピー数を増加さすように選択した
   少なくとも１種類の抗生物質で細菌を処理することを包
   含するプラスミド収量増加のだめの処理を行なう、上記
   （９〕項記載の方法。 ａｌｌ（ＩＩＬ）修復および（または）組換えを欠如す
   る細菌株を用意し、 （ｂ）　該修復および（または）組換えを欠如する細菌
   株をプラスミドの収量を増加きず処理に処し、そして （Ｃ）　そのように処理した細菌に約肌４から０．５ｋ
   Ｇｙ　／　時のガンマ−線を約１から６０分のあいだ照
   射すること を包含する、染色体ＤＮＡを実質的に含有しない、プラ
   スミドＤＮＡ　、まだはその発現生成物が濃縮された細
   胞の調製方法。 ０秒　プラスミドのコピー級を増加さすよりに選択した
   少なくとも１イル類の抗生物質でｒ６ｃ　Ａ細菌ｒ処理
   することを包含するプラスミド収量増加のための処理を
   行なう、上記０９項記載の方法。 （ＩＪ　（ａ）　細胞含有生物を用危し、（１））　細
   胞の染色体ＤＮＡ勿崩壊さすか、または崩壊を助長をす
   よりに化学的に処理し、 （ｃ）　該細胞奮プラスミド収量を増加さすだめの処理
   に処し、そして （ｄ）　そのように処理した細菌に約０．４からＵ・５
   ｋｅｙ／時のガンマ−線を約１から６０分のあいだ照射
   すること を包含する、染色体ＤＮＡ？１１１−実質的に含有しな
   い、プラスミｌ５ＤＮＡおよびそれの発現生成物をＩＮ
   Ｎする方法。 ０　シラスミドのコピー数を増加さすように選択した少
   なくとも１種類の抗生物質で細胞を処理することを包含
   するシラスミドの収量を増加はす処理に処する、上記０
   ４項記載の方法。 α５（ａ）（ｉ）　望む特性をコー−するＤＮＡフラグ
   メント、そして （１１）　シラスミドを含有する生物 を用意し、 （ｂ）　該ＤＮＡフラグメントをプラスミド中にクロー
   ン化し、 （Ｃ）　適当な受け入れ生物紮上記組換えプラスミドで
   形質転換するか丑たｆよトランスフエクノヨンし、 （ｄ）　染色体ＤＮＡを実質的に含有しないでシラスミ
   ドの増殖を維持しうる、分裂しない細胞を生成さすのに
   有効な照射量のイオン化照射で、訳プラスミド含有生物
   を処理し、そして （ｅ）　そのように処理した細胞を適当な培地中に保持
   すること を包含する、プラスミドＤＮＡの発現生成物を合成する
   方法。 αＧ（０勺プラスミド含有細胞を望む濃度まで発育さす
   こと をさらに包含する上記０９項記載の方法。 （１７１生物が修復および（または）組換えを欠如する
   細菌株である、上記ｔｈｅ項記載の方法。 ０句　細胞が詰壕つた状態で存在する、上記（１７１項
   記載の方法。 Ｑリ　細胞がＥ、　ｃｏｌｉのｒｅｃ　Ａ株である上記
   Ｑ樽項記載の方法っ □□□　細菌を、約肌４から０゜５　ｋＧｙ　／時のガ
   ンマ−線で約１から６０分照射する、上記住り項記載の
   方法。 ■υ　発現生成物をＲＮＡ捷たは発現蛋白質より選択す
   る、上記（ａ）＋１記載の方法。 に）　生成物が、抗生、仇ウィルス、ホルモンまたは酵
   素活性、または他の有用な生理約１たは生物−上記（１
   ）項記載の方法で製造した、シラスミドＤＮＡの濃縮さ
   れた細胞。 （ハ）　上記α４項記載の方法で製造された、プラスミ
   ドＤＮＡの発現生成物。