JPS6043396A - 塩基性ペプチドの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） 本発明は、絹換えＤＮＡ技術を用いて造成された微生物
の培養菌体からの塩基性ペプチドの精製法に関１−る。

さらに詳しくは、該塩基性はブチドをコードする遺伝子
を発現可能なように組みこんだシラスミドによって形質
転換された微生物が生産Ｔろ適当な蛋白と該塩基性間ブ
チドとの融合蛋白から、目的とする塩基性ペプチドを効
率的に精製する方法に関−［ろ。

（発明の背景・先行技術） １９７７年Ｉ　ｔａ　ｋ　ＩＩ　ｒａ　らによって化学
合成遺伝子を用いてソマトスタチンを大腸菌で生産させ
ろことに成功（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６．１
９７７）以来、種々のＲブチドが組換えＤＮＡ技術を駆
使し、大腸菌、酵母、枯草菌などの微生物および動物細
胞を宿主として生産されるようになってきている。また
、インスリン、インターフェロン、や成長ホルモンなど
一部のポリはブチドについては既に実用の段階にあると
言われているが、未だそれらのペプチドの微生物からの
精製法に関して具体的に開示されたものはない。さらに
、例えば、組換えＤＮＡ微生物の生産するα−ネオエン
ドルフィンの実験室しはルでの精製法については開示さ
れている（Ｔａｎａｋａ、Ｓ、Ｓ　ＮｌｌＣｌ　Ａｃｊ
ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０：１７４１゜１９８２、および特
開昭５８−６３３９５）が、その方法を大量精製にその
ま〜適用することはできない。

組換えＤＮＡ微生物の生産する有用図ゾチドの効率的精
製法の開発は、組換えＤＮＡ技術のμ体的応用において
重要な課題である。

通常、組換えＤＮＡ技術を用いて、ソマトスタチンチド
を微生物に生産させる場合、該啄プチドな適当なポリは
ブチドとの融合蛋白としてつくらせ、次に臭化シアン（
ＣＮＢｒ　）のような試薬又はトリプシン、キモトリプ
シンなどの酵素処理によって目的とする啄ゾチドを該融
合（又は雑種）蛋白から分離する方法が用いられている
。本発明者らも基本的には−ｔｒ、述の方法（例えばＩ
　ｔａｋｕｒａら５ｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６．１
９７７　）に従い、塩基性ペプチドを他のポリＲゾチド
との融合蛋白として生産させ、臭化シアン処理により該
はブチドな分離する方法をとった。そして、該Ｒブチド
の精製法に関して鋭意研究の結果、陽イオン交換樹脂に
よるカラムクロマトグラフ、ゲル濾過を行うことにより
組換えＤＮＡ微生物の生産する塩基性はブチドを純粋に
精製しうろことを見出し、さらに、該塩基性ペプチドを
高速液体クロマトグラフィにかけることにより発熱物質
（−９！イロゲン）を除去することができることも見出
し、本発明を完成するに至った。

以下、具体的に本発明における組換えＤＮＡ微生物が生
産でる融合蛋白からの目的とする塩基性ペプチドの精製
法を述べる。尚、説明を簡単にするために、大腸菌が生
産する分子量３８５６のヒトｍカルシトニン前駆体もし
くはヒト・カルシトニン類似物質（以下ＨＰＣＴと略す
）と分子量１２２８．５のα−ネオエンドルフィン（以
下αＮＥと略ｆ）の精製法について述べるが、本発明は
、特許請求の範囲に示す内においてこれらに限定１−る
ものではない。

以下に述べろＨＰＣＴおよびαＮＫは以下に示すような
塩基性はプチドである。

Ａ）ＨＰＣＴは６６個のアミノ酸残基からなる分子量３
．８５６のはプチドで次に示すよ５なアミノ酸配列を有
する。

ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｃｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−８ｅｐ”−
Ｔｂｒ−Ｇｌｙ−ＶａｌＸ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ”−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌ、ｕ−Ａｓｐ１５−Ｐｔ＋ｅ−
Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ２０−Ｔｈｒ−Ｐｌ＞
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ２５−Ａｌａ−１１ｅ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ｖａ］、−Ｇｌ、ｙ３０−Ａ　Ｌａ−Ｐｒｏ３
２−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ３”−Ａｒｇ−ＧＯＣＩＨ
尚、本積ブチドは、Ｎ末端がら８番目のアミノ酸残基で
あろＶａ　］、　（］’ｌ、−印をＭｅｔ、に替えれば
ヒト・カルシトニン前駆体の構造の一部となる。

また、本ＨＰＣＴは天然のカルシトニンと同様、ラット
の血清中のカルシウム濃度を低下させる薬理的作用を有
することが示されている（特願昭５７−８６１８１参照
）。

Ｂ）αＮＥは１０個のアミノ酸残基からなる分子量１２
２８．５の塩基性はヅチドで次のようなアミノ酸配列を
有する。

ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｇｌ、ｙ−Ｇ１．ｙ−Ｐｂｅ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃ０ＯＨ αＮＥはｂｉ、ｇ　Ｌｅｕ−ｅｎｋｅｐｂａｌ、ｉｎと
考えられ、強いモルヒネ様作用を有することが知られて
いる（Ｋ、Ｋａｎｇａｗａｓ、Ｂｊｏｃｂｅｍ　Ｂｊ、
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、９９：８７１．１９８１および特願昭５
６−１６６３０６参照）。

本発明に使用したＩ（ＰＯＴ生産株ＷＡ３Ｑυ’ｐＡＬ
ｃＴ１は特願昭５７−１０７４７４に開示された組換え
ＤＮＡ技術を用いて造成された形質転換大腸菌である。

本枕は、化学的に合成したＨＰＣＴ遺伝子７、ｌａｃ　
ＵＶ　５プロモーターの下流に連結された大腸菌アルカ
リ性フオスファクーゼ構造遺伝子の下流に連結せしめる
ことにより該プロモーター支配下にＨＰＣＴが大腸菌ア
ルカリ性フォスファターゼとの融合蛋白として生産でき
るような組換えプラスミドな有する。

一方、αＮＥ生産株ＷＡ８０２／ｐαＮＥ２は特願昭５
６−１６３３０３に開示された方法で造成された形質転
換大腸菌であり、αＮＥが１．ａｃＵＶ５プロモーター
支配下にβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白として生産
できるような組換えプラスミドを有する。ＷＡ８０２／
ｐＡＬＧＴ　１およびＷＡ８０２／Ｔ）Ｑ’　ＮＥ２は
各々ＳＢＭＣ１３５および８８Ｍ１０２と命名して、工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託し各々受託番号Ｆ
ＥＢＭＰ−６５６８（ズタはスト条約にもとづ（寄託の
受託番号はＦＥＲＭＢＰ−２８５）とＦＥＢＭＰ−６０
３１を各々得ている。

ＷＡ８０２／ｐＡＬＣＴｉが生産するＨＰＣＴおよびＷ
Ａ８ｆ”１２／ｐ／ｌｆ’ＮＥ２が生産ｆるαＮＥ＆！
各々フルカリ性フォスファターゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ、ポリはプチドとメチオニン残基（Ｍｅｔ、）’
！介して連結されている。従って、メチオニン残基部位
ケ特異的に開裂する試薬臭化シアン（ＣＮＢｒ　）で処
理することにより各々の融合蛋白から各々の目的とする
はブチドを遊離させることができる（ＨＰＣＴおよびα
ＮＥのアミノ酸配列中にはメチオニン残基はない）。

以下ＷＡ８０２／ｐＡＬＧＴｌが生産するＨＰＣＴの精
製法について述べるが、αＮＥについても同様な工程で
精製することができる。

まず、ＷＡ８０２／ｐＡＬｃＴ　Ｉ　Ｙ　Ｌ−Ｂｒｏｔ
ｈやＭ９Ｓ′ｉｃどの培地で数時間３７７１１’で培養
後ｌ５ｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｊｏｇａｌａｃｔ
ｏ　ｐｙｒａｎｏｓｊｄｅ　（以下ＩＰＴＧと略）を添
加し、アルカリ性フォスファターゼ−ＨＰＣＴ融合蛋白
の生産を誘導する。誘導剤（１ｎｄｕｃｅｒ　）である
ＩＰＴＧは乳糖でおきかえることもできる。

次に、集菌後臭化シアンを含む７０チ蟻酸水溶液で菌体
を処理することにより菌体からの蛋白の抽出と融合蛋白
からの目的とするＲプチドの遊＃を行う。蟻酸水溶液に
代えて塩酸、硫酸などの強酸性の水溶液であってもよい
。続いて蟻酸および臭化シアンを減圧下に除去後、残香
に酢酸、蟻、酸、塩酸または硫酸等の水溶液を加え、遠
心分離で沈澱物を除くことにより蛋白の抽出液を得る。

＃抽出液は減圧下に蒸発乾固されろ。乾固物（残香）を
前よりも濃度の低い酢酸を加え再度蛋白の抽出を行う。

沈澱物を遠心分離で除き、−上層部に含まれる抽出物ケ
好まＬ　＜はＳＰセファデックス、ＳＰセルロース、ア
ンバーライトＩＲＣ５Ｑもしくはダウエックス５０Ｗ８
のような陽イオン交換樹脂に吸着させた後、好ましくは
ピリジン−酢酸溶液のような揮発性の酸性バッファーで
溶出する。吸着物質はアンモニア溶液のようなアルカリ
性水溶液で溶出させることもできる。次に、酸性バッフ
ァーを用いた場合はピリジン、酢酸を除（ため、アルカ
リ性バッファーの場合はアンモニウム除くため、該溶出
液を減圧下で濃縮する。この際生じろ沈澱物乞遠心分＃
することにより除き、上清部を０Ｍセルロース、０Ｍセ
ファデックスのような弱陽イオン交換樹脂にかける。こ
の際吸着した物質を蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムのような有機酸のアンモニウム塩の溶液で溶出せしめ
る。次に、減圧下に、蟻酸のような有機酸およびアンモ
ニアを除き、目的とするパプチドを含む残香ケ酢酸酸性
中でセファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−５０
または＋ファデックスＧ−２５のよウナゲルを利用１〜
だゲル濾過を行う。このゲル濾過は弱陽イオン交換樹脂
による処理の前に行っても也い。これら一連の操作によ
り目的とする塩基性啄ゾチドは高純度に精製できるが、
医薬に使用する際に有害となる不純物や発熱物質（・ξ
イロゲン）は除かれてｔ「い。

微量に含まれる不純物や発熱物質を除く方法は種々ある
が、本発明者らは、μボンダパックＣ１８カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬＣと略）を用
いろことによりこの不純物を除くことができた。

１す下、具体的実施例によって本発明をさらに説明する
。

実施例 大腸菌形質転換株ＷＡ８０２／ｐＡＬＣＴｌを、糖を含
まないＬ−ｂｒｏｔｈ又はＭ９Ｓ培地２０．６中で、６
７Ｃで４時間通気攪拌培養後、最終濃度がｉｍＭになる
ようにＩＰＴＧを添加しさらに２時間培養した。

−８菌体な連続遠心分離（１７，００Ｏｒｐｍ、４０−
＃／ｈ　）により集め、０．１Ｎ酢酸ナトリウムで洗滌
した。１β当り約６．６Ｉのｗｅｔ菌体（１２６Ｐ／２
０−ｅ　）が得られた。次に、ｗｅｔ菌体１ψあたり７
．６　ｍｌの７０％蟻酸および０．１４　Ｐの臭化シア
ンを加え懸濁し、２７Ｃにて２４時間攪拌した。つづい
て、等量の水を加えた後、減圧下に蟻酸および臭化シア
ンを除去した。次に、残香１１当り、８ｍｌの割合いで
１Ｎ酢酸を加えホモゲナイズすることにより目的はプチ
ドを抽出し、不溶物（沈澱物）を遠心分離（１０，ＯＯ
Ｏｒｐｍ　、　２中ｍｉｎ　）で除去した上清部分（約
１００１００Ｏを有効区分Ｉとした。

Ｂ、ＳＰ−セファデックスクロマトグラフィー約９０７
．のｓｐセファデックスＣ−２５（’ｐｈａｒｍａｃｊ
ａＦｊｎｅ　Ｃｈｅｍｊｃａｌ、ｓ製）を水で膨潤させ
た後、０７５係ピリジン酢酸バツフアー、ｐＨ４，２５
にて平衡化し、４　Ｘ　３０ｃ＋＋＋のカラムに充填し
た。このカラムに上記有効区分１を、１分当り４ｍｌの
速度でロード後、１．０００ｍｌの０７５チ１リジン酢
酸バツフ７　（ｐＨ４，２５）で洗滌し、さらニ１８０
０ｍｌの２．５チビリジン酢酸バツフアー（ｐＨ４，，
８５）で洗滌した。次に、２．５係から６．０チに至る
直線的濃度勾配をもつ１２リジン酢酸バツフア一３００
０ｍｌで溶出し、さらに１０００　ｍｌの１０係ピリジ
ン酢酸バツフアーで溶出した。溶出液は１ｏｏｍｅｒつ
分取した。各分画から１０７’−ｇ’＆取り、ＨＰＬＣ
により下記の条件で分析し、ＨＰＣＴ量を測定した。カ
ラムはｐボンダパックＣｌ８（日本ウォーターズ製）を
用いトリフルオロ酢酸でｐＨ２，０に調整したアセトニ
トリル−水の混合溶媒にてアセトニトリルの濃度を２０
係から５０係に直線的に変え分析・定量した。この条件
では、目的と１°ろベプチＶＨＰＣＴは１１分のｒｅｔ
ｅｎｔｊ−ｏｎ　ｔｉ、ｍｅ’ｆ７）トコ口に定量的に
溶出される。このようにして溶出画分のＨＰＧＴを分析
した結果を第１図に示した。第１図に示されたように、
ＨＰＣＴは２０番目から２６番目の両分に９０％以上溶
出されていた。

次にこの両分（７０（Ｃｌ）を集め、減圧下に約２００
ｍ１になるまで濃縮し、これを有効画分■とした。

ｃ、０Ｍセルロースクロマトグラフィ　（図２参照）Ｃ
Ｍセルｏ−ス（Ｓｅｒｖａ　Ｎｏ、０７５．２４　）　
４６ｆｔを水にて膨潤後、１０ｍＭ蟻酸アンモニウムで
平衡化し王５×１００儂のカラムに充填した。このカラ
ムに、有効画分■からｌＱｍＭ蟻酸アンモニウムで抽出
した抽出液の遠心分離（１０，０００ｒｐｍ　、　１Ｑ
分）上清液２００ｍ１を、１分間２ｍｌの割合でロード
■７ムニ。次に、２倍量の１０ｍＭ蟻酸アンモニウムで
洗滌後、１０■ＩＭから３０　［］　ｍＭの直線的濃度
勾配をもつ１０１００Ｏの蟻酸アンモニウム溶液で溶出
（〜、さらに５００　ｍＭの蟻酸アンモニウム溶液で溶
出Ｉ−だ。

溶出液は’ｌＯｍｅずつ分取し１こ。各分画より２μｍ
βを取り、前述の条件でＨＰ　Ｌ　Ｃにより、目的とす
る＝ｏブチドＨＰ　ＣＴを定損１−た。その結果を第２
図に示１．た。ｉ（Ｐ　ＣＴは１６番目から１５番目の
両分に約８０％溶出された。この画分化集め、減圧下に
約２０ｍｅまで濃縮しこれを有効画分■とした。

Ｄ　セファデックスＧ−７５によるクロマトグラフィ（
図３参照） セフ７デツクスＧ　−７５（Ｐｂａｒｍａｃｊａ　Ｆｉ
ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）を水で膨潤させ１Ｎ酢酸に
て洗滌・平衡化後２礪×１００ＣＴＬのカラムに充填し
た。

このカラムに１分当りＱ、　５　ｍｌの流速で上記有効
画分Ｍｗ添加し、１Ｎ酢酸にて展開した。溶出液は５ｍ
ｅ＃”つ分増Ｉ、た。各分画より２１すを取り、前述の
条件でＨＰＬＣにより、目的とするペプチドＨＰＣ：Ｔ
を定量した。その結果を第６図に示１〜た・ＨＰＣＴは
、３８番目から４６番目の両分に全体の８０％以上が溶
出された。この両分を集め減圧下に２０ｍｅまでｅ、′
４縮しこれを有効画分■とした。

Ｅ、ＨＰＬＣによる不純物および発熱物質の除去分取用
カラムとして７１ボンダパツク０１８（日本ウォーター
ズ製）を用い、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：
日本ウォーターズ製モデル４４１）による微量不純物の
除去を行った。

１Ｎ酢酸５０ｍ１に溶解した上記有効画分■（約４０η
）を、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２，０とした
アセトニトリル−水の溶媒にて上記分取用カラムに吸着
させた後、アセトニトリルの濃度７３０分間に２０％か
ら５０係に直線的に上昇させながら溶出を行った（流速
ｆ、ｍｌ１分）。図４に示すよ５に、有効画分■に含ま
れる目的と（ろペプチドＨＰＣＴは７分から８分の間に
溶出された（他に約１０ケ所にピークを示す不純物があ
った）。

７分から８分の間に溶出される両分の約８０％溶出める
部分（図４では斜線部分）を集め、減圧下にアセトニト
リル、水を除き精製ＨＰＣＴとした。

この精製ＨＰＣＴの純度をアミノ酸分析および条件を変
えたＨＰ　ＬＣで測定したところ６９９チ以上であった
。また、発熱物質（・ξイロゲン）含量を、凝集酵素が
オリゴはブチドｐ−ｎｉ、ｔｒｏ　ａｎｉｌｉｄｅ　ｆ
水Ｎｆる反応を利用１．たＰｙｒｏｄｉｃ法（Ｊ、　Ｍ
ｅｄ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ−、３，４６〜６０．１９７８参照：帝
国臓器製キラ）　１．ｏｔ、　Ｎｏ、　０２６を使用）
で測定したところ０、０２５　ｒＬｆｔ／ｍｇ％　ＨＰ
ＣＴ以下であった。また、日本薬局法に記載のウサギを
用いた発熱性試験法においても、発熱はいずれの検体で
も０．４Ｃ以下であった。従って、本精製ＨＰＣＴは医
薬用として使用し５ろ純度を有していると言える。

以−ヒ実施例１のＡからＥに至るＨＰＣＴ精製過程を第
１表にまとめた。

Ｆ、精製ＲＰＣＴの構造の確認 精製ＨＰＣＴのアミノ酸組成およびアミノ酸配列は特願
昭５７−８６１８１に記載した方法に従って測定した。

即ち、アミノ酸組成は、ＨＰＣＴ−ｉ減圧封管中０．１
　％フェノール含有６Ｎ塩酸を用い、１１０Ｃで２４，
４８．７２時間加水分解したもののアミノ酸分析および
ＨＰＣＴｚ７ｊ％法（Ｃ，Ｈ，Ｗ、Ｈｊ、ｒｓ　、　”
　Ｍｅ　ｉ、ｂｏａｊ　ｎ　Ｅｎ　Ｚｙｍ（）１　ｏ（
＜Ｘ／−ｅｄ　、ｂｙ　Ｃ，Ｈ，Ｗ、Ｈｉ　Ｉ−８，Ｖ
Ｏ４、１１゜■）１９Ｚ　（１９６７）、Ａｃａ、ｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従い、過蟻
酸化したものを６Ｎ塩酸で１１０υ、２４時間加水分解
後のアミノ酸分析の結果から決定した。また、精製ＨＰ
ＣＴのアミノ酸配列は、トリズシン分解１−たペプチド
断片および過蟻酸酸化物をカルボキシ投ブチグーゼ法（
Ｔ、ｌ５ｏｂｅ　ｓ、　Ｊ。

Ｍｏ、ｌ−、Ｂｊｏｌ、、　１０２．３４９，１９７６
）やヒドラジン分解法（Ａ、Ｔｓｕｇｊ　１．ａ　ｓ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｒゝａｄ、ｓｃｊ、。

ＵＳＡ、　４６．１４６２．１９６０　）を用い決定し
た。

その結果、精製ＨＰＣＴは、前述したような目的とする
配列を有する３６ケのアミノ酸残基からなるペプチドで
あることを確認した。

■、αＮＥの精製 大腸菌形質転換株ＷＡ８０２／ｐ（１’ＮＥ２　（特願
昭５６ｉ６ろろ０ろに開示し、微Ｔ研より寄託番号ＦＥ
ＢＭ　Ｐ−６０６１を得ている）を、１係ポリはブトン
、０．５係酵母エキス、０．５％食塩の培地２０ｅで６
７Ｃ１６時間通気・攪拌培養後、最終濃度が１ｍＭにな
るようにＩＰＴＧＹ添加しさらに２時間培養した。菌体
な遠心分離にて集め（Ｉｎ当りｗｅｔ菌体約８ｇ−が得
られた）、０．ＩＮ酢酸す）　＋１ウム溶液で洗滌後、
菌体１１当り７．６　ｍｅの７０係蟻酸に懸濁し、その
中に０．１４　Ｐの臭化シアンを加えて、２７Ｃで２４
時間攪拌した。次に、等量の水を加え減圧下に蟻酸と臭
化シアンを除去し、残存１Ｊ当り８ｔＬ＃の割合で１Ｎ
酢酸を加えてａＮＥ分画を抽出した。抽出液ケ５Ｃで遠
心分離（１３，００Ｏｒｐｍ＋３ｏ分）し不溶物を除い
た後、減圧下に蒸発乾固した。この乾固物１Ｊ当り０．
６　ｍｅの０．ＩＮ酢酸を加え再度目的はブチドを抽出
し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）にて沈澱
区分を除いた十清を有効画分Ａとした。

約９０ｇのＳＰセファデックスＧ　−２５（Ｐｂａｒｍ
ａｃｉ、ａＦｊｎｅＣｈｅｍ＋ｃｒｌ製）を水で膨潤後
よく洗滌し、０１Ｎ酢酸にて平衡化したあと２×３４Ｃ
ＴＬＯカラムに充填した。これに−ヒ記有効画分Ａ（２
００ｍ／）を０．８ｍｅ１分の速度で吸着させ、０．Ｉ
Ｎ酢酸（５００ｍｇ）、水（５００＋＋＋／）、２Ｍピ
リジン（２−ｅ）にて洗滌後、１にアンモニア水（５０
０ｍｌ）にて目的ペプチドを溶出させた（図５参照）。

溶出液に含まれるアンモニア、水を減圧下に除去し、こ
れを有効画分Ｂ（／ＳＯＯｍｇ）とした。

この両分に含まれろαＮＥは、ＨＰＬＣによって分析さ
れた。ｆｌボンダ・３ツクＣｌ８（日本ウォーターズ製
）カラムを用い、トリフルオロ酢酸でｐＨ２，０とした
アセトニトリル−水の溶媒にて、アセトニトリルの濃度
を１０係から５０係に直線的に変化させ溶出させた。こ
の条件でαＮＥは１３分のｒｅｊ・ｅｎｔｉ、ｏｎ　ｔ
、ｉｍｅのところで゛溶出された。また、αＮＦは、ラ
ジオイムノアッセイ　（特願昭５６−１６ろろ０ろに開
示）によっても定性並びに定量された。

Ｃ，０Ｍセルロースクロマトグラフィ （図６参照） ０Ｍセルロース（ＳｅｒｖａＮｏ、０７５−２４）４６
！７を水にて膨潤後、１０　ｍＭ蟻酸アンモニウムで−
ｉｌＺ。

衡化し、２．Ｄｘ１５ｃｍのカラムに充填した。次に、
上記有効画分Ｂ（６，６ｇ′）’＆ろＯＯｍ／！の１Ｑ
　ｍＭ蟻酸アンモニウムに溶解させ、遠心分ＩＬ’１ｌ
（１０，０００ｒｐｍ、１０分）で不溶物ケ除いた一ヒ
清区分を、−１−配力ラムに１．６　ｍ／！／分の速度
で吸着させた。つづいて、カラムの１０倍量の１０　ｍ
Ｍ蟻酸′アンモニウムで洗滌後、蟻酸アンモニウムの濃
度’ｉ　１０　ｍＭカ・ら３００　ｍＭまで直線的に変
化させた溶液（ろ００＋ｎｅ）で目的はプチドを溶出し
た。ｌ（，８ｍｌずつ分取さ第１た溶出液は、前述と同
じ条件でＴ（Ｐ　Ｌ　Ｏに供した３゜αＮＥは４６番目
から５００番目画分Ｖこ約８０係の収率で溶出された（
図６参照）。この両分を集め、減圧下に濃縮Ｉ〜有効画
分Ｃ（約５＋ｎ／りとした３゜Ｄ、十ファデックス（、
−２５によるクロマトセファデックスＧ−２５（Ｐｌ＋
ａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｊｃａ］ｓ製）約１
００！７を水で膨潤後、１Ｎ酢酸にて洗滌し、２ｃｍ×
１００ＣＴｆＬのカラムに充填した。次に、１Ｎ酢酸に
て乎衡化後、０．５　ｍｌ１分の流速で上記有効画分Ｃ
（約５社−ｅ）ヲ添加し、１Ｎ酢酸にて溶出した。溶出
液は５ｍｌずつ分取し、前記と同じ条件で）（Ｐ　Ｌ　
Ｏに供しαＮＥを定量した。

ＵＮ　Ｅ　＆’；ｌ’、４９９番目ら５７７番目両分に
、約８０係の収率で溶出さ」１ていた（図７参照）。こ
の両分（約５［］ｍ／りを集め減圧下に濃縮し、有効画
分りとした。

Ｅ、ＨＰＬＣに、Ｌる微昂゛不純物および発熱物質の除
去　（図８参照） ＨＰ　Ｌ　Ｃおよび分取用ツｙラムは実施例１−Ｅと同
じものヶ使用した。また、アセトニトリルの濃度を１０
係から４Ｄ係に上昇させろことを除いて（実施例１−Ｅ
では２０％がら５０％Ｌ実施例１−Ｅに記載の方法に従
った。

αＮＥは、その条件で１１分のところに溶出され、その
他数ケ所に不純物のピークがみられた（図８参照）。α
ＮＥが溶出１−る両分の約９０係を占めろ部分を集め、
減圧下にア→コト二）　＋１ルと水を除き精製αＮＥと
した。

この精製αＮＥの純度はＨＰＬＣで、発熱物質含量はｐ
ｙｒｏｄｉｃ法（前述）並びにウサギを用いて行った（
前述）。その結果、純度は９９係り、上、発熱物質含量
は０．　Ｉ　ｎ、ｆｔ／ｍ９・αＮＥ以下であり、ウサ
ギによる試験結果も陰性（いずれの検体でも上昇温度は
０．４Ｃ以下）であった。

以上、実施例■のＡからＥまでのαＮＥ精製過程を第２
表にまとめた。

【図面の簡単な説明】

図１は培養菌体を臭化シアンで処理し、酸性水溶液で抽
出した抽出物を、ＳＰセファデックスクロマトグラフィ
にかけて得られろＨＰＣＴの溶出曲線である。尚、ＨＰ
ＣＴ溶出曲線は各分画の１０μｍｅ中の量を示す。 図２は図１で得られたＨＰＣＴ含有抽出液を更に０Ｍセ
ルロースクロマトグラフィにかけてイｎられるＨＰＣＴ
の溶出曲線で・ある。尚、ＨＰＣＴ溶出曲線は各分画の
２ｆ’Ａ中の量を示す。 図６は図２で得られたＨＰＣＴ含有抽出液？セファデッ
クスＧ−７５でゲル沖過して得られろＨＰＣＴの溶出曲
線である。尚、ＨＰＣＴ溶出曲線は各分画０２μｐ中の
量を示す。 図４は精製ＨＰＣＴＱ高速液体クロマトグラフィにかけ
て得られる溶出曲線である。 図５はαＮＥを含む培養菌体を臭化シアンで処理し、酸
性水溶液で抽出した抽出物を、ＳＰセファデックスクロ
マトグラフィにかげて得られろαＮＥの溶出曲線で゛あ
る。 図６は図５で得られたαＮＥ含有溶出液ケ更に０Ｍセル
ロースクロマトグラフィにかけて得られろαＮＥの溶出
曲線で゛ある。 図７は図６で得られたαＮＥ含有溶出液をセファデック
スＧ−２５でゲル濾過して得られろαＮＥの溶出曲線で
・ある。 図８は精製（Ｙ　Ｎ　Ｅを高速液体クロマトグラフィに
かけて得られる溶出曲線である。 特許出願人　ザントリー株式会社 （外４名） 具ａｌ￥Ｉ ″［目４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩基性はブチドをコードする発現可能な遺伝子を組
   み込んだブラスミ１によって形質転換された微生物の培
   養菌体から該塩基性膜ブチ＋ｊｗ分離・精製するに当っ
   て、 （カ　該培養菌体を臭化シアンの強酸性水溶液処理した
   後、酸性水溶液で抽出し、 （イ）該酸性水溶液抽出物を陽イオン交換樹脂に吸着す
   せた後、酸性もしくはアルカリ性の・ミツファーまたは
   水溶液で溶出し、 （つ）該溶出物を弱陽イオン交換樹脂に吸着させた後、
   有機酸アンモニウム塩の水溶液で済出し、この溶出物を
   ゲル濾過てるが、または（イ）の溶出物をゲル濾過ｌ−
   た後、Ｐ液を弱陽イオン交換樹脂に吸着させ、有機、酸
   了ンモニウｌ、塩の水溶液で溶出（−１ （国　必要に応じて、高速液体クロマトグラフィに、）
   こり微量の不純物や発熱物質を除去する、各工程から成
   る塩基性（ブチドの分離・精製方法。 ２、塩基件投プチドの分子量が１，０００から５，００
   ０の範囲である特許請求の範囲第１項記載の精製法。 ３　塩基性被ブチドがα−ネオエンドルフィンである特
   許請求の範囲第１項記載の精製法。 ４　塩基性はプチドがヒト・カルシトニン前駆体も１−
   ＜はヒト・カルシトニン類似物である特許請求の範囲第
   １項記載の精製法。 ５　前記工程（７１の強酸性水溶液が蟻酸、塩酸もしく
   は硫酸の水溶液である特許請求の範囲第１項記載の精製
   法。 ６　前記工程（支）の抽出用酸性水溶液が酢酸、蟻酸、
   塩酸もしくは硫酸の水溶液である特許請求の範囲第１項
   記載の精製法。 ７　前記工程（イ）の陽イオン交換樹脂がＳＰセファデ
   ックス、ＳＰナセルース、アンバーライトＩＲＣ５０（
   ）Ｌ　＜はダウエックス５０ＷＸ８である特許請求の範
   囲第１項記載の精製法。 ８　前記工程（イ）の酸性もしくはアルカリ性のバッフ
   ァーまたは水溶液がそれぞれピリジン−酢酸水溶液もし
   くはアンモニア水溶液である特許請求の範囲第１項記載
   の精製法。 ９、前記工程（つ）の弱陽イオン交換樹脂が０Ｍセルロ
   ースもしくは０Ｍセファデックスである特許請求の範囲
   第１項記載の精製法。 １０　前記工程（つ）の有機酸アンモニウム塩が蟻酸ア
   ンモニウムもしくは酢酸アンモニウムである特許請求の
   範囲第１項記載の精製法。 １１　前記工程（つ）の弱陽イオン交換樹脂が０Ｍセル
   ロースまたは０Ｍセファデックスであり、ゲル濾過材が
   セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−５０また
   はセファデックスＧ−２５である特許請求の範囲第１項
   記載の精製法。 １２、塩基性ペプチドをコードする発現可能な遺伝子を
   有するプラスミドにより形質転換された微生物が大腸菌
   である特許請求の範囲第１項記載の精製法。 １３　形質転換された微生物がアルファネオエンドルフ
   ィンなコー１５１−る発現可能な遺伝子を組み込んだプ
   ラスミドによって形質転換されている！１でｉ″許請求
   の範囲第１項記載の精製法。 １４　形質転換された微生物がピト・カルシトニン前駆
   体もしくはヒト・カルシトニン類似物質をコードする発
   現可能な遺伝子を組み込んだプラスミドによって形質転
   換されている特許請求の範囲第１項記載の精製法。