JPS6044869A - 遺伝物質の可視化技術 - Google Patents
遺伝物質の可視化技術Info
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- JPS6044869A JPS6044869A JP59151469A JP15146984A JPS6044869A JP S6044869 A JPS6044869 A JP S6044869A JP 59151469 A JP59151469 A JP 59151469A JP 15146984 A JP15146984 A JP 15146984A JP S6044869 A JPS6044869 A JP S6044869A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、生物学的遺伝物質を染色する技術に
関する。さらに詳しくは１本発明の方法は、（，１）卵
および１細胞の受精卵を包含する、生きている前核細胞
（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｆｓ）の前核（ｐｒｏ
ｎｕｃｌｅｉ）、（２）精子の頭部中の凝集ＤＮＡ、お
よび（３）移ψ前の胚細胞を可視化する独特の手段を提
供する。これらのタイプの生きている細胞中の遺伝物負
の可視化は、生体外の増殖および成熟、遺伝子および核
の移送可能性のそれ以上の研究および発展、および引き
続く家畜の胚のクローニングに重要である。従来、前核
および精子ＤＮＡは、細胞質が透明である鰯歯類および
人間以外の生きている、生存能力のある哺乳動物の細胞
において見られなかった。より成熟した胚におい士、核
の面積は多少確認できるが、細胞の大きさがこれより小
さいと、個々の核を可視化することは不可能である。
関する。さらに詳しくは１本発明の方法は、（，１）卵
および１細胞の受精卵を包含する、生きている前核細胞
（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｆｓ）の前核（ｐｒｏ
ｎｕｃｌｅｉ）、（２）精子の頭部中の凝集ＤＮＡ、お
よび（３）移ψ前の胚細胞を可視化する独特の手段を提
供する。これらのタイプの生きている細胞中の遺伝物負
の可視化は、生体外の増殖および成熟、遺伝子および核
の移送可能性のそれ以上の研究および発展、および引き
続く家畜の胚のクローニングに重要である。従来、前核
および精子ＤＮＡは、細胞質が透明である鰯歯類および
人間以外の生きている、生存能力のある哺乳動物の細胞
において見られなかった。より成熟した胚におい士、核
の面積は多少確認できるが、細胞の大きさがこれより小
さいと、個々の核を可視化することは不可能である。
発展した遺伝的改良および選択技術は、動物飼育の分野
において絶えず探究されてきている。とくに乳牛につい
て述べると、乳の有意の増加は遺伝的に優秀な雄親およ
び人工受精の広範な規模の使用により見られた。今也酪
農の乳牛は、３０年以前に比べてほぼ２倍の乳を生産す
る。さらに、遺伝的改良は、クローニングにより優秀な
胚ま艶は遺伝的に操作された胚の増殖により達成するこ
とができる。胚は、（１）受精卵細胞中の前核または核
を共与体の前核または早期の多細胞の胚と置換するか、
あるいは（２）価値ある遺伝子を前核または核中に移す
ことによりクローニングすることができる。
において絶えず探究されてきている。とくに乳牛につい
て述べると、乳の有意の増加は遺伝的に優秀な雄親およ
び人工受精の広範な規模の使用により見られた。今也酪
農の乳牛は、３０年以前に比べてほぼ２倍の乳を生産す
る。さらに、遺伝的改良は、クローニングにより優秀な
胚ま艶は遺伝的に操作された胚の増殖により達成するこ
とができる。胚は、（１）受精卵細胞中の前核または核
を共与体の前核または早期の多細胞の胚と置換するか、
あるいは（２）価値ある遺伝子を前核または核中に移す
ことによりクローニングすることができる。
遺伝子の転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、所望の遺伝子配
列を含有するＤＮＡ断片を顕微操作により前核または核
中へ転移できるようにするために、受容体細胞の前核ま
たは核を可視化することを必要とする。他方において、
核の転移は、核または雄および雌の前核を所望のクロー
ンの系統からの核との交換において受精細胞から取り出
すことができるようにするために、それらを可視化する
ことが必要である。遺伝物質の操作を含むこれらのよう
な技術は、ネズミの胚を用いる研究において開発された
。ネズミにおいて、前核および胚細胞の細胞質は透明で
あり、光学顕微鏡により生きている細胞中の核物質の可
視化を可能と・する。
列を含有するＤＮＡ断片を顕微操作により前核または核
中へ転移できるようにするために、受容体細胞の前核ま
たは核を可視化することを必要とする。他方において、
核の転移は、核または雄および雌の前核を所望のクロー
ンの系統からの核との交換において受精細胞から取り出
すことができるようにするために、それらを可視化する
ことが必要である。遺伝物質の操作を含むこれらのよう
な技術は、ネズミの胚を用いる研究において開発された
。ネズミにおいて、前核および胚細胞の細胞質は透明で
あり、光学顕微鏡により生きている細胞中の核物質の可
視化を可能と・する。
ウシおよびブタの配偶子および移植前の胚細胞における
場合は非常に異る。これらの細胞の細胞質は、密かつ粒
状であり、そして濃厚な液状の滴を含有する。遺伝物質
は不明確であり、そして光学ｗＡ微鏡により可視化する
ことができない、核の普通の染料は生体染色ではない、
すなわち、それらは染色前に細胞を固定しかつ透明化す
ることが必要である。したがって、ウシおよびブタの配
偶子および移植前の胚細胞は、通常、固定化され、透明
化された、生きていない標本で検査されてきた。
場合は非常に異る。これらの細胞の細胞質は、密かつ粒
状であり、そして濃厚な液状の滴を含有する。遺伝物質
は不明確であり、そして光学ｗＡ微鏡により可視化する
ことができない、核の普通の染料は生体染色ではない、
すなわち、それらは染色前に細胞を固定しかつ透明化す
ることが必要である。したがって、ウシおよびブタの配
偶子および移植前の胚細胞は、通常、固定化され、透明
化された、生きていない標本で検査されてきた。
前述のように、遺伝子および核の転移のような遺伝的改
良技術は、生きている前核または胚細胞中の核または前
核の選択的染色を必要とする。これらの技術は、実験室
の研究の宿主と一緒に、必・要な選択性をもつ可視化法
を提供しかつ生きている細胞を使用できる本発明の技術
によって可能となる。
良技術は、生きている前核または胚細胞中の核または前
核の選択的染色を必要とする。これらの技術は、実験室
の研究の宿主と一緒に、必・要な選択性をもつ可視化法
を提供しかつ生きている細胞を使用できる本発明の技術
によって可能となる。
ここに記載する技術は、細胞質の密度が常態で前核を不
明確にしている種においてさえ、生きている哺乳動物の
細胞において雄および雌の前核を可視化することを可能
とする。生きている細胞中に前核の可視化は、ネズミお
よびヒトの細胞を除外して、従来報告されてきていない
、また、この技術は、各分割後の発育中の胚中に存在す
る細胞の数の計数を可能とし、ならびに遺伝子および核
の転移のための遺伝物質の操作を可能とする、多細胞の
核物質の可視化手段を提供する。
明確にしている種においてさえ、生きている哺乳動物の
細胞において雄および雌の前核を可視化することを可能
とする。生きている細胞中に前核の可視化は、ネズミお
よびヒトの細胞を除外して、従来報告されてきていない
、また、この技術は、各分割後の発育中の胚中に存在す
る細胞の数の計数を可能とし、ならびに遺伝子および核
の転移のための遺伝物質の操作を可能とする、多細胞の
核物質の可視化手段を提供する。
可視化は、生きている細胞を二本鎖のＤＮＡに対して特
異性であるが、細胞の連続する生存能力を妨げない染料
に暴露することによって達成される。蛍光染料、例えば
ＤＡＰＩまたはビス−ベンズイミダゾール化合物を使用
する。染料は、配偶子、ｌ細胞の受精卵または多細胞の
胚を含有する培地へ添加する。数分程度に短い時間であ
ることができるインキュベーション後、遺伝物質は紫外
線への露光により可視化することができる。前核または
核の構造は、細胞質内の染色区域として現われる。強度
は非常に弱から鮮明な蛍光まで変化する。
異性であるが、細胞の連続する生存能力を妨げない染料
に暴露することによって達成される。蛍光染料、例えば
ＤＡＰＩまたはビス−ベンズイミダゾール化合物を使用
する。染料は、配偶子、ｌ細胞の受精卵または多細胞の
胚を含有する培地へ添加する。数分程度に短い時間であ
ることができるインキュベーション後、遺伝物質は紫外
線への露光により可視化することができる。前核または
核の構造は、細胞質内の染色区域として現われる。強度
は非常に弱から鮮明な蛍光まで変化する。
本発明の全体の目的は、遺伝子および核の転移技術、お
よび卵母細胞の生体外操作および生体外増殖および胚の
培養のパターンおよび進行の研究のような実験室の仕事
を可能としかつ促進することである。
よび卵母細胞の生体外操作および生体外増殖および胚の
培養のパターンおよび進行の研究のような実験室の仕事
を可能としかつ促進することである。
本発明の１つの主目的は、生きている哺乳動物の前核細
胞の前核を可視化する技術を提供することである。
胞の前核を可視化する技術を提供することである。
より特定の目的は、生きている哺乳動物、とくにウシお
よびブタの配偶子およびｌ細胞の受精卵の雄および雌の
ＤＮＡまたは前核の可視化を可能とすることである。
よびブタの配偶子およびｌ細胞の受精卵の雄および雌の
ＤＮＡまたは前核の可視化を可能とすることである。
それ以上の目的は、多細胞の胚の核物質を可視−化する
ことができる同様な技術を提供することである。
ことができる同様な技術を提供することである。
関連する目的は、遺伝物質および細胞質内容物を示差染
色する手段を提供することである。
色する手段を提供することである。
なお他の目的は、細胞の健康および生存能力な維持する
ことができるような方法で、生きている生殖細胞および
胚細胞中の遺伝物質を染色する手段を提供することであ
る。
ことができるような方法で、生きている生殖細胞および
胚細胞中の遺伝物質を染色する手段を提供することであ
る。
さらに、遺伝物質を過度に損傷または変更しない染料を
提供することは望ましい。
提供することは望ましい。
本発明の方法は、生きている細胞において従来法して可
視化されなかったある種の遺伝物質を示差染色（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｔｉａｌ ｓｔａｆｎｉｎｇ）する技術を提供
する。この方法において使用する蛍光染料は、細胞の固
定および透明化を必要としないで、細胞の遺伝物質を選
択的に染色する。この染色技術の選択性は、家畜の胚に
おける増殖、発生学的発育、および遺伝子および社の転
移のそれ以上の研究を促進する１強力な研究手段を提供
する。
視化されなかったある種の遺伝物質を示差染色（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｔｉａｌ ｓｔａｆｎｉｎｇ）する技術を提供
する。この方法において使用する蛍光染料は、細胞の固
定および透明化を必要としないで、細胞の遺伝物質を選
択的に染色する。この染色技術の選択性は、家畜の胚に
おける増殖、発生学的発育、および遺伝子および社の転
移のそれ以上の研究を促進する１強力な研究手段を提供
する。
この方法の染料は、いかなる種の遺伝物質を選択的に染
色するためにも使用することができる。
色するためにも使用することができる。
しかしながら、この技術は、細胞質物質（例えば脂Ｗ）
が生きている状態の前核または核の物質を不明確にする
種を用いたとき最高の価値を見い出す０ｇｈ物飼育工業
にとってかなり興味がありかつ重要である例は、ウシお
よびブタである。他の研究または家畜へのこの技術の応
用は同様に考えられる。
が生きている状態の前核または核の物質を不明確にする
種を用いたとき最高の価値を見い出す０ｇｈ物飼育工業
にとってかなり興味がありかつ重要である例は、ウシお
よびブタである。他の研究または家畜へのこの技術の応
用は同様に考えられる。
この方法に従って使用するある種の蛍光染料は、細胞の
染色選択性および連続する生存能力という二重の目的を
達成するであろうことがわかった。いわゆる「生体染料
類（ｖｉｔａｌ ５ｔａｉｎｓ）Ｊと呼ばれる蛍光染料
、すなわち、細胞を固定しかつ透明化する必要がなくか
つ細胞の連続する発育を妨害しない蛍光染料は、この手
順において有用である。さらに、染料は細胞中に組み込
まれかつ生きている生殖細胞または胚細胞中の二本鎖の
ＤＮＡにより取す−ヒげられるタイプのものであるべき
である。
染色選択性および連続する生存能力という二重の目的を
達成するであろうことがわかった。いわゆる「生体染料
類（ｖｉｔａｌ ５ｔａｉｎｓ）Ｊと呼ばれる蛍光染料
、すなわち、細胞を固定しかつ透明化する必要がなくか
つ細胞の連続する発育を妨害しない蛍光染料は、この手
順において有用である。さらに、染料は細胞中に組み込
まれかつ生きている生殖細胞または胚細胞中の二本鎖の
ＤＮＡにより取す−ヒげられるタイプのものであるべき
である。
ビス−ベンズイミダゾールの蛍光染料の部類に属する染
料は、この方法においてとくに有用であることがわかっ
た。この部類の化合物は１次の基本構造を有する： この部類におけるｌ系列の染料は、ヘキスト社（ｆ（ｏ
ｅｃｈｓｔ ＡＧ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ。
料は、この方法においてとくに有用であることがわかっ
た。この部類の化合物は１次の基本構造を有する： この部類におけるｌ系列の染料は、ヘキスト社（ｆ（ｏ
ｅｃｈｓｔ ＡＧ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ。
Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。この系列の化合
物は１次のものを包含する： ヘキスト番号 Ｒム′ ３２０２０ ＣＭ、−＃” −Ｃ１ ＼ ３２０２１ ｃｍ、−ｙり−ｏｃｔ：ｔ３ａ ａ ２５
ｓ ｃｈ、−ｕり−ｏＲ３３３４２ＣＤ、−Ｎ、−Ｑ
Ｃ，１１５３８３１２Ｈ−Ｃ” −Ｃ１ ３８３１７Ｈ−Ｃ” −ＮＨ。
物は１次のものを包含する： ヘキスト番号 Ｒム′ ３２０２０ ＣＭ、−＃” −Ｃ１ ＼ ３２０２１ ｃｍ、−ｙり−ｏｃｔ：ｔ３ａ ａ ２５
ｓ ｃｈ、−ｕり−ｏＲ３３３４２ＣＤ、−Ｎ、−Ｑ
Ｃ，１１５３８３１２Ｈ−Ｃ” −Ｃ１ ３８３１７Ｈ−Ｃ” −ＮＨ。
〜
ニス・ニー・ラットらによる研究［Ｓ、Ａ、Ｌａｔｔ
ｅｔ ａｌ、、 “５ｐｅｃｔｒａｌ ５ｔｕｄｉｅｓ
ｏｎ ３３２５８ Ｈｏｅｃｈｓｔａｎｄ Ｒｅ１ａ
ｔｅｄ Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｄｙｅｓ
Ｕｓｅｆｕｌ ｆ。
ｅｔ ａｌ、、 “５ｐｅｃｔｒａｌ ５ｔｕｄｉｅｓ
ｏｎ ３３２５８ Ｈｏｅｃｈｓｔａｎｄ Ｒｅ１ａ
ｔｅｄ Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｄｙｅｓ
Ｕｓｅｆｕｌ ｆ。
ｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｃｔｆｏｎｏｆ
Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ＡＣｉｄ ５ｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ、”Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
Ｖｏｌ、２３゜Ｐ Ｐ 、２４−３３ （１，９７６）
］は、上に列挙した系列の化合物の類似性を証明しかつ
これらの化合物が体細胞中のＤＮＡの合成の検出におい
て有用であることを開示している。
Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ＡＣｉｄ ５ｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ、”Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
Ｖｏｌ、２３゜Ｐ Ｐ 、２４−３３ （１，９７６）
］は、上に列挙した系列の化合物の類似性を証明しかつ
これらの化合物が体細胞中のＤＮＡの合成の検出におい
て有用であることを開示している。
以下の実施例は、ヘキストの染料第３３２５８吟および
同第３３３４２号がここに開示する技術において有用で
あることを証明する。ヘキストの染料第３３２５８吟の
化学名は、２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６
−ベンズイミダゾイル］ −６−（１−メチル−４−ピ
ペラジル）−ベンズイミダゾールである。ヘキストの染
料第３３３４２号の化学名は、２− ［２−（４−エト
キシフェニル）−６−ベンズイミダゾイル］−６−（ｌ
−エチル−４−ピペラジル）−ベンズイミダゾールであ
る。関連するビス−ベンズイミダゾール化合物のすべて
は、生きている生殖細胞および胚細胞中の遺伝物質の選
択的可視化に有用であることが期待される。実際に試験
した２種類の化合物のうちで、ヘキストの染料第３３３
４２号はへキストの染料第３３２５８号よりも有意に性
能がすぐれており、したがって好ましい試薬である。
同第３３３４２号がここに開示する技術において有用で
あることを証明する。ヘキストの染料第３３２５８吟の
化学名は、２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６
−ベンズイミダゾイル］ −６−（１−メチル−４−ピ
ペラジル）−ベンズイミダゾールである。ヘキストの染
料第３３３４２号の化学名は、２− ［２−（４−エト
キシフェニル）−６−ベンズイミダゾイル］−６−（ｌ
−エチル−４−ピペラジル）−ベンズイミダゾールであ
る。関連するビス−ベンズイミダゾール化合物のすべて
は、生きている生殖細胞および胚細胞中の遺伝物質の選
択的可視化に有用であることが期待される。実際に試験
した２種類の化合物のうちで、ヘキストの染料第３３３
４２号はへキストの染料第３３２５８号よりも有意に性
能がすぐれており、したがって好ましい試薬である。
しかしながら１種々の種の細胞は異る効能で異る染料を
吸収することが認められた０例えば、ヘキストの染料第
３３２５８号はマウスの胚細胞により急速に吸収される
が、ウシの胚細胞により非常にゆっくり吸収される。
吸収することが認められた０例えば、ヘキストの染料第
３３２５８号はマウスの胚細胞により急速に吸収される
が、ウシの胚細胞により非常にゆっくり吸収される。
前述の要件を満足する他の蛍光染料、すなわち、生体染
料として使用できるＤＮＡ結合蛍光色素は、この方法を
用いて同様に有用であることが期待される０例はＤＡＰ
Ｉ（４，６−ジアミジノ＝２−フェニルインドール）お
よびＤＩＰＩ（ＤＡＰＩに類似する化合物）を包含する
が、これらに限定されない。
料として使用できるＤＮＡ結合蛍光色素は、この方法を
用いて同様に有用であることが期待される０例はＤＡＰ
Ｉ（４，６−ジアミジノ＝２−フェニルインドール）お
よびＤＩＰＩ（ＤＡＰＩに類似する化合物）を包含する
が、これらに限定されない。
配偶子中または胚細胞中の遺伝物質を染色する方法は、
適当な蛍光染料への細胞の暴露、インキュベーションお
よび紫外線への露光を本質的に伴う。染料の使用量およ
びインキュベーション期間は、使用する染料および可視
化を望む目的に依存して、変化させることができる。
適当な蛍光染料への細胞の暴露、インキュベーションお
よび紫外線への露光を本質的に伴う。染料の使用量およ
びインキュベーション期間は、使用する染料および可視
化を望む目的に依存して、変化させることができる。
誤ったポジティブ（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は
この染色技術を用いて見い出されなかった。すなわち、
この手順は核または前核のＤＮＡ以外の物質を有意に染
色することが発見されなかった。しかしながら、過度に
染色された細胞は多少のバックグラウンドの染色を示す
ことが認められた。この技術は多少の誤ったネガティブ
（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を生ずることがわか
った。すなわち、他の方法により核または前核を含有す
ることがわかったある細胞は蛍光を発しなかった。これ
は実験室または商用の設備においてこの技術の有用性を
妨害しあるいは弱めると考えられない。
この染色技術を用いて見い出されなかった。すなわち、
この手順は核または前核のＤＮＡ以外の物質を有意に染
色することが発見されなかった。しかしながら、過度に
染色された細胞は多少のバックグラウンドの染色を示す
ことが認められた。この技術は多少の誤ったネガティブ
（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を生ずることがわか
った。すなわち、他の方法により核または前核を含有す
ることがわかったある細胞は蛍光を発しなかった。これ
は実験室または商用の設備においてこの技術の有用性を
妨害しあるいは弱めると考えられない。
卵細胞（１１１ｇ母細胞）、ｌ細胞の受精卵または移植
前の胚細胞は、細胞の健康を保存する常用の手段により
成熟した雌の動物から得られる。精子細胞（精子）は、
成熟した雄の動物の射精から、あるいは切採した重大、
副皐丸または雄の管系の一部分から得られる。生殖細胞
または配偶子（卵母細胞および精子）は、結合して受精
卵を形成する半数体である。次いで受精卵（雄および雌
の前核を含有する）は融合（雄および雌の前核が結合し
て接合体の核を生成すること）し、次いで１系列の細胞
分裂を行なう、胚細胞は１系列の有糸分裂を行なうとき
、桑実胚段階を経て胚盤胞段階へ発育し、その時組織の
分化および特殊化がおこる。
前の胚細胞は、細胞の健康を保存する常用の手段により
成熟した雌の動物から得られる。精子細胞（精子）は、
成熟した雄の動物の射精から、あるいは切採した重大、
副皐丸または雄の管系の一部分から得られる。生殖細胞
または配偶子（卵母細胞および精子）は、結合して受精
卵を形成する半数体である。次いで受精卵（雄および雌
の前核を含有する）は融合（雄および雌の前核が結合し
て接合体の核を生成すること）し、次いで１系列の細胞
分裂を行なう、胚細胞は１系列の有糸分裂を行なうとき
、桑実胚段階を経て胚盤胞段階へ発育し、その時組織の
分化および特殊化がおこる。
本発明の主な焦点は、移植前（ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔ
ａｔｉｏｎ）段階の胚、ならびに生殖細胞および！細胞
の受精卵である。これらの非常に早期の細胞は、広範な
研究努力の主題である。前述の遺伝子および核転移技術
は、受精卵細胞および早期の胚細胞を利用する。この技
術は他の発生学的研究に同様に有用であることが証明さ
れた。
ａｔｉｏｎ）段階の胚、ならびに生殖細胞および！細胞
の受精卵である。これらの非常に早期の細胞は、広範な
研究努力の主題である。前述の遺伝子および核転移技術
は、受精卵細胞および早期の胚細胞を利用する。この技
術は他の発生学的研究に同様に有用であることが証明さ
れた。
例えば、それによると、研究者らは、生体外受精卵の発
育、例えば、核および細胞質分裂の対称性、核割球中の
単一の核の出現、各分裂後の胚中の細胞の数などを研究
することができる。さらに、それは精子の健康および運
動性の研究に有用である。
育、例えば、核および細胞質分裂の対称性、核割球中の
単一の核の出現、各分裂後の胚中の細胞の数などを研究
することができる。さらに、それは精子の健康および運
動性の研究に有用である。
生殖細胞または胚細胞は、好ましくは、細胞の健康を維
持するために適当な培地中に配置される。所定の応用、
例えば、特定の種の細胞および特定の発育段階の細胞に
好ましい培地は、この分野においてよく知られている。
持するために適当な培地中に配置される。所定の応用、
例えば、特定の種の細胞および特定の発育段階の細胞に
好ましい培地は、この分野においてよく知られている。
いくつかの培地は実施例中に記載されている。精子は、
精液、普通の増量剤、例えば、卵黄または乳の増量剤を
含む精液または培地中で検査することができる。
精液、普通の増量剤、例えば、卵黄または乳の増量剤を
含む精液または培地中で検査することができる。
染料は好ましくは溶液で使用する。これにより、使用量
のより精確な調節が可能となり、ならびに非常に希薄な
染料を使用することができるようになる。使用量を歩な
くすると、細胞へ遺伝的損傷を与える傾向を少なくする
ことができると信じられる。
のより精確な調節が可能となり、ならびに非常に希薄な
染料を使用することができるようになる。使用量を歩な
くすると、細胞へ遺伝的損傷を与える傾向を少なくする
ことができると信じられる。
染料の原溶液は、適当な溶媒、すなわち、生きている細
胞に悪影響を及ぼさない溶媒、を使用して調製すること
ができる。溶媒に例は、ダルベツコ（Ｄｕ １ｂｅｃｃ
ｏ）のリン酸塩Ｉ！１．衝塩溶液（ＤＰＢＳ）、ＴＡＬ
Ｐ、つ４ ッ７７ （Ｗｈ ｉ ｔｔｅｎ）またはイー
グル（Ｅａｇｌｅ）の培地。
胞に悪影響を及ぼさない溶媒、を使用して調製すること
ができる。溶媒に例は、ダルベツコ（Ｄｕ １ｂｅｃｃ
ｏ）のリン酸塩Ｉ！１．衝塩溶液（ＤＰＢＳ）、ＴＡＬ
Ｐ、つ４ ッ７７ （Ｗｈ ｉ ｔｔｅｎ）またはイー
グル（Ｅａｇｌｅ）の培地。
あるいは細胞の生存能力の持続と適合する他の培地また
は溶媒であるが、これらに限定されない。
は溶媒であるが、これらに限定されない。
原溶液は好ましくは冷蔵温度、好ましくは約０〜４℃に
おいて貯蔵して汚染の可能性を減少すべきである。しか
しながら、凍結は一般に塩類を溶液から沈殿させるので
望ましくないことに注意すべきである。
おいて貯蔵して汚染の可能性を減少すべきである。しか
しながら、凍結は一般に塩類を溶液から沈殿させるので
望ましくないことに注意すべきである。
原溶液の強度は、必要に応じて変化させることができる
。強度のより強い溶液は遺伝物質をより短い期間に染色
し、これに対しより弱い溶液は遺伝物質が蛍光を発する
までにより長いインキュベーション期間を必要とするで
あろう。さらに、染料の吸収測度は種とともに変化し、
ウシおよびブタの細胞はネズミの細胞よりも非常に長い
インキュベーション期間を必要とする。上に示したよう
に、細胞の健康および生存能力を維持するために、少な
い染料を使用することが好ましい。
。強度のより強い溶液は遺伝物質をより短い期間に染色
し、これに対しより弱い溶液は遺伝物質が蛍光を発する
までにより長いインキュベーション期間を必要とするで
あろう。さらに、染料の吸収測度は種とともに変化し、
ウシおよびブタの細胞はネズミの細胞よりも非常に長い
インキュベーション期間を必要とする。上に示したよう
に、細胞の健康および生存能力を維持するために、少な
い染料を使用することが好ましい。
例えば、ＤＰＢＳの１ｍｌにつき２０ＪＬｇの染料の原
溶液を使用するとき、マウスの１細胞の胚を含有する４
９＃Ｌｌの培地中にｌ＃Ｌ文程度の少量（５０ＩＬｕの
合計体ａ）は１５分以内に前核の明確な蛍光および少な
くとも１つの極性物体を生じた。ウシの１細胞の胚およ
び２０ｕ４／ｍｌの染料の原溶液を、胚を含有する培地
の４８終見中の２ル交の使用量で使用するとき、極性の
物体は３０分以内に蛍光を発したが、前核は１〜２時間
で見ることはできなかった。実施例を参照すると理解で
きるように、使用量およびインキュベーション期間は種
々の実験または他の目剤について必要に応じて変化させ
ることができる。
溶液を使用するとき、マウスの１細胞の胚を含有する４
９＃Ｌｌの培地中にｌ＃Ｌ文程度の少量（５０ＩＬｕの
合計体ａ）は１５分以内に前核の明確な蛍光および少な
くとも１つの極性物体を生じた。ウシの１細胞の胚およ
び２０ｕ４／ｍｌの染料の原溶液を、胚を含有する培地
の４８終見中の２ル交の使用量で使用するとき、極性の
物体は３０分以内に蛍光を発したが、前核は１〜２時間
で見ることはできなかった。実施例を参照すると理解で
きるように、使用量およびインキュベーション期間は種
々の実験または他の目剤について必要に応じて変化させ
ることができる。
染料含有構造体は、紫外線への露光により顕微鏡的に可
視化することができる。約３５０ｎｍの励起波長および
約４６０ｎｍの放射の光は、適当であることがわかった
。核および前核は細胞質内で染色されたブルーの区域と
して現われる。精子は明確な前核をもたず、ＤＮＡは凝
集しかつ詰まって精子の頭部となり、ここでそれはこの
方法により可視化されうる。前核について言及する場合
、それは、特記しないかぎり、精子のＤＮＡを意味する
。ＤＮＡにより吸収される染料の量、これは使用量およ
び時間の関数である、に依存して、強度は非常に弱から
鮮明な蛍光の間で変化するであろう。
視化することができる。約３５０ｎｍの励起波長および
約４６０ｎｍの放射の光は、適当であることがわかった
。核および前核は細胞質内で染色されたブルーの区域と
して現われる。精子は明確な前核をもたず、ＤＮＡは凝
集しかつ詰まって精子の頭部となり、ここでそれはこの
方法により可視化されうる。前核について言及する場合
、それは、特記しないかぎり、精子のＤＮＡを意味する
。ＤＮＡにより吸収される染料の量、これは使用量およ
び時間の関数である、に依存して、強度は非常に弱から
鮮明な蛍光の間で変化するであろう。
次の実施例は例示のみを目的とし、特許請求の範囲によ
り規定される以外ここに記載する本発明を限定するよう
に解釈してはならない、実施例において使用した原溶液
および培地は、下に示すようにして調製した。
り規定される以外ここに記載する本発明を限定するよう
に解釈してはならない、実施例において使用した原溶液
および培地は、下に示すようにして調製した。
ダルベツコのリン酸塩緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）は、次の
ようにして調製した： 溶液＃１ ８．ＯＯｇのＮａＣ１ ０，２０ＨのＫＣｌ １．１５ｇ（７）Ｎａ２ＨＰＯ４ ０，２０ｇのＫＨ２ＰＯ４ ８００，００ｍ１の脱イオン水 溶液＃２ ０ 、１ ｇ（＋）ＣａＣ１２１００，０ｍ
ｌの脱イオン水 溶液９３ ０．１ｇのＭｇＣｌ２ １００．０ｍｌの脱イオン水 各溶液を別々に２０分間水蒸気オートクレーブ処理し、
次いで冷却した。３つの溶液をＩＪＩのメスフラスコ内
で混合し、そして合計の体積をオートクレーブ処理した
脱イオン水で１１にｔＪＲｍした。
ようにして調製した： 溶液＃１ ８．ＯＯｇのＮａＣ１ ０，２０ＨのＫＣｌ １．１５ｇ（７）Ｎａ２ＨＰＯ４ ０，２０ｇのＫＨ２ＰＯ４ ８００，００ｍ１の脱イオン水 溶液＃２ ０ 、１ ｇ（＋）ＣａＣ１２１００，０ｍ
ｌの脱イオン水 溶液９３ ０．１ｇのＭｇＣｌ２ １００．０ｍｌの脱イオン水 各溶液を別々に２０分間水蒸気オートクレーブ処理し、
次いで冷却した。３つの溶液をＩＪＩのメスフラスコ内
で混合し、そして合計の体積をオートクレーブ処理した
脱イオン水で１１にｔＪＲｍした。
このＤＰＢＳ原溶液を約４℃に冷却した。
ＤＰＢＳを使用して細胞を洗浄するとき、５ｍｇ （０
，１ｍ１）のガンタマイシン硫酸塩原溶液をまず１００
ｍ１のＤＰＢＳへ添加した。このゲンタマイシン原溶液
は５０ｍｇのゲンタマイシｙｓｏ、／ｍｌのＮａＣｌで
あった。
，１ｍ１）のガンタマイシン硫酸塩原溶液をまず１００
ｍ１のＤＰＢＳへ添加した。このゲンタマイシン原溶液
は５０ｍｇのゲンタマイシｙｓｏ、／ｍｌのＮａＣｌで
あった。
袋粁象症漉Ω！［
へ羊スト第３３３４２号を使用して染料原溶液を、次の
濃度で調製した： １０ｒＬ１／ｍｌのＤＰＢＳ ２０ ｐ、 ｇＬ／ ｍ ｌのＤＰＢＳ８０ｇＪｌ／ｍ
ｌのＤＰＢＳ ヘキスト第３３２５８号を使用して染料原溶液を、次の
濃度で調製した： ｔｏｐ交／ ｍ ｌのＤＰＢＳ ２０ｕ４／ｍｌのＤＰＢＳ 染料原溶液を４℃において貯蔵した。
濃度で調製した： １０ｒＬ１／ｍｌのＤＰＢＳ ２０ ｐ、 ｇＬ／ ｍ ｌのＤＰＢＳ８０ｇＪｌ／ｍ
ｌのＤＰＢＳ ヘキスト第３３２５８号を使用して染料原溶液を、次の
濃度で調製した： ｔｏｐ交／ ｍ ｌのＤＰＢＳ ２０ｕ４／ｍｌのＤＰＢＳ 染料原溶液を４℃において貯蔵した。
ＴＡＬＰ培地の構成に使用するための原溶液を１次のよ
うにして調製したニ ー戊勿−−一量一一 −溶双− ＮａＣ１９，２１０ｇ １．０１＋７１Ｈ２０ＭＣＩ
１．２３７ｇ １００ｍ１のＨ２ＯＣａＣｌ２１．３３
２ｇ １００ｍ１のＨ２゜（２Ｈ２ ０） Ｍ ｇ Ｃ１２２、４３６ｇ １００ ｍ ｌのＨ２゜
（６Ｈ２ ０） ＮａＨＣ１，４０３ｇ ｌｏｏｍｌ（７）Ｈ２００ａ
４１ｍｇの フェノール レッド グルコ−５，３１０１００ｍ１のＨ２Ｏス ｇ Ｎａ乳酸 １．０ｍｌの 塩 ＤＬ−乳酸本 Ｎａ）（２Ｆ ２８．０ｍｇ 木本 ０４（）（２ ０） 木ＤＬ−乳酸は、６０％のシロップとしてのナトリウム
塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ０、）。この１
．０ｍｌの乳酸シロップを、それが溶解するまで３５
ｍ ｌのＨ２Ｏ中に水洗して入れた。ｐＨをＮａＯＨで
ほぼ７．４の調節した（オーバーシュートは乳酸の非常
に小さい滴の添加により補正することができる）。
うにして調製したニ ー戊勿−−一量一一 −溶双− ＮａＣ１９，２１０ｇ １．０１＋７１Ｈ２０ＭＣＩ
１．２３７ｇ １００ｍ１のＨ２ＯＣａＣｌ２１．３３
２ｇ １００ｍ１のＨ２゜（２Ｈ２ ０） Ｍ ｇ Ｃ１２２、４３６ｇ １００ ｍ ｌのＨ２゜
（６Ｈ２ ０） ＮａＨＣ１，４０３ｇ ｌｏｏｍｌ（７）Ｈ２００ａ
４１ｍｇの フェノール レッド グルコ−５，３１０１００ｍ１のＨ２Ｏス ｇ Ｎａ乳酸 １．０ｍｌの 塩 ＤＬ−乳酸本 Ｎａ）（２Ｆ ２８．０ｍｇ 木本 ０４（）（２ ０） 木ＤＬ−乳酸は、６０％のシロップとしてのナトリウム
塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ０、）。この１
．０ｍｌの乳酸シロップを、それが溶解するまで３５
ｍ ｌのＨ２Ｏ中に水洗して入れた。ｐＨをＮａＯＨで
ほぼ７．４の調節した（オーバーシュートは乳酸の非常
に小さい滴の添加により補正することができる）。
木本２８ｍｇのＮ ａＨ２ＰＯ４（Ｈ２０）を１０ｍ１
の上で調製したグルコース原溶液と混合した。
の上で調製したグルコース原溶液と混合した。
各原溶液の成分を混合し、ミリポア（Ｍｉｌｌ１ｐｏｒ
ｅ）（０，２２川の孔大きさ）で濾過して無菌のびんに
入れ、約４℃で冷蔵した。
ｅ）（０，２２川の孔大きさ）で濾過して無菌のびんに
入れ、約４℃で冷蔵した。
ＴＡＬＰ培地を、次の量の原溶液を混合することにより
必要に応じて構成した： 示した埜を十分なＮａＣ１と一緒にして最終体積をｌｏ
ｏｍｌにし、そして６．５ｍｇのベニシリア （１００
ｉ 、 ｕ 、 ／ｍｌ）およびｌ 、 Ｏｍｇのフェ
ノールレッドを添加した。得られる混合物をミリポア（
０，２２，の孔大きさ）で濾過して無菌のびんに入れた
。
必要に応じて構成した： 示した埜を十分なＮａＣ１と一緒にして最終体積をｌｏ
ｏｍｌにし、そして６．５ｍｇのベニシリア （１００
ｉ 、 ｕ 、 ／ｍｌ）およびｌ 、 Ｏｍｇのフェ
ノールレッドを添加した。得られる混合物をミリポア（
０，２２，の孔大きさ）で濾過して無菌のびんに入れた
。
使用の日に、ＴＡＬＰ培地を、所望の用途に依存して、
次のように補充した： １ 、 ！［１１！！−６ｍ ｇのウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）（脂肪酸不合）および１ＯＩＬ文のＮａピル
ビン酸塩原溶液／ｍ１ＴＡＬＰを添加し、そしてミリポ
アで濾過した。（ＢＳＡ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ’Ｃｏ、から入手した）。
次のように補充した： １ 、 ！［１１！！−６ｍ ｇのウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）（脂肪酸不合）および１ＯＩＬ文のＮａピル
ビン酸塩原溶液／ｍ１ＴＡＬＰを添加し、そしてミリポ
アで濾過した。（ＢＳＡ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ’Ｃｏ、から入手した）。
あるいは
２、胤然培ルー ４．５ ｍ ｌ ノＴＡ Ｌ Ｐに、
５００ル交の胎児のウシ血清（１０％）、５０ＩＬｊｌ
のＮ８Ｍ溶液およびｌＯｍｇＦｓＨ／ｍ１ＴＡＬＰを添
加し、そしてミリポアで濾過した。
５００ル交の胎児のウシ血清（１０％）、５０ＩＬｊｌ
のＮ８Ｍ溶液およびｌＯｍｇＦｓＨ／ｍ１ＴＡＬＰを添
加し、そしてミリポアで濾過した。
ライ・テン の・
一威分一 一旦−
ＮａＣ１５１４，０ｍｇ
ＫＣｌ ３６．０ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４１６，０ｍｇ
Ｍｇ Ｓ ０２ （７Ｈ２０） ２９ 、 ＯｍｇＮａ
ＨＣｏ １９０．０ｍｇ Ｎａピルビン酸塩 ３ 、５ｍｇ Ｃａ乳ｒａ堪（５Ｈ２０） ５３ 、 ＯＩｎ ｇグル
コース ｌｏｏ、ｏｍｇ Ｋペニシリン ８．０ｍｇ ストレプトマイシン３０４ ５．０ｍｇ培地は列挙して
成分を１００ ｍ ｌの容積のフラスコへ添加すること
によって構成した０次に、０．３７ｍ１の６０％Ｎａ乳
酸塩ジロー２プ（Ｓｔｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、）および０゜１ ｍ ｌのフェノールレッドを添加し
た。最終の体積を１００ ｍ ｌに脱イオン水で調節し
た−次いで、培地をミリポア（０，２２１Ｌの孔大きさ
）で濾過し、４℃で貯蔵した。使用の日に、培地をつシ
血清アルプミｙ（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ、）で１．５ｍｇＢｓＡ／ｍｌ培地の添加に
より補充した。
ＨＣｏ １９０．０ｍｇ Ｎａピルビン酸塩 ３ 、５ｍｇ Ｃａ乳ｒａ堪（５Ｈ２０） ５３ 、 ＯＩｎ ｇグル
コース ｌｏｏ、ｏｍｇ Ｋペニシリン ８．０ｍｇ ストレプトマイシン３０４ ５．０ｍｇ培地は列挙して
成分を１００ ｍ ｌの容積のフラスコへ添加すること
によって構成した０次に、０．３７ｍ１の６０％Ｎａ乳
酸塩ジロー２プ（Ｓｔｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、）および０゜１ ｍ ｌのフェノールレッドを添加し
た。最終の体積を１００ ｍ ｌに脱イオン水で調節し
た−次いで、培地をミリポア（０，２２１Ｌの孔大きさ
）で濾過し、４℃で貯蔵した。使用の日に、培地をつシ
血清アルプミｙ（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ、）で１．５ｍｇＢｓＡ／ｍｌ培地の添加に
より補充した。
一災施１ニー
マウスの胚をこの実施例において使用して、生。
きている１細胞の胚中の遺伝物質の染料の特異性につい
て評価した。なぜなら、この種の前核は未染色の状態で
可視であるからである。胚は、前夜に子を生んだ雌のマ
ウスから得た。動物を頚部転位により殺し、卵巣および
卵管を切株した。卵管を解剖により遊離させ、モしてｌ
細胞の胚を卵管中に膨隆区域として位置させ、かつ卵管
壁を細い針および小さいはさみで穿刺することによりｌ
細胞の胚を回収した。１００〜２００ＩＬｌのヒアウロ
ン酸分解酵素溶液を解剖した卵管の区域へ添加し、かつ
そこに１０分間存在させることにより、６細胞を除去し
た。ｌ細胞の胚をピペットで回収し、ライラテン培地へ
の添加前に、３ｍｇのウシ血清アルブミ７ （ＢＳＡ）
／ｍ１ＤＰＢｓの溶液中で数回洗浄した。ＢＳＡはＳｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、から購入した。
て評価した。なぜなら、この種の前核は未染色の状態で
可視であるからである。胚は、前夜に子を生んだ雌のマ
ウスから得た。動物を頚部転位により殺し、卵巣および
卵管を切株した。卵管を解剖により遊離させ、モしてｌ
細胞の胚を卵管中に膨隆区域として位置させ、かつ卵管
壁を細い針および小さいはさみで穿刺することによりｌ
細胞の胚を回収した。１００〜２００ＩＬｌのヒアウロ
ン酸分解酵素溶液を解剖した卵管の区域へ添加し、かつ
そこに１０分間存在させることにより、６細胞を除去し
た。ｌ細胞の胚をピペットで回収し、ライラテン培地へ
の添加前に、３ｍｇのウシ血清アルブミ７ （ＢＳＡ）
／ｍ１ＤＰＢｓの溶液中で数回洗浄した。ＢＳＡはＳｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、から購入した。
ライラテン培地の個々の滴を、プラスチックの培養皿−
ヒに置いた０滴をひつかいて板へ接着させ、次いでその
上の油を置いた０次いで、ｌ細胞の胚を滴中に配置した
０本発明の方法に従い染色する前番乙前核は光学顕微鏡
により可視化された。
ヒに置いた０滴をひつかいて板へ接着させ、次いでその
上の油を置いた０次いで、ｌ細胞の胚を滴中に配置した
０本発明の方法に従い染色する前番乙前核は光学顕微鏡
により可視化された。
ヘキスト第３３３４２ｃ７）２０ｐｇ／ｍｌの強度の染
料原溶液を、この実施例において使用した。
料原溶液を、この実施例において使用した。
１滴につき５０＃Ｌ文の合計の培地−胚一染料の体積中
のＯ，１７１文、ＺＪＬ見、ｓＩＬ文またはｌＯ弘交の
染料原溶液の使用量を１細胞の胚に与えることが望まし
い、したがって、所望の染料の使用量を収容する大きさ
で、培地−胚の滴をスライド上に配置することが必要で
あった。すなわち、ｌル文の染料使用量につき４９ＩＬ
Ｑの培地−胚、２延文の染料使用量につき４８ル皇の培
地−胚など、胚は３７℃、ＰＨ７−２において空気中５
％のＣＯ２中で染色した。それらを可視化される間染料
中に放置した。
のＯ，１７１文、ＺＪＬ見、ｓＩＬ文またはｌＯ弘交の
染料原溶液の使用量を１細胞の胚に与えることが望まし
い、したがって、所望の染料の使用量を収容する大きさ
で、培地−胚の滴をスライド上に配置することが必要で
あった。すなわち、ｌル文の染料使用量につき４９ＩＬ
Ｑの培地−胚、２延文の染料使用量につき４８ル皇の培
地−胚など、胚は３７℃、ＰＨ７−２において空気中５
％のＣＯ２中で染色した。それらを可視化される間染料
中に放置した。
ｌ細胞のマウスの胚の前核および極性物体（ｐｏｌａｒ
ｂｏｄｙ）は、倒立顕微鏡ＤＩＡＰＨＯＴ −ＴＭＰ
（Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ）用のＮ１ｋｏｎｚピ（ｅ ｐ
ｉ）−蛍光取付Ｎｏ、ＴＭＤ−ＥＦを使用して可視化
した。この系は高圧水銀燈を使用する。使用したＵＶフ
ィルターはＮ１ｋｏｎ製であった。この系によると、光
りおよび蛍光を同時に使用して可視化が可能であるので
、蛍光区域を前核および極性物体としてポジティブに（
ｐ。
ｂｏｄｙ）は、倒立顕微鏡ＤＩＡＰＨＯＴ −ＴＭＰ
（Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ）用のＮ１ｋｏｎｚピ（ｅ ｐ
ｉ）−蛍光取付Ｎｏ、ＴＭＤ−ＥＦを使用して可視化
した。この系は高圧水銀燈を使用する。使用したＵＶフ
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りおよび蛍光を同時に使用して可視化が可能であるので
、蛍光区域を前核および極性物体としてポジティブに（
ｐ。
５ｉｔｉｖｅｌｙ）同定することが可能であった。
この方法で染色された６６の胚のすべては、染料への初
期の１５分以内の暴露の間に、使用量に無関係に、前核
および少なくとも１つの極性物体の両者の明確な蛍光を
示した。頻繁に、第２の極性物体が経時的に退化すると
き、１つのみの極性物体がはっきり見えた。
期の１５分以内の暴露の間に、使用量に無関係に、前核
および少なくとも１つの極性物体の両者の明確な蛍光を
示した。頻繁に、第２の極性物体が経時的に退化すると
き、１つのみの極性物体がはっきり見えた。
次に、２４の１つの細胞のマウスの胚を上と同じ方法で
、低い使用量（ｌＩＬｉの染料溶液および４９１ＬＪｌ
の培地−胚の滴）を使用して染色した。
、低い使用量（ｌＩＬｉの染料溶液および４９１ＬＪｌ
の培地−胚の滴）を使用して染色した。
一突１壽■−
１細胞のハムスターの胚および１ｏＩＬｕの染料溶液１
５０ｇ１の合計の滴体積の使用量を用いて、実施例工の
手順を反復した。第１の極性物体は、染料への１５分の
暴露後に着色した。前核は３０分の暴露まで蛍光を発し
なかった。各卵生の２つの前核および少なくとも１つの
極性物体を完全に可視化するためには、４５分までの暴
露を必要とした。実施例Ｉにおけるように、両者の極性
物体は常には染色されなかった。
５０ｇ１の合計の滴体積の使用量を用いて、実施例工の
手順を反復した。第１の極性物体は、染料への１５分の
暴露後に着色した。前核は３０分の暴露まで蛍光を発し
なかった。各卵生の２つの前核および少なくとも１つの
極性物体を完全に可視化するためには、４５分までの暴
露を必要とした。実施例Ｉにおけるように、両者の極性
物体は常には染色されなかった。
一犬施１Ｊ−
成熟したウシ配偶子、１細胞の胚および２細胞の胚を使
用して、実施例Ｉの手順を反復した。卵巣を畜殺場から
得た。配偶子を小胞から吸引した。匣細胞を、染色前に
、実施例工におけるようにヒアウロン酸分解酵素および
ピペットを使用して取り出した。
用して、実施例Ｉの手順を反復した。卵巣を畜殺場から
得た。配偶子を小胞から吸引した。匣細胞を、染色前に
、実施例工におけるようにヒアウロン酸分解酵素および
ピペットを使用して取り出した。
回収された配偶子のあるものを、後述するように、染色
に使用し、そして他のものを生体外受精に使用した。配
偶子を２４時間３９℃においてＴＡＬＰ成熟培地中でイ
ンキュベーションし１次いで射精された雄牛の精液を用
いてＴＡＬＰ受精培地中でインキュベーションした。１
細胞の受精した卵細胞を２４時間のインキュベーション
後に回収し、ＤＰＢＳ−ゲンタマイシン溶液中で洗浄し
、新鮮なＴＡＬＰ受精培地中に再懸濁させた。
に使用し、そして他のものを生体外受精に使用した。配
偶子を２４時間３９℃においてＴＡＬＰ成熟培地中でイ
ンキュベーションし１次いで射精された雄牛の精液を用
いてＴＡＬＰ受精培地中でインキュベーションした。１
細胞の受精した卵細胞を２４時間のインキュベーション
後に回収し、ＤＰＢＳ−ゲンタマイシン溶液中で洗浄し
、新鮮なＴＡＬＰ受精培地中に再懸濁させた。
？細胞の胚を同じ方法で調製し、精子および受精培地を
用いて４８時間インキュベーションした後回収し、次い
で洗浄し、新鮮な受精培地中に再懸濁させた。
用いて４８時間インキュベーションした後回収し、次い
で洗浄し、新鮮な受精培地中に再懸濁させた。
２０、ｇの濃度のヘキスト第３３３４２号の染料原溶液
を、この実施例において使用した。５０ＩＬ文の培地−
胚一染料につき２ＩＬｌおよび５ｐＬ１の染料の使用量
を用いて、実施例Ｉの手順を反復した。染料−培養物混
合物を３９℃においてインキュベーションし、カバース
リ）ブの下のガラスのスライド上にマウントし、そして
周囲温度のもとで可視化した。
を、この実施例において使用した。５０ＩＬ文の培地−
胚一染料につき２ＩＬｌおよび５ｐＬ１の染料の使用量
を用いて、実施例Ｉの手順を反復した。染料−培養物混
合物を３９℃においてインキュベーションし、カバース
リ）ブの下のガラスのスライド上にマウントし、そして
周囲温度のもとで可視化した。
極性物体は、染料添加後３０分以内に可視化した。配偶
子および１＃胞の胚の前核および２細胞の胚の核は、１
〜２時間以上経過後に可視化した。
子および１＃胞の胚の前核および２細胞の胚の核は、１
〜２時間以上経過後に可視化した。
次いで染色された細胞をマウントし、固定し。
透明化して、存在する染色買上のクロスチェックを提供
した。染色された胚および配偶子な有するスライドをほ
ぼ４０ ｍ ｌの酢＃：エタノール（１：３（容量／容
量））を含有するコピリン瓶内に入れ、そして室温にお
いて一夜透明化した。染色質は１％の７セトーオルセイ
ン（重量／容量）（６０：４０の水−酢酸溶液中の１％
のオルセイン染料）で染色された。染色質は、ネマース
キー（Ｎｅｍａｒｓｋｙ）および相オプチックスを用い
る光学顕微鏡により可視化された。
した。染色された胚および配偶子な有するスライドをほ
ぼ４０ ｍ ｌの酢＃：エタノール（１：３（容量／容
量））を含有するコピリン瓶内に入れ、そして室温にお
いて一夜透明化した。染色質は１％の７セトーオルセイ
ン（重量／容量）（６０：４０の水−酢酸溶液中の１％
のオルセイン染料）で染色された。染色質は、ネマース
キー（Ｎｅｍａｒｓｋｙ）および相オプチックスを用い
る光学顕微鏡により可視化された。
配偶子および早期の１細胞の胚のほぼ１５％は中期板ま
たは前核を含有したが、それらはビス−ベンズイミダゾ
ール染料へ暴露したとき蛍光を発しないことが分った。
たは前核を含有したが、それらはビス−ベンズイミダゾ
ール染料へ暴露したとき蛍光を発しないことが分った。
２細胞の胚では、核が蛍光を発しない場合は見られなか
った。染料は誤ったポジティブを与えなかった。蛍光を
発したすべての胚は、第２方法で評価したとき、染色質
を含有することがわかった。染色質は、次の形態の１つ
で存在した＝（１）配偶子のための散乱したあるいは中
期板（未成熟の卵核胞を含む）、（２）受精した卵細胞
のための前核、（３）胚細胞のための核、または（４）
配偶子に浸透しているが、雄の前核を形成する通常のデ
コンデンセイション（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）
を行なわない凝集した精子頭部。
った。染料は誤ったポジティブを与えなかった。蛍光を
発したすべての胚は、第２方法で評価したとき、染色質
を含有することがわかった。染色質は、次の形態の１つ
で存在した＝（１）配偶子のための散乱したあるいは中
期板（未成熟の卵核胞を含む）、（２）受精した卵細胞
のための前核、（３）胚細胞のための核、または（４）
配偶子に浸透しているが、雄の前核を形成する通常のデ
コンデンセイション（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）
を行なわない凝集した精子頭部。
一里麓ＩＬ
ブタの配偶子、ｌ細胞の受精卵および２細胞および４細
胞の胚を使用して、実施例■に基本的手順を反復した。
胞の胚を使用して、実施例■に基本的手順を反復した。
卵管を外科的にフラッシングし、そしてＴＡＬＰ成熟培
地中に懸濁させることにより、子を生んだ雌豚かも配偶
子を回収した。ヘキスト第３３３４２号の６０ ｇ ／
ｍ ｌの強度の原溶液を、実施例■の手順に従い、培
地−胚一染料の５０μＪｌにつき０．１７ｚ［，５μｕ
および１０ｇ１Ｌの染料の使用量で用いた。これらの混
合物を３９℃で３時間インキュベーションした。
地中に懸濁させることにより、子を生んだ雌豚かも配偶
子を回収した。ヘキスト第３３３４２号の６０ ｇ ／
ｍ ｌの強度の原溶液を、実施例■の手順に従い、培
地−胚一染料の５０μＪｌにつき０．１７ｚ［，５μｕ
および１０ｇ１Ｌの染料の使用量で用いた。これらの混
合物を３９℃で３時間インキュベーションした。
中期板および受精しなかった配偶子の極性物体および受
精卵は、非常に明確に着色し、前核は明確さに劣るよう
に見えた。さらに、配偶子の帯層に浸透した精子！Ｓ部
は蛍光を示した。２細胞および４細胞の胚の核は、非常
に明確な蛍光を示した。１０ｇ４’の使用量は高いレベ
ルのバックグラウンドの染色を生じた。
精卵は、非常に明確に着色し、前核は明確さに劣るよう
に見えた。さらに、配偶子の帯層に浸透した精子！Ｓ部
は蛍光を示した。２細胞および４細胞の胚の核は、非常
に明確な蛍光を示した。１０ｇ４’の使用量は高いレベ
ルのバックグラウンドの染色を生じた。
染色された細胞を、実施例■におけるようにマウトし、
固定し、そして透明化したが、ただしそれらを酢酸：エ
タノール中で４８時間透明化した。結果は実施例■にお
ける結果に類似した。配偶子およびｌ細胞の胚の約４０
％は蛍光を発しなかったが、誤ったポジティブは観察さ
れなかった。多細胞の胚は、ヘキストの染料で日常的に
染色された。
固定し、そして透明化したが、ただしそれらを酢酸：エ
タノール中で４８時間透明化した。結果は実施例■にお
ける結果に類似した。配偶子およびｌ細胞の胚の約４０
％は蛍光を発しなかったが、誤ったポジティブは観察さ
れなかった。多細胞の胚は、ヘキストの染料で日常的に
染色された。
一丈施１ヱー
ヘキストの蛍光染料第３３３４２号へ暴露した胚の生体
外発育を、マウスの胚を用いて２細胞および桑実胚の段
階で評価した。実施例Ｉに記載する方法により胚を回収
し、調製した。それらを１０ｐＬ文の染料溶液（２ＯＩ
Ｌ文の濃度、５０７７、文の合計の滴体積につき０．２
の使用量を与える）で染色した。
外発育を、マウスの胚を用いて２細胞および桑実胚の段
階で評価した。実施例Ｉに記載する方法により胚を回収
し、調製した。それらを１０ｐＬ文の染料溶液（２ＯＩ
Ｌ文の濃度、５０７７、文の合計の滴体積につき０．２
の使用量を与える）で染色した。
胚を染料に１５分間暴露した０次に、胚をＤｒＢＳ−ゲ
ンタマイシン中で３回洗浄し、そしてライラテン培地中
で培養した。
ンタマイシン中で３回洗浄し、そしてライラテン培地中
で培養した。
染料へ暴露した２６の２細胞のマウスの胚のうちで、１
６すなわち６５％は桑実胚の段階に発育した。これは染
料へ暴露しない、すなわち、ＤＰＢＳＱ！独の１ＯＩＬ
ｊＬを用いて１５分間インキユベイーゴンした、２６の
対照のうちの２１（８０％）と同定度である。
６すなわち６５％は桑実胚の段階に発育した。これは染
料へ暴露しない、すなわち、ＤＰＢＳＱ！独の１ＯＩＬ
ｊＬを用いて１５分間インキユベイーゴンした、２６の
対照のうちの２１（８０％）と同定度である。
桑実胚の段階の胚を染料へ暴露したとき、４４の２３（
５１％）は胚盤胞に生育した。対照（ＤＰＢＳのみ）に
ついて、３１の２３（７４％）は胚盤胞に発育した。
５１％）は胚盤胞に生育した。対照（ＤＰＢＳのみ）に
ついて、３１の２３（７４％）は胚盤胞に発育した。
一犬施勇ｌ−
ヘキスト第３３２５８号（ｌＯＩＬ文および２０ｐ−１
の染料原溶液）を用い、実施例Ｉの基本的手順を反復し
て、ｌ細胞のマウスの胚を染色した。
の染料原溶液）を用い、実施例Ｉの基本的手順を反復し
て、ｌ細胞のマウスの胚を染色した。
使用量は５０ＩＬｌの合計の培地−胚一染料体積中の０
１５ＪＬＪｌおよび１０＃Ｌｕであった。胚を周囲条件
下で３０分間染色した後、検査した。前核および極性物
体は蛍光を発し、そして実施例■におけるようにして光
学顕微鏡によりポジティブに同定された。この染料の１
０１ＬＪＬは過度の染色またはバックグラウンドの染色
を日常的に起こさないことが分った。
１５ＪＬＪｌおよび１０＃Ｌｕであった。胚を周囲条件
下で３０分間染色した後、検査した。前核および極性物
体は蛍光を発し、そして実施例■におけるようにして光
学顕微鏡によりポジティブに同定された。この染料の１
０１ＬＪＬは過度の染色またはバックグラウンドの染色
を日常的に起こさないことが分った。
一丈員１１−
ウシの精子をヘキスト染料第３３３４２号で染色して、
精子の運動性およびトラッキングのノ寸ターンを評価し
た。新しく射精された雄牛の精液をＤＰＢＳで洗浄し、
遠心分離した。得られる沈降物をＴＡＬＰ培地中に懸濁
させ、２０ＩＬｆ／ｍ１のヘキスト第３３３４２号染料
原溶液に３ル交７５０％ｌの使用量において暴露した。
精子の運動性およびトラッキングのノ寸ターンを評価し
た。新しく射精された雄牛の精液をＤＰＢＳで洗浄し、
遠心分離した。得られる沈降物をＴＡＬＰ培地中に懸濁
させ、２０ＩＬｆ／ｍ１のヘキスト第３３３４２号染料
原溶液に３ル交７５０％ｌの使用量において暴露した。
培地−精子一染料一混合物を、３９℃において１５分間
インキ′ユベイーョンし、観察した。
インキ′ユベイーョンし、観察した。
染色後、蛍光性精子を実施例工に記載したＮ１ｋｏｎ蛍
光システムを使用して可視化した。この顕微鏡の光学シ
ステム中のカメラを使用して、約１０〜２０秒の露光に
おいてカラーの時間経過の写真を撮った。現像された写
真上の蛍光性ＤＮＡにより生成された軌跡を、精子の運
動性の速度およびパターンについて分析した。丘−配偶
子複合体を培地へ添加して手順を反復し、そして得られ
た写真をこれらの細胞の精子の運動性の速度およびパタ
ーンへの作用を分析した。
光システムを使用して可視化した。この顕微鏡の光学シ
ステム中のカメラを使用して、約１０〜２０秒の露光に
おいてカラーの時間経過の写真を撮った。現像された写
真上の蛍光性ＤＮＡにより生成された軌跡を、精子の運
動性の速度およびパターンについて分析した。丘−配偶
子複合体を培地へ添加して手順を反復し、そして得られ
た写真をこれらの細胞の精子の運動性の速度およびパタ
ーンへの作用を分析した。
一丈施１１一
種々の段階のブタの胚の分割を観察するために、この実
施例を実施した０発情後４８〜１２０時間において排卵
過度の雌豚の生殖管から胚を得た。生殖管を畜殺後に回
収し、実験室においてフラッシングして胚を取り出した
０回収された胚はｌ細胞（４８時間）ないし多細胞の桑
実胚（１２０時間）の胚であった。ＤＰＢＳ−ＢＳＡ溶
液中で２回洗浄した後、胚をウィー、７−ン培地中で培
養する（対照）するか、あるいは染色し、次いでライラ
テン培地中で培養した。
施例を実施した０発情後４８〜１２０時間において排卵
過度の雌豚の生殖管から胚を得た。生殖管を畜殺後に回
収し、実験室においてフラッシングして胚を取り出した
０回収された胚はｌ細胞（４８時間）ないし多細胞の桑
実胚（１２０時間）の胚であった。ＤＰＢＳ−ＢＳＡ溶
液中で２回洗浄した後、胚をウィー、７−ン培地中で培
養する（対照）するか、あるいは染色し、次いでライラ
テン培地中で培養した。
ヘキスト第３３３４２号の６０１Ｌｇ ／ ｍ ｌの強
度の染料原溶液を、この実施例において使用した。胚を
１時間３９℃において１．５または１ＯＪＬｆＬの染料
溶液１５０ ＩＬｌでインキュベーションした。次いで
、清浄なりＰＢＳ （１，５ｍｇ／ＢＳＡ／ｍｌ）中で
３分間洗浄した。洗浄された胚を２４時間つ４−／テン
培地（１，５ｍｇ／ＢＳＡ／ｍｌ）中で培養し、次いで
発育（分割分裂の完結）について評価した。結果を表１
に示す。
度の染料原溶液を、この実施例において使用した。胚を
１時間３９℃において１．５または１ＯＪＬｆＬの染料
溶液１５０ ＩＬｌでインキュベーションした。次いで
、清浄なりＰＢＳ （１，５ｍｇ／ＢＳＡ／ｍｌ）中で
３分間洗浄した。洗浄された胚を２４時間つ４−／テン
培地（１，５ｍｇ／ＢＳＡ／ｍｌ）中で培養し、次いで
発育（分割分裂の完結）について評価した。結果を表１
に示す。
／／（Ｃ１２Ｎ ５１００
Ｃ１２Ｒ１：９１）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 （ａ）生殖細胞、１細胞の受精卵および移植前の
胚細胞から成る群より選ばれた生きている哺乳動物の細
胞を蛍光染料と接触させ、そして（ｂ）紫外線に露光し
たとき前記細胞のＤＮＡが蛍光を発するまでインキュベ
ーションする。 ことを特徴とする生殖細胞、１細胞の受精卵および移植
前の胚細胞から成る群より選ばれた生きている哺乳動物
の細胞のＤＮＡを染色する方法。 ２、前記細胞または卵が培地中に存在する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、蛍光染料がＤＡＰＩ、ＤＩＰＩおよびビス−ベンズ
。イミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ４、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第３ｑ４
記載の方法。 ５、前記染料の使用針が、前記哺乳動物の細胞を含有す
る培地の５０１１．文につき約０．００１ｇｇ〜約１０
ｐｇである特許請求の範囲第３項記 。 載の方法。 ６、特許請求の範囲第１項記載の方法により染色された
ＤＮＡを有することを特徴とする生殖細胞、１＃ｌ胞の
受精卵および移植前の胚細胞から成る群より選ばれた生
きている哺乳動物の細胞。 ７、蛍光染料がＤＡＰＩ、ＤＩＰＩおよびビスーベンズ
イミグゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求の
範囲第６項記載の細胞。 ８、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第７項記
載の細胞。 ９、前記染料の使用量が、前記細胞を含有する培地の５
０ＪＬ文につき約０．００１用ｇ〜約１０μｇである特
許請求の範囲第７項記載の細胞。 １０、特許請求の範囲第６項記載のから誘導された生き
ている細胞またはクローン。 １１、（ａ）生きている哺乳動物の前核細胞を蛍光染料
と接触させ、そして （ｂ）前記前核が蛍光を発するまでインキュベーション
する、 ことを特徴とする生きている哺乳動物の前核細胞中の前
核を染色する方法。 １２、前記生きている哺乳動物の前核細胞がウシまたは
ブタの１細胞の受精卵である特許請求の範囲第１１項記
載の方法。 １３、前記細胞が培地中に存在する特許請求の範囲第１
１項記載の方法。 １４、蛍光染料がＤＡＰｌ、ＤＩＰＩおよびビヌーベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第１１項記載の方法。 １５、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第１４
項記載の方法。 １６、前記染料の使用量が、前記啼前核細胞を含有する
培地の５０．４９．につき約０．００１１Ｌｇ〜約１０
ｐｇである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １７、許請求の範囲第１１項記載の方法により染色され
た前核を有することを特徴とする生きている哺乳動物の
前核細胞。 １８、特許請求の範囲第１７項記載のから誘導された生
きている細胞またはクローン。 １９、（ａ）生きている哺乳動物の生殖細胞、ｌ細胞の
受精卵または移植前の胚細胞を培地中に懸濁させ、 （ｂ）前記懸濁液を蛍光染料と接触させ、（Ｃ）紫外線
で照明したとき遺伝物質が蛍光を発するまでインキュベ
ーションし、そして（ｄ）前記遺伝物質を前記細胞から
顕微操作技術により取り出す。 ことを特徴とする生きている哺乳動物の生殖細胞、ｌ細
胞の受精卵または移植前の胚細胞から遺伝物質を取り出
す方法。 ２０、前記前核細胞がウシまたはブタの１細胞の受精卵
である特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、蛍光染料がＤＡＰｌ、ＤＩＰＩおよびビス−ベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第１９項記載の方法。 ２２、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第２１
項記載の方法。 ２３、前記染料の使用量が、前記細胞または卵を含有す
る培地の５０１Ｌｌにつき約０．００１ｇｇ〜約ｌＯＩ
Ｌｇである特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２、特請求の範囲第１９項記載の方法により単離された
遺伝物質。 ２５、（ａ）生きている哺乳動物の前核細胞を蛍光染料
と接触させ。 （ｂ）前核が蛍光を発するまでインキュベーションし、
そして （ｃ）所望の遺伝物質を前核細胞の前核中に顕微操作技
術により転移する、 ことを特徴とする遺伝物質を生きている哺乳動物の前核
細胞の前核中に移す方法。 ２６、前記前核細胞がウシまたはブタの１細胞の受精卵
である特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、前記細胞が培地中に存在する特許請求の範囲第２
５項記載の方法。 ２８、蛍光染料がＤＡＰＩ、ＤＩＰＩおよびビス−ベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第２５項記載の方法。 ２９、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第２８
項記載の方法。 ３０、前記染料の使用量が、前記細胞を含有する培地の
５０μ見につき約０．ＯＯ１ｐＬｇ〜約１０＃１−ｇで
ある特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３１、特許請求の範囲第２５項記載の方法により挿入さ
れた遺伝物質を有することを特徴とする遺伝的に変更さ
れた生きている哺乳動物の細胞。 ３２、特許請求の範囲第３１項記載のから誘導された生
きている細胞またはクローン。 ３３、前記遺伝物質が。 （ａ）前記遺伝物質を含有する細胞を蛍光染料と接触さ
せ。 （ｂ）前記遺伝物質が蛍光を発するまでインキュページ
式ンし、そして （ｃ）前記遺伝物質を細胞から顕微操作技術により取り
出す。 ことからなる方法により単離される特許請求の範囲第２
５項記載の方法。 ３４、蛍光染料がＤＡＰｌ、ＤＩＰＩおよびビス−ベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第３３項記載の方法。 ３５、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第３４
項記載の方法。 ３６、前記染料の使用量が、前記遺伝物質を含有する培
地の５０ＩＬ見につき約０．００１１Ｌｇ〜約ｌＯμｇ
である特許請求の範囲第３４項記載の方法。 ３７、（ａ）生殖細胞、ｌ細胞の受精卵および移植前の
胚細胞から成る群より選ばれた生きている哺乳動物の細
胞を蛍光染料と接触させ、そして （ｂ）紫外線に露光したとき前記細胞のＤＮＡが蛍光を
発するまでインキュベーションする、ことからなる方法
によって生産されたことを特徴とする生殖細胞、ｌ細胞
の受精卵および移植前の胚細胞から成る群より選ばれた
生きている哺乳動物の細胞中の哺乳動物の蛍光性ＤＮＡ
。 ３８、前記蛍光性ＤＮＡの調製に使用した生きている哺
乳動物の細胞がウシまたはブタの１細胞の受精卵であり
、そして前記蛍光性ＤＮＡが前記細胞の前核からなる特
許請求の範囲第３７項記載の哺乳動物の蛍光性ＤＮＡ。 ３９、蛍光染料がＤＡＰｌ、ＤＩＰＩおよびビス−ベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第３７項記載の哺乳動物の蛍光性ＤＮＡ。 ４０、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第３９
項記載の哺乳動物の蛍光性ＤＮＡ。 ４１、前記染料の使用量が、前記細胞を含有する培地の
５０ＪＬ交につき約０．００１１Ｌｇ〜約ｌｏｇｇであ
る特許請求の範囲第３９項記載の哺乳動物の蛍光性ＤＮ
Ａ。 ４２、（ａ）精子細胞を蛍光染料と接触させ、 （ｂ）紫外線に露光したとき精子頭部中のＤＮＡが蛍光
を発するまでインキュベーションし、そして （ｅ）蛍光性精子の時間経過の写真を調製する、 ことを特徴とする精子の動きおよび追跡パターンの写真
表示を生成する方法。 ４３、蛍光染料がＤＡＰｌ、ＤＩＰＩおよびビス−ベン
ズイミダゾール化合物から成る群より選ばれる特許請求
の範囲第４２項記載の方法。 ４４、前記染料を溶液で使用する特許請求の範囲第４３
項記載の方法。 ４５、前記染料の使用量が、精液、増量精液または精液
−培地懸濁液の５０１Ｌｉにつき約０．００１μｇ〜約
１０１Ｊ、ｇである特許請求の範囲第３９項記載の方法
。 ４６、特許請求の範囲第４２項記載の方法により作られ
た写真表示を、追跡パターンの定性的または定量的な面
を決定するために、研究することを特徴とする精液の移
動性および追跡パターンを比較的に評価する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52062983A | 1983-08-05 | 1983-08-05 | |
| US520629 | 1983-08-05 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6052567A Division JPH0751059A (ja) | 1983-08-05 | 1994-02-28 | 遺伝物質の可視化技術 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6044869A true JPS6044869A (ja) | 1985-03-11 |
| JPH07104341B2 JPH07104341B2 (ja) | 1995-11-13 |
Family
ID=24073420
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59151469A Expired - Lifetime JPH07104341B2 (ja) | 1983-08-05 | 1984-07-23 | 遺伝物質の可視化技術 |
| JP6052567A Pending JPH0751059A (ja) | 1983-08-05 | 1994-02-28 | 遺伝物質の可視化技術 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6052567A Pending JPH0751059A (ja) | 1983-08-05 | 1994-02-28 | 遺伝物質の可視化技術 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPH07104341B2 (ja) |
| AU (1) | AU581409B2 (ja) |
| CA (1) | CA1271716A (ja) |
| CH (1) | CH669670A5 (ja) |
| DE (1) | DE3427553C2 (ja) |
| FR (1) | FR2550218B1 (ja) |
| GB (1) | GB2144542B (ja) |
| MX (1) | MX161889A (ja) |
| NL (1) | NL8401137A (ja) |
| NZ (1) | NZ207393A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB2214518A (en) * | 1988-01-28 | 1989-09-06 | Innofinance Altalanos Innovaci | Process and equipment for the rapid determination of the spermium cell count and/or living spermium count |
| NZ239893A (en) * | 1990-09-25 | 1993-11-25 | Hoechst Japan | A method for introducing a foreign dna into a cell |
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| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| DE19829495A1 (de) * | 1998-07-02 | 2000-01-05 | Jacques Paysan | Reagenzien und deren Anwendung zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zellulären Molekülen und deren Lokalisation in Zellen |
| EP1230223B1 (fr) * | 1999-11-05 | 2004-02-25 | Aventis Pharma S.A. | Derives d'oligobenzimidazoles et leur utilisation comme agents de transfection d'adn |
| FR2800736B1 (fr) * | 1999-11-05 | 2002-08-23 | Aventis Pharma Sa | Derives d'oligobenzimidazoles, les compositions les contenant et leurs utilisations |
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| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
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| DE10305768A1 (de) * | 2003-02-11 | 2004-08-19 | Justus-Liebig-Universität Giessen | Verfahren zum Färben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe |
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