JPS6047683A - プロモ−タ− - Google Patents
プロモ−タ−Info
- Publication number
- JPS6047683A JPS6047683A JP58154270A JP15427083A JPS6047683A JP S6047683 A JPS6047683 A JP S6047683A JP 58154270 A JP58154270 A JP 58154270A JP 15427083 A JP15427083 A JP 15427083A JP S6047683 A JPS6047683 A JP S6047683A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- promoter
- restriction enzyme
- gene
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、遺伝子ＤＮＡ中の一部位として構造遺伝子の
機能の発現に関与するプロモーターに関する。さらに具
体的には、本発明は、植物由来のプロモーターに関する
。
機能の発現に関与するプロモーターに関する。さらに具
体的には、本発明は、植物由来のプロモーターに関する
。
プロモーターは、ＤＮＡ上でＲＮＡポリメラーゼが結合
して転写を開始する部位であり、それが属するオペロン
内の構造遺伝子の発現のためにはこの部位の存在が不可
欠である。
して転写を開始する部位であり、それが属するオペロン
内の構造遺伝子の発現のためにはこの部位の存在が不可
欠である。
遺伝子の解析は主として原核生物、たとえば細菌および
ファージ、就中細菌、特に大腸菌、について行なわれて
きたので、プロモーターも原核生物のそれについて調べ
ら治てセリ、１ａｃ（大腸菌ラクトースオペロン）・の
プロモーター、ｔｒｐ （同菌トリプトファンオペロン
〕のプロモーター５ａｒａ （同菌アラビノースオペロ
ン・）のプロモーター等、多数のものが知られている。
ファージ、就中細菌、特に大腸菌、について行なわれて
きたので、プロモーターも原核生物のそれについて調べ
ら治てセリ、１ａｃ（大腸菌ラクトースオペロン）・の
プロモーター、ｔｒｐ （同菌トリプトファンオペロン
〕のプロモーター５ａｒａ （同菌アラビノースオペロ
ン・）のプロモーター等、多数のものが知られている。
一般に、真核細胞のプロモーターは原核細胞中では働か
ないとされていて、形質転換等において宿主として原核
生物を用いたときは原核生物たとえばファージのプロモ
ーターを用いることが必要である。
ないとされていて、形質転換等において宿主として原核
生物を用いたときは原核生物たとえばファージのプロモ
ーターを用いることが必要である。
このような一般的知見に対して、真核生物に分類される
べきゼニゴケのクロロプラストＤＮＡをＥｃｏＲＩで切
断して得られるフラクションのうち大きさが約５．Ｉ
Ｋｂｐのものが原核生物である大腸菌内でプロモーター
として機能することを本発明者らは見出している（第８
回植物組織培養シンポジウム）。
べきゼニゴケのクロロプラストＤＮＡをＥｃｏＲＩで切
断して得られるフラクションのうち大きさが約５．Ｉ
Ｋｂｐのものが原核生物である大腸菌内でプロモーター
として機能することを本発明者らは見出している（第８
回植物組織培養シンポジウム）。
プロモーターとしての強度、すなわちＤＮＡからＲＮＡ
をつくる際の転写の頻度、換言すればプロモーター活性
、はプロモーターの種類によって差があるから、プロモ
ーターを含むＤＮＡをベクターとして分子育槙に利用す
る場合にはプロモーター活性の高いものほど有利である
といえる。また、ベクターはパラセンジャー（すなわち
外来遺伝子）を組込むためのものであるところから、そ
のサイズは小さいことが好ましく、従ってそこに含まれ
るプロモーターも小さいものの方が使い勝手がよいとい
うことができる。このようなところから、新しいプロモ
ーターについては不断の希求があるといえよう。
をつくる際の転写の頻度、換言すればプロモーター活性
、はプロモーターの種類によって差があるから、プロモ
ーターを含むＤＮＡをベクターとして分子育槙に利用す
る場合にはプロモーター活性の高いものほど有利である
といえる。また、ベクターはパラセンジャー（すなわち
外来遺伝子）を組込むためのものであるところから、そ
のサイズは小さいことが好ましく、従ってそこに含まれ
るプロモーターも小さいものの方が使い勝手がよいとい
うことができる。このようなところから、新しいプロモ
ーターについては不断の希求があるといえよう。
発明の概要
要旨
本発明は上記の希求に応えるものである。
すなわち、本発明によるプロモーターは、ゼニサケ（詣
ｒｃｈａｎｔｉａ把す＝叩ｈａＬ、） のクロロプラス
トＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ［で切断して得られる、１
６ＳｒＲＮＡ 遺伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡ 遺伝子
の一部とを含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断して得られる約１．Ｉ ＫｂｐのＤＮＡ断片、
と同じ塩基配列のＤＮＡからなるものである。
ｒｃｈａｎｔｉａ把す＝叩ｈａＬ、） のクロロプラス
トＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ［で切断して得られる、１
６ＳｒＲＮＡ 遺伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡ 遺伝子
の一部とを含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断して得られる約１．Ｉ ＫｂｐのＤＮＡ断片、
と同じ塩基配列のＤＮＡからなるものである。
本発明によるプロモーターは、一般のプロモーターと同
様に、ＤＮＡ中の一部位としての存在であるが、本発明
はそのようなりＮＡの一具体例をも提供するものである
。
様に、ＤＮＡ中の一部位としての存在であるが、本発明
はそのようなりＮＡの一具体例をも提供するものである
。
すなわち、本発明によるハイブリッドＤＮＡは、下記の
（Ａ）のフラクションおよび（Ｂ）のフラクションを含
むものである。
（Ａ）のフラクションおよび（Ｂ）のフラクションを含
むものである。
ＦＡ） ゼニゴケ（λ４ａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ Ｌ、 ） のクロロシラス） ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られる、１６ Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部と
ン含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵素とＨｌ で切断し
て得られる約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片、と同じ塩基配
列のＤＮＡからなるプロモーター、゛（Ｂ）原核生物由
来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡ。
ｍｏｒｐｈａ Ｌ、 ） のクロロシラス） ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られる、１６ Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部と
ン含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵素とＨｌ で切断し
て得られる約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片、と同じ塩基配
列のＤＮＡからなるプロモーター、゛（Ｂ）原核生物由
来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡ。
本発明はまた、前記のプロモーターを一部位として含む
４クターの一具体例をも提供するものである。本発明に
よるこのベクターは、（Ａ）のフラクションおよび（ｎ
）のフラクションを含むノ１イゾリツドＤＮＡからなる
ものである。
４クターの一具体例をも提供するものである。本発明に
よるこのベクターは、（Ａ）のフラクションおよび（ｎ
）のフラクションを含むノ１イゾリツドＤＮＡからなる
ものである。
効果
後記実施例から明らかなように、本発明によるプロモー
ターはプロモーター活性が高い。特に、本発明によるプ
ロモーター（１，Ｉ Ｋｂｐ ）はその前駆体である５
、ＩＫｂｐのプロモーターよりも高活性である。本発明
によるプロモーターはその前駆体プロモーターの上流測
的４１５を切除したものに相当するが、このような処理
によってプロモーターとしての活性が向上したというこ
とは思いがけなかったことというべきである。
ターはプロモーター活性が高い。特に、本発明によるプ
ロモーター（１，Ｉ Ｋｂｐ ）はその前駆体である５
、ＩＫｂｐのプロモーターよりも高活性である。本発明
によるプロモーターはその前駆体プロモーターの上流測
的４１５を切除したものに相当するが、このような処理
によってプロモーターとしての活性が向上したというこ
とは思いがけなかったことというべきである。
このように、本発明によるプロモーターは高活性である
ので、大きさが約１．ＩＫｂｐと小さくて使い勝手がよ
いということと相俟って、ベクターの形として分子育種
において原核生物細胞（たとえば大腸菌）あるいは植物
細胞（たとえばゼニゴケのプロ・ドプラスト）に外来遺
伝子を導入してそれ −を発現させるのに有利に利用す
ることができる。
ので、大きさが約１．ＩＫｂｐと小さくて使い勝手がよ
いということと相俟って、ベクターの形として分子育種
において原核生物細胞（たとえば大腸菌）あるいは植物
細胞（たとえばゼニゴケのプロ・ドプラスト）に外来遺
伝子を導入してそれ −を発現させるのに有利に利用す
ることができる。
なお、本発明によるハイブリッドＤＩ（Ａの一具体例は
このプロモーターＤＮＡを大腸菌由来のシラスミドであ
るｐＭｃ１４０３に組込んでなるシラスミドｐＭＰ９０
４であるが、このハイブリッドプラスミドは本発明プロ
モーター末端のＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩ切断部位
を加えて三種類の制限酵素切断都立（ＢａｍＨＩ 、
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａ Ｉ ）を本プロモーターを挾
んで一組ずつ持っているので（第３図参照）、それへの
構造遺伝子の導入が容易であるところよりこのハイブリ
ッドプラスミドはベクターとして使い易いものであり、
またこのハイブリッドシラスミドからの本プロモーター
の切出しおよび他のベクターへの導入も容易である。
このプロモーターＤＮＡを大腸菌由来のシラスミドであ
るｐＭｃ１４０３に組込んでなるシラスミドｐＭＰ９０
４であるが、このハイブリッドプラスミドは本発明プロ
モーター末端のＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩ切断部位
を加えて三種類の制限酵素切断都立（ＢａｍＨＩ 、
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａ Ｉ ）を本プロモーターを挾
んで一組ずつ持っているので（第３図参照）、それへの
構造遺伝子の導入が容易であるところよりこのハイブリ
ッドプラスミドはベクターとして使い易いものであり、
またこのハイブリッドシラスミドからの本プロモーター
の切出しおよび他のベクターへの導入も容易である。
３、発明の詳細な説明
プロモータ一
本発明によるプロモーターは、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａ
ｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｌ、 ） のクロロ
シラスト（すなわち葉緑体） ＤＮＡを制限酵素旦凹Ｒ
Ｉで切断して得られるＤＮＡ断片であって１６ Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の全部と２３ Ｓ ｒ Ｒ犯遺伝子の一
部とを含む大きさが約５、ＩＫｂｐのもの（以下、前駆
体プロモーターという）を、さらに制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断して得られる約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片と同じ
塩基配列のＤＮＡからなるものである（Ｋｂｐが１０３
塩基対を示す慣用表現であることはいうまでもない）。
ｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｌ、 ） のクロロ
シラスト（すなわち葉緑体） ＤＮＡを制限酵素旦凹Ｒ
Ｉで切断して得られるＤＮＡ断片であって１６ Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の全部と２３ Ｓ ｒ Ｒ犯遺伝子の一
部とを含む大きさが約５、ＩＫｂｐのもの（以下、前駆
体プロモーターという）を、さらに制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断して得られる約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片と同じ
塩基配列のＤＮＡからなるものである（Ｋｂｐが１０３
塩基対を示す慣用表現であることはいうまでもない）。
ゼニゴケのクロロプラストＤＮＡの制限酵素切断地図は
、本発明者らによって既に明らかにされている（Ｍｏ１
．、Ｇｅｎ、、 Ｇｅｎ＝、ｔ、（１９８３） １８９
：１−９）および前記シンポジウム）。添付の第１図は
、この制限酵素切断地図を示すものである。
、本発明者らによって既に明らかにされている（Ｍｏ１
．、Ｇｅｎ、、 Ｇｅｎ＝、ｔ、（１９８３） １８９
：１−９）および前記シンポジウム）。添付の第１図は
、この制限酵素切断地図を示すものである。
前駆体プロモーターは、第１図において領域ｌおよび■
で示したところに含まれている。すなわち、このクロロ
プラス） Ｉ）ＮＡは２種のｒ ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ
および２３Ｓ）を逆方向反復配列で２組持っているので
、前駆体プロモーターも２組存在する。ゼニゴケクロロ
プラストＤＮＡの領域■および■のＤＮＡがプロなモー
ター活性を持つものであることは既に本発明者らの報告
したところである（前記）。
で示したところに含まれている。すなわち、このクロロ
プラス） Ｉ）ＮＡは２種のｒ ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ
および２３Ｓ）を逆方向反復配列で２組持っているので
、前駆体プロモーターも２組存在する。ゼニゴケクロロ
プラストＤＮＡの領域■および■のＤＮＡがプロなモー
ター活性を持つものであることは既に本発明者らの報告
したところである（前記）。
本発明によるプロモーターは、この前駆体プロモーター
（約５．Ｉ Ｋｂｐ ）をさらに制限酵素Ｂａｍ［（Ｉ
で切断した約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片と同じ塩基配列
を有するＤＮＡからなるものである。本発明において（
特許請求の範囲を解釈する場合を含む）１−約１、ＩＫ
ｂｐのＤＮＡ断片と同じ塩基配列のＤＮＡからなる」と
いうことは、本発明によるプロモーターがゼニゴケクロ
ロプラストＤＮＡ由来のものである場合の外に、核酸合
成の常法に従って純化学合成的に得られたものである場
合をも包含することを意味するものである（これら両極
端の場合の中間として生化学合成／半生合成により得ら
れる場合も包合されることはいうまでもない）。
（約５．Ｉ Ｋｂｐ ）をさらに制限酵素Ｂａｍ［（Ｉ
で切断した約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片と同じ塩基配列
を有するＤＮＡからなるものである。本発明において（
特許請求の範囲を解釈する場合を含む）１−約１、ＩＫ
ｂｐのＤＮＡ断片と同じ塩基配列のＤＮＡからなる」と
いうことは、本発明によるプロモーターがゼニゴケクロ
ロプラストＤＮＡ由来のものである場合の外に、核酸合
成の常法に従って純化学合成的に得られたものである場
合をも包含することを意味するものである（これら両極
端の場合の中間として生化学合成／半生合成により得ら
れる場合も包合されることはいうまでもない）。
本発明によるプロモーターは、第１図において領域■お
よび■において斜腺で示した位置のＤＮＡに対応する。
よび■において斜腺で示した位置のＤＮＡに対応する。
第２図は、第１図の領域ｌを拡大して示したものである
。記号に、ＫＸＢｇ、およびＢを付して示した直線１は
制限酵素Ｋｐｎ Ｉ 、旦要ＲＩ、■■、およびＪｌ！
Ｔ（Ｉによる切断部位を有するゼニゴケクロロプラス）
ＤＮＡ鎖であって、１６ＳｒＲＮ纜伝子および２３Ｓ
ｒＲＮＡ；ｉｌｌ伝子が直線２および３で示した位置に
存在する。このＤＮＡ（１）をＥｃｏＲＩで切断して得
られるＤＮＡ断片（直線４）が、約５．Ｉ Ｋｂｐの大
きさの前駆体プロモーターであって、１６８ｒＲＮＡ遺
伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡｉ伝子の一部とを含んでい
る。本発明によるプロモーターは、直線５に対応するも
のであって、前駆体プロモーター由来のＥｃｏＲＩ切断
部位な一端に、新しく形成された陰ＨＩ切断部位を他端
に有する。
。記号に、ＫＸＢｇ、およびＢを付して示した直線１は
制限酵素Ｋｐｎ Ｉ 、旦要ＲＩ、■■、およびＪｌ！
Ｔ（Ｉによる切断部位を有するゼニゴケクロロプラス）
ＤＮＡ鎖であって、１６ＳｒＲＮ纜伝子および２３Ｓ
ｒＲＮＡ；ｉｌｌ伝子が直線２および３で示した位置に
存在する。このＤＮＡ（１）をＥｃｏＲＩで切断して得
られるＤＮＡ断片（直線４）が、約５．Ｉ Ｋｂｐの大
きさの前駆体プロモーターであって、１６８ｒＲＮＡ遺
伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡｉ伝子の一部とを含んでい
る。本発明によるプロモーターは、直線５に対応するも
のであって、前駆体プロモーター由来のＥｃｏＲＩ切断
部位な一端に、新しく形成された陰ＨＩ切断部位を他端
に有する。
ハイブリッドＤＮＡ／ベクター
プロモーターは遺伝子ｍ鎖中のある部位のＤＮＡフラク
ションのことであるから、本発明によるプロモーターも
その罠のフラクションと他のＤＮＡのフラクションとか
らなるハイブリッドＤＮＡの形で存在することがふつう
である。この場合の他のＤＮＡ ７ラクシヨンどしては
、細菌、ウィルス、植物細胞、咄乳動物、その他がらの
ものまたはそれと同じ塩基配列のもの、がありうる。
ションのことであるから、本発明によるプロモーターも
その罠のフラクションと他のＤＮＡのフラクションとか
らなるハイブリッドＤＮＡの形で存在することがふつう
である。この場合の他のＤＮＡ ７ラクシヨンどしては
、細菌、ウィルス、植物細胞、咄乳動物、その他がらの
ものまたはそれと同じ塩基配列のもの、がありうる。
このようなハイブリッドＤＮＡの一つり具体例は、前記
した本発明によるプロモーターのフラクション（Ａ）と
原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡのフラク
ション（Ｂ）とからなるものである。ここで「原核生物
由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡ ｊとは、本発明
プロモーターに関して前記したと同様に、該生物由来の
ものの外に純化学合成的に得られたＤＮＡをも包含する
ものである。この具体例のハイブリッドＤＮＡの好まし
い一例は、原核生物由来のＤＮＡが大腸菌のプラスミド
の少なくとも一部をなすもの、であるものである。
した本発明によるプロモーターのフラクション（Ａ）と
原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡのフラク
ション（Ｂ）とからなるものである。ここで「原核生物
由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡ ｊとは、本発明
プロモーターに関して前記したと同様に、該生物由来の
ものの外に純化学合成的に得られたＤＮＡをも包含する
ものである。この具体例のハイブリッドＤＮＡの好まし
い一例は、原核生物由来のＤＮＡが大腸菌のプラスミド
の少なくとも一部をなすもの、であるものである。
このフラクション（Ａ）と（Ｂ）とからなるハイブリッ
ドえＡの好ましい形態は、環状構造のプラスミドである
。このようなプラスミドの一具体例は、大腸菌由来のプ
ラスミドｐＭｃＬ４０３に本発明プロモーターを該シラ
スミド由来の数塩基対のＤＮＡと共に組込んでなるｐＭ
Ｐ９０４である（詳細後記）。プラスミｐ ｐＭＰ９０
４は三種の制限酵素（Ｅ、ｓおよびＢ）切断部位を本発
明プロモーターを挾んで一組ずつ持っていて便利なもの
であることは前記したところである。
ドえＡの好ましい形態は、環状構造のプラスミドである
。このようなプラスミドの一具体例は、大腸菌由来のプ
ラスミドｐＭｃＬ４０３に本発明プロモーターを該シラ
スミド由来の数塩基対のＤＮＡと共に組込んでなるｐＭ
Ｐ９０４である（詳細後記）。プラスミｐ ｐＭＰ９０
４は三種の制限酵素（Ｅ、ｓおよびＢ）切断部位を本発
明プロモーターを挾んで一組ずつ持っていて便利なもの
であることは前記したところである。
本発明によるプロモーターを含む前記のノ・イブリッド
ＤＮＡないしプラスミドは、外来遺伝子ＤＮＡをそこへ
挿入してなる組込体によって適当な宿主細胞に該外来遺
伝子を心入すべきベクターとして利用することができる
。ベクターとしての一興体例は、本発明によるプロモー
ター以外の部分が原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列
のＤＮＡであるものである。すなわち、本発明によるベ
クターは、前記の（Ａ）のフラクションおよび（Ｂ）の
フラクションを含むハイブリッドＤＮＡからなるもので
ある。この具体例のベクターの一例は、原核生物由来の
ＤＮＡが大腸−のプラスミドの少なくとも一部をなすも
のおよび（または）環状構造のプラｖミドリ形態である
もの、である。このようなプラスミドの一例は、前記し
たｐＭＰ９０４ （詳細後記）である。
ＤＮＡないしプラスミドは、外来遺伝子ＤＮＡをそこへ
挿入してなる組込体によって適当な宿主細胞に該外来遺
伝子を心入すべきベクターとして利用することができる
。ベクターとしての一興体例は、本発明によるプロモー
ター以外の部分が原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列
のＤＮＡであるものである。すなわち、本発明によるベ
クターは、前記の（Ａ）のフラクションおよび（Ｂ）の
フラクションを含むハイブリッドＤＮＡからなるもので
ある。この具体例のベクターの一例は、原核生物由来の
ＤＮＡが大腸−のプラスミドの少なくとも一部をなすも
のおよび（または）環状構造のプラｖミドリ形態である
もの、である。このようなプラスミドの一例は、前記し
たｐＭＰ９０４ （詳細後記）である。
プラスミドｐＭＰ ９０４を含む大腸菌に１２ＭＣ１０
６１は、昭和お年８月１９日に工業技術院微物工業技術
研究所に寄託されて、微工研菌寄第７２０２号の受託番
号を得ている。
６１は、昭和お年８月１９日に工業技術院微物工業技術
研究所に寄託されて、微工研菌寄第７２０２号の受託番
号を得ている。
顎
本発明プロモーターの有Ｎ性
本発明によるプロモーターは、その前駆体プロモーター
と同様に、あるいは一般のプロモーターと同様に１プロ
モ一ター個有の有用性を有する。
と同様に、あるいは一般のプロモーターと同様に１プロ
モ一ター個有の有用性を有する。
すなわち、本発明によるプロモーター（ハイブリッドＤ
ＮＡないしハイブリッドプラスミドの形態にあるのがふ
つうである）の下流（α」Ｒ■切断側）に原核生物の遺
伝子を結合させて得られるキメラないし組換体ＤＮＡな
いしプラスミドは、適当な宿主細胞での当該遺伝子の発
現に有利に利用するととができる。
ＮＡないしハイブリッドプラスミドの形態にあるのがふ
つうである）の下流（α」Ｒ■切断側）に原核生物の遺
伝子を結合させて得られるキメラないし組換体ＤＮＡな
いしプラスミドは、適当な宿主細胞での当該遺伝子の発
現に有利に利用するととができる。
また、一般に、原核生物の遺伝子発現においては・、た
とえばラクトースオペロンの場合のように一つのプロモ
ーターによってそれに続く一連の構造遺伝子群の発現が
支配されているのに対し、真核生物の遺伝子発現におい
ては各構造遺伝子ごとにプロモーターが必要であって、
真核細胞由来の外来遺伝子を発現させるのはプロモータ
ーをその遺伝子の前に置くことによって可能となる。従
って、本発明によるプロモーターのＤＮＡ塩基配列が決
定されれば、本ＤＮＡ断片上の翻訳開始コドンから下流
に、外来遺伝子ＤＮＡ断片を組込み部位をあわせて結合
させることにより、真核生物の遺伝子プｐモーター／ハ
イブリッドプラスミＰの作成本発明によるプロモーター
は、ゼニゴケクロロプラス） ＤＮＡの単離およびその
二段階制限酵素処理から基本的になる方法によって得る
ことができる訳であるが、好ましくは適当なプラスミド
を選んで制限酵素による切断、連結、形質転換等の単位
操作を適宜実施すること罠よって、このプロモーターを
該シラスミドとの組換体として得るのがよい。これらの
単位操作は遺伝子操作において慣用されているものであ
り、その詳細は放置あるいは総説、たとえば「遺伝子操
作実験マニュアル」（講談社（１９８２年刊））、に記
載されている。
とえばラクトースオペロンの場合のように一つのプロモ
ーターによってそれに続く一連の構造遺伝子群の発現が
支配されているのに対し、真核生物の遺伝子発現におい
ては各構造遺伝子ごとにプロモーターが必要であって、
真核細胞由来の外来遺伝子を発現させるのはプロモータ
ーをその遺伝子の前に置くことによって可能となる。従
って、本発明によるプロモーターのＤＮＡ塩基配列が決
定されれば、本ＤＮＡ断片上の翻訳開始コドンから下流
に、外来遺伝子ＤＮＡ断片を組込み部位をあわせて結合
させることにより、真核生物の遺伝子プｐモーター／ハ
イブリッドプラスミＰの作成本発明によるプロモーター
は、ゼニゴケクロロプラス） ＤＮＡの単離およびその
二段階制限酵素処理から基本的になる方法によって得る
ことができる訳であるが、好ましくは適当なプラスミド
を選んで制限酵素による切断、連結、形質転換等の単位
操作を適宜実施すること罠よって、このプロモーターを
該シラスミドとの組換体として得るのがよい。これらの
単位操作は遺伝子操作において慣用されているものであ
り、その詳細は放置あるいは総説、たとえば「遺伝子操
作実験マニュアル」（講談社（１９８２年刊））、に記
載されている。
このプロモーターの塩基配列が判れば、全合成化学的に
作成が可能なことはいうまでもない。
作成が可能なことはいうまでもない。
本発明プロモーターの前駆体プロモーター（約５、Ｉ
Ｋｂｐ ）が公知であることは前記したところであるが
、この前駆体プロモーターの作成をも含めて本発明プロ
モーターをハイブリッドシラスミドとして得る方法の一
具体例を示せば、下記の通りである。第３図は、この反
応を示す工程図である。
Ｋｂｐ ）が公知であることは前記したところであるが
、この前駆体プロモーターの作成をも含めて本発明プロ
モーターをハイブリッドシラスミドとして得る方法の一
具体例を示せば、下記の通りである。第３図は、この反
応を示す工程図である。
第３図において、プラスミドｐＭＰ９０３は前駆体プ１
：ｌモー１−（約５．ＩＫｂｐ）のフラクション（斜想
の部分）を含むものであり、シラスミドｐＭＰ９０４は
本発明によるプロモーター（約１゜Ｉ Ｋｂｐ ）のフ
ラクション（斜線の部分）を含むものである。なお、プ
ラスミドｐＭｃ１４０３は、１ａｅＺ構造遺伝子は持つ
がプロモーター領域が欠失しているものである（ Ｊ、
Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏ、座、Ｎｏ 、２．９７１〜９
８０（１９８０））。
：ｌモー１−（約５．ＩＫｂｐ）のフラクション（斜想
の部分）を含むものであり、シラスミドｐＭＰ９０４は
本発明によるプロモーター（約１゜Ｉ Ｋｂｐ ）のフ
ラクション（斜線の部分）を含むものである。なお、プ
ラスミドｐＭｃ１４０３は、１ａｅＺ構造遺伝子は持つ
がプロモーター領域が欠失しているものである（ Ｊ、
Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏ、座、Ｎｏ 、２．９７１〜９
８０（１９８０））。
１）ゼニゴケクロロプラストＤＮＡ中のプロモーターの
単離 （１）プラスミド１）ＭＰ９０３の作成定常期のゼニゴ
ケ培養細胞より犬山らの方法（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、４６．２３７（１９８２））、によりクロ
ロプラストα勉を単離精製する。このＤＮＡを制限酵素
Ｅｃ ｏＲＩで分解する。一方、大腸菌プラスミドｐＭ
ｃ１４０３ （ｌａｃ Ｚ構造遺伝子はもつが、プロモ
ーター領域は欠失している）を、制限酵素Ｅｅ。
単離 （１）プラスミド１）ＭＰ９０３の作成定常期のゼニゴ
ケ培養細胞より犬山らの方法（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、４６．２３７（１９８２））、によりクロ
ロプラストα勉を単離精製する。このＤＮＡを制限酵素
Ｅｃ ｏＲＩで分解する。一方、大腸菌プラスミドｐＭ
ｃ１４０３ （ｌａｃ Ｚ構造遺伝子はもつが、プロモ
ーター領域は欠失している）を、制限酵素Ｅｅ。
ＲＩ で分解してから、アルカリホスファターゼ処理に
付す。これらの鳳をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結後
、生成組換体シラスミドで大腸ｆｄＭｃ１０６１ （１
ａｃ−）を形質転換させ、アンピシリンを會むＭａｃ
Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地（Ｊ、ＨｌＭｉｌｌｅｒ ： Ｅ
ｘｐｅｒｌ−＋Ｔ１ｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅ’ｃｕｌ
ｓｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ。
付す。これらの鳳をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結後
、生成組換体シラスミドで大腸ｆｄＭｃ１０６１ （１
ａｃ−）を形質転換させ、アンピシリンを會むＭａｃ
Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地（Ｊ、ＨｌＭｉｌｌｅｒ ： Ｅ
ｘｐｅｒｌ−＋Ｔ１ｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅ’ｃｕｌ
ｓｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ。
１９７２、Ｐ４８）上でアンピシリン耐性かつβ−ガラ
クトシダーゼ活性プラスの組換体を得る。この組換体の
プラスミドを抽出して構造を調べると第３図中段に示す
制限酵素切断地図が得られ、５．ＩＫｂｐのゼニゴケク
ロロプラストＤＮＡ中片が含まれることがわかる。
クトシダーゼ活性プラスの組換体を得る。この組換体の
プラスミドを抽出して構造を調べると第３図中段に示す
制限酵素切断地図が得られ、５．ＩＫｂｐのゼニゴケク
ロロプラストＤＮＡ中片が含まれることがわかる。
（２）ゼニビケクロロプ２ストＤＮＡ制限酵素切断地図
上でのプロモーターを含む５．１１ｃｂｐのＥｅ。
上でのプロモーターを含む５．１１ｃｂｐのＥｅ。
ＲＩ切断断片の位置の推定
とのＢｅ ｏＲＩ切断断片の位置は、本断片をゾローブ
とする方法によって、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡ上
の既に知られているリセソームＲＮＡ遺伝子を含む位置
であることがわかる。また、より詳しいゼニビケクロロ
プラスト■仏の制限酵素切断地図（第１図）から、これ
は第１図の領域ｌおよび■の位置であることがわかる。
とする方法によって、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡ上
の既に知られているリセソームＲＮＡ遺伝子を含む位置
であることがわかる。また、より詳しいゼニビケクロロ
プラスト■仏の制限酵素切断地図（第１図）から、これ
は第１図の領域ｌおよび■の位置であることがわかる。
すなわち、この部分は逆方向反街配列であることが知ら
れているので、図に示すように２箇所に同一の塩基配列
のものが存在する。
れているので、図に示すように２箇所に同一の塩基配列
のものが存在する。
（３）プラスミ＋ｙ ｐＭＰ９０４の作成上記のように
して得られるプラスミドｐＭＰ９０３を、制限酵素−１
１により切断する。一方、プラスミドｐＭｃ１４０３を
、制限酵素−■で分解してからアルカリフォスファター
ゼ処理に付す。これらのＤＮＡをＴ４ＤＮＡ リガーゼ
により連結し、生成組換体プラスミドで大腸菌ＭＣ１０
６１を形質転換させ、アンピシリンを含むＭａｃ Ｃｏ
ｎｋｅｙ培地上でアンピシリン耐性かつβ−ガラクトシ
ダーゼ活性プラスとなった形質転換体を得る。この形質
転換体中に、原プラスミドｐＭＰ９０３と異なるものが
得られ、そりｔｔｉｌｌ限酵素切断地図は第２図下段に
示す通りである。このシラスミド、すなわちｐＭＰ９０
４は、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡの、１．Ｉ Ｋｂ
ｐの、厘−■−Ｅｃ ｏＲＩ 切断断片、すなわち本発
明によるプロモーター、を含むものである。
して得られるプラスミドｐＭＰ９０３を、制限酵素−１
１により切断する。一方、プラスミドｐＭｃ１４０３を
、制限酵素−■で分解してからアルカリフォスファター
ゼ処理に付す。これらのＤＮＡをＴ４ＤＮＡ リガーゼ
により連結し、生成組換体プラスミドで大腸菌ＭＣ１０
６１を形質転換させ、アンピシリンを含むＭａｃ Ｃｏ
ｎｋｅｙ培地上でアンピシリン耐性かつβ−ガラクトシ
ダーゼ活性プラスとなった形質転換体を得る。この形質
転換体中に、原プラスミドｐＭＰ９０３と異なるものが
得られ、そりｔｔｉｌｌ限酵素切断地図は第２図下段に
示す通りである。このシラスミド、すなわちｐＭＰ９０
４は、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡの、１．Ｉ Ｋｂ
ｐの、厘−■−Ｅｃ ｏＲＩ 切断断片、すなわち本発
明によるプロモーター、を含むものである。
実 験 例
実施例
１）クロロプラストＤＮＡの取得
ゼニビク培養細胞を２リツトルの１Ｍ５ Ｉ Ｃ培地（
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、 １４．２２５（１９
７９） ）中で５℃で５日間培養した。この細胞を集め
フレンチプレスで破砕後、常法にしたがって粗クロロプ
ラスト両分を集めた。この粗クロロプラスト両分を２０
％と４（）チの２段階庶糖密度勾配遠心により分画して
、クロロプラスト両分を得た。このクロロプラスト画分
を３％ザルコシルＮＬ９７を含むＴＥ緩衝液（１（１ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液−１ｍＭ ＥＤＴＡ ） （ｐＨ８
，０）中に溶かしたのち、塩化セシウム密度勾配遠心に
より分画して、（９）μｇの閉環状クロロプラストＤＮ
Ａを得た。
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、 １４．２２５（１９
７９） ）中で５℃で５日間培養した。この細胞を集め
フレンチプレスで破砕後、常法にしたがって粗クロロプ
ラスト両分を集めた。この粗クロロプラスト両分を２０
％と４（）チの２段階庶糖密度勾配遠心により分画して
、クロロプラスト両分を得た。このクロロプラスト画分
を３％ザルコシルＮＬ９７を含むＴＥ緩衝液（１（１ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液−１ｍＭ ＥＤＴＡ ） （ｐＨ８
，０）中に溶かしたのち、塩化セシウム密度勾配遠心に
より分画して、（９）μｇの閉環状クロロプラストＤＮ
Ａを得た。
２） ｐＭＰ９０３の作成
このクロロプラストＤＮＡ １μｇを１０ ｍＭ ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、７ｍＭ塩化マグネシウム
、１００ ｍＭ塩化ナトリウムおよび７ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む溶液中でＥｃｏＲＩ １０ユニツ
トとともに３７℃で１時間反応させた。その後フェノー
ル処理およびエタノール沈殿を行なった。
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、７ｍＭ塩化マグネシウム
、１００ ｍＭ塩化ナトリウムおよび７ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む溶液中でＥｃｏＲＩ １０ユニツ
トとともに３７℃で１時間反応させた。その後フェノー
ル処理およびエタノール沈殿を行なった。
一方、シラスミドｐＭｃ１４０３１μｇを上記と同条件
で旦ｅｏＲＩで切断し、フェノール処理を行なったのち
、エタノール沈殿させた。この沈殿を加μｌのＴＥ緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶かし、大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ１ユニツトを加えて、３７℃で３０分反応させた。
で旦ｅｏＲＩで切断し、フェノール処理を行なったのち
、エタノール沈殿させた。この沈殿を加μｌのＴＥ緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶かし、大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ１ユニツトを加えて、３７℃で３０分反応させた。
そのあと、フェノール処理およびエタノール沈殿を行な
った。
った。
このように処理したクロロプラストＤＮＡ断片とプラス
ミ）′ＰＭＣ１４０３ＤＮＡとを水に溶解してから、連
結反応を行なった。この反応液（資）μｌ中には、１
＋ｎＭ ＡＴＰ−６６ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，６）−６，６ｒｒ＋］１１（塩化マグネシウムと１０
ｍＭジチオスレイトールとＴ ４ ＤＮＡリガーゼＯ
ｏ１ユニットとが含まれていた。１２℃で１６時間反応
させたのち、フェノール処理およびエタノール沈殿を行
ない、その後ＴＥ（ｐＩ（８，０）１０μｍに溶解した
。
ミ）′ＰＭＣ１４０３ＤＮＡとを水に溶解してから、連
結反応を行なった。この反応液（資）μｌ中には、１
＋ｎＭ ＡＴＰ−６６ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，６）−６，６ｒｒ＋］１１（塩化マグネシウムと１０
ｍＭジチオスレイトールとＴ ４ ＤＮＡリガーゼＯ
ｏ１ユニットとが含まれていた。１２℃で１６時間反応
させたのち、フェノール処理およびエタノール沈殿を行
ない、その後ＴＥ（ｐＩ（８，０）１０μｍに溶解した
。
この全量によって大腸菌ＭＣ１０６１（１ａｃ−）の形
質転換を行なった。形質転換は、カルシウム法な用いて
、大腸菌をコンピテントセル化する方法によって行なっ
た。このコンピテントセルに上記のようにして作成した
ＤＮＡを加え、０℃に２）仕置いたのち４３．５℃で２
分間熱処理してから、２×Ｌ培地（２０ｇポリペプトン
、１０ｇイーストエキストラクトおよび１０ ｇ Ｎａ
Ｃ１を１リツトルの水に溶解してｐＨ７，５としたもの
）を等量加え、３７℃でω分間インキュベーションした
のち、５０ｍｇ／リットルのアンピシリンを含むＭａｃ
Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地（デフコ社製の培地１０ｇを１
００ ｍｌ の水に溶解したもの）にまいた。３７℃で
１晩静置培養後、アンピシリン耐性株２００株が得られ
たが、そのうち３株が赤く着色したコロニーとなった。
質転換を行なった。形質転換は、カルシウム法な用いて
、大腸菌をコンピテントセル化する方法によって行なっ
た。このコンピテントセルに上記のようにして作成した
ＤＮＡを加え、０℃に２）仕置いたのち４３．５℃で２
分間熱処理してから、２×Ｌ培地（２０ｇポリペプトン
、１０ｇイーストエキストラクトおよび１０ ｇ Ｎａ
Ｃ１を１リツトルの水に溶解してｐＨ７，５としたもの
）を等量加え、３７℃でω分間インキュベーションした
のち、５０ｍｇ／リットルのアンピシリンを含むＭａｃ
Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地（デフコ社製の培地１０ｇを１
００ ｍｌ の水に溶解したもの）にまいた。３７℃で
１晩静置培養後、アンピシリン耐性株２００株が得られ
たが、そのうち３株が赤く着色したコロニーとなった。
このシラスミドをアルカリ法により抽出し、制限酵素Ｅ
ｃ ｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍｎＩ 、Ｂｇｌ ＩＩ
などにより分解し制限酵素切断地図を作成した（第３図
）。第３図に示すように、５、Ｉ Ｋｂｐゼニげケクロ
ロッジストＤＮＡ断片がプラスミ＋’ｐＭＣ１４０３の
ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入されていることがわかった。
ｃ ｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍｎＩ 、Ｂｇｌ ＩＩ
などにより分解し制限酵素切断地図を作成した（第３図
）。第３図に示すように、５、Ｉ Ｋｂｐゼニげケクロ
ロッジストＤＮＡ断片がプラスミ＋’ｐＭＣ１４０３の
ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入されていることがわかった。
このプラスミｒをｐＪＶＩＰ ９０３とした。
３） ｐＭＰ９０４の作成
プラスミドｐＭＰ９０３には５．Ｉ Ｋｂｐのゼニ２ケ
クロロプラス） ＤＮＡが含まれており、このＤＮＡ断
片中よりＲＮＡ伝写が開始されてβ−ガラクトシダーゼ
が生産されることは本発明者らの示したところである（
第８回植物組織培養シンポジウム）。
クロロプラス） ＤＮＡが含まれており、このＤＮＡ断
片中よりＲＮＡ伝写が開始されてβ−ガラクトシダーゼ
が生産されることは本発明者らの示したところである（
第８回植物組織培養シンポジウム）。
本発明者らはこのプロモータ一部位をさらに限定するた
め、ｐＭＰ９０４を作成した。シラスミｒｐＭＰ９０３
をアルカリ法により取得したのち、前述と同様の方法で
１μｇのＤＮＡを１０ユニツトの１３ａｍＨＩ により
分解した。一方、プラスミドｐＭｃ１４０３についても
同様に１μｇを１０ユニツトのＢａｍＴ（Ｉにより分解
し、つづいてアルカリフオスファターぜ処理した。
め、ｐＭＰ９０４を作成した。シラスミｒｐＭＰ９０３
をアルカリ法により取得したのち、前述と同様の方法で
１μｇのＤＮＡを１０ユニツトの１３ａｍＨＩ により
分解した。一方、プラスミドｐＭｃ１４０３についても
同様に１μｇを１０ユニツトのＢａｍＴ（Ｉにより分解
し、つづいてアルカリフオスファターぜ処理した。
これらのＤＮＡ断片をＴ ４ ＤＮＡリガーゼにより連
結し、生成組換体プラスミドで大腸菌ＭＣ１０６１の形
質転換を行なった。アンピシリン耐性株として１００個
のクローンが得られ、そのうち１６個がβ−ガラクトシ
ターゼ活性プラスであった。このうち３１固のクローン
中には１．ＩＫｂｐのゼニザケンロロプラス） ＤＮＡ
断片が含まれていた（残りはプラスミドｐＭＰ９０３と
まったく同一であった）。このプラスミドを抽出して、
制限酵素切断地図を作成した（第２図下部）。
結し、生成組換体プラスミドで大腸菌ＭＣ１０６１の形
質転換を行なった。アンピシリン耐性株として１００個
のクローンが得られ、そのうち１６個がβ−ガラクトシ
ターゼ活性プラスであった。このうち３１固のクローン
中には１．ＩＫｂｐのゼニザケンロロプラス） ＤＮＡ
断片が含まれていた（残りはプラスミドｐＭＰ９０３と
まったく同一であった）。このプラスミドを抽出して、
制限酵素切断地図を作成した（第２図下部）。
このシラスミｒを、ｐＭＰ９０４と名づけた。プロモー
ターは、このＥｃ ｏＲＩとＢａｒｒｆｆＩＩにかこま
れる１、ＩＫｂｐの断片の中に存在すると考えられた。
ターは、このＥｃ ｏＲＩとＢａｒｒｆｆＩＩにかこま
れる１、ＩＫｂｐの断片の中に存在すると考えられた。
参考例
本プロモーターを含む１．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片と、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドとの組換
体を作成して、実際に本プロモーターがβ−ガラクトシ
ダーゼの発現に有効であり、しかもラクトースプロモー
ター活性および約５．Ｉ Ｋｂｐ断片でのプロモーター
活性に較べて約１．２倍強い活性を有することを明らか
にした。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドとの組換
体を作成して、実際に本プロモーターがβ−ガラクトシ
ダーゼの発現に有効であり、しかもラクトースプロモー
ター活性および約５．Ｉ Ｋｂｐ断片でのプロモーター
活性に較べて約１．２倍強い活性を有することを明らか
にした。
具体的には、前記実施例で得られるシラスミｒｐＭｃ９
０４ でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持たない大腸菌
ＭＣ１０６１を形質転換させて得た株のβ−ガラクトシ
ダーゼ生産能を、（１）ラクトースプロモーターにより
β−ガラクトシ〆−ゼを生産する大腸菌の野生株Ｗ３１
１０． （２）形質転換を行なってな（・大腸菌ＭＣ１
０６１株、並びにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はあるが
プロモーターのないシラスミドｐＭｃ１４０３および５
，１１ｃｂｐ ＤＮＡ断片とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子とを含む組換体プラスミドｐＭｃ９０３でそれぞれ大
腸ｆｆｊＭｃ１０６１株を形質転換させた株（（３）お
よび（４））の４株と比較した。各菌株のβ−ガラクト
シダーゼ生産能の測定は、ミラーの方法（Ｊ、Ｈ０Ｍｉ
ｌｌｅｒ前掲書、第３５２頁）に従った。
０４ でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持たない大腸菌
ＭＣ１０６１を形質転換させて得た株のβ−ガラクトシ
ダーゼ生産能を、（１）ラクトースプロモーターにより
β−ガラクトシ〆−ゼを生産する大腸菌の野生株Ｗ３１
１０． （２）形質転換を行なってな（・大腸菌ＭＣ１
０６１株、並びにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はあるが
プロモーターのないシラスミドｐＭｃ１４０３および５
，１１ｃｂｐ ＤＮＡ断片とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子とを含む組換体プラスミドｐＭｃ９０３でそれぞれ大
腸ｆｆｊＭｃ１０６１株を形質転換させた株（（３）お
よび（４））の４株と比較した。各菌株のβ−ガラクト
シダーゼ生産能の測定は、ミラーの方法（Ｊ、Ｈ０Ｍｉ
ｌｌｅｒ前掲書、第３５２頁）に従った。
結果は、下記第１表に示す通りであった。
この結果、本プロモーターを含む１．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮ
Ａ断片は、組換体ＤＮＡに組込まれたときもプロモータ
ーとして働き、しかもラクトースプロモーター活性およ
び５．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片でのプロモーター活性の
約１．２倍の生産量を示すことから、本プロモーターを
含む１．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片が非常に有用であるこ
とは明らかである。
Ａ断片は、組換体ＤＮＡに組込まれたときもプロモータ
ーとして働き、しかもラクトースプロモーター活性およ
び５．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片でのプロモーター活性の
約１．２倍の生産量を示すことから、本プロモーターを
含む１．Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片が非常に有用であるこ
とは明らかである。
第１図は、ゼニザケクロロプラス） ＤＮＡの各種制限
酵素による切断地図および本発明プロモーターの地図上
の位置を示す説明図である。 図中、内部のｒＲＮＡ矢印は当該ｒＲＮＡ遺伝子の位置
を示す。 第２図は、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡの本発明プロ
モーター塩基配列付近の制限酵素切断地図、ならびに同
地図における５、Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片および本発男
による］ 、Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片の位置を示す説明
図である。 図中に、Ｂｇ、ＥおよびＢは、それぞれ制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ、ジｒｌ ｌ 、 ＥｃｏＲｒ 、および御四Ｆ（Ｉ
の切断部位を示す。また、１ａｃ’Ｚ、ＩａｃＹおよび
Ａｐ ｒは、それぞれプロモーターの入植したβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシド）ぞ−ミアーゼ
遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子である◎第３図は
、本発明プロモーターの一製法に関する説明図である。 出願人代理人 猪 股 渭 図面の浄書（内容に変更なし） ｂ １ 圓 ５２ 図 （４） 丁−、ＭＰ９０４ （５） 朽 ３ 口 ｐＭＣ１４０３ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和郭年特許願第１５４２７０号 ２、発明の名称 プロモーター ３、補正をする者 事件との関係特許出願人 誤麟麦酒株式会社 （ほか１名） 手続補正書 昭和閏年１２月耕日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５４２７０号 ２、発明の名称 ゾ０−１ニーター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 夙麟麦酒株式会社 （ほか１名） 明細書の「発明の詳細な説明」の欄および「図面の簡単
な説明」の欄。 Ｑ７− ８、補正の内容 （１）明細書を下記の通りに補正する。 ４ １４ １ａｃ Ｉａｃ ４１５ｔｒｐ 且且 ４１７ａｒａ ａｒ土 ５２ ファージ 細菌またはファー ジ ９１７ １−９） １−９ １０ ４ ２組 ２１固 １１１ 包合 包含 １５ ５ 発現させるのは 発現させるには１７１４）
）。に ））に ７、 １８ ４ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＩ「 −１２０９蔗糖 蔗糖 ２３１９ ガラクトシダーゼ ガラクトシダーゼ２４４
第２図 第３図 （２１Ｆ！Ａａ書第あ頁の＠１表を、下記の通りに補正
する。 欄 補正前 補正後 宿主の（岡 Ｗ３１１０（１；匹） Ｗ３１１０（Ｉａ
ｃ”）シラスミドの欄 （！王ｚ）（側２） （３）明細書第２７頁下かも第２行と最終行との間に、
下記を加入する。 ［クル３図は、本発明プロモーターの一つの製法に関す
る説明図である。」 （４） 明細書第２８員第６−７行 「第３図は〜である。」を削除する。 手続ネｆｌｉ正錫 昭和５９年８ 月ノア日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年 特許願 第１５４２７０号２ 発明の名称 プ ロ モ − タ − ３ 補正をづ゛る者 事件との関係 特許出願人 田（麟 麦 酒 株 式 会 社 （ばか１名） ４ 代 理 人 ７ 補正の対象 ゛ご −′ 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 受託番号変更届 昭和５９年８り／７日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年 特許願 第１５４２７０号２ 発明の名称 プ ロ モ − タ − ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ｍ＋ 麟 麦 酒 株 式 会 社 （ほか１名） ４ 代 理 人 工業技術院微生物工業技術（σ１究Ｊ１１６ 旧受託番
号 微工研菌寄第７２０２号 ９ 添付書類の目録 （１） 新寄託番号を証明する書面（写）１１３８
酵素による切断地図および本発明プロモーターの地図上
の位置を示す説明図である。 図中、内部のｒＲＮＡ矢印は当該ｒＲＮＡ遺伝子の位置
を示す。 第２図は、ゼニゴケクロロプラストＤＮＡの本発明プロ
モーター塩基配列付近の制限酵素切断地図、ならびに同
地図における５、Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片および本発男
による］ 、Ｉ Ｋｂｐ ＤＮＡ断片の位置を示す説明
図である。 図中に、Ｂｇ、ＥおよびＢは、それぞれ制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ、ジｒｌ ｌ 、 ＥｃｏＲｒ 、および御四Ｆ（Ｉ
の切断部位を示す。また、１ａｃ’Ｚ、ＩａｃＹおよび
Ａｐ ｒは、それぞれプロモーターの入植したβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシド）ぞ−ミアーゼ
遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子である◎第３図は
、本発明プロモーターの一製法に関する説明図である。 出願人代理人 猪 股 渭 図面の浄書（内容に変更なし） ｂ １ 圓 ５２ 図 （４） 丁−、ＭＰ９０４ （５） 朽 ３ 口 ｐＭＣ１４０３ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和郭年特許願第１５４２７０号 ２、発明の名称 プロモーター ３、補正をする者 事件との関係特許出願人 誤麟麦酒株式会社 （ほか１名） 手続補正書 昭和閏年１２月耕日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５４２７０号 ２、発明の名称 ゾ０−１ニーター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 夙麟麦酒株式会社 （ほか１名） 明細書の「発明の詳細な説明」の欄および「図面の簡単
な説明」の欄。 Ｑ７− ８、補正の内容 （１）明細書を下記の通りに補正する。 ４ １４ １ａｃ Ｉａｃ ４１５ｔｒｐ 且且 ４１７ａｒａ ａｒ土 ５２ ファージ 細菌またはファー ジ ９１７ １−９） １−９ １０ ４ ２組 ２１固 １１１ 包合 包含 １５ ５ 発現させるのは 発現させるには１７１４）
）。に ））に ７、 １８ ４ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＩ「 −１２０９蔗糖 蔗糖 ２３１９ ガラクトシダーゼ ガラクトシダーゼ２４４
第２図 第３図 （２１Ｆ！Ａａ書第あ頁の＠１表を、下記の通りに補正
する。 欄 補正前 補正後 宿主の（岡 Ｗ３１１０（１；匹） Ｗ３１１０（Ｉａ
ｃ”）シラスミドの欄 （！王ｚ）（側２） （３）明細書第２７頁下かも第２行と最終行との間に、
下記を加入する。 ［クル３図は、本発明プロモーターの一つの製法に関す
る説明図である。」 （４） 明細書第２８員第６−７行 「第３図は〜である。」を削除する。 手続ネｆｌｉ正錫 昭和５９年８ 月ノア日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年 特許願 第１５４２７０号２ 発明の名称 プ ロ モ − タ − ３ 補正をづ゛る者 事件との関係 特許出願人 田（麟 麦 酒 株 式 会 社 （ばか１名） ４ 代 理 人 ７ 補正の対象 ゛ご −′ 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 受託番号変更届 昭和５９年８り／７日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年 特許願 第１５４２７０号２ 発明の名称 プ ロ モ − タ − ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ｍ＋ 麟 麦 酒 株 式 会 社 （ほか１名） ４ 代 理 人 工業技術院微生物工業技術（σ１究Ｊ１１６ 旧受託番
号 微工研菌寄第７２０２号 ９ 添付書類の目録 （１） 新寄託番号を証明する書面（写）１１３８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ％Ｌ、） のク
ロロプラストＤＮＡを制限酵素旦遼ＲＩで切断して得ら
れる、１．６ Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全部とＺ３ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子の一部とを含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵
素ＢａｍＩ（Ｉで切断して得られる約１．ＩＫｂｐのＤ
ＮＡ断片、と同じ塩基配列のＤＮＡからなるプロモータ
ー。 ２、下記のｔＡ）のフラクションおよびＦＢ）のフラク
ションを含むハイブリツ＋ｙ ＤＮＡ ０（Ａ） ゼニ
ゴケ（ＲＪａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
Ｌ、 ）のクロロプラス） ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断して得られる、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全
部と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部とを含むＤＮＡ断片
を、さらに制限酵素ＢａｒｎＩ（Ｉで切断して得られる
約１．Ｉ ＫｂｐのＤＮＡ断片、と同じ塩基配列のＤＮ
Ａからなるプロモークー、 （Ｂ） 原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡ
。 ３、原核生物由来のＤＮＡが大腸菌のプラスミｒの少な
くとも一部をなすものである、特許請求の範囲第２項に
記載のハイブリッドＤＮＡ。 ４、シラスミドの形態である、特許請求の範囲第２〜３
項のいずれかに記載のハイプリツＰＤＮＡ、＋５、下記
の偽）のフラクションおよび（Ｂ）のフラクションを含
むハイブリッドＤＮＡからなるベクター。 （Ａ） ゼ＝＝ｒヶ（八ｋｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｖ
ｒｒ＋ｏｒｐｈａ Ｌ、 ）のクロロプラス） ＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られる、１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の全部と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部とを
含むＤＮＡ断片を、さらに制限酵素−工で切断して得ら
れる約１．ＩＫ、ｂｐのＤＮＡ断片、と同じ塩基配列の
ＤＮＡからフ、「るプロモーター、 （１３） 原核生物由来のＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮ
Ａ、 。 ６、原核生物由来のＤＮＡが大腸菌のシラスミドの少な
くとも一部をなすものである、特許請求の範囲第５項に
記載のベクター。 ７、プラスミドの形態である、特許請求の範囲第５〜６
項のいずれかに記載のベクター。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58154270A JPS6047683A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | プロモ−タ− |
| US06/642,191 US4710461A (en) | 1983-08-24 | 1984-08-20 | Promoter derived from chloroplast DNA |
| DE19843431023 DE3431023A1 (de) | 1983-08-24 | 1984-08-23 | Promotor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58154270A JPS6047683A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | プロモ−タ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6047683A true JPS6047683A (ja) | 1985-03-15 |
Family
ID=15580492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58154270A Pending JPS6047683A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | プロモ−タ− |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4710461A (ja) |
| JP (1) | JPS6047683A (ja) |
| DE (1) | DE3431023A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5075217A (en) * | 1989-04-21 | 1991-12-24 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n ·(dG-dT)n sequences |
| GB9923306D0 (en) * | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Isis Innovation | Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant |
| GB0212885D0 (en) * | 2002-06-05 | 2002-07-17 | Isis Innovation | Therapeutic epitopes and uses thereof |
| ATE426033T1 (de) * | 2003-08-11 | 2009-04-15 | Greenovation Biotech Gmbh | Promoter sequenzen aus moos und dessen verwendung |
| WO2005105129A2 (en) | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
| US10105437B2 (en) | 2004-04-28 | 2018-10-23 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
| AU2007223364B2 (en) * | 2006-03-02 | 2014-02-13 | Athenix Corporation | Methods and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant |
-
1983
- 1983-08-24 JP JP58154270A patent/JPS6047683A/ja active Pending
-
1984
- 1984-08-20 US US06/642,191 patent/US4710461A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-08-23 DE DE19843431023 patent/DE3431023A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3431023C2 (ja) | 1987-08-13 |
| DE3431023A1 (de) | 1985-03-07 |
| US4710461A (en) | 1987-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0946711B1 (en) | Improved expression vectors | |
| CN107488649A (zh) | 一种Cpf1和p300核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统和应用 | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| Waters et al. | Mutational analysis of essential IncP alpha plasmid transfer genes traF and traG and involvement of traF in phage sensitivity | |
| JPH04346787A (ja) | Ｄｎａ、組換えベクター、微生物、ｄｎａの取得法、組換え蛋白質の取得法及び組換え蛋白質 | |
| Maestro et al. | Modulation of pPS10 host range by plasmid-encoded RepA initiator protein | |
| JPH03504561A (ja) | 組換えヒトインターロイキン‐３およびその変異たんぱく質の生産および精製 | |
| Heuel et al. | Genes for D-arabinitol and ribitol catabolism from Klebsiella pneumoniae | |
| Yu et al. | Control of prophage integration and excision in bacteriophage P2: nucleotide sequences of the int gene and att sites | |
| JPS61257189A (ja) | 新規プラスミドベクタ− | |
| Meyer | Mapping type IV secretion signals on the primase encoded by the broad-host-range plasmid R1162 (RSF1010) | |
| US4710461A (en) | Promoter derived from chloroplast DNA | |
| JPH01501037A (ja) | 有機化合物の又はそれに関連する改良 | |
| Rao et al. | Characterization of mutations of the bacteriophage P1 mod gene encoding the recognition subunit of the EcoP1 restriction and modification system | |
| US5049501A (en) | Production method for PvuI restriction endonuclease | |
| JP2830030B2 (ja) | 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| Liebeschuetz et al. | Phage T1-mediated transduction of a plasmid containing the T1 pac site | |
| Gayle III et al. | Construction and characterization of pBR322-derived plasmids with deletions of the RNA I region | |
| US5830720A (en) | Recombinant DNA and expression vector for the repressible and inducible expression of foreign genes | |
| Guzman et al. | Transcription of a bacteriophage lambda DNA site blocks growth of Escherichia coli | |
| JP2612684B2 (ja) | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａを導入した形質転換微生物とその利用 | |
| JPH0380088A (ja) | 組換えｄｎａ、その製法、表現ベクター、その製法及びフラグメントの誘導可能で抑制可能な表現法 | |
| EP0234075B1 (en) | Prokaryotic expression system | |
| US4865982A (en) | Cloned streptomycete gene | |
| JPS61111691A (ja) | プロモ−タ− |