JPS6043383A - 環状ｄνａの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高等動物または高等植物に存在する染色体外環
状ＤＮＡの調製方法に関するものである。

近年１高等動物１高等植物の真核生物の分子生物学の発
展進歩は目覚しいものがあり１特に高等生物の分化、発
癌機構が遺伝子のレベルで盛んに研究されている。これ
らの研究の過程で１従来原核生物のみに存在するといわ
れていた環状ＤＮＡ１− が多くの真核生物に存在することが見出された。

すなわち１９７２年スミスおよびビッグラドによリヒー
ラ細胞に１環状ＤＮＡが存在することが報告されて以来
Ｎ　１９７６年スタンフィールドおよびヘリンスキーら
によってショウジョウノく工の環状ＤＮＡが存在するこ
とが示され、それに関する広範な研究が報告されている
。更にデラツブら１ｔ１９７８年アフリカン・グリーン
・モンキーの腎細胞にも環状ＤＨｋが存在することを明
らかにしている。その後１マウス胸腺細胞やコムギにも
見出されている。

そのような環状ＤＮＡは動物１植物を問わず、染色体外
に環状で存在し、その塩基配列はＩＫｂないし敵方Ｋｌ
）のものであり１その中に一定の塩基配列のくりかえし
を多数分散して含んでいるものである。ラット、コムギ
ではそれぞれ１０００塩基対の細胞質因子であり、自己
複製可能なものである。これは細胞分装１細飽分化の段
階の如何を問わず常に存在し１分化しつつある細胞で産
生される環状ＤＮＡは３０００塩基から３０，０００塩
基対におよぶものもある。

このような真核生物の環状Ｔ）ＮＡは為細胞分裂周期と
同調せずにおこる複製の結果、産生されるものもあり１
染色体内ＤＮＡ組挟え結果１切り出されるものもある。

また一部には遺伝子増巾の結果、産生されるものもある
と考えられている。この環状Ｉ）ＮＡは種々の遺伝制御
現象に関与する働きをするといわれているが１その機構
について為いずれも不明な点が多い。ただ、これらの環
状ＤＮＡは高等動物１植物の分化１動物細胞の腫瘍化機
構および老化の現象と深くかかわりあっている可能性が
強く、今後の研究の発展が期待されている。しかしなが
ら、これらの環状Ｉ）ＨＡは染色体ＤＮＡに比べて微量
であり抽出１稍製が煩雑で研究上解決されるべき問題と
考えられていた。原核生物に見出されるプラスミドなど
の環状ＤＮＡの抽出精製はよく研究され、基本的な操作
はすでに確立されている。すなわち細胞の細胞壁をリゾ
チームで破壊した後１界面活性剤で穏やかに菌を溶かし
てプラスミド、ポリゾーム１可溶性タンパク質、ｔ−Ｒ
ＮＡなど、細胞質内の物質を溶出させ１染色体ＤＮＡを
細胞の残渣に付着させたまま遠心分離を行なう。

次に粗細胞抽出上澄液をフエ７−ルで処理し除蛋白を行
ない、それから環状二本鎖ＤＮＡを分離精製するもので
ある。実際には各段階で種々の方法が考案されている。

例えば原核生物の場合１上澄液甲の宿主細胞のＤＮＡの
混在は少量で１通常エチジウムプロミドを含む塩化セシ
ウム密度勾配遠心法で除去され、精製環状二本鎖を得る
ことができる。しかしながら１真核生物の環状ＤＮＡは
細胞内にある全ＤＮＡ中１極めて少量（＜　ｏ、ｏｇ％
）で１大部分が直鎮状−重鎖ＤＮＡおよび直鎖状二本鎖
ＤＮＡであり、原核生物の場合のように、環状ＤＮＡの
分離１精製は簡単でなく１真核生物の場合、これまでは
上澄液をアルカリ変性−再生ニトロセルロースカラムク
ロマトグラフィーを行なった後１エチジウムプロミドを
含む塩化セシウム密度勾配遠心法を繰返し行なう方法が
従来の方法である。しかし１この分ＭＳ精製方法はＤＮ
Ａの損傷を生じやすいアルカリ変性−再生のプロセスや
高価な塩化セシウムを使用する超遠心分離の繰返しのプ
ロセスがあるため１純度〜収瀘が悪いうえ１費用や時間
がかかり過ぎるなど１種々の欠点が認められる。例えば
アフリカン・グリーン・モンキーの腎細胞のＢ５０−１
株から小環状のＤＮＡが精製され％　ｐＢ１３２ｇにク
ローン化された報告が発表されている。この報告では精
製された環状ＤＮＡは１，５　Ｋ　ｂ　、　１．２　Ｋ
　ｂ　、　０，８　Ｋ　ｂ　（ＤＤＮｋで１．５　Ｋ　
’ｂ以上のＤＮＡは精製されていない。これは精製工程
中のアルカリ変性−再生で大きな閉環状ＤＮＡが開環状
ＤＮＡに変えられ、これがエチジウムプロミドを含む塩
化セシウム密度勾配遠心法で失われたために、ｌ、５Ｋ
ｂ以下の小さなりＮＡのみが精製されたとの疑いがもた
れる。しかし１アルカリ変性−再生のプロセスなしでは
１小さな二本鎖ＤＨｋ断片の夾雑は避けられず、不満足
ながら上記の方法が一般的に７Ｖｍ状ＤＮＡの分離、精
製に使われており、それに代わる効果的な分離〜精製方
法の確立が望まれていた。

５一 本発明者等は高等動物−植物の細胞内環状ＤＮＡの機能
産生機構の研究牛馬環状ＤＮＡの分離１精製において１
特異的な核酸分解酵素１即ち直鎖状ＤＮＡを消化し１濃
状ＤＮＡに作用しない酵素の利用とイオン交換樹脂を使
用するカラムクロマトグラフィーの手法の組合せにより
Ｘ環状ＤＮＡの大磁精製方法を確立することに成功した
。

すなわち本発明は高等動物または高等植物に存在する染
色体外環状ＤＮＡおよび直鎖状一本鎖ＤＮＡおよび直鎖
状二本鎖ＤＮＡを含む粗細胞抽出上澄液から直鎖状一本
［ＤＮＡを除去し１次いでＡＴＰ依存核酸分解酵素処理
を行ない）直鎮状二本ｔａＤＮｈを消化し、低分子化す
ることにより、７Ｖ環状ＤＮＡｔ−調製することを特徴
とする小環状ＤＮＡの調製方法である。

従来１原核生物のプラスミド等の環状ＤＮＡの分Ｍ１精
製にはＡＴＰ依存核酸分解酵素を利用して、細胞が含む
ＤＮＡの大部分を分解）消化した後に、残った環状二本
鎖ＤＮＡを密度勾配法で分離することはすでに知られて
いることである（プロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ第７０巻第１
０号第８８８４〜２８８７頁％　１９７３年）。真核生
物の環状ＤＮＡの単離−精製においても蔦原核生物と同
様な方法で調製した粗細胞抽出上澄液に含まれる宿主由
来の直鎖Ｉ）ＮＡ　（＞ｅ　５％）を酵素消化すること
により、）環状ＤＮＡが容易に精製されると推察できる
。ところが１真核生物由来の粗細胞抽出上澄液中に含ま
れるｗ、鎖状ＤＮＡに酵素処理を施し分解を試みたが１
予想に反して分解が進行しないことが判明した。すなわ
ち真核生物の粗細胞抽出上澄液には酵素反応を阻害する
因子があり、このままでは環状ＤＮＡの調製にＡＴＰ依
存核酸分解酵素を適用出来ないことが見出された。本発
明に用いるＡ’ｆ’Ｐ依存核酸分解酵素は直鎖状一本＃
ＤＮＡに対する分解速度が直鎖状二本鎖ＤｌｉＡのそれ
に比べて、極めて遅く１また分解には遂−的に進行する
ことから１直鎖状−重鎖ＤＮＡは直鎖状二本鎖ＤＮＡの
分解に対して拮抗的阻害剤として作用することが明らか
となった。

本発明に用いるＡＴＰ依存核酸分解酵素の性質Ｓ を示す例として１直鎖状−重鎖（以下を中と略す）ＤＮ
Ａによる阻害をバクテリアプラスミドの系で説明する。

閉環状（以下）冶と略する）ｐ刀Ｒ３２，２ＤＩＪＡと
制限酵素Ｉｆ！ｏ　ｏＲ工で切断した直鎖状二本鎖（以
下ｄａと略す）ＰＢＲ３２２ＤＮＡとこれを熱処理し〜
急冷して調製した５ｓｐＢＲ３２２ＤＮＡを混合し、こ
れを対照とした。これを対照として、５ｓＤＮＡが存在
する条件を存在しない条件下で本発明の酵素を過剰に作
用させた。アガロース電気泳動ではｄｓＤＮＡがほとん
ど認められない程、分解した後（１，５μｆ　ＤＮＡに
対し、６単位、１時間）Ｓ１！子顕微鏡で対照区（ｓｓ
ＤＮＡ存在）と試験区（ｓｓＤＮＡ非存在）全存在ぞれ
観察した。ａｓＤＮＡが存在する場合１酵素処理後の分
解物では５ｏｏｐＢＲ３，１！２ＤＮＡ　は５４％を占
め、対照よりその比率を増加しているものの、まだ未分
解のｄｓｐＢＲ３２２ＤＮＡ　や分解時に産生されるａ
ｓｐＢＲ３２ｇＤＭＡが残存していた。他方、５ａｐＢ
Ｒ３１２１１！Ｄ　Ｎ　Ａがほぼ完全に分解されている
ことが観察された。その観察結果を第１表に示す。

以上の観察結果より％　ａｓＤＮＡがｃｌ　ｓ　ＤＮＡ
の分解を阻害することが明白であり１真核生物のｏｏＤ
ＭＡの調製においては１粗細胞抽出上澄液に含まれるｅ
ｓＤＮＡを除去した後１本発明のＡＴＰ依存核酸分解酵
素を作用させると効果的に（１８ＤＮＡを消化する。

本発明では真核生物１すなわち高等動物または高等植物
に存在する染色体外環状Ｄ　Ｉｉ　Ａ　（Ｑ　Ｑ　ＤＮ
Ａ　）％５ｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡを含む粗細胞抽出
上澄液９− に含まれるａｓＤＮＡをイオン交換カラムクロマトグラ
フィー等の適当な手段で除去した後１該上澄液にＡ、　
Ｔ　Ｐ依存核酸分解酵素を作用させ５）ａＤＮＡを完全
に分解することにより飄・ＯＤ　Ｎ　Ａ　ｔｔ　１４製
する。

次に具体的に本発明を説明する。真核生物の環状ＤＮＡ
　（ａｃＤＮＡ　）の調製においては１１通常細胞ヲ約
ｌＯ％前後のシュクロースと３０製ＭＩＤＴＡ２−ナト
リウム塩を含む５０１１Ｍ）リス塩酸（￥Ｉｉａ、ｏ）
に懸濁した後％）リドンＸ−１００やザルコシルＮ−３
０などの界面活性剤を加えて細胞を溶かす。この粗細胞
溶解液を超遠心分離を行ない粗細胞抽出上澄液を得る。

この上澄液には微量の環状ＤＮＡ（ｏｏＤＮＡ）と宿主
ＤＮＡの断片や一本鎖ＤＭＡを含んでいる。この粗細胞
抽出上澄液に人ＴＦ依存核酸分解酵素を作用させても、
前述した如く入直鎮状ＤＮＡを分解しない。本発明では
例えばイオンクロマトグラフィーを用いて高濃度に存在
する５ａＤＮＡを除去した後、ＡＴＰ依存核酸分解酵素
を作用させ、効率よく直鎖状ＤＮＡを分解させる。

本発明において粗細胞抽出上澄液がら５ｓＤＮＡを除去
するイオン交換樹脂としては蔦ニトロセルロース１ヒド
ロキシアパタイト等を列挙できるが、これらに限定され
るものではない。

本発明に用いるＡＴＰ依存核酸分解酵素は８８ＤＭＡお
よび６ｓＤＮＡにのみ作用し、ｃｏＤＮＡに作用しない
性質を有する。該酵素はミクロコツカス　ルテウス（Ｍ
ｉｃｒｏｏｏｏｏｕｓ　１ｕｔ＠ｕｓ　）Ｘエシエヒリ
ア　コリ（ｌ１ｓｏｈｅｒｉｃｈｉａ　ｏｏｌｉ　）Ｘ
バチルス　サブチリス（Ｂａｏｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉ
ｌｉｓ　）　、バチルス　セレウス（Ｂａｏｉｌｌｕａ
　ａｅｒｅｕａ　）　％デイプロコッ力スニュモニア（
Ｄｉｐｌｏｃｏｏｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　）　Ｘ
ミコバクテリウム　スメガティス（Ｍｙｏｏｂａｏｔｅ
ｒｉｕｍｓｍｓｇａｔｉｓ　）、ヘモファイルス　イン
フルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｇ　１ｎｆｌｕｅｎ
ｚａｓ　）％シュードモナスエアルギノーサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａａ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）等が産生ず
るものが知られているが、本発明に使用される酵素はこ
れらの起源に限定されることはない。

以上の説明の如く、本発明では５ｓＤＮＡを除去する手
ｆｆ（、例えばニトロセルロース１ヒドロキシアパタイ
ト等を利用するイオン交換捕脂カラムクで精度に難点の
あった従来法に比べて１短時間で極めて簡単に迅速に環
状ＤＮＡの調製が行なわれる。

以下１実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例　１゜ ４週令のマウス１２０匹より胸腺を採取し、５０ｍ１　
Ｍ　）　ＩＪ　ス塩酸（Ｉ■ａ、ｏ　）−ｙ、ｓ５Ｗ／
Ｖ％シュクロース−３０冒ＭＩＨＩＤＴＡＢ−ナトリウ
ム塩を懸濁した。これにトリトンＸ−１００とザルコシ
ルＮ−３０を加えて最終濃度をそれぞれ２％、１％とな
るようにした。１０分間氷水にて放置した後１超遠心分
子ｉ　（４８０００Ｘ　（ｋ　）を４℃でｇｏ分間行な
い、粗細胞抽出上澄液を得た。これをエチジウムプロミ
ドを含む塩化セシウム密度勾配遠心法で平衡になるまで
超遠心分離を行なった（１５０，０００Ｇ、１０時間）
。

環状ＤＮＡ（ｃｏＤＮＡ）を含む両分を集めて、色素を
塩化セシウムで飽和させたイソプロピルアルコールで抽
出し、Ｏ，１Ｍリン酸カリウム緩衝液（田６．８　）　
−５＠　Ｍ　Ｉ　Ｉ）　Ｔ　Ａ　ｆｆ１−ナトリウム塩
で透析した。透析後１濃縮して０．Ｉｓ　Ｍ　ＫＯＩ　
−０，０１Ｍトリス塩酸緩衝液（田７．３）で緩衝化し
たニトロセルロースカラム（ｏ、５ｍ）＜４ｃｍ）に吸
着させた。

ｄａＤＮＡはほとんど吸着されなかったが１変性したＤ
ＭＡ（２０％）は吸着された。ｓ　ｓ　ＤｌｉＡを除去
した両分（ボイドフラクション）を集めてキャリヤーＤ
ＮＡとして酵母のＲＮＡ　３００μｍを加えて後、エタ
ノール沈澱を行なった。次いで沈澱をｌＡ４０μノの水
溶液とした。

この水溶液に３０１１Ｍ塩化マグネシウムおよび８．３
ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む６６’１１１Ｍグ
リシンー苛性ソーダ（田８．５）を３０μノと５　ｍ　
Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐを３０μ！加えて後、ＡＴＰ依存核酸分
解酵素１８単位を加えて、３７℃、１時間消化させた。

消化後１消化物の成子顕微鏡観察を行なった◎その結果
を第２表に示す。

１３− 同様に粗細胞抽出上澄液をニトロセルロースカラムクロ
マトグラフィーを行なわないで％ＡＴＰ依存核酸分解酵
素処理を行なった後１電子顕微鏡による観察を行なった
。その結果を第２表に示す。

第　２　表 ニトロセルロース処理を行なった粗細胞抽出上澄液の酵
素消化液に１更にニトロセルレースカラムクロマトグラ
フィーを行なうとｃｏＤＮＡが除去され１９６％の純度
の環状ＤＮＡが得られた。

ニトロセルロース処理を行なわなかった粗細胞抽出上澄
液の酵素消化液を更にニトロセルロースカラムクロマト
グラフィーを行なうと、２９％の純度の環状ＤＭＡしか
得られなかった。

−１１，＝ 実施例　２ 実施例１で得た粗細胞抽出上澄液をエチジウムプロミド
を含む塩化セシウム密度勾配遠心分離を行なった。ｃ　
ｏ　ＤＩｉＡを含む両分を集めて色素を塩化セシウムで
飽和させたイソプロピルアルコールで抽出した後、０゜
２４　Ｍリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，８）で透析した
。次いで０゜２４　Ｍリン酸ソーダ緩衝液（ｍ６．８）
で緩衝化したヒドロキシアパタイトカラムクロマト（０
゜５３　Ｘ　ｌ　５　（”　）に吸着させた。

粗細胞抽出上澄液に含まれているａａＤＮＡは吸着され
ず通過した。０゜ａ４Ｍ’）ン酸ソーダ緩衝液（ＩＩＨ
６，８）でよく洗った後１０゜３Ｍリン酸ソーダ緩衝液
で溶出し１溶出液に酵母のＲ１１Ａ　３００μｐを加え
てエタノール沈澱を行なった。沈殿物を８０％エタノー
ルでよく洗浄した後１乾燥し１２４０μノの５０＋ｇＭ
）リス塩酸（田８．０）で溶解させてから、実施例１と
同様にＡＴＰ依存核酸分解酵素１８単位を加えて反応さ
せた。反応液の一部を取りＳ電子顕微鏡による観察を行
なった。その結果を第３表に示す。

第　３　表 実施例１と同様に％（１８ＤＮＡが分解されてａａＤＮ
Ａの比率が８５．５％に増加した。

実施例　＆ ヒーラ細胞の組織培養液をトリプシン処理後１遠心分［
（６００Ｘ＃　４−１５分間）を行ない１５×１０１セ
ル（ｃｅｌｌ　）を得た。セルペレットを５０ｍ１　Ｍ
　）　ＩＪ　Ｘ塩酸（ｐＨｓ、ｏ）、７．３５　Ｗ／ｖ
％シュクロース−３Ｏ講Ｍ］１ｉＤＴＡ２−ナトリウム
塩にＭ７１１ｉ！し、ｌ−当り４ＸＩＯ’セルの濃度と
した。これにトリトンＸ−１００およびザルコシルＮ−
３０を加えて抽出し１氷水中で１０分間放置した後１４
８、ＯＯＯ×ｆで２０分、４℃で遠心分離した。

上澄液を実施例１と同様にエチジウムプロミドを含む塩
化セシウム密度勾配超遠心分ＩＩ　（ａｏ、ｏｏ。

Ｘ１４８時間）を行ない１環状Ｄ）ｉＡを含む両分を取
り、エチジウムプロミドを除去した後１透析してニトロ
セルロースカラムクロマトグラフィーを行ない、ボイド
７ラクシヨンを集めた。この画分に酵母ＲＮＡ３００μ
Ｉを加えてエタノール沈澱を行なった。沈澱を５０１１
Ｍ）リス塩酸（μ（Ｂ、０）２４０μ！で溶解しＮ　Ａ
ＴＰ依存核酸分解酵素用緩衝液（６６７μ！Ｍグリシン
ー苛性ソーダ（田８．５）−３Ｏ箇Ｍｆｉ化マグネシウ
ムー８．３■Ｍ２−メルカプトエタノール）３０μノお
よび５１１ＭＡＴＰ３０μノを加えて後、ＡＴＥ依存核
酸分解酵素１８単位を加えて１時間反応させた。反応液
を電子顕微鏡観察を行なった結果１環状ＤＮＡの純度は
８８、Ｑ％であり、混在する直鎖状ＤＮＡは２Ｋｂ以下
であった。

実施例　本 ニワトリファプリキウス嚢を１９日庇上り摘出し、常法
に従いフィコールパックを用いて多電のリンパ球（１Ｏ
−）を精製した。これより粗細胞抽１７− 山上澄液を実施例１の方法に従い１ＡＴＰ依存核酸分解
酵素処理を行ない１閉填状ＤＮＡを抽出１純化した。純
化した環状ＤＮＡの純度は８６．６％であり１すべで１
μ箇以下のキ環状ＤＮＡであった。

特許出願人　東洋紡繍株式会社 手　続　補　正　書（自発） 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １　事件の表示 昭和５８年特許願第１５２２６０号 区　発明の名称 環状ＤＮＡの調製方法 ＆　補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 に訂正する。

（２）同第２頁第１７〜１８行目 ［自己複製可Ｉヒなもので］を［自己複製の可能性を示
すものが」に訂正する。

（８）同第６頁第５行目 「イオン交換Ｗ　脂Ｊを「ニトロセルロース１ハイドロ
キシアパタイト」に訂正する。

（４）同第１０頁第１行目 「イオン交換」を削除する。

（５）同第１０頁第１８行目 ［イオンクロマトグラフィー」を「ニトロセルロースク
ロマトグツフィー」に訂正する。

（６）同第１１頁第３行目 「イオン交換樹脂」を「クロマトグラフィー」に訂正す
る。

（７）同第１１頁第４行目 ［ヒドロキシアパタイト］の次に「のクロマトグラフィ
ー」を挿入する。

（８）同第１２頁第２行目 「イオン交換樹脂」を削除する。

　２−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 高等動物または高等植物に存在する染色体外環状ＤＮＡ
   および直鎖状−重鎮ＤＮＡおよび直鎖状二本鎖ＤＮＡを
   含む粗細胞抽出上澄液から直鎖状一本ｆｆ１ＤＮＡを除
   去し１次いでＡＴＰ依存核酸分解酵素処理を行ない１直
   鎖状二本鎖Ｉ）ＭＡを消化し１低分子化することにより
   、環状ＤＮＡを調製することを特徴とする環状ＤＮＡの
   調製方法。