JPS6041479A - 新規突然変異菌及びそれを使用して化石質燃料から有機イオウ化合物を除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 真珠、シュードモナス　エスピー　ＣＢ＋及びそれを利
・用して化石質燃料、たとえば石炭、石油及び石油製品
のような炭零質物質力）ら有機イオウ化合物を除去する
方法に関するものである。

多数の等級の石炭及び石油は燃焼中にＩＮ蝕性の空気汚
染性及び水汚染性生成物を形成するイオウ化合物を多量
に含イゴしている・硫酸塩及び黄鉄鉱（１ｒｏｎ　ｐｙ
ｒｉｔｅｓ　）　のような鋸機イオウ化合物の除去に関
しては多数の化学的及び物理的方法が開発されている。

またメルカプタン、脂肪族硫化物及び二硫化物類のよう
な若干の有機イオウ化合物は化学的方法によって比較的
除去し易いものである。しかしながら、硅化ジフェニル
、ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン等のごとき芳
香族イオウ化合物は石炭中にかなりＢ　？ａ度で存在す
る。

これらの芳香族イオウ化合物は化学的及び級生物学的攻
４＜に耐性であシ、屡々難溶性又は除去困難な（ｒｅｆ
ｒａｃｔｏｒｙ　）　有機イオウ化合物として特徴付け
られるものである。

有機イオウの除去のために多数の化学的方法が研究され
ている。実験室的又は工業化試験的規模で評価されてい
る方法としては酸化脱硫法、塩素化分解法、酸化法、水
添脱硫法及び重力溶融（Ｇｒａｖｊｍｅｌｔ　）法があ
る。Ｂｅｒｒｙによれば、１０〜５０チの有機イオウの
除去のために卓上試験規模及び１柴化試験規模において
４１〜５８ドル／トン（１９７９年当時で）の範囲の突
出した全製品コストが要求される（　Ｂｅｒｒ３’、　
Ｒ，１，（１９８１ゝ・−Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｃｏａｌ
　−Ｃｌｅａｎｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　−。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｆ：ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｊａ
ｎｕａｒｙ　２６　ｆ３照）。

微生物学的処理によるか＼る除去困難な有機イオウ化合
物の除去は多くの重要な利点をもつであろう。微生物学
的方法においては高需・高圧又は腐蝕に耐性の装置は必
要でなく、安価なｔＢ設拐科を使用し得るので資本経費
を低く抑えることができる０また廃物質を利用して微生
物の生育を行なえば操桑経費も低く抑えることができる
。また多くの現場では、生物学的処理は同曲条件下で行
なうことができる０さらに微生物学的処理は石炭の措造
及び組成を認め得るほどに変化させ又は石炭のＢＴＵ値
を実質的に低下させることはない。

石油及び石炭の微生物学的処理は種々の微生物を用いて
寮験段階の研究が行なわれている０従来、（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　、ベイジエリンキア（Ｂｏｉ
ｊｅｒｉｎｃｋｉａ　）　、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　）な屈を包含する＠これらの微生物のあるもの
はＴ（ｅｄｒｉｃｋらによって報告されているごとく除
去困難な有機イオウ化合物を分解する可能性を示した（
　Ｈｃｄｒｉｃｋら（１９８２＞　、Ｄｅｓｕｌｆｕｒ
ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＣｏａｌ　ｂｙ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｐｒａｔｒｅａｔｍａｎｔ　”　！Ｓｔ＋ｔｃ
　−ｏｆ　ｔｈｅ−Ａｒｔ　参照）。この雑文はか＼る
実粘研究の包括的要約を提供しているものである０しか
しながら、この雑文にもまたその他の入手しイＵる技術
文献にも突然変異株、シュートモブース　エスピー　Ｃ
’Ｂ　ｌ　（ＡＴＣＣ應３９３ｇ＋　）についての記載
又はそれが炭素質物質中に見出されるチオフェン類のよ
うな除去困難な有機・イオウ化合物力）らのイメウの除
去に有効である可能性に関する記載は全く認められない
。

今般、本発明者は、シュードモナスに」の突然変異株で
あって、ウレアーゼ反応に陰性、マツコン卑−寒天培地
上で生育するが４．１’ｃでは生育しないとイウ％徴ヲ
有するシュードモナス　エスピー（Ｐｇｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｓｐ、　）　ＣＢ　ｌの生物学的に純粋な培養物
を単離しかつそれが石炭及び石油のような化石質燃料か
ら除去困難な有機イオウ化合物の除去にきわめて有用で
あることを見出した・Ａ　３９３８１　）　Ｉｄ、　約
（Ｌ　５　Ｘ　ｌ　ミクロンの非運動性ノグラム陰性桿
菌であり、単−又は短かい連鎖で存在する。、この菌株
は好気的１ｃ牛育し、黄緑色水溶性色素を生成し、カタ
ラーゼ拭い及びオキシダーゼ試験Ｋ　１４４性、唯一の
炭素源としてクエン酸塩を利用せず、４１ｏＣでは生育
せずかつマツコンキー寒天培地上で生育する。栄な寒天
培地上に形成するコロニーは円形、規則的かつ白色であ
る。この菌は生育及び活動用の唯一の炭素源としてナフ
タリン、フェノール又ハレゾルシノールを利用しナイが
唯一の炭梠汀として安息？ｒ酪酸塩利用するＯこの閑は
大きい（〉２５メガグルトン）プラスミドを３有する。

この菌株の培養物はＡ　’Ｉ’　ＣＣに寄託され、その
寄託番号はＡＴＣＣ１１瓜３９３８１でらる〇この一株
は天然菌ヲジベンゾチオフエン（ＤＢＴ）に対してＭｌ
化させ、かく４す１化させた培養物を唯一の炭素源とし
て安息香酸塩を餐化１−得る菌株を得るように選択し、
ついで水性媒質中でＤＢＴを酸化し得る菌株を得るよう
に選択し、さらに水性媒−質中でＤＢＴを酸化し得る菌
株をＤＢＴ酸化能を増大させる突然変異誘発要因で処理
することによって創製された。

本発明の突然変異株ＣＢ＋の生化学的特性を類結果（下
表参照）、ＣＢ＋はほとんど間違いなくされた・馴化、
突然変異誘発要因による処理及び選択の結果、ＣＤＩと
命名されたｉ′３株の純粋培養物が得られた。

炭　素　源　ＣＢｔ　ＰＩｌ、スツツツエ’Ｉ　Ｐｇ、
プチダ安息香酸アンモニウム　ト　− 酢酸ナトリウム　ト　ト 了セチルサリチル酸　ト　− クエンＩ￥２塩 パ　リ　ン　ト　＋　−ト 了うニン　（−十 本発明の新規突然変異株ＣＢＩ（ＡＴＣＣＡ３９３ｇ＋
　＞は除去困難な難治性の芳香族及び脂肪族有機イオウ
化合物全上首尾に分＋’ｆｆ　ｔ、・特に石炭。

石油及び石油製品のような炭素質基質からのこれら混入
不純物を該炭素式物賀を利用することなしに酸化・除去
するのに有効であることが酌められたＯ この新規突然変異株ＣＢＩは微粉状から粗塊状までの程
々の粒度をもつ種々の等級の石炭から有（幾イオウ化合
物を除去するために使用することができる◇この微生物
はまた石炭／水燃料スラリー及びパイプラインスラリー
中の有機イオウ化合物の除去にも使用し得る。

分　ドｊ口１ 土壌試料は米国メリーランド州、／〈−ジニ丁州におい
て及びペンシルベニア炭坑から得たものでアル・各試料
ヲ変性リンゲル液、すなわち塩化すｌ・リウム（０−７
’４　）　、ＣａＣ／２（０，００２６’ｆｙ　）、Ｉ
（Ｌ／（０，０３５チ）及び蒸留水を含有する滅菌塩溶
液で抽出することによって微生物個体群を各試料から分
離した。微生物群を含有する塩抽出物の各々を栄養寒天
上で培養しセして培会物増殖用のトリブチケ−ス大豆肉
汁培地中 ス大豆肉汁培地中に接種した０ 馴化 上記做生物培会物のすべてをそれぞれトリブチケース大
豆肉汁培地中でＤＢＴの存在下にＰＩｌ化し、ついで最
小項培地（ＭｇＳＯ４０，０２％、クエ酒−Ｔ（，００
，０２％　、　Ｋ２ＨＰＯ４１，０％　、　Ｎａ（Ｎ［
１４）ＨＰＯ４０，３５チ、ｐｉ（７）中でＤＢＴの存
在下でピ１１化した６　ＤＯＴの濃度は１００〜１００
０り／Ｌの範囲であった◎選択 ＤＢＴの存在下で上６尾に馴化されたすべての４　養物
’　（メリーランド、パージ二丁及ヒペン’７にベニア
の土壌試料からの微生物個体群及びシュードモナス　プ
チダの純粋培養物）　ｋ　ｎｉｌｇ−の炭素源として安
息香酸塩（安息香ｒ／￥ナトリウム０．２５１）の与を
含有する最小項培地（クエン酸塩を含有しない）中に接
種することによって炭素佇として安息香酸塩を利用する
個体奮逍択した。

唯一の炭素ぶとして安７１−１香酸塩を使用しイυる゛
すべての培養物を安息香酸塩０．２５幅を含有する最小
塩基地中で・振盆台上で室１．′、八で一晩生育させた
・これらの培養９勿を水）１培地中でのＤＯＴの酸化に
ついて評価するために、−晩振η才培養した各基３を物
にＤＢ’ｌ’を最終濃度２００又は４００η／Ｌになる
ように接種した。対ｊ；α用培地にもＩ）　Ｂ　Ｔを同
一り　Ｂ　Ｔａ度で接種した。ＤＢＴ扱口後、培養物を
振Ｑ台に戻し−Ｃ数日間培養した０水性培地中に残存す
るＤ　１１７のｉせをσ１り定するために、各フラスコ
の全内容物を塩化メチレンで抽出した。３種の供試培養
物（メリーランド州及びバージ二アシ（（土Ｊ３３の歳
生物個体ｇ′６及びシュードモナス　プチダの純粋培倹
物）は溶剤抽出し得るＤ　Ｂ　Ｔ　ｇ３度の若干の１ｔ
９少を示１−た。こｎらの培養物を別々に及び３種の培
養物の混合物と１〜で保持しグヒ。この晶合培り穿り勿
を”コンポ（Ｃｏｍｂｏ　）”と称する。

これら３種の別々の培養物及び”コンポ”をさらにＩ）
　Ｂ　Ｔの存在下での１１化しそして安息香１浚塩を唯
一の炭素源として利用し得る（ＩＩ’、ｌ　１４ｃを迅
択した。

これら４種の培養物の各々及びペンシルベニア炭坑の培
養物をｌ１ｏｔｈ　によって報１１テされでいるジエチ
ルサルフエー）　（ＤＩｉ：ｓ）ｂてよる突然変異誘発
法［Ｊ、ｔｔ、　Ｒｏｔｈ　（１９７１）　、　−Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ　５ｔｕｄｉｅ
ｓ　ｏｆ　［１ａｃｔｅｒｉａｌ　ｈｉｅｔａｂｏｌｉ
ｎｍ　−。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＸＳ１
［、Ａ、　ｇｆｉ　３〜３５頁わ照〕によって処理した
。これら５種の培養物の各々においていくつかの（ｓｏ
ｍｅ　）Ｉａ生物はＤＥＳ処理に耐えて生存しそして新
しい栄養肉汁培地中１１Ｕｅｌｔｉ’［ＹＰｓ　（１／
ｌｏｏ　）　Ｌ、３５Ｄｃチー晩１培’ａして生育させ
ることＶこよつ一仁°救済（ｒｅａｃｕｅｄ）　”され
た。

Ｄ　ｇ　Ｓ突然変異誘発処理に続く栄−く肉汁培地中で
の゛救済“によって１０られｆＣ微生物培養物を炭素源
として安息香酸塩を含有する最小塩培地中に接種しそし
て振盆台上で室温で一晩生育させた。

この培養物のフラスコ及び培地対１ｆｉフラスコの各々
にＤＢＴ’ｉ種々の濃度Ｃ（たとえば１００１η／Ｌ、
２００　Ｑ／　Ｌ）ｉ；÷１２貧した。こしらのフラス
コを振詰台に戻しそし゛Ｃ種々の培−♂ｆ待時間たとえ
ば１８時間、４日、７０））ｙ　ＪＩ　Ｌ　／Ｌ　Ｅ”
ｅ、ｌ）　＋１　’ｒ　分析のグ、こめにフラスコの全
内容物を３ｍＩＢメブーレンで油出した０沼剤拙出し、
イするｌ）　Ｂ　ｉ’の晴の一１イ怠の減少を示し７た
のは“コンポ”培養物のみであった０１）　ｒＤ　Ｓ処
理後の゛コンボ”培養物を安息香酸塩を一部する最小塩
培地中に植継き゛した・このＩＩ代培基ｃ　’吻を分８
１Ｆのために栄養寒天平板上に画線した・１１ｉ−−コ
ロニーの分；誦は３回行ないそして第三の分離〃）らの
単一コロニーイｃ安息香酸塩栄加えた最小塩培地中に植
継ぎしてＤＢＴ酸化につい゛〔ｉＦ　１ｌｌｉ　した・
この３回分離処理した単一コロニー単ト；１ｒ体？Ｃと
命名した。

プラスミド分析 たとえばアクリジンオレンジのような種々め化学剤の使
用及び高幅における生育によっである種の（３ｏｍｅ　
）　細菌のＫ（ｌ胞からプラスミドＤＮＡ分子をとり出
し又は除去（ｃｕｒｅ　）　することができる。独立枚
製ｌ（ν環状ＤＮＡデュプレックス（ａｕｔｏｎｏｒｎ
ｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｃｉｒｃｕｌａ
ｒ　ＤＮＡｄｕｐｌｅｘｅｓ　）　として存在するプラ
スミドはイ晃製（アクリジン）による妨害のために又は
それらのｆｌｉ１７７１７回の付着部位（高温〕の変化
のために、これらの化学剤によって除去される。

ＣＢＩについて使用した除去（ｃｕｔ３ｎｇ　）　方法
は°へ１ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ａｉｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ
　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、
Ｃ，］　に６己載される方法に従って行なった。対数増
殖期にあるＣＢＩ培β物を５０又は２５０ｙｙ／Ｌのア
クリジンオレンジを添加した栄養肉汁培地を含む一連の
試験管中に細胞数１０３〜１０４個の濃度で接種した。

これらの培養物を２５°Ｃで又は４０’Ｃで一晩通気培
子（ｌ−た。ついで各培養物の一部を新しい培地中に１
：１Ｏ４ＯＶｃ稀釈しそして通気ぜずに２５″Ｃ又は４
０°Ｃで生育させた。単一のコーニ−（小集落）を得る
ために適当な稀釈培巽物を栄養寒天上で千面培ｊ！ξし
、得られた単一コロニー単１９ｉＣ体ｉ　Ｄ　Ｂ　Ｔ酸
化について試験した。

プチダの保存培養物及び減少したＤ　Ｂ　ｉ”酸化を示
した２種のアクリジンオレンジ処理しり単一コロー−単
離体を栄養寒天平板上Ｑこ１面線しそしてプラスミドＤ
ＮＡの分ａｍのために旧ｒｎｂｏｉｍ　及びＤ６１ｙ　
の方法〔８ｉｒｎｂｏｉｍ、　ｌｆ、ｃ、及びＪ、Ｉ）
ｏｌｙ。

−Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ａ１１ｃａ目ｎｅ　Ｅｔｒａｃｔｉ
ｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇ
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｌａａｍｉｄ　ＤＮＡ　
−ｒ　ＮｕｃｌｅｊｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ＋＋ｅａｒｃｈ
＋　７．１５１３−１５２３　〕及びＮ５ｗ１ａｎｄら
の１井戸中でのｍＭ’ｌ　（１ｙｓｉｓ　ｉｎ’ｔｈｅ
ｙＣｌｌ　）　”　技術〔Ｎｅｗｌａｎｄ、Ｊ、νＶ、
ら（＋９８０）　。

’　Ｒａｐｉｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｐｌａ
ｓｍｉｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎ＋ｎｅｎｔａ１ｗｅ
ｌｌ　”　Ｌｙｓｉａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｕｓｉｎ
ｇ　Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ　”　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　Ｐｒｏｃ、、
３　ｒｄ　ＡｎｎｕａｌＭｉｄ−Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ｒ
ｏｇｉｏｎａｌ　Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　
Ｆｌｅｒｒｒ＋ｎｔｇＭｏｅｔｉｎｇ、　ＰｌａＩＩｍ
ｉｄ、　３．２３８３　ｆ用いて処理した。

これらのプラスミド分析法によつ”Ｃ′除去処理されな
い（ｕｎｃｕｒｃｄ　）　”　ＣＢ　ｌ　ＣＡＴＣＣＩ
＆　３９３８１　）は〉２５メツＩダルトンの大きさの
大きなプラスミドを含んでいることが立証された。非処
理のシューの親菌株の一つはこれらの分析法によって検
出し得るプラスミドを全く含有しなかった。アクリジン
オレンジ処理後はＤＢＴを酸化しない上記処理されたＣ
Ｕｔの単離体も分析し、その結果ＣＢ＋巾に見出された
プラスミｐと同等の分子延をもつ大きなプラスミドを含
有することが見出された。

この場合には、了クリジンオレンジ処理は明らかにプラ
スミドを除去することなしに敵生物ノ曳伝物２１に影響
を与えた。上述した結果はＣＢ　ｌ　（ｆＣよるＤＢＴ
の酸化はプラスミドによって仲介されない（ｎｏｔ　ｐ
ｌａｓｍｉｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　）　ことを示しプと
。

生化学的特性 Ｃ１０１，シュードモナス　エルギノーザ（Ｐｓ。

ｐ、ｅｒｕｇＬＨｏｓａ　）、シュードモナス　プグー
ダ（ＰＬＬ。

ｐｕｔｉｄｌｌ）　ｌｉヒシュードモナス　スツノツエ
＋７（Ｐ８・５ｔｕｔｚｅｒｔ　）　の保存ユ）ｌ養物
の体化学的特性をＡＰＩ２ＯＥ系ＣＡＰＩ　２０　Ｅ　
ＳｙｓｔｅｍΔｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒｏｆｉｌｅ　Ｉ
ｎｄｅｘ＋Δｎａｌａｂ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｐｌａ
ｉｎｖｉｅｗ。

ＮＹ　］を用いて試験した。ＣＢＩ及びぞれＱｃきわめ
て近似するシュードモナスｈ３の菌株についてのソｌｊ
フィルｆｒ、Ｓル１表にボす。ＣＢ＋とその他のシュー
ドモナス属菌の各々との間にはｒＷ大な差異があること
が認められるでおろう。

第　１シミ　ＡＰＩ２０ｇシステム試験０ＮＰＧ　−−
−− ＡＤＩＩ−トトーー− Ｌｌ）Ｃ−−−− Ｌｌ）Ｃ−−−− 〇ＤＣ−−−、−。

ＣＩＴ　−）−〜　−− Ｈ，Ｓ　−−−− ＩＪＲＥ＋トーー Ｔｌ）Ａ　− ＩＮＤ　−−−− ｖｐ　−−−− ＧＥＬ　ｌ−−−−− ＧＬＵ　−〜　−− ｒｈｎ　−−−− 第　１　表（３泣き） １７１Ｇｌ　−−−− Ａ　ｎｌ　ｙ−−−− ０ｘ！＋−１−１−罎− ＮＯ−−−−ト Ｎガ゛ス　−−− 運動ｒ１ミ　→−＋−−１− ＭＡＣ→　−４−− ｏｙ−ｏ　→−十−１−→〜 ０１”　−Ｆ　− ４１Ｃ−Ｌ　、１−　−　−１− カタラーゼ　４−　＋　１　＋ ナフタリン　− フエノール　− レゾルシノール　− ベンゾエート　十　− ＤＢＴを用いた機借的検討 ”Ｃ−ＤＯＴ及び　５−ＤＢＴを用いてＣＢ−１を培養
するラジオアイソトープ試験の結果、ＤＢＴのイオウ及
び炭素骨格は水溶性化合物に酸化されたことが認められ
た。しかしながら、ＣＯ２は生成されなかった０このこ
とはＣＢＩがＤＢ、Ｔの炭素骨格を炭素源として利用し
なかつ／′ヒことを示している。画体（ｂｉｏｍａｓｓ
　）　’ｉ遠心分離及び０．２ミクロンのフィルターを
通じての一過によって除去し、戸液１Ｈａｃｈ　の−ｆ
（ａｎｄｂｏｏｋ　ｆｏｒ　ＷａｔｅｒＡｎｘｌｙｓｉ
ｇ　＠（Ｈａｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
、　１９７９　）に記載されるごとき分析法及びイオン
クロマトグラフィーによって硫酸塩について分析した。

これら２種の分析法は匹敵する結果を与えた。ＣＢＩで
処理されたＤＢＴ培地中の硫酸塩濃度は１００及び９９
キ／Ｌであり、一方対照試験における硫酸塩濃度は５５
及び６７ｑ／Ｌであった０これらのデータはＣＢＩがＤ
ＢＴに作用してそのイオウ基を酸化し、無機硫酸塩を生
成することを示している０この反応機構はすべての他の
文献に報告さｆシーＣいる微生物によるＤＢＴの分解に
おいては主生成物が３−ヒトａキシ−２−ホルミルベン
ゾチオフェンである＠夷とは相違する〔Ｋｏｄａ＋ｎａ
、　Ｋ、ら（１’／７３）　、−Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｆｒｏｍ　Ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ　ａｎｄ
　Ｉｔｓ　ＰｒｏｐｏｓｅｄＯｘｉｄａ−ｔｉｏｎ　Ｐ
ａｔｈｗａｙ　”’　＋　Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ・＋　３７（１＋、４５〜５０頁参照〕０ 石炭を用いた機構的検討 石炭中の有機イオウは黄鉄鉱型イオウ、硫酸塩型イオウ
及び全イオウについての分析を伴う回りくどい方法によ
って測定されているＯ該有機イオウは全イオウ含量から
黄鉄鉱型イオウ及び硫酸塩型イオウの合計含量を差引く
ことによって測定される。ＣＢＩが石炭中の有機イオウ
のみに作用することを立証するために、石炭を洗滌して
硫酸塩型イオウを除去した。洗滌後の石炭の全イオウ含
量の減少は石炭の種顛及び粒度に応じて８〜３４憾の範
囲であった。ＣＢ＋が黄鉄鉱型イオウには作用しないこ
とを立証するためにつぎの実醗を行なった〇 ＣＢ＋を水１０〇−中０．２５ｔの黄鉄鉱（約３２５メ
ツシユ）を用い、振盆台上で２５°Ｃで培養した。対照
試験用フラスコには最小項培地〜安息香酸塩及び黄鉄鉱
のみを含有せしめた０培養後各フラスコの内容物を遠心
分離しそして上澄液を０．２ミクロンのフィルターを通
じて濾過、除去した・Ｐ　ｊａ　した上澄液を前記引用
したＩＩａｃｈ　の”　Ｈ！１ｎｄｂｏｏｌｃ　ｆｏｒ
　Ｗａｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　−中に記載された方
法を用いて硫酸塩について分析した。遠心分＋ｑｔａに
より得られた黄鉄鉱／菌体を６０°Ｃで一晩乾燥しそし
てＦｉｓｂａｒ　の全イオウ分析装置を用いて全イオウ
含ｈＮ’こついて分析した。対照Ｅ験及びＣＢ１で処理
した本発明の実験における黄鉄鉱の全イオウ含量は同一
であった。これらの結果はＣＢ１が黄鉄鉱を酸化しない
ことを示している。したがって・石炭中の有機イオウ型
のイオウの今がＣＢ１によって酸化されると結論するこ
とができるＣ実施例 つぎに本発明の突然変異株、シュー）％ｆ７エスピーＣ
ＢＩｉ種々の有機イオウ化合物の酸化に使用する実施例
を示フ”・ 実施例１ 非処理の°コンポ”藏生物培養閉及び突然変異株ＣＢ　
＋培養菌による水性培地からのＤＢＴの酸化実験を種々
の培養ｎ＠間、ＤＩＩＴ〔７１度及び温度の榮件下、で
行ない、その結果を第２表及び２８３表に示す。これら
の結果はＣＢＩが水は培Ｍｌ中で非処理の親培養物より
も著しく多部のＤ［ｌＴを０化したことを例証している
Ｏ 第２表　ＣＢＩ及び親（コンボ）培養菌コンボ　３８　
５０　４ コンボ　５日　５０　３ コンポ　７日　ｔｏｏ　７ コンポ　７日　２００　。

コンボ　１０日　２００　ｌ　。

コンボ　１０日　ｔｏｏ　７ （：Ｂｌ　１８時間　ｔｏｏ　６２ Ｃ１ｌｌ　１８時間　＋００　６５ ＣＢ＋　１８時間　＋　００　６０ 第３表　Ｃｌ３１によるＤ　Ｂ　Ｔの酸比に及培ｇｕｍ
間　培’Ｊｊ　Ｌ’ｊｊｒ度　当初の［）　Ｂ　’Ｉ”
１ｉ）ＩＩＪ　Ｄ　Ｂ　Ｔの減少率１８　・　２５　２
００　７１ ７２　２５　２００　８８ １８　２５　２５０　４６ １８　２５　４２Ｂ　６７ ＩＳ　２５　８００　４４ １ｇ　２５　８００　５８ １８　３５　２５０　８３ １８　３５　２００　９４ １８　４０　２００　７６ 実施例２ 水性培地中におけるＣＢＩのｌ）　Ｂ　Ｔ以外の有札龜
イオウ化合物に対する酸化能を評価するために−述の試
験２行なった。ＣＢＩ培養菌を安息香酸塩（０，２５幅
）を含有する最小ｊ舅培Ｊ准中に接種して振Ω台上で２
５°Ｃで一晩生育させた。ＣＢ＋の一晩培養物を含むフ
ラスコに選定された有機イオウ化合物を特定濃度で添加
した◎微生物培養物及び有機イオウ化合物を含むフラス
コを２４〜４８時間静置培養した後、フラスコの全内容
物を抽出して有機イオウ化合物含量全測定した。すなわ
ち、各フラスコの内容物を１０−の塩化メチレンで３回
抽出しそして抽出物をガスクロマトグラフィーによって
分析した０培地対照試験フラスコには最小項培地、安息
香酸塩及び評価すべき有機イオウ化合物を特定濃度で含
有せしめた０第二の組の培地対照試験フラスコについて
は装入後ｉ１ちに抽出を行なって各有機イオウ化合物の
抽出効２ｆｓ　’ｆｒ　ｆｌ！Ｉ定した・結果を第４表
に示す・これらの結果は本発明の突然変異株ＣＢ＋は著
量の溶剤抽出可能な有機イオウ化合物を水性培地から除
去したことを実証している。

第４表　ＣＢＩによる他の有機イオウ化合物最初の培養 ｎ−メクチルザルフ丁イド　２４　ｔｏｏ　４４２４　
２００　８５ ２４　２００　８１ ベンジルメチルサルフアイド　２４　ｔｏｏ　３１２４
　ｔｏｏ　３２ チオアニンール　２４　１００　４５ ２４　１０（１５１ １−ベンゾチオフェン　２４　２００　ｇ＋実施例３ 本実施例は本発明の突然変異株ＣＢ＋が秤々の石炭試料
で種々の粒径をもつものからイオウを除去し得る能力を
試験するために行なったものでａる・ＣＢＩ培養菌を安
息香酸塩（０，２５幅）を含む最小項培地に接種して振
盪台上で２５°Ｃで一晩生育させた。各１８〜２４時間
培養物に石炭粉本分５爪ｌけ／容刊多添加した。ｔ゛及
生物培テ・４物１５炭混合物を含むフラスコを振盪台上
に戻して２４〜４８時間培養した後、石炭粉末を遠心外
ｉ’ｉｌｆによって除去し、それを蒸留水で洗滌しそし
て該石炭粉末の全イオウ含Ｗｅ分析した。

石炭の有ωイオウ含（％”Ｋ正確にＩｔｌ定するために
利用し得る分析法は現在知られていないので、これらの
実験の結果は全イオウ含ｔ！■によって与えられること
に留意すべきである・ＣＢ　ｌ　’ｆｆ用いる試Ｉ倹の
ための石炭としてウエンツ（Ｗｅｎｔｚ　’）石炭及び
モン）　（Ｍｏｎｔ　）　石炭を選定した０その理由は
これらの石炭の有４Ｓイオウ型イオウの含１１′は全一
イオウ含−はの約９０％を構成することが報告され′Ｃ
いるからである。結果を第５表に示す。第５表の結果は
本発明の突然変異株ＣＢ＋による石炭式４Ｆの処ｊ里は
石炭勃子の粒度が２５０ミクロン（６０メツシユ）又は
それ以下である場合に石炭の全イオウ含量の著しい減少
をもたらしたことを実ＫＥ　Ｌでいる。

／ 実施例４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １・　シュードモナス団の突然変異株であって、ウレア
   ーゼ反応に陰性、マツコンキー寒天培ｊｌ！ｌ−１で生
   育するが４１０Ｃでは生育しないという特徴を有するシ
   ュードモナス　エスピー　ＣＢ＋の生物学的に純粋な培
   養物。 ２、炭素質！質をシュードモナス　エスピーＣＢＩの培
   養物で処理することからなる炭素質μ買から有機イオウ
   化合物の除去力法。 ３６　炭素質基質が石炭である特許請求の範囲群２項記
   載の除去力法。 ４・　炭素質基質が石油又は石油生成物であるｌ（ｈ許
   醒１求の範囲第２項記載の除去力法〇