JPS6043382A - 固定化微生物およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生化学反応に使用される酵素を含む微生物を
、セラミックハニカム構造の触媒に固定化した固定化微
生物およびそのａ＋！！造法に関するものである。

近来、微生物を用いた生化学反応は急速に発達し、有機
合成、食品工業、分析化学等の分野に広、く利用される
ようになった。これらの生化学反応１に使用される酵素
を含む微生物の固定化法として、水に不溶性のビーズ状
、ベレット状の各種担体に酵素を含む微生物を共有結合
させる共有結合法、２個またはそれ以上の官能基をもっ
たグルタルア。

ルデヒド、ビスジアゾベンジジン等の架橋試薬を用いて
担体に微生物を架橋する架橋法、あるいは、ポリアクリ
ルアミド、デンプン、カラギーナン等の高分子のゲル格
子の中に微生物を包み込むか半透膜性の高分子皮膜で微
生物を被覆するいわゆる１・包括法等が知られている。

しかし、共有結合法や架橋法は固定化によって微生物の
性質が変化し活性低下が大きい等の欠点があり、また包
括法は包括調整時での微生物の活性低下に問題点がある
。微生物を付着固定化した１固定化微生物の形状として
は、前述のビーズ状、ペレット状のほかにサイコロ状、
膜状等がある。

しかし、このような形状では、例えば、酵素反応として
よく知られているデンプンの糖化反応において、高濃度
で粘度が大きいデンプン液を基質に一通した場合、圧力
損失の増大、固形物による流路□の閉塞等の問題が生じ
る。また、酵母によるアルコール発酵、メタン生成菌に
よるメタン発酵等においては、反応中にガスが発生する
ため、充填床の一部にガスが蓄積して充填床が閉塞しや
すく、ガス発生に伴いゲル粒子にせん断力が加わり粒子
の損傷が起きる等の欠点があった。

本発明の目的は、活性低下が小さく付着強度の強い固定
化微生物およびその製造法を提供することにある。また
本発明の目的は、圧力損失や閉塞１・・の問題を解消す
ると共に、ガス発生を伴う場合はガスの散出を容易にし
、しかも反応物との接触面積の大きい固定化微生物およ
びその製造法を提供することにある。

本発明は、多糖類物質と酵素を含む微生物との・混合物
を、酵素を含む微生物を多糖類物質中に包括した形態で
、複数の平行な貫通孔を有するセラミックハニカム構造
体のセル壁面上に付着固定化した固定化微生物を特徴と
する。

また本発明は、多糖類物質と酵素を含む微生物、。

との混合物をゲル状液とし、このゲル状混合物を１複数
の平行な貫通孔を有するセラミックハニカム構造体のセ
ル壁面上に付着し、次いで、この構造体を同化用溶液と
接触させて、ゲル状混合物を固化し、酵素を含む微生物
を多糖類物質中に包括し・た形態でセル壁面上に付着固
定化する固定化微生物の製造法にある。

本発明に使用する多糖類物質は寒天、カッパーカラギー
ナン、アルギンＰＩＩ塩等である。また、本発明に適用
できる微生物、並びに微生物内に含ま１１・れる酵素に
ついては特に制限されるものではないが、例えば微生物
としては細菌類、放射菌類、カビ類、酵母菌類等があり
、また酵素としてはグルコアミラーゼ、アミノアシダー
ゼ、グルコースイソメラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
セルラーゼζ。

インベルターゼ、アスパラギナーゼ、アスパルターゼ、
カタラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リシンデカルボ
キシラーゼ、ヘキソキナーゼ、トリプトファンシンター
ゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ等があげられる。

本発明に使用するセラミックハニカム構造体はアルミナ
、ムライト、−一ジエライト等のセラミック質から成る
。これはセラミックハニカム構造体が酵素を含む微生物
の固定化に最適の表面状」熊を有するとともに、接触面
積が大きく確保でき、かつ圧損が小さい利点を有するか
らである。このセラミックハニカム構造体のセル開口長
さは２１１１１１１〜１０關、好ましくは３　ｍｍ−７
ｍである。セル開口長さが２ｍに満たないと、ゲル状混
合物の付着が容易かつ均一にならず、また流路が閉塞さ
れて１圧力損失が急激に増大することがあり、逆にセル
開口長さが１０鰭より大きくなると、機械的強度が小さ
くなると共に反応に必要なハニカム４１１造体の占める
容積が大きくなり過ぎる欠点が生じる。

この構造体のセル壁面は、ゲル状混合物の付着強。

度を上げるため、表面粗さを１０μｍ〜１００μｍ好ま
しくは８０μｍ〜７０μｍに調整する。表面粗さが１０
μｍより小さいとゲル状混合物がはがれ易く、また１０
０μｍより大きいと機械的強度が小さくなる。好ましい
表面粗さ全書るには、１例、。

として、押出し成形によるセラミックハニカム構１造体
のセル壁面上に、粒径２００μｍ〜１０００μｍのセラ
ミック粒子粉末を付着した後、焼成して固着させる。セ
ラミックハニカム構造体の四通孔は、閉塞の問題を避け
るため平行に、また接触面積を。

大きくするため多数設けることが好ましい。貫通孔は、
例えば５０闘角のセラミックハニカム構造体に５０〜５
００個程ｔヶである。

多糖類物質と酵素を含む微生物との混合物はゲル状液に
する。この理由は、ゲル格子の中に微生１１薯物を包み
込むためである。ゲル状液を得るには、混合する物質の
種類・性質により異なるが、液温を例えば３０°Ｃ〜？
０°Ｃに保持する。酵素を含む１敞生物を名糖類物質中
に包括した理由は、多糖類物質が酵素を含む微生物の栄
養源となるとともに、。

酵素活性の低下が少ない為である。

ゲル状液をセラミックハニカム構造体のセル壁面上に付
着させる。この場合付着は噴霧法、流入法等でもよいが
、浸漬法が最もよい。そして、例えばゲル状液にセラミ
ックハニカム構造体を浸漬、。

する時間は使用するゲル状液によるが約８０秒がら１０
分間程度である。ゲル状液から取出したセラミックハニ
カム構造体に付着したゲルを、圧縮空気等により余分な
ものを吹き飛ばして、任意の膜厚にする。このセル壁面
上へのゲル状物質の付着膜厚は、後の生化学反応を行う
際に必要な酵素量を得るため、１００μｍ−１０００μ
ｍを必要とする。従って、この膜厚は、反応に必要な酵
素量から任意に設定する。

セラミックハニカム構造体のセル壁面上に付着したゲル
状混合物を固化させるには、冷水、ＫＣノ溶液、０ａＯ
ｊｓ溶液、Ａｌ０Ｉ８溶液、グルタルアルデヒド溶液、
ヘキサメチレンジアミン溶液、Ａｊ　２　（Ｓ　Ｏ４）
　ａ溶液等の中に浸漬し同化用溶液とこの構造体を接触
させる。これによりセラミックハニカム構造体のセル壁
面に多糖類物質中に包括された形態で微生物が付着固定
化される。同化用溶液と接触させる時間は３０秒から１
０分間程度でよい。この時間は、多糖類物質の導度とセ
ラミックハニカム構造体のセル開口長さ等により任意に
選択実施できる。

このようにして得られた固定化微生物は、多糖類物質中
に包括された形態で、セル壁面上にほぼ一定の厚みで膜
状に付着しているので、機械的強度が’１ｉｆｊ　＜　
、高粘性液を使用する反応系、あるいはガス発生を伴う
反応系においても、長期に安定して連続的に使用できる
。

以下、本発明を実施例により説明する。

−実ＪＥ例すュ 多糖類物質として、第１表に記載する寒天、カッパーカ
ラギーナン、およびアルギン酸ナトリウムを用意し、各
８重ｈ１％濃度となるように水に溶かした。酵素を含む
微生物として、加水分解酵素β−ガラクトシダーゼを含
む大腸菌ニスチェリチア・コリＥ１０６を水に溶かし、
菌体懸濁液を５重Ｉ！ｔ％濃度に調整した。この菌体懸
濁液１０ｍｊ！を採取し、９倍量の各多糖類物質の水溶
液に添加し、多糖類物質と、酵素を含む微生物との、混
合物を調整した。

多糖類物質が寒天の場合、混合物を湿度５５℃に保持し
てゲル状液とした後、このゲル状液中にアルミナ質のセ
ラミックハニカム構造体を６０秒間浸漬し、この構造体
のセル壁面上にゲル状混合物を付着膜せた。この構造体
は第１表に記載する表面粗さおよびセル開口長さを有す
る。ぞの後、圧縮空気で付着した余分のゲル状混合物を
吹き飛ばし、第１表に記載する付着膜厚に調整した。次
いで、３°Ｃに保持した冷水から成る同化用溶液中に２
分間浸漬して、ゲル状混合物をセラミックハニカム構造
体のセル壁面上に付着固定化した。

また多糖類物質がカッパーカラギーナンの場合、混合物
を温度８７℃に保持して、寒天の場合と同様に、ゲル状
液とした後このゲル状液中にセラミックハニカム構造体
を浸漬し、この構造体のセル壁面上にゲル状混合物を付
着させた。次いで、圧・縮空気で付着膜厚を調整後、２
重量％の環化カリウム溶液から成る固化用溶液中に浸漬
して、ゲル状混合物をセル壁面上に付着固定化した。

更に多糖類物質がアルギン酸す）　ＩＪウムの場合、前
記のカッパーカラギーナンの場合と同様な操作を行い、
固化用溶液として０．４モル濃度の塩化カルシウム溶液
を用いて、ゲル状混合物をセル壁面上に付着固定化した
。

このように酵素を含む微生物を多糖類物質中に包括した
形態で、セラミックハニカム構造体のセル壁面上に付着
固定化した本発明の固定化微生物Ａ１−漸１９について
、それぞれ酵素活性を測定した。なお、比較のため、多
糖類物質以外の高分子物質、ポリアクリルアミド、コラ
ーゲン、ポリビニルアルコールについても、同梯に実施
し、参考例扁２０〜Ａ２２として、それぞれ酵素活性を
測定した。酵素活性の測定には、基質として乳糖類似物
質である２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シドを採用した。この物質は、β−ガラクトシダーゼに
よって０−ニトロフェノールとガラクトースに分解する
ので、０−ニトロフェノールの生成量を４２０１ｍの吸
光麿で計測することにより、酵素活性を定量・シた。

結束を第１表に示す。

なお、セラミックハニカム構造体は５０關の立自方形状
のものを使用し、反応には攪拌槽型反応器を使用した。

セラミックハニカム構造体の表面粗さを大きくして付着
力を向上させるため、押出成形により得られた表面平滑
なセラミックハニカム構造体のセル壁面に、第１表に記
載する粒径のアルミナ質セラミック粒子粉末を付着焼成
して固着させた。なお、単位菌体量当りの酵素活性ＩＵ
（ユニット）は１マイクロモルの基質を１分間に変化さ
せる活性単位である。

第１表から、本発明の固定化微生物は、参考例に比較し
て、単位菌体量当りの酵素活性が優れていることが認め
られる。

実施例２ この実施例では、本発明のハニカム形状の固定。

化微生物と、従来公知のビーズ状固定化微生物との特性
を比較する実験をした。

酵素としてグルコースイソメラーゼを含む放線菌ストレ
プトミセス・フエオクロモゲネスを水に溶かして５重量
％濃度の菌体懸濁液を用意した。。

この懸濁液１０　ｍ／と、８．５重量％濃麻のカッパー
カラギーナン水溶液７０ｍ１とを混合した。この混合物
を２重量％濃度の塩化カリウム水溶液に滴下して、平均
直径０．４０ｍの既知のビーズ状固定化微生物を作成し
た。

次に、同じ混合物を用い、実施例１と同様に温度８７°
Ｃに保持してゲル状液とした後、このゲル状液中にアル
ミナ質のセラミックハニカム構ａ体を６０秒間浸漬し、
セル壁面に付着膜厚８００μｍのゲル状混合物を付着さ
せた。用いたセラミックハニカム構造体はセル開口長さ
が５ｍｍ、セル壁面の表面粗さが５０μｍで、大きさが
５０πｍ角であった。この後、２重量％濃度の塩化カリ
ウム水溶液中に３分間浸漬してゲル状混合物を固定化し
、本発明の固定化微生物を作成した。

このようにして得られた各固定化微生物を、５０ｍｍ角
で２００朋長さの管型反応器に充填し、グルコースイソ
メラーゼの酵素活性および充填床の圧力損失を測定した
。酵素活性の測定には、高速液体クロマトグラフィーを
用いて、生成するフルクトースを定量した。なお、基質
のグルコースの重匿は１ｍ１１分であった。

結果を第２表に示す。

第　２　表 第２表の結果から明らかなように、本発明の固定化微生
物は従来の固定化微生物に比較して、圧力損失が小さく
、酵素活性においても優れていることが認められた。

実施例８ 酵母サツカロミセス・セレビシェの３０％懸濁液と８重
量％アルギン酸ソーダ水溶液とを、温度４０℃にて混合
しゲル状液とした。この液中にセル開口長さが５ｍｍ、
セル壁面の表面粗さが５０μｍで大きさが５０闘角のム
ライト質セラミックハニ１カム構造体を浸漬する。次い
で、付着ゲルを圧縮空気により吹き払い付着膜厚を２０
０μｍとした後、硫酸アルミニウム３重量％溶液中に２
分間浸漬してゲル状混合物を固定化し、本発明のハニ力
−１ム状固定化微生物を得た。

次に、前記と同じゲル状混合物を用い、硫酸アルミニウ
ム８重量％溶液中に滴下し、平均直径・ｏ、ａ　ａｍの
ビーズ状固定化微生物（従来品）を作成した。

このようにして得られた各固定化微生物を、実施例２と
同じ大きさの管型反応器に充填し、反応器下部から０．
０１重＠％の硫酸アルミニウムを含む１５重量％のグル
コース水溶液を送入して、酵母菌によるエタノール発酵
を行い、反応器出口でのエタノール生成濃変を比較測定
した。

結果を第８表に示す。

第　８　表 第８表の結果から明らかなように、本発明品よりも従来
品の方がエタノール化ｒ＆−，６度が小さい。

これは、従来品のビーズ状固定化微生物の場合、反応中
に発生するＣＯ，ガス気泡により反応床の一部に００．
ガスが蓄積して反応液が乱れ、逆混合も発生するからで
ある。本発明品の場合、このような現象は見られなかっ
た。

以上、本発明による固定化微生物は、従来の固定化微生
物に比較して、酵素を含む微生物を多糖類物質中に包括
した形態で、ハニカム構造体のセル壁面上に膜状に付着
固定化した結果、次の効果を有する。

１、ゲル状混合物をセル壁面上に付着固定化したので機
械的強度が大きく活性低下が少ない。

２、平行な貫通孔を有するハニカム構造のため、従来の
ビーズ状、ペレット状等の固定化微生物に比べ、固形物
による流路の閉塞が少なく、圧力損失が小さい。

８、反応中にガスが発生する酵素反応あるいは微生物反
応においても、発生ガスは貫通孔内を通って容易に上昇
散出するので、反応液の乱れ、逆混合の発生が少ない。

４接触面積が大きく、酵素活性にも優れている。

従って、本発明によれば、各種の酵素反応に有効に利用
でき、特に反応中にガスの発生が多いアルコール発酵、
メタン発酵等の発酵分野や、基質が高粘性であるデンプ
ンの糖化反応等、あらゆる微生物反応に利用することが
できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　多糖類物質と酵素を含む微生物との混合物を、酵素
   を含む微生物を多糖類物質中に包括した形態で、複数の
   平行な貫通孔を有するセラミックハニカム構造体のセル
   壁面上に付着固定化した固定化微生物。 区　多糖類物質が寒天、カッパーカラギーナン、アルギ
   ン酸塩のうちいずれか１種である特許、、。 請求の範囲第１項記載の固定化微生物。 ＆　多糖類物質と酵素を含む微生物との混合物をゲル状
   液とし、このゲル状混合物に複数の平行な貫通孔を有す
   るセラミックハニカム構造体のセル壁面」二に付着し、
   次いでこの構ｉ；ｊｊ　。 体を同化用溶液と接触させてゲル状混合物を固化し、酵
   素を含む微生物を多糖類物質中に包括した形態でセラミ
   ックハニカム構造体のセル壁面上に付着固定化する固定
   化微生物の製造法。 生　セラミックハニカム構造４造体のセル壁面の表面粗
   さが１０μｍ〜１０（１μｍである特許請求の範囲第８
   項記載の固定化微生物の製造法。 五　表面粗さを、粒径２００μｍ〜１０００μｍのセラ
   ミック粒子粉末をセル壁面上にイ」着することにより調
   整する特許請求の範囲第４・項記載の固定化微生物の製
   造法。 ａ　セル壁面上にゲル状混合物を１００μｍ〜１０００
   μｍの厚さに付着固定化する特許請求の範囲第３項記載
   の固定化微生物の製造法。 ７、　セラミックハニカム構造体のセル開口長さが２龍
   〜１０關である特許請求の範囲第８項記載の固定化微生
   物の製造法。