JPS6041591B2 - カワラタケ種の新規な一核菌糸体の生産方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担子菌類ヒダナシタケ目サルノコシカケ科カ
ワラタケ属カワラタケ種の二核を有する二次菌糸体から
安定な一核を有する菌糸体を生産する方法に関する。

最近、カワラタケは、医薬或は食品としての有用性が
認められ、その人工培養が行はれてはいるが、従来技術
ではその増殖率が小さく、したがつて、増殖率の向上が
望まれていた。

本発明はこのカワラタケの増殖率を向上させるため課
題を解決したものである。

すなわち、本発明の二核菌糸体であるカワラタケ種の二
次菌糸体について、液体培地を使用し、特殊な条件下で
液内培養を行うことにより、カワラタケ種の安定な・
一核菌糸体が得られることを初めて見出し、更に、該一
核菌糸体が従来既知の二核菌糸体に比し数倍の増殖速度
を示し、且つその培養生成物より抽出して得られた物質
が従来法で得られる物質と全く同等の生理活性を有する
事を確認して本発明をなすに至つた。従来、きのこを形
成する菌類が担子胞子を形成し、その胞子から発芽して
生成するものは通常一核の菌糸てある一次菌糸体であり
、これが相互に瘉合して二核菌糸である二核菌糸体（二
次菌糸体）を生成するとされている。

ここで一核菌糸体は子実体形成能力はないが、二核菌糸
体は子実体形成能力を有するものであるといわれている
。しかしながら、通常の胞子から生成する一核菌糸体は
カワラタケ種に関しては末だ確認せられていない。又こ
れについての報告も殆んどされていない。本発明者等が
行つた実験においても胞子を培養して得た生成白色気菌
子は二核であり、一核菌糸は、中間段階の極めて不安定
な状態て直ちに二核に変換してをくものと推定される。
しかるに本発明により得られる一核菌糸体は極めて安定
であることが大きな特色である。本発明によるカワラタ
ケ種の一核菌糸体と従来の二核菌糸体の相違点を列配す
ると第１表のとおりである。本表に若干の説明を加える
と、カワラタケ種を従来法に従い、培養して得られる二
核の通常の生成菌糸体はペレット状を通常形成する。

これに対し、一核の菌糸体を生成した場合はペット形成
は認められず、培地が太い菌糸体で恰もバルブが水中に
懸濁した如き濁つた状態になり明らかに差違が認められ
るものである。又核数の測定法は、本発明者等により初
めて完成されたものであつて以下の手法により行うもの
である。カワラタケ菌糸体を含む培養液（培養プロス）
を水で稀釈後、遠心分離して菌糸体を分離し、固定数（
へソー液）を入れる。

２肴間放置後分離し、菌体を水洗し、希塩酸中に入れ１
紛間あたため、冷却後水洗し、希硝酸処理後数回水洗す
る。

繊維状の菌体をスライドグラス上に拡げ放置し、染色液
（ギムサ氏液）を菌体の上に数滴滴下する。１紛間放置
したのち水洗乾燥し、１００皓の光学顕微鏡で観察する
。

円形状の赤染部が核であり、１個の細胞円の核の数を調
べることにより核数を測定するものである。本測定法に
より、通常のペレット状菌糸体１細胞中の核数は２であ
り、本発明に係る懸濁状菌糸体１細胞中の核数は１であ
ることが判明した。

前述の全く特異な性状を示す本発明による一核菌糸体は
、本発明によつて、カワラタケ種二核菌糸体は液体培地
で剪断作用もしくは磨砕作用を示す機械的処理を施すか
或は施しながら液内培養する操作を継代的に行なうこと
により生産される。上記生産方法における機械的処理を
更に具体的に説明すると以下の如くである。（１）二核
菌糸体を液内振盪培養にする際に不活性固体粒状物、例
えば硝子ビーズ等を添加し菌糸体を磨砕する。

（２）二核菌糸体を液内連続培養を行う際に攪拌翼を用
いて菌糸体を剪断しつつ行う。

（３）二核菌糸体を液内培養する際にホモジナイザーを
用いてペレット状菌糸体が外見上認めない−程に菌糸体
を剪断又は磨砕する。

また、一核菌糸体を上述したような条件下で液内培養す
る際、さらに下記のような手法を用いることも可能であ
る。

（１）通常培地（グルコース５％、酵母工キズ０．７５
．％）に対し、１．５〜３倍程度の濃厚状態培地を用い
ることによる富栄養状態を与える。

（２）液内培養の雰囲気を酵素減少状態に保つ。

なお、酵素減少状態とは培養装置を密封状態に保つとか
、窒素ガス、炭酸ガスなどの不活性．ガスを流通せしめ
ることをいうものである。（３）液内培養を液体培地を
補給しながら長期間連続的に行う。上記の各手法を単独
又は適宜組合せることにより、二核菌糸体よソー核菌糸
体を容易に得ることができる。

本発明では前記操作での液内培養を継代することによソ
ー核菌糸体が十分に得られるようになる。なお、培養条
件は２５℃±５℃、日数は３〜１５日である。本発明の
方法で得られたカワラタケ種一核菌糸体はこれを前述の
一核菌糸体が生成する条件の下で培養を継続する時は、
常に同一の状態、性質を保持するものであることが判明
した。

すなわち、前述の方法で得た一核菌糸体は、そのま）一
核菌糸体として継代し、前記第１表記載の一核菌糸体の
性質を保有し続けるものである。この一核菌糸体を平板
培養成は液面培養（静置培養）をすると、気菌糸はつく
り難いが、数ケ月の継代培養により、再度気菌系を生成
するに至る。

この気菌糸は二核菌糸であり、原木に接種し、子実体を
形成せしめたところ、明らかにカワラタケそのものであ
つた。従つて、もとの菌糸体が生成していることが判明
した。以上の点からみて本発明によるカワラタケ種の一
核菌糸体はもとのカワラタケ種の二核菌糸体である二次
菌糸の変異種（Ｍｕｔａｎｔ）であるものと考えられる
。

本発明によるカワラタケ種一核菌糸体は上述の方法によ
り初めて提供せられた新規な菌糸体であり、従つて、カ
ワラタケ種一核菌糸体（ＣＯｒｉＯｌｕｓｖｅｒｓｉｃ
ＯｌＯｒ（Ｆｒ）ＱｕｄｌＧＸ−１０１−３）と命名し
微工研菌寄第３６８６号として受託されているものであ
る。

本発明によるカワラタケ種一核菌糸体の特色は、前記第
１表に示す通りであるが、本菌の産業上の効果はその増
殖速度の大きさである。

すなわち、従来の二核菌糸体に比し、１．５倍乃至１０
＠に達し工業生産上極めて有用てある。また、このカワ
ラタケ種一核菌糸体は従来のカワラタケ種二核菌糸体と
同様の用途に利用することができる。

例えば、その水性媒体（水、希アルカｌ八希酸等）の抽
出物より含窒素多糖体を得ることができ、これは制癌剤
、抗種瘍剤、免疫増進剤、抗ビールス剤、抗カビ剤、抗
ライ剤、食欲増進剤等として利用することができる。又
、低温抽出法等により、プロテアーゼ、アミラーゼ、そ
の他など各種酵素を採取することもできる。

又、そのもの自体又はその抽出物域はその残渣を食品、
嗜好品として使用しうるし、又動物の飼料として、又動
植物一般の肥料等として利用することもできる。以上の
他、従来のカワラタケ菌を用い得る用途にすべて同様に
使用することが可能である。

次に、実施例を例示してさらに具体的に説明する。なお
、各実施例の％は特記しない限り重量で表わす。実施例
１ 一核菌糸体の生産方法： ブドウ糖（昭和産業（株）製）５％と酵母工キズ（極東
製薬工業（株）製）０．７５％を含む液体培地１００ｍ
Ｌを５００ｍ１の三角フラスコに分注し、１２０℃で２
０分ｌ間、オートクレーヴ中で水蒸気殺菌後、ブ下ウ糖
３％、酵母工キズ０．５％を含む液体培地５０ｍ１を用
い２５゜Ｃで２０日間静置培養したカワラタケ菌糸体を
生理的食塩水６０ｍ１と共に６０００ｒ′Ｐｍで３分間
ブレンダーで菌糸苔をほぐし分散させた菌糸体懸濁液を
上記液体培地に１ｍ１植え継ぎ、２５℃で２００ｒｐｍ
の回転速度で振盪培養を開始した。

培養開始後３日目に培養物を２００ｍ１のブレンダーカ
ツプ（佐久間製作所製）に無菌的に移し、ホモミキサー
（佐久間製作所製）によつて、１００００ｒｐｍの速度
で１０分間磨砕した後、直ちに振盪培養を再関し、累積
７日間振盪培養を行なつた。培養を終えたカワラタケ菌
糸体は、嘴状突起がみあたらず、標準寒天平板培地にお
ける気菌糸発生が悪く、本発明者らによる核染色法によ
つて検鏡した結果、一核のみの菌糸体であつた。なおそ
の菌糸体はリトマスミルクを資化せず、ゼラチンの液化
能力を有しなかつた。一核菌糸体の増殖性： 上述のようにして得られた一核菌糸体を２０ｅジヤーフ
アーメンター（協立理工（株）製）でブ下ウ糖５％（商
品名グルシユガー昭和産業（株）製）と酵母工キズ０．
７５％（極東粉末酵母工キズ極東製薬工業（株）製）を
含む液体培地１２ｅを仕込み、２ｋ９１ｄゲージ圧の蒸
気を直接ジヤーフアーメンターに吹き込み、１２０℃で
２吟蒸気殺菌冷却後、一核菌糸体を含む懸濁展を１ｅ植
菌し（接種量は０．５ｙＩｅ）０．５ｖｖｍの通気量と
５５０ｒ′Ｐｍの回転速度で培養を行なつた。

比較検討のため一核菌糸体と全く同一の培養条件で二核
菌糸体の培養も同時に行なつた。その結果、増殖速度を
８ｑＩ′の菌糸体濃度に達する時間をもつて比較すると
、添附図面の第１図に示すように、一核菌糸体は二核菌
糸体の１の培養時間で充分である。また菌糸体の生成量
についても一核菌糸体は二核菌糸体の約２０％増加した
ことが確認された。実施例２ カワラタケを斜面培養して得た菌糸体につき前述の核数
測定を行なつたところ、添附図面で第２図として示した
写真から明らかな様に、その全部が二核菌糸体であり、
一核菌糸体は全く認められなかつた。

したがつて、これは二核菌糸体であると判断される。な
お、この菌はカワラタケ（ＣＯｒｉＯｌｕｓａｖｅｒｓ
ｉｃＯｌＯｒ（Ｆｒ．）Ｑｕｄｌ系統保有番号ＣＭ−１
０１）であり、微工研菌寄第２４１鏝として寄託されて
いる。

５００ｍ１容三角フラスコにブ下ウ糖５％、酵母１キズ
０．７５％を含む液体培地１００ｍ１を加熱殺菌し、こ
れに上記カワラタケニ核菌糸体を白金耳を用いて接種し
、２５℃±２゜Ｃに調節された室で３日間振盪培養した
（前培養）ところ、生成菌糸体はペレット状となつた。

このペレット状菌糸体を含む（培養プロス）をホモブレ
ンダー（佐久間製作所・製）で５分間ホモジナイズして
剪断処理を行なつたところペレット状態はほぼ消失した
。さらに前記条件で培養を続け、４日後（後培養）生成
したペレット状菌糸体を再度５分間ホモジナイズして剪
断処理を行なつた。このときの菌体濃度は１１ｙ１ｅで
あつた。このホモジナイズ処理済菌糸体を含む培養プロ
ス１ｍ１をとり前回と同一の液体培地に加え、前回同様
の条件で第２回目の培養を行なつた。

但し、培養日数のみを前培養３日、後培養３日で行ない
、ほぼ第１回振盪培養同様の菌体濃度であつた。次に、
同様に第３回目培養をさらに継続したが、前培養２日、
後培養３日でほぼ第１回振盪培養同様の菌体濃度に達し
た。

さらに同様に第４回目の培養を行なつたが前培養２眠後
培養２日でほぼ第１回振盪培養以上の菌体濃度である１
２ｙＩ′の培養プロスが得られた。

このときの菌糸体の状態はペレットを生成せず、ホモジ
ナイズ処理をしなくてもバルブ状に分散していた。この
菌体を光学顕微鏡を用いて観察すると、通常の二核菌糸
体で見られる嘴状突起（クランプ）は認められず、二核
菌糸体の約２倍の太さの形態の菌糸体であつた。

この菌糸体を前述の該数測定法により核数を測定したと
ころ、第３図として示した顕微鏡写真から明らかな様に
一核菌糸体が生成していた。

この菌糸体をさらに前回と同様の条件で培養したとき、
増殖生成菌糸は一核細胞よりなる菌糸体であり、前記第
１表中、一核菌糸体の保有する性質をいずれも具えてい
た。ここで生成した一核菌糸体は従来の二核菌糸体と比
較した場合、その増殖速度はほぼ２倍以上となつている
ことが判明した。

上記方法て得た一核菌糸体乾燥物１０ｑを熱水３００℃
で９５〜１００℃、３時間抽出を行なつた。

抽出液を３０′Ｃに迄減圧濃縮後、９０％濃度になる様
に純エタノールを加え、生成する沈澱を乾燥したところ
、灰色粉末０．２ｙを得た。この灰色粉末は化学分析の
結果含窒素高分子量多糖体であることが判明した。

この物質をザルコマー１８０固型を接種したマウスに投
与したところ高い腫瘍抑制率を示した。実施例３ ５００ｍ１容の三角フラスコに直径２〜５ｗｎのガラス
ビーズ８ｙを加えたものにブドウ糖５％、酵母工キズ０
．７５％を含む液体培地１００ｍ１に加えたものを加熱
殺菌し、これに実施例１で接種したと同様にカワラタケ
ニ核菌糸体を白金耳を用いて接種し、２５゜Ｃ±５℃で
７日間振盪培養した。

この生成菌糸体を含む培養プロス１Ｔｎｔをとり、上記
と同様のガラスビーズを加えた培地に加えて植え継ぎ、
さらに６日間第２回目の振盪培養を行なつた。さらにこ
の生成物を継代し、第３回目の振盪培養を５日間行なつ
た。

ここで生成した菌糸体は嘴状突起がなく、もとの二核菌
糸体の約１．５倍の太さを有し、核数測定の結果、一核
菌糸体であることが判明した。

この菌糸済プロス１ｍｔをとり、ガラスビーズを含まな
いブ下ウ糖５％、酵母工キズ０．７５％を含む液体培地
１００ｍ１に接触し２５゜Ｃ±２゜Ｃで培養した結果３
日後生成菌糸体濃度は１０．５ｇ１１であり、二次菌糸
の同様な培養の結果は４日後で７ｙＩ１であつた。実施
例４ ５００ｍ１容三角フラスコにブドウ糖５％、酵母工キズ
０．７５％を含む液体培地１００ｍｔを入れて加熱殺菌
し、これを実施例１て使用したカワラタケニ核菌糸体を
白金耳を用いて接種し、３日間振盪培養した。

ついでホモジナイズ処理し、容器全体をポリエチレン袋
を用いて密封し、外気と遮断してさらに４日間培養を続
けた。培養終了時点で容器雰囲気中にはＣＯ２ガスが５
．０％含まれていた。

この生成菌糸体を含む培養プロス１ｍ１をとり、第１回
同様培地に接種、第１回同様第２回目の振盪培養を行な
つた。

この継代培養をさらに２回繰り返した結果生成培養プロ
ス中に生成したカワラタケ菌糸体は一核であつた。実施
例５ カワラタケを斜面培養して得た菌糸体を採取、前述の核
数測定を行なつたところ、第４図として示した写真から
明らかな様にその全部が二核菌糸体であり、一核菌糸は
全く認められなかつた。

したがつて、これは二次菌糸体であると考えられる。な
お、この菌はカワラタケ（ＣＯｒｉＯｌｕｓｖｅｒｓｉ
ｃＯｌＯｒ（Ｆｒ．）Ｑｕｄｌ系統保有番号ＣＭ−１０
３）であり、微工研菌寄第２４１４号として寄託されて
いる。

５００ｍ１容の三角フラスコにブドウ糖５％、酵母工キ
ズ０．７５％を含む液体培地１００ｍｔを加えたものを
加熱殺菌し、これに上記カワラタケ菌糸体を白金耳を用
いて接種して２５゜Ｃ±２゜Ｃで７日間振盪培養した。

この中にはカワラタケ菌糸体は二核菌糸体であり、１０
．８ｙ１ｅの濃度で含まれていた。このようにして得ら
れた二核菌糸体をブ下ウ糖１０％、酵母工キズ１．５％
溶解した液体培地２０′に０．０１％接種し、２５℃±
２℃に調節された培養槽で５００ｒｐｍの速度でカイ型
攪拌機を使用して深部攪拌培養した。７日後培養液中に
は１０．２ｑＩ′の濃度で菌糸体が生成していた。

この培養ブ七スを２０Ｔｎｔ使用して同一培地に植え継
ぎ、同様条件て第２回目の培養を６日間行なつた。同様
に植え継ぎ培養を行ない、第３回目５日間、第４回目４
日間夫々行なつた。ノ 第４回目培養終了後、培養プロ
スは均一なパルス状であり、１１．５ｙＩｅの濃度で菌
糸体を生成していた。

この菌糸体は嘴状突起がなく、第３図に示すとおソー核
菌糸体であつた。

【図面の簡単な説明】

添附図面の第１図は本発明によるカワラタケ種一核菌糸
体の通気攪拌培養における増殖曲線を二核菌糸体との比
較において示したものであり、第２図ならびに第４図は
カワラタケを斜面培養して得られる二核菌糸体の顕微鏡
写真を、第３図は本発明によるカワラタケ種一核菌糸体
の顕微鏡写真を夫々示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カワラタケ種（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏ
   ｌｏｒ（Ｆｒ．）Ｑｕ■１）の二核菌糸体を、それに剪
   断作用又は磨砕作用を示す機械的処理を施すか又は施し
   ながら液内培養する操作を継代的に繰り返し行なうこと
   を特徴とするカワラタケ種の新規な一核菌糸体の生産方
   法。 ２ 機械的処理がホモジナイザーを用いた剪断又は磨砕
   作用によるものである特許請求の範囲第１項記載の生産
   方法。 ３ 機械的処理が攪拌機を用いた磨砕は又は剪断作用に
   よるものである特許請求の範囲第１項記載の生産方法。 ４ 機械的処理が不活性固体粒状物を用いた磨砕作用に
   よるものである特許請求の範囲第１項記載の生産方法。
   ５ 液内培養を高濃度の液体培地を使用した富栄養化の
   状態で行う特許請求の範囲第１項乃至第４項記載の生産
   方法。６ 液内培養を酸素欠乏の雰囲気で行う特許請求
   の範囲第１項乃至第５項記載の生産方法。 ７ 液内培養を液体培地を補給しながら長期間連続的に
   行う特許請求の範囲第１項乃至第６項記載の生産方法。 ８ 不活性固体粒状物が硝子ビーズである特許請求の範
   囲第４項記載の生産方法。