JPS6046955B2

JPS6046955B2 - 抗生物質ｇ−６３０２

Info

Publication number: JPS6046955B2
Application number: JP52160308A
Authority: JP
Inventors: 哲今田; 一昭北野; 満子浅井
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-12-30
Filing date: 1977-12-30
Publication date: 1985-10-18
Also published as: FR2413399B1; JPS54163501A; ES476480A1; DK147452C; GB2011380A; FR2413399A1; HU179350B; PH15534A; DK582978A; DE2855949A1; IT1202812B; CH644593A5; AU4230778A; NL7812493A; AU521534B2; ZA786882B; DK147452B; BE873217A; CS208768B2; CA1113873A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規抗性物質Ｇ−６３０２およびその塩ならび
にその製造法に関する。

本発明者らは、新規な抗性物質の探索を目的として多数
の微生物を土壌より分離し、その産生する抗性物質を分
離探索したところ、ある種の微生物が新規な抗生物質を
産生すること、該微生物がＪシュードモナス属に属する
こと、該微生物を適宜の培地に培養することによつてグ
ラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して抗菌力を示
す抗生物質を培地に蓄積しうることなどを知り、これを
単離し、その物理化学的および生物学的諸性質か；ら、
当該抗性物質が新規な抗性物質てあることを確め、これ
を抗性物質Ｇ−６３０２と称することにした。

さらに、抗性物質Ｇ−６３０２のの生産条件についても
検討を加え、抗性物質Ｇ−６３０２生産菌の資化しうる
硫黄化合物を添加して培養することにより抗性物質Ｇ−
６３０２の生産量が著しく増大することを見出した。本
発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ね
た結果、本発明を完成した。なお、本願では抗性物質Ｇ
−６３０２を単にＲＧ−６３０２Ｊと称することもある
。

本発明は、（１）抗性物質Ｇ−６３０２およびその塩、
（２）シュードモナス属に属する抗性物質Ｇ−６３０２
生産菌を培地に培養し、培養物に抗生物質Ｇ−６３０２
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする抗
性物質Ｇ−６３０２の製造法である。

本発明て使用される抗性物質Ｇ−６３０２生産菌として
は、シュードモナス（ＰｓｅｕｄＯｍＯｒｌａｓ）属に
属し、抗性物質Ｇ−６３０２を産生する能力を有するも
のであれば如何なる細菌でもよいが、たとえば本発明者
らによつて神奈川県足柄下郡の土壌より２採取したシュ
ードモナス属細菌Ｇ−６３０２株（以下、ＲＧ−６３屹
株ョと略称することもある。）があげられる。シュード
モナス種Ｇ−６３０漱の菌学的性状は下記のとおりであ
る。

２（ａ）形態肉汁寒天斜
面上で２８゜Ｃ，２日間培養後の観察では、細胞はグラ
ム染色標品ては、直径０．４〜０．５μ，長さ０，６〜
１．７μ、生細胞の位相差顕微鏡による観察ては直径０
．７〜１．０μ、長さ０．７〜３．５μ３の桿で、多形
性を示さない。

運動性があり、極鞭毛を有する。胞子を形成せす、また
細胞貯蔵としてのポリ−ベーターヒドロキシ酪酸は含ま
れない（Ｒ．Ｙ．ステイニアら、ジャーナル●オブ◆ジ
エネラル◆マイクロバイオロジー（ＪＯｕｒｎａｌＯｆ
３、ＧｅｎｅｒａＩＭｌｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ）第招巻
，第１５９頁，１９６６年）。グラム染色は陰性で、抗
酸性を示さない。（ｂ）各種培地上での生育状態２８）
Ｃて培養し、１ないし１４日間にわたつて観察した。

４（１肉
汁寒天平板培養て直径１ないし３Ｔ！Ｒｌｎの円形，隆
起状，全縁の集落を形成する。表面は平滑，不透明，白
色を呈する。拡散性色素は生成しない。２内汁寒天斜面
培養：中程度の糸状の生育を示し、不透明、クリーム色
を呈する。

３肉汁液体培養：混濁状に生育し、沈澱はほとんど生じ
ない。

１４日間培養て菌膜を形成する４内汁ゼラチン穿刺培養
：表面に生育し、液化は認められない。

５リトマス・ミルクニ変化なし。

（ｃ）生理的性質１硝酸塩の還元：陰性２脱窒反応：陰性３■けストニ陰性４ＶＰテストニ陰性５インドールの生成：陰性６硫化水素の生成：陽性（弱い）７デンプンの加水分解：陰性８クエン酸の利用：陽性９無機窒素源の利用Ｉ硝酸カリウムニ陰性ないしわずかに陽性■ 硫酸アン
モニウムニ陽性［相］色素の生成：認められない９ウレアーゼニ陽性＠オキシダーゼニ陰性＠カタラーゼニ陽性Ｏ生育の範囲ＩＰＨ４〜８て生育するがＰＨ４．５〜６６．０が最適
■ 温度：２ないし３７℃て生育するが最適温度は２．
５ないし３０℃［相］酸素に対する態度：好気性００−Ｆテスト〔ビュー・レイフソン（ＨｕｇＦｌ●ＬｅｌｆｓＯｎ）法〕５糖からの酸およびガスの生成：Ｄ−グルコース，Ｄ−
マンノース，Ｄ−ガラクトース，麦芽糖，シヨ糖トレハ
ロース，Ｄ−ソルビツト，Ｄ−マンニット，イノシツト
およびグリセンをそれぞれ１ＷＩＶ％含むベプトン水で
微弱な酸の生成が認められるが、ガス生成は認められな
い。

［株］各種炭素源の利用性：各種炭素源を含む無機塩培
地（リン酸２カリウム０．７Ｗ１Ｖ％，リン酸１カリウ
ム０．３ＷＩＶ％，硫酸アンモニウム０．１ＷＩＶ％，
ＷＩＷ％，硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ＷＩＶ％
で１４日間培養した結果を第１表に示す。

±：微弱な生育ありーニ生育なし ◎ その他の性質Ｉマロン酸の利用性：陰性 ■ フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰１■ デカ
ルボキシラーゼ活性ａアルギニンニ陰性ｂリジン：陰性ｃオルニチンニ陰性 ■ エスクリワの加水分解性：陽性 ■ ツイーン８０の加水分解性：陽性 ■ＤＮＡのＧＣ（グアニン−シトシン）１量：５９
．５モル％以上の菌学的性質を有するＧ−６３屹株をバ
ー・−ズ●マニュアル・オブ●デターミナテイブ・クテ
リオロジー（Ｂｅｒｇ＞／ＳＭａｎｕａＩ（Ｄｅｔｅｒ
ｎｌｌｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉＯｌＯｇｙ）第７版
および第．版の記載と照合すると、Ｇ−６３屹株はグラ
ム陰（桿菌て、厳密に好気性て、極鞭毛を有して運動・
１・があり、カタラーゼ陽性であるところからシユ・ド
モナダセー科に属することは明らかである。

らに栄養要求性がなく、０含量が５９．５％であ．こと
から、シュードモナス属に属するものと考，られる。シ
ュードモナス属細菌の中で、上記記１と比較的近似のも
のとしては、チトクロームオシダーゼ陰性のシュードモ
ナス●シリンジエおびシュードモナス・マルトフイリア
があげられが、後者はメチオニン要求性があることおよ
びＣで生育がないことてＧ−６３屹株とは明らか．ノ区
別される。シュードモナス・シリンジエは変・に富んだ
多くの菌株を包含するヘテロな種であが、この種に含ま
れる菌株に共通の性質てある種の炭素源の資化性がＧ−
６３屹株ては異つていことが第２表から明らかである。
また、Ｇ−６３０漱の生育最適ＰＨが４．５〜６．０と
極めて低く、かつＰＨ４．Ｏでも生育可能なことなどか
ら、Ｇ−６３屹株をシュードモナス・シリンジエの１菌
株と見なすことは困難であり、本菌株はシュードモナス
属の新種に属すると考えられる。

そこてＧ−６３屹昧の生育最適ＰＨが４．５〜６．０と
シュードモナス属細菌としては低い特徴にもとづいて本
菌をシュードモナスアシドフイラ（ＰｓｅｕｄＯｍＯ
ｎａｓａｃｉｄＯｐｈｉｌａ）と命名した。

なお、本菌株Ｇ−６３屹株は工業技術院微生工業技術研
究にＦＥＲＭ−ＰＮＯ４３４４として供託され、財団法
人発酵研究所にＩＦＯｌ３７７４として、ジ・アメリカ
ン◆タイプ◆カルチャー●コレクション（ＮｌｅＡｍｅ
ｒｉｃａｎＴｙｐｅＣＵｌｔｌｌｒ′ＥＣＯｌｌｅｃｔ
ｉＯｎｌＵ−Ｓ−Ａ・）にＡＴＣＣ−３１３６３として
、それぞれ寄託されている。本発明に用いられるシュー
ドモナス属細菌は一般にその性状が変化しやすく、たと
えば紫外線，Ｘ線，化学薬品などを用いる人工変異手段
で容易に変異しうるものであり、どの様な変異株であつ
ても本発明の対象とするＧ−６３０２の生産能を有する
ものはすべて本発明に使用することができる。

本菌の培養に際しては、炭素源としては、たとえばグル
コース，シユークロース，マルトース，廃糖蜜，グリセ
ロール，油脂類（例、大豆油，オリーブ油など），有機
酸類（例、クエン酸，コハク酸，グルコン酸など）など
菌が資化しうるものが適宜用いられる。窒素源としては
、たとえば大豆粉，棉実粉，コーン・ステイーブ・りカ
ー，乾燥酵母・酵母工キズ，肉工キズ，ペプトン，尿．
素，硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，塩化アンモ
ニウム，リン酸アンモニウムなどの有機窒素化合物や無
機窒素化合物が利用できる。また、無菌塩としては、た
とえは塩化ナトリウム，塩化カリウム，炭素カルシウム
，硫酸マグネシウム，リン酸一カリウム，リン酸二ナト
リウムなどの通常細菌の培養に必要な無機塩類が単独も
しくは適宜、組合せて使用される。さらに資化しうる硫
黄化合物たとえは硫酸ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム
などの無機硫酸黄化合物，シスチン，システ・イン，メ
チオニンなどの有機硫黄化合物を添加すると目的物の生
成量が増大することが見出された。特にチオ硫酸ナトリ
ウムは好ましい。硫黄化合物の培地中の濃度は、０．０
１〜ＷＩＶ％さらに好ましくは、０．０２〜０．５Ｗ１
Ｖ％である。硫黄化合物を培地中に添加すると、Ｇ−６
３０２の生成量が増大し、工業上きわめて有利である。
また、硫酸第１鉄，硫酸銅などの重金属類，ビタミンＢ
ｌ，ビオチンなどのビタミン類なども必要に応じて添加
される。

さらにシリコーンオイルやポリアルキレングリコールエ
ーテルなどの消泡剤や界面活性剤を培地に添加してもよ
い。その他菌の発育を助け、Ｇ−６３０２の生産を促進
するようノな有機物を適宜に添加してもよい。培養方法
としては、一般の抗生物質の生産方法と同様に行なえば
よく、固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合
は静置培養，攪拌培養，振盪培養，通気培養などいずれ
を実施してもよいがとくに通気攪拌培養が好ましい。又
培養温度はおよそ１５゜Ｃ〜３５℃の範囲が好ましく、
培地のＰＨは約４〜８の範囲でおよそ８時間〜１Ｂ時間
、好ましくは２橋間〜１４麟間培養する。生成したＧ−
６３０２は主として培養沖液中に存在するので、培養物
を遠心分離あるいは沖過によつて上清液と菌体とに分離
し、その上清液から精製するのが有利である。

しかし、培養物から、直接に精製することも可能である
。本物質の力価測定は、たとえばプロテウス・ミラビリ
スＩＦＯ３８４？を試験菌として、Ｇ−６３０２を標準
品として、ＴＳＡ（トリプテイケース・ソイ◆アガー（
ＢａｌｔｉｍＯｒｅＢｉＯｌＯｇｉｃａｌｓＬｉｍｉｔ
ｅｄ，Ｕ−Ｓ−Ａ・製）培地を用いるカップ法，ベーパ
ーディスク法により実施できる。

Ｇ−６３０２を採取するには、微生物が生産する代謝産
物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用するこ
とができる。

たとえば遠心分離によつて菌体を除去したのち、その沖
液から一般に有効物質を分離、採取、精製する方法を用
いる。すなわち適当な溶媒に対する溶解性および溶解度
の差、溶液からの析出法および析出速度の差、種々の級
着親和力の差、イオン交換体によるイオン交換クロマト
グラフィーあるいは減圧濃縮，凍結乾燥，結晶化，再結
晶，乾燥などの手段が単独あるいは任意の順序に組合わ
せて、または反復して用い、利用される。その１例を示
すと次のとおりてある。すなわち培養終了後培養液を沖
過し、得られる沖液を活性炭カラムに通過させ、吸着さ
れるＧ−６３０２を親水性有機溶媒系を用いて溶出させ
る。親水性有機溶媒系として用いられるものには、アセ
トン，メチルエチルケトン，メチルイソブチルケトンな
どの低級ケトン類，メタノール，エタノール，イソプロ
パノール，プロパノール，ブタノール等の低級アルコー
ル類の単独または混合溶媒と水との混合溶液があげられ
る。またイオン交換樹脂としては当該物質が酸性物質て
あるため、アニオン交換樹脂〔アンパーライトＩＲＡ−
４００，４０２，米国アンパーライト社製造；ダウエツ
クスー１米国タウ・アンド・ケミカル社製造：ダイヤイ
オンＳＡ−２１Ａ日本，三菱化成（日本）製造〕等のＣ
Ｉ型等が有利に利用出来る。吸着した当該物質の溶出に
は食塩等の水溶液を用い有効物質を溶出する。溶出液の
脱塩には再び活性炭のカラムクロマトグラフィーを行う
。次に有効物質を溶出した溶出液を濃縮した後、アセト
ン等を加えて析出する沈澱を沖取したのち、アセトン，
エーテル等で洗浄後乾燥すると淡褐色の粉末が得られる
。得られた粉末をさらに精製するには、ＤＥＡＥセフア
デツクス（スエーデンフアルマシア社製）のカラムク
ロマトグラフィーが有利に利用出来る。すなわち、ＤＥ
ＡＥセフアテツクスＡ−２５をリン酸緩衝液（ＰＨ６．
６）で洗浄した後、さきに得られた粉末を水に溶解した
液を通過、吸着せしめ、同緩衝液で洗浄後、０．５ＷＩ
Ｖ％食塩を含ませた緩衝液て溶出する。得られた有効区
分をＰＨ３．Ｏは調整後、再び活性炭カラムに通し、水
洗、２０ＶＩ■％メタノール水て洗浄する。゛ついで含
水アセトンで溶出し、有効区分を減圧濃縮後、アセトン
を加えるとＧ−６３０２が得られる。また本品は金属塩
およびアンモニウム塩を形成する。金属塩としては、た
とえはナトリウム塩，カリウム塩，リチウム塩などが挙
げられる。実施例１て得られたＧ−６３０２の物理化学
的性質はつぎのとおりてある。

１融点：１２０℃（湿潤），１３０℃（分解）２物質の
色，形状：白色粉末３元素分析：５酸化リン上て４０′
Ｃ，６時間減圧乾燥したもの。

（％）Ｃ３４．８３３５．４５（３４．９９±０．５）
Ｈ５．４ｌ５．２４（５．５８±０．５）Ｎｌ３．２２
ｌ３．７３（１３．６０±０．５）Ｓ７．６５（７．７
０±０．５）（０３８
．１３±０．５）４分子量：滴定法４００±２０推定分子式（上記の実測値より）Ｃｌｌ〜１３Ｈ１６〜２０Ｎ４Ｓ０７〜８ｆ（Ｈ２Ｏ）
１〜３５紫外部吸収スベクトルニ末端吸収のみ（２１０
ｒ１ｍ以上に特異な吸収を示さない。

）６赤外部吸収スペクトル（第１図）臭化カリウム錠による吸収スペクトルの主要ピークはつ
ぎの通りである。

３４４０（ｓ），２９２０（ｍ），２８５０（ｍ），２
６００（ｗ），１７７０（ｓ），１６５０（ｓ），１５
３０（ｓ），１４５８（ｍ），１３９０（ｗ），１３４
０（ｗ），１２８０（Ｓｈ），１２４０（ｓ），１２１
０（Ｓｈ），１１８０（ｍ），１１１８（ｗ），１０３
８（ｓ），７９２（ｓ），６３２（Ｃｒｎ−１）（ただ
し、Ｓ，ｍ，ｗは強，中，弱をそれぞれ示す。

Ｓｈは肩を示す）７比旋光度：〔ａ′３？＋９４中±１０そ（Ｃ＝０．３５，Ｈ２０）
８核磁気共鳴スペクトル（ジメチルスルフオキシド中１
００ｒ１ｖ４ＦＩＺ）δ３．３１ｐｐｍ１＝０−ＣＨ３
のシグナルを認める。

９溶媒に対する溶解性：石油エーテル，ヘキサン，ジエチルエーテル，ベンゼン
，酢酸エチルおよびクロロホルムには不溶。

エタノール，ピリジン，アセトンには難溶。メタノール
，ジメチルスルフオキシドには可変。水には易溶。１哩
色反応：ニンヒドリン，過マンガン酸カリウム試薬には陽性。

塩化第２鉄一フェリシアン化カリウム試薬，坂口反応，
モーリツシユ試薬には陰性。工ールリツヒ試薬には擬陽
性。１１安定性：ＰＨ３〜ＰＨ７の水溶液は６００Ｃ，１０分て安定。

ＰＨ８．５以上では不安定。１憇基性，中性，酸性の区
別：酸性物質実施例３で得られたＧ−６３０２・ナトリウム塩の物理
化学的性質はつぎの通りである。

）１融点：明確な融点を示さない。

（１７０℃褐変）２物質の色，形状：白色粉末３元素分
析：５酸化リン上４０℃，６時間減圧乾燥した。

Ｃ３３．Ｏ８３３．３２Ｈ５．Ｏ７４．９７Ｎｌ２．７３ｌ３．２７Ｓ７．３３７．４８Ｎａ５．ｌ９５．３ｌ４分子量：分子中Ｎａを１ｍ０１含有するとすれば４漠士
５推定分子式（上記の実測値より）ＣｌｌＡ，ｌ３Ｈｌ５、１９Ｎ４Ｓ０７、８Ｎａ争（
Ｈ２Ｏ）卜３５紫外部吸収スベクトルニ末端吸収のみ６
赤外部吸収スペクトル（第２図）臭化カリウム錠による吸収スペクトルの主要ピークはつ
ぎの通りてある。

３４３０（ｓ），３２５０（Ｓｈ），３０００（ｍ），
１７７０（ｓ），１６４（（Ｓ），１５３０（Ｓ），１
４５状Ｗ），１４０５（ｗ），１３４３（Ｗ），１２８
（（Ｓｈ），１２４５（Ｓ），１１８ＣＸ．Ｗ），１１
１８（ｗ），１０５０（Ｓ），８２〔（ｗ），７８５（
ｗ），６３２（ｓ），（Ｃｍ−１）（ただし、Ｓ，ｍ，
ｗは強，中，弱をそれぞれ示す。

Ｓｈは肩を示す。）７比旋光度：〔ａ〕Ｂ３＋８５ｈ
士１０示（Ｃ＝０．３７，Ｈ，０）８溶媒に対する溶解
性：石油エーテル，ヘキサン，ジエチルエーテル，六ンゼン
，酢酸エチル，クロロホルムおよびアセトンに不溶。

メタノール，エタノールおよびピリジンには難溶。ジメ
チルスルフオキシドには可溶。水には易溶。９呈色反応
：ニンヒドリン，過マンガン酸カリウム試薬には陽性。

塩化第２鉄・フェリシアン化カリウム試薬，坂口反応，
モーリツシユ試薬には陰性。工ールリツヒ試薬には擬陽
性。１咬定性：ＰＨ３〜ＰＨ７の水溶液は６０゜Ｃ，１
吟加熱にも安定。

ＰＨ８．５以上では不安定。Ｇ−６３０２の遊離形のも
のを塩にするには、たとえば遊離酸の水溶液に当モルの
水酸化ナトリウムを添加し凍結乾燥するとナトリウム塩
が得られる。

またＧ−６３０２の塩を遊離形のものにするにはたとえ
ば、Ｇ−６３０２ナトリウム塩の水溶液に１規定塩酸を
加えＰＨ３Ｏとなした後活性炭て脱酸操作を行うと遊離
形が得られる。

以上に述べたＧ−６３０２の物理化学的性ならびにその
他の物理化学的性質のデータから、本物質の化学構造式
を次式のとおり決定した。

次にＧ−６３０２の生物学的性状について述べる。

Ｇ−６３０２およびこのナトリウム塩の各種微生物に対
する抗菌スペクトルは第３表に示すとおりてある（寒天
平板稀釈法）。この表から明らかなように抗生物質Ｇ−
６３０２は主としてグラム陰性細菌に有効てあり、また
一部グラム陽性細菌に対しても有効である。ゝ抗生物
質Ｇ−６３０２・ナトリウム塩の急性毒性はマウスに対
する静脈内投与て５００ｍ９Ｉｋ９ては死亡例を認めず
、低毒性である。

Ｇ−６３０２は、エシエリヒア・コリ，クレプシエラｅ
ニユーモニエの感染マウスに、１０ｍ９Ｉｋ９の皮下投
与または１００ｍ９１ｋ９の経口投与て保護効果を示し
た。

本発明によつて得られるＧ−６３０２は、上記抗菌スペ
クトルから明らかなように、グラム陰性菌，グラム陽性
菌に対して抗菌力を示す。

したがつて、咄乳動物（例、マウス，ラット，イヌ，人
）および家（例、ニワトリ，アヒル）の上記細菌の感
染症の治療に用いることができる。Ｇ−６３０２をたと
えば大陽菌感染症の治療薬として用いるには、たとえば
Ｇ−６３０２を生理的食塩水に溶解して注射剤として非
経口的に皮下または筋肉内に５〜３０ｍ９１ｋｇ／日投
与する。

また経口剤として、抗生物質Ｇ−６３０２を乳糖と混合
してカプセル剤とし、Ｇ−６３０２として２０〜２００
ｍ９１ｋ９／日投与する。また、本発明によつて得られ
るＧ−６３０２は、殺菌剤として用いることができる。
たとえばＧ−６３０２を０．１〜１．０ＷＩＶ％の濃度
で蒸留水に溶解した液剤、またはワセリン，ラノリンを
基剤とし、１ｙあたりＧ−６３０２を５〜２０Ｔｎ９含
有する軟膏剤として、上記の動物の手，足，眼，耳など
の殺菌，消毒に用いることができる。また、Ｇ−６３０
２は新しい医薬品の合成中間体としても極めて有望な化
合物てある。

以上の諸性質を有する抗性物質Ｇ−６３０２を、既知抗
生物質と比較してみると、ます水溶性酸性物質でＳを含
有する抗性物質としては、ペニシリン類，セフアロスポ
リン類があげられるが、本品は紫外部吸収を示さないこ
とからセフアロスポリン類とは異なり、また本品の核磁
気共鳴スペクトルでＯ−メチルのシグナルが認められる
ことおよび、酸加水分解によつてグルタミン酸が検出さ
れることから、天然に得られているペニシリン類と”は
一致しないことが明らかである。

また、シュードモナス属細菌によつて産生される抗生物
質としては数多くのものが知られているが、水溶性酸性
物質てＳを含有する抗細菌性抗生物質は全く知られてい
ない。

またシュードモナス属細菌以外の微生物の産生する既知
抗生物質のいずれとも物理化学的および生物学的性状を
異にしている。したがつて本願物質は新規化合物である
と判断される。次に実施例をもつてさらに詳細に本発明
の内容ノを説明するが、これによつて本発明が限定され
るものではない。

パーセントは、特にことわりのないかぎり重量／容量％
を示す。実施例１栄養寒天斜面上に生育させたシュードモナス・アシドフ
イラＧ−６３０２ＦＥＲＭ−Ｐ４３４４の菌体を、グル
コース１％，ポリペプトン（大五栄養化学社製）０．５
％，肉工キズ０．５％，食塩０．５％（ＰＨ７．Ｏ）か
らなる培地５００ｍ１を含む２′容坂ロフラスコ２本に
接種して、２８℃で招時間往復振盪培養しその培養物を
種菌とする。

次にグリセロール３％，グリコース０．１％，ポリペプ
トン０．５％，肉工キズ０．５％，ＮａＣｌＯ．５％か
らなる培地１２０ｅを２００ｅ容ステンレス製発酵槽に
入れ、その液性を３０％水酸化ナトリウム溶液にてＰＨ
７．Ｏに調整し、１２０℃で２０分間蒸気減菌したのち
、前記種菌を接種した。

ついで温度２８％，通気量１２０ｅ／分，攪拌回転数１
８０ｒ−ｐ−ｍ・の条件下でＢ時間培養した。この培養
物をシャープレス遠心分離機にかけ、菌体を分離し、上
清液１１０ｅをえた。ＰＨ４．２に調整したのち活性炭
（クロマト用白サギ武田薬品工業製）１５ｆを充て
んしたカラムに通し活性物質を吸着させ水４５ｅて洗滌
後５０ＶＩＶ％アセトン水４５ｅて溶出した。溶出液を
１０′宛分画し、ロテウス●ミラビリスＩＦＯ３８４９
を被検菌として有効区分をしらべ、フラクシヨンＮＯ．
２〜３を集めて水２０ｅを加えた後、ダウエツクスー１
（Ｃｌ）（米国タウ・アンド・ケミカルエ業製造）１
０ｅを詰めたカラムに通した。水５２ｅで洗滌後、５％
食塩水５０′で溶出した。有効区分を集めＰＨ４．Ｏに
調整後、再び活性炭カラム（８ｅ）に通し、水２４ｆて
洗滌後２０ＶＩＶ％メタノール水で溶出を行つた。有効
区分を５０ｍ１まて減圧濃縮した後、アセトン２００ｍ
１を加え、析出する沈てんを沖取、アセトン５０ｍＬ，
エーテル１００ｍ１て洗滌後、減．圧乾燥すると粗物質
１２ｙが得られた。ここに得られた粗物質１０ｙＭＩ１
００リン酸緩衝液（ＰＨ６．６）５００ｍ１に溶解した
後、同緩衝液て緩衝化されたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−２５（スエーデン，フアルマシア社製造）カラム２
００ｍ１に通過させ吸．着せしめた。

同緩衝液４００ｍＬてカラムを洗滌後、０．５％食塩を
添加した同緩衝液て溶出を行つた。有効フラクシヨンを
集め、Ｎ一塩酸を添加して液性をＰＨ３．２に調整した
後活性炭カラム６０ｍ１に通過させた。同カラムを水２
００ｍ１，２０ＶＩＶ％メタノー・ル水１００ｍ１て洗
滌した後、５０Ｖ１■％アセトン水で溶出を行い、有効
フラクシヨンを集めて減圧下に濃縮した後、メタノール
５ｍ１を加えて溶解し、アセトン１００ｍ１を加え冷所
に放置した。析出した沈澱を？取し、エーテルで洗滌後
、５酸化リン上で減圧下、４０℃，６時間乾燥し３．８
ｙの粉末が得られた。その赤外部吸収スペクトルを第１
図に示す。元素分析値Ｃ３４．８３，Ｈ５．４ｌ，Ｎｌ
３．２２，Ｓ７．６５％実施例２グリセロール３％，グリコース０．１％，ポリペプトン
０．５％，肉工キズ０．５％，食塩０．５％からなる培
地３５ｅを５０ｅ容ステンレス製発酵槽に入れ、そ」の
液性を３０％水酸化ナトリウム溶液でＰＨ７．Ｏに調整
し、１２０゜Ｃで２紛間蒸気減菌したのち、実施例１に
示した種菌を接種し、関℃で招時間、通気量３５ｆ／分
，攪拌回転数１８０ｒ−ｐ−ｍ・の条件下で培養したも
のを第２次種菌とする。

グリセロール８％，グルコース０．１％，ポリペプトン
０．５％，肉工キズ０．５％，食塩０．５％，チオ硫酸
ナトリウム０．１からなる培地１２００ｅを２０００ｅ
容のステンレス製発酵槽に入れ、３０ＶＩ■％水酸化ナ
トリウム溶液にはＰＨ７．Ｏに調整し、１２０℃て２紛
間蒸気減菌したのち、第２次種菌を接種した。

ついて温度２８℃，通気量１２００ｅ／分，攪拌回転数
１８０ｒ′・ｐ−ｍ・の条件下て９Ｃ＠間培養し、培養
液１１５０ｅを得た。ここに得られた培養液にハイフロ
スーパーセル（米国，ジヨンズマンヴイル社）４０ｋ９
を加え、加圧式？過機でろ過後４Ｎ一硫酸を加えてＰＨ
４．２に調整後、活性炭カラム１２０′に通過させた。
カラムを水３００ｅて洗滌後、５０■ｌ■％アセトン水
て溶出を行つた。溶出液の有効フラクシヨンを集め、減
圧濃縮によりアセトンを留去した。得られた水性濃縮液
に水を加えて液量を２００ｅとし、タイヤイオンＳＡ−
２１Ａ（Ｃ１）（三菱化成社製）５０ｅのカラムに通過
させ、カラムを水１５０ｅで洗滌後、１％食塩水で溶出
した。溶出液の有効区分を集めて１００ｍ１まて減圧濃
縮し、メタノール２ｆを加え沈澱する食塩を戸去し、得
られたＰ液をさらに２００ｍ１まで減圧濃縮した後、ア
セトン２′を加えて析出する沈澱を沖取、乾燥し、７５
７ｙの粗物質を得た。ここに得られた粗物質５００ｙを
水５ｅに溶解後、ＰＨ４．Ｏに調整した後、活性炭カラ
ム（５ｅ）に通過吸着せしめ、水１０ｅ→７０ＶＩＶ％
メタノール水１０ｅによる傾斜溶出を行い、溶出液は１
ｅ宛分画した。有効フラクシヨンを集め減圧濃縮してメ
タノールを留去した後、ＮＩｌＯＯリン酸緩衝液（ＰＨ
６．Ｏ）を加えて６ｅとした。実施例１でのべた方法に
したがつて用意さｉたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２
５３′のカラムにこの試料溶液を通過吸着させた後、同
緩衝液６ｅで洗浄後０．５％食塩を添加した緩衝液で溶
出し５００ｍ１宛分画採取した。有効フラクシヨンを集
め、Ｎ一塩酸を添加してＰＨ３に調整した後、活性炭カ
ラム０．５ｅに通過、水２ｅついて２０Ｖ１Ｖ％メタノ
ール水２′で洗浄後、５０Ｖ１Ｖ％アセトン水で溶出し
た。溶出液を２００ｍ１宛分画し、有効フラクシヨンを
集め、減圧濃縮した後、メタノール′３００ｍ１を加え
て溶解後、アセトン３ｆ，エーテル４ｆを加えて冷所に
放置、析出するＧ−６３０２の沈でんを沖取し、エーテ
ルで洗浄後五酸化リン上で減圧乾燥した。収量７２ｙ０
元素分析値Ｃ３５．４５，Ｈ５．２４，Ｎｌ３．７３，
Ｓ７．７５％。

実施例３実施例１，２て得られたＧ−６３０浦離体４．０ｙを水
９０ｍ１に溶解後、冷却しながらＮ一水酸化ナトリウム
約９．０ｍ１を加えた後、ＰＨを測定しながら注意して
Ｎ一水酸化ナトリウムを加えＰＨ６．５に調整した後、
凍結乾燥を行ない白色粉末Ｇ−６３０２・モノナトリウ
ム塩４．２ｙが得られた。

本品を４０′Ｃ６時間減圧乾燥したものの赤外部スペク
トラムは第２図に示される。また元素分析値はＣ３３．
Ｏ８，．Ｈ５．Ｏ７，Ｎｌ２．７３，Ｓ７．３３，Ｎａ
５．ｌ９％てあつた。実施例４栄養寒天斜面上に生育さ
せたシュードモナス・アシドフイラＧ−６３０２（ＦＥ
ＲＭ−ＰＮＯ４３４４）の菌体を、グルコース１％，ポ
リペプトン（大五．栄養化学社製）０．５％，肉工キズ
０．５％，食塩０．５％（ＰＨ７．Ｏ）からなる培地４
０ｍ１を２００ｍ１三角フラスコに接種して２８゜Ｃて
絽時間、回転振盪培養し、その培養物を種菌とする。

次にグリセロール３％，グルコース１％，ポリペプトン
（大五栄養化学社製）０．５％，肉工キズ０．５％，食
塩０．５％（ＰＨ７．Ｏ）からなる培地４０ｍ１を２０
０ｍ１三角フラスコに入れたものに種々硫黄化合物を０
．０２〜０．５％添加して２８℃，９６時間回転振盪培
養することにより次表の如くＧ−６３０２の生産量・の
増大が認められた。

実施例５実施例１，２で得られた遊離体のＧ−６３０淘末１ｙを
冷水７．５ｍ１に溶解し、これに冷メタノール１７．５
ｍ１を加えて冷所に放置した。

析出した結晶を沖取し、冷８０Ｖ１Ｖ％メタノール水，
冷メタノール，エーテルで洗滌後、五酸化リン上で減圧
下６０℃、６時間乾燥すると、９３０ｍｇのＧ−６３０
２の結晶が得られた。得られた結晶の物性を以下に示す
。

（１）融点１６８〜１７０℃ （２）元素分析値実測値計算値Ｃｌ２Ｈ２ＯＮ４ＳＯ９・ＣＨ３ＯＨ−↓Ｈ２Ｏ
として（３）比旋光度〔ａ）邑３＋８２℃±５ＨＣ（
Ｃ＝１．０，１ｒ１Ｈ２０）（４）赤外線吸収スペクト
ル（第３図）臭化カリウム錠による吸収スペクトルの主な波数は次の
とおりてある。

３４４０，３３５５，３０００，１７８０，１６６０，
１６５０，１５３８，１２６５，１２４５，１２２０，
１０３８，６２５０（５）核磁気共鳴スペクトル（ＮＭ
Ｒ）ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ｉｎＤＭＳ０）
においては、本品のＯ−Ｍｅ（δ３．３１ｐｐｍ，ｓ，
３Ｈ）のシグナル、および結晶溶媒として１モル含有さ
れているメタノールのＯ−Ｍｅ（δ３．２０ｐｐｍ，ｓ
，３１１）のシグナルが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｇ−６３０２の赤外部吸収スペクトル（ＫＢ
ｒ法）を、第２図は、Ｇ−６３０２・ナトリウム塩の赤
外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を、第３図は、Ｇ−６
３０２の結晶の赤外部吸収スペクトル（ＫＢ琺）を、そ
れぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次の特性を有する抗生物質Ｇ−６３０２およびその
塩１融点：１２０℃（湿潤）、１３０℃（分解）２
性状：白色粉末３元素分析値：Ｃ３４．９９±０．５
；５；５８±０．５；Ｎ１３．６０±０．５；Ｏ３８．
１３±０．５；Ｓ７．７０±０．５（％）（４０℃、６
時間５酸下リン上で減圧乾燥したもの）４紫外部吸収
スペクトル：２１０ｍｍ以上に特異な吸収を示さない。５赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠による吸収
スペクトルの主な吸収（波数）は次のとおりである。１７７０，１６５０，１５３０，１２４０，１０４３（
ｃｍ＾−＾１）６比旋光度：〔ａ〕＿Ｄ＾２＾３゜＋
９４゜±１０゜（Ｃ＝０．３５，Ｈ＿２Ｏ）７容解性
：石油エーテル、ヘキサン、ジエチルエーテル、ペンゼ
ン、酢酸エチルおよびクロロホルムには不溶。エタノール、ピリジンおよびアセトンには難容。メタノ
ールおよびジメチルスルフオキシドには可溶。水には易
溶。８塩基性、中性、酸性の区別：酸性物質９分子
量：４００±２０（滴定法による）１０呈色反応：ニ
ンヒドリン、過マンガン酸カリウム試薬に陽性。塩化第二鉄−フェリシアン化カリウム試薬、坂口反応、
モーリツシユ試薬に陰性。エールリツヒ試薬に擬陽性。
２シュードモナス属に属する抗性物質Ｇ−６３０２生
産菌を培地に培養物中に抗性物質Ｇ−６３０２を生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とする抗生物質Ｇ
−６３０２の製造法。３培地中にシュードモナス属に属する抗生物質Ｇ−６
３０２生産菌の資化しうる硫黄化合物を添加して培養す
る特許請求の範囲第２項記載の方法。４硫黄化合物がチオ硫酸ナトリウムである特許請求の
範囲第３項記載の方法。