JPS6048703B2 - クロマトグラフィ−用支持体およびその調製方法 - Google Patents

クロマトグラフィ−用支持体およびその調製方法

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JPS6048703B2 JP50065250A JP6525075A JPS6048703B2 JP S6048703 B2 JPS6048703 B2 JP S6048703B2 JP 50065250 A JP50065250 A JP 50065250A JP 6525075 A JP6525075 A JP 6525075A JP S6048703 B2 JPS6048703 B2 JP S6048703B2
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Description

【発明の詳細な説明】 生物学システムの成分の分離、精製及び単離に際しては
、吸着、特にクロマトグラフィーに基ずく極めて多数の
方法が、利用できる。
このような成分は、分子又は分子の凝集体の性質を有し
、更にそれらは、全細胞、細胞形成粒子又はビールス粒
子などの組織的な生物システムからなつている。クロマ
トグラフィーは、不動相若しくは相のシステムと移動相
の成分との間の一連の複雑な相互作用によつて支配され
る。
そこで相互作用の背後にある駆動力は、静電気、水素結
合、電荷移動、或いは親油性現象に由来している。会合
−解離平衡に、天然に含まれるシステムの一つの成分が
、固定化によつて、担体のポリマーに不動化された場合
には、極めて特殊な吸着効果が得られる。
かくして得られるクロマトグラフィー媒体は相補的構造
物の吸着に使用される。この原理に基すく一つの方法は
、生化学親和力（ＢｉＯａｆｆｌｎｊｔｙ）クロマトグ
ラフィーと呼ばれている。
生化学物質の吸着とクロマトグラフィーのためには、共
有結合は、ほとんど信頼できる効果ではない。
その使用は、特異性即ち、特定の官能基又は構造に対す
る反応性を示す。増加する特異性の程度は、錯（ＣＯｍ
ｐｌｅｘ）生化学物質との働きにおいて予想できる。な
ぜならそのような分子内では、一つ及び同じ官能基の反
応性は、立体的に引き起された微細な環境のために変化
するからである。生化学物質を分離するための、多少と
も特異性のある吸着剤を調製する理論的な試みには、し
ば−しは大きな困難がある。
合理的な出発物質は、巨大分子に対して透過性のある、
化学的に中性な、強い親油性の担体ポリマーである。該
ポリマーの骨格それ自体は、化学的に不活性であるが、
温和な水性の条件下に、ラジカル反応はもちろん、塩三
生成、錯体生成、レドックス反応、置換及び付加反応の
如き広範な反応に役に立つ誘導体一形成基を備えている
。また、誘導体一形成基は、適宜の化学的変性を受けた
とき又はこうむつたときには、吸着の中心として働き、
結合ブリッジが相互４作用の中心を構成する。適当なそ
して最終的誘導化が行なわれ、このようにして導入され
た置換基又は含有された基は、相互作用の中心として働
く。
チオールは、調製の観点からして、特に利点のある官能
基であり、この基は、温和な条件下での水性システムで
も、たくさんの反応に関与する。
チオール基は、種々の機構により、錯体や塩形成・のほ
かに置換、付加更には酸化を含む反応に貢献する。この
ような反応から生じる生成物は、Ｓ一Ｃ，．Ｓ−Ｓ）Ｓ
−０ＮＳ−Ｍ）Ｓ−金属及びＳ一金属−Ｃ型の結合を含
む、チオールは、ラジカル機構を含む反応を容易に受け
るということも、こフの点で強調される。アガロースゲ
ル（ＡｇａｒＯｓｅｇｅｌ）、特にビーズ状のものは、
生化学の分離技術における担体ポリマーとして、重要な
役割を果している。近年、生特異化学親和力クロマトグ
ラフィーの急速な発展が見られる。この技術は、ほと；
んど専ら、ビーズ状のアガロースゲルに基ずいており、
アーム（Ａｒｍ）又はスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）の端部
に、クロマトグラフィーの相互作用の中心を取り付け、
かくして、担体ポリマーの骨格から、一定の最小の距離
を確保するのが有用であること”力化ばしば見出される
。他の親水性の水酸基含有ポリマー例えば架橋されたデ
キストランも、この関係でのある用途が見出される。
チオール基を含むアガロースゲルは、アセチルホモシス
チン−チオラクトンの反応によつて、アガロースのｗア
ルキル誘導体から、Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓによつて調
製された。（Ｊ −ＢｉＯｌ・Ｃｈｅｍ・２４５，３０
５９（１９７０））チオール化された生成物は、更に化
学変性した後に、生化学親和力クロマトグラフィーの吸
着剤として使用された。ＢｒＯｃｋｌｅｈｕｒｓｔ等は
、臭化シアン活性のアガロースゲルにグルタチオンを直
接カップリング（ＣＯｕｐｌｉｎｇ）することにより、
チオール基を保護することなく、チオール化したアガロ
ースゲルを調製した。（ＢｉＯｃｈｅｍ．Ｊ．ｌ３３，
５７３（１９７３））Ｅｌｄｊａｒｎ等は、エピクロル
ヒドリンで架橋したデキストランからアミノエチルスル
フェートでの処理によるアミノ基の導入、次いでアセチ
ル−ホモシステイン チオラクトンとの反応を含む二段
階の反応によつてチオール含有ゲルを調製した。（Ａｃ
ｔａｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．．ｌ７，２６ｌＯ（１９６
３））生成したチオール化したゲルは、次いで二官能性
の水銀試剤で処理され、、得られる生成物は、そのよう
な基をもたないタンパク質から、チオール含有タンパク
質を単離するのに使用された。末端構造が、−ＣＨ（０
Ｈ）−ＣルーＳＨ）−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨ２ＯＨ） −
Ｃ］−１２−ＣＨ２ＳＨ） −ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨ。
又は−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨβＨなどの構造を有する側鎖
を含むアガール及びアガロース誘導体は、ビーズ状のア
ガール及びアガロースゲＺルから、ゲルの網状構造を崩
壊させることなく調製することができる。ビーズ状の出
発物質は、最初に既知の方法で、エピハロヒドリン、２
，３−ジハロプロバノール、二官能性オキシラン、ジビ
ニルスルホンで処ノ理するか、又はハロゲン化アリルで
処理した後、ジハロプロピルエーテルにハロゲン化する
。
以下の反応式１，２，３及び４を参照されたい。生成す
る反応誘導体は、次いでＮａＳＨ又はＮａ。
ｓ。Ｏ３の水溶液で処理される。後者の場合は、次いで
、１，４ージメルカプトブタン又はその誘導体などの適
宜の還元剤で処理する。トレオ又は工リトロー１，４ー
ジメルカプトー２，３−ブタンージオールが有益である
のが判明した。かゝる後者の誘導体はそれぞれジチオト
レイトール及びジチオエリトリオールと以下表現する。
エピハロヒドリン、ジハロプロパノール又はハロゲン化
アリルを使用した場合には、−０−ＣＨ。一結合を通じ
て、ポリマーの網状構造と上記した末端構造との間に橋
かけが含まれる。適宜の長鎖の二官能性オキシランのカ
ップリングは、アーム又はスペーサー効果を直接導入す
る一つの方法である。最終の誘導体は、一Ｏ−ＣＨ２−
ＣＨ（０Ｈ）−ＣＨ２−０−アリルー０−Ｃルー末端基
などの長鎖の置換基を含む。
ジビルニルスルホンは、−Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ２
−末端基による橋かけを生じる。Ｃ−アルキル化した末
端構造は、適宜のＣ−アルキルを含むエピノ和ヒドリン
、ジハロプロパノール、ビスオギシラン、ビニルスルホ
ン又はハロゲンアリルを使用す ノることによつて得ら
れる。また、これらの反応は、他の親水性の水酸基含有
ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニル
クロライドとポリビニルアセテートの一部加水分解した
コポリマー、セルロース又はエピ ιクロハヒドリンで
架橋したデキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ：Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＮＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＵｐｐ
ｓａｌａの登録商標）などでも実施できる。
アミノ基含有ポリマー、例えばアミノ置換ポリアクリル
アミドなども、上記の反応に関与する。ある場合、それ
はゲル状での場合であろうがポリマーは、透過性である
のが好ましい。
しかし、他の場合には、これは好ましい性質ではない。
酸化反応に対して最大限保護するために、チオール化さ
れた生成物は、通常、最初に生成されたチオ硫酸塩か、
又は部分酸化によつて生成されたジサルフアイド、−Ｓ
−Ｓ として保存され、また市販されている。これらの
製品は、ジチオトレイトールの溶液で処理することによ
つて、その活性な形態に極めて簡単に還元される。かゝ
る還元は、長期間保存したチオール含有ポリマーに対し
ても適切な処理である。チオールゲルは、ＰＨ７又はそ
の付近における、例えばヨードアセトアミド及び２，４
ージニトロフルオロベンゼンでの処理によつてアレキル
化されうる。求核付加は、通常ゆるやかである。
しカル多くの生物学的化合物は、共役、又は隣接基の効
果によつて、活性化された二重結合を含んでいる。従つ
て硫黄付加物は、α、β一不飽和アルデヒド、ケトン、
ラクトン、ニトリル及びエーテルから得られる。ある天
然物には、キノイド構造が存在しており、キノンへのチ
オールの付加は、一連の興味ある反応を構成する。チオ
エーテル構造は、ほとんどのクロマトグラフィーの条件
で安定なものとみなされる。安定チオエーテルの生成を
導く、上記した型のフ反応は、生特異的吸着剤、親油的
親和性のクロマトグラフィーの吸着剤及び電荷移動効果
に基ずく吸着剤などの如き、特殊な化合物の調製に特に
適したチオールゲルをつくる。
また、チオールゲルは、化学吸着、共有 ５（ＣＯｖａｌｅｎｔ）クロマトグラフィー、化学的不
動化及び変性のための、化学的に新規な反応性官能基を
導入する出発物質としても極めて有用てある。
アルデヒド及びケトンへのチオールの付加及び縮合は、
ヘミメルカプタール、メチルカプヨークル、ヘミメルカ
プトール及びメルカプトールの生成をもたらす。これら
の生成は、可逆的化学吸着のための一応もつともな機構
を構成する。チオ硫酸塩及びチオールポリマーの種々の
調製方式はそれぞれ以下の反応式で示される。
反応方式１ａ エピクロルヒドリンと水酸化ナトリウムからのチオール
アガロースの調製反応方式１ｂ エピクロルヒドリとチオ硫酸塩からのチオポリマーの調
製反応方式２ １，４−ブタンジオールージグリシジルエーテル、チオ
硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）から
のチオールーアガロースの調製、チオ硫酸塩を含むポリ
マーは、保存安全物として回収され、且つ市販される。
それは、容易にチオールポリマーに転換され、或いは、
チオール含有化合物を固定化するための反応性ポリマー
を調製するのに使用される。（以下を参照）［Ｆ］−０
Ｈ＋ＣＨ２＝ＣＨ−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２−＋［Ｆ］−
０ −ＣＨ２−ＣＨ，−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ，峠Ｎａ，
ｓ２Ｏ３［Ｆ］−０ −ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ
２−Ｓ，Ｏ３−Ｎａ＋ＤＴＴ峠［Ｆ］−０−ＣＹｌ２−
ＣＨ，−ＳＯ，−ＣＨ，−ＣＨ２−ＳＨ反応方式３ ジビニルスルホン、チオ硫酸ナトリウム及びジチオトレ
イトール（ＤＤＴ）からのチオールーアガロースの調製
［Ｆ］−０Ｈ＋Ｂｒ−ＣＨ，−ＣＨ＝ＣＨ，−［Ｆ］−
０−ＣＨ，−ＣＨ＝Ｃ］］２Ｂｒ２反応方式４ 臭化アリル、臭素、チオ硫酸ナトリウム及びジｂチオト
レイトールからのチオールアガロースの調製。
本発明に関係する他のチオー化合物には、炭素チオエス
テルが含まれる。
これらは慣用手段により、合成される。これらの化合物
は、多くの点１で、対応するアルコール性のエステルと
顕著に異なる。クロマトグラフィーに関連するそれらの
使用は、まだ充分には、開発されていない。チオエステ
ルは、生物学的システムでは、重要な役割を果している
。とにわけ、それらは高エネルギーを．有する化合物で
ある。またそれらは、アシル化の＊Ｒ−ＳＨ＋Ｒ′−Ｓ
−Ｓ−Ｒ’＝Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ′＋Ｒ′ポリマーに結合さ
れたチオール基による、−Ｓ．−Ｓ結合の還元は、極め
て高度に置換されたチオールポリマーを必要とする。そ
のようなポリマーは、ジサルフアイド蛋白質をチオール
蛋白質に転換するのに使用される。か）る反応の後、ポ
リマーそれ自体は、ジサルフアイドブリツジを含むこと
になり、それは、例えば、上記した環元剤であるジチオ
トレイトールでの処理によつて、チオール基に再転換さ
れる。酵素は、多くの場合、その活性と直接関係してい
るチオール基をしばしば有している。
アルブミンやセルロプラスミンなどの特定の血しよう蛋
白質もチオール基を有している。細胞形成粒子も、もち
ろん蛋白質に結合したチオール基及ひ他の型のチオール
を含んでいる。しかしながら、ほとんどの蛋白質は、−
Ｓ−Ｓ−ブリッジを含むが、それは、本出願に記載した
種類の適当な高度に置換したチオールポリマーによる処
理によつて、容易にチオールに転換される。他方、チオ
ールポリマーは、チオールージサルファイド交換反応に
よつて、高い反応性のジサル （ファイト基を有するポ
リマーに容易に変換される。
そのようなポリマーがチオール含有蛋白質と反応せしめ
られた場合は、生じる生成物は、−Ｓ−Ｓ蛋白質ポリマ
ーである。しかしながら、以一ト曳試剤であり、その構
造は、アシル基のα一炭素を活性化する。従つて、不動
化されたチオエステルは、種々の生物技術分野において
、例えは蛋白質のアシル化のための水不溶性試剤として
潜在的利点がある。極めて大きな利点は、チオールが酸
化を受ける容易さにある。
かゝる反応による多くの生成物のなかで、ジサルフアイ
ドは、特に重要な役割を演じる。もろ反応性は、チオー
ル基のそれに比較して概して低い。しかし、それらは生
理学的条件においてさえも、還元や交換反応に関与する
。ジサルフアイドの還元は、チオール基によつて行なわ
れる。（チオールージサルファイドの交換は、生成学シ
ステムにおいて、実際上、極めて重要な反応である）に
示されるように、他の方法においても、チオールポリマ
ーを活性化して、チオール含有化合物の固定化にそれを
容易に利用てきるようにすることも可能てある。
チオールポリマーは、直接に、又はそのチオール基を適
宜のジサルフアイド若しくは他の類似構造に変換した後
に、例えば蛋白質の分離における、天然物の化学吸着に
使用される。
溶液中で、チオール成分と急速かつ完全な反応を導くジ
サルフアイドポリマーを、本発明では、ブ“反応性’’
ポリマージサルフアイド構造と呼ぶ。
原理的には、そのような構造は内部的であり、この場合
の高められた反応性は、特定の環張力における配座の歪
みによつて説明できる。ポリマ−ーＳ−Ｓ上のような外
面的構造のより重要な場合５においては、か）る基は、
配位子Ｌからその反応性を引き出す。チオール基のジサ
ルフアイド基への完全な変換に向かつて、反応をできる
だけ進めるために、配位子Ｌにおいて、満足されねばな
れない一定の要ｏ件が存在する。
−Ｓ −Ｓ結合の開裂に際し、チオールジサルフアイド
交換を適切に実施するためには、Ｌに結合している硫黄
は、互変異性か又は共鳴によつて、低い求核性の状態を
達成しなければならない。か＼る要件を満足させる−Ｓ
−Ｓ 一化合物の例として、ＳＨ−ポリマーと化合物
Ｌ−ＳＨとから生成される混合ジサルフアイド類が選択
される。
Ｌ一ＳＨは、そのチオン形との平衡状態で存在し、後者
が好ましい種である場合（ＬＳＨ口Ｌ−ニＳ＋Ｈ＋）、
２−チオピリドンがこの種のＬを構成する。別の例とし
ては、チオールポリマーとジチオ炭酸の誘導体とから得
られる−Ｓ−Ｓ一構造が提供される。かｊる場合、共鳴
構造は、開裂反応の不可逆性に対する基礎的な理由であ
るかもしれない。テトラメチル チウラム ジサルフア
イドは、この型の機構のよい例である。か＼る配位子を
含むチオールポリマーは、もとのチオールポリマーから
、Ｌ−Ｓ−Ｓ上とのチオールージサルファイド交換によ
つて生成される。
かくすることにより、ゲルに結合したチオール基の化学
量論的な転換を事実上与えるように反応を制御すること
によつて、ポリマー −Ｓ −Ｓ 上型のポリマー化合
物を生成できる。上記と同様にして、配位子Ｌの性質は
、ポリマ−ーＳ−Ｓ上化合物とチオール化合物との溶液
中の反応の背後にある“゜駆動力゛に影響を与え，ゝる
。
しかしながら、本発明者は、チオールポリマーへの配位
子の導入は、チオ硫酸塩エステルポリマーをＬ−Ｓ−Ｓ
上試剤で処理することによつて、即ち、チオ硫酸塩エス
テルのチオールへの予備的還元を行なうことなく直接に
行なえることを見い出した。
これは、一段階でほぼ理論的な収率をもつて、強い反応
性のあるポリマ−ーＳ−Ｓ上生成物に転換するところの
、貯蔵安定性のあるチオ硫酸塩ポリマーの使用を正当化
するので、極めて技術的及び経済的な利点がある。例え
ば、これは、上記した一つのジサルフアイド化合物との
反応によつて達成できる。こ＼で述べた型、即ち他の型
のポリマー −Ｓ −ｓ −ＰｒＯｔ化合物を（ＰｒＯ
ｔ＝蛋白質）のポリマージサルフアイド配位子を生成さ
せる全く別の方法は、ポリマー スルフエニル誘導体と
蛋白質−チオールとの反応にその根拠を有する。このよ
うなスルフエニル誘導体は、例えば、ポリマ−ーチオー
ルとアゾジカルボン酸塩との一般式（１）による反応に
よつて得られる。続く蛋白質−チオールとの反応は、式
１２）によつて示される。カルボン酸エチル基は、他の
カルボン酸塩基又は更に一般的には、他の電子吸引基に
よつて置換できる。従つてチオ−ルー蛋白質の不動化は
、二段階の反応を通じて進行する。
即ち、段階１では、チオ−ルーポリマーのアルキルスル
フエニルヒドラジドへの活性化一転換が含まれる。後者
の化合物は、水性媒体での貯蔵で安定であり、また、例
えばＰＨ４又はそれ以下の弱酸性溶液のような温和な条
件下に、溶液中てチオール化合物と反応して、ポリマー
−ｓ −ｓ −ＰｒＯｔ又は他の類似物を生成させる
。上記では、チオール化合物の例として、それ自身が結
合するようなＨＳ−ＰｒＯｔが使用された。しかし、か
ｊる方法は、その表面に、天然に生じるか又は人工的に
導入した接近可能なＳＨ−基を有するならば、細胞片、
ビールス粒子などの種はもちろん、如何なる溶解性のチ
オール化合物を使用しても実施てきるもので、上記の例
は、限定的に解釈してはならない。生化学の分野におけ
る生特異性のクロマトグラフィーの技術の発展は、水−
不溶性の酵素の発展と大きく関係している。
酵素を不動化するために、最も普通に使用される方法は
、担体ポリマーに対する共有（ＣＯｖａｌｅｎｔ）付着
又は吸着を含んでいる。最近の情勢における極めて興味
深いこと５は、ジサルフアイドブリツジを通じて酵素を
不動化できる可能性がある点である。その結合自体は、
適宜の条件下で還元開製を起す。不動化酵素のカラムは
、一定期間使用後にその活性を失なうので、不活性化し
た酵素の還元脱離を通じて、そ１ιの場所で再生される
。ポリマーの再活性化（その場での）の後、次いで、カ
ラム反応器は、新たな酵素の更新カップリング（ＣＯｕ
ｐｌｉｎｇ）のために使用される。酵素の可逆的不動化
の別の方法、それは最近発１−見されたのであるが、そ
の根拠は、酵素と、混合した親油−親水的特徴を有する
担体ポリマーとの間の親油的相互作用にある。
かゝる不動化の技術は、大きな利点を有していない。そ
の理由は、イオンカ又は他の周囲のパラメーターにおけ
る変化２によつて、部分的又は全面的不活性を招く、酵
素の解任（ＲｅｍＯｖａｌ）を許すためである。（例え
ばスエーデン特許出願ＮＯ．７４ｌＯ５５Ｏ−３を参照
）か）る解任は、しばしば問題となる。かゝる場合には
、例えば、アルキルメルカプタンに由来す冫る親油性の
構造が、ジサルフアイドブリツジによつて、親水性のポ
リマーに付着する可能性が存在する。次いで、酵素蛋白
質の解放が、ジサルフアイドブリツジの還元によつて起
り、それは、混成した酵素−アルキル構造の否定を引き
起こす。
しかしながら、上記の反応は、以下のようにして集成化
することが可能であると思われる。
まず、一般式［Ｆ］−Ｓ−Ｙを有する反応性ポリマー誘
導体が生成されねばならない。こゝで、［Ｆ］一Ｓは、
本出願と関係する、ＰはＳＨ又はＰ−ＳＯ，Ｎａポリマ
ーに由来する。符号Ｙは、る反応によつて、普通の反応
条件下では、反応鷲反対方向に進めるための認識できる
能力をもたよい生成物を生成するような基を示す。（Ｈ
Ｓは、例えば蛋白質又は露出したＳＨ−基をｈするよう
な粒子などのチオール含有の有機化合勿を示す。
）Ｙ−基は、少なくとも二つの異なつｔこ方法で、上記
の要求を満たす。ａ）Ａ−Ｓ−ＳＡ型の一定のジサルフ
アイドは、テオ硫酸塩又はチオールポリマーと反応して
、一般式（１）に従つて、反応性のジサルフアイドポリ
マーの生成を導く能力をもつている。
（１）［Ｆ］−ＳＨ＋Ａ−Ｓ−Ｓ−Ａ＝［Ｆ］−Ｓ −
Ｓ 一Ａ＋Ｚ’Ｚ’は、すぐにチオンーチオールの平衡
を確立するだろうが、そこでは、チオンが極めて有利な
種である。
Ｐ−ＳＨポリマーのかわりに、対応するチオ硫酸塩ポリ
マーＰＳ− ＳＯａＮａが直接に（２）て使用される。
（２）［Ｆ］−Ｓ−ＳＯ３Ｎａ＋Ａ−Ｓ−Ｓ−Ａ＝［Ｆ
］−Ｓ−Ｓ−Ａ＋Ｚ“こ）では、可溶性の反応生成物を
表わし、それはＺのように可逆反応を送進することはな
い。
反応性のジサルフアイドポリマーと、チオール含有の蛋
白質のような溶解されたチオール化合物との反応は、次
いで以下の式に従つて行なわれる。
［Ｆ］−Ｓ −Ｓ −Ａ ＋ＨＳ−ＰｒＯｔ−＊［Ｆ］
−Ｓ −Ｓ −ＰｒＯｔ＋Ｚ生成するポリマ−ー蛋白質
生成物は、上記のようにして、適宜の還元剤による処理
により、［Ｆ］一ＳＨｆＰｒＯｔ−残基に分裂する。
（ｂ）式、Ｒ，−Ｎ ＝Ｎ −Ｒ，を有するアゾジカル
ボン酸塩は、チオールポリマーと接触させることによつ
て、Ｒ１の電子吸引性のためにチオール含有化合物に対
して高い反応性を示す生成物を生成させる。
活性化したポリマーは、続いてＨＳ−ＰｒＯｔと反応し
、（ｆり−Ｓ−Ｓ−ＰｒＯｔｆＲ，−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ，
を生成する。
こ、で、溶解性のヒドラジドは、反応を逆に進めるよう
な性質はもたない。か）る極めて充分に活性化した二つ
の種類のポリマーは、その反応性にもか）わらず、活性
度における認識できる。従つて、カップリング反応それ
自体、即ち、例えばＨＳ−ＰｒＯｔの実際の不動化は、
より後の時点で実施できる。高度に置換したチオールゲ
ルによつてチオール基を欠くが、ジサルフアイド構造を
含む酵素を還元できる。
生じたチオール基は、続いて不動化に使用できる。チオ
ール化のための適切な試剤を使用することによつて、酵
素にチオール基を導入することもでき、かくして、それ
は、上記式における’゛ＨＳ−ＰｒＯｔ’’として反応
する適当な形をもつことになる。安定なチオエーテル構
造を導くようなポリマーに結合されたチオール基との反
応も、酵素の不動化に使用できる。
かゝる反応を通じて、ポリマーは、酵素分子内のある官
能基と共有結合を直接に、又は適宜の試剤を用いて形成
できる新しい反応基をもつことになる。それに代つて、
酵素吸着の中心が、チオエーテルとして導入される。実
際の不動化反応のほかに、酵素の不動化に影響を与える
他の因子がある。これは、酵素の安定．性を高めるよう
な官能基を有するポリマー網状構造を与えるためにしば
しば重要である。更に、基体一生成物の禁止剤システム
の成分は、ポリマー置換基によつて影響を受け、与えら
れた条件下で触媒活性の増加を引き起こす。チオールゲ
ルとの２反応は、水性媒体における極めて温和な条件下
で起るので、かゝる補助的置換反応は、不動化プロセス
の後においても実施できる。微生物、細胞、細胞形成粒
子、膜片、受容体サイトなどを活性化するために類似方
法が使用でき３る。
本発明で記載されたチオールポリマーは、種々の生物学
的分野て使用てきる。
金属錯体を形成する能力及びその電子交換性は、チオー
ル含有の生物システムを自動酸化から保護することに結
果と３．して依存するのかもしれない。かゝる場合、生
物システムは、チオールゲルの存在下に貯蔵される。
チオールの自動酸化は、酸化生成物、即ちジサルフアイ
ドのほかに、Ｃｕ゜”のような一定の金属イオンによつ
て接触されること４ιが知られている。生成したジサル
フアイドとチオールゲルとの間の連続する電子交換は、
電子交換剤がなくなるまで、溶液中のチオールの濃度を
一定の大きさに保持する。チオールポリマーは、天然物
を化学的に変性するための支持相としても使用できる。
かゝる場合、ポリマーへの付着は、ジサルフアイドブリ
ツジを通じて行なわれる。ジサルフアイドブリツジは、
加水分解に安定であるが、所望の変性反応の後は、それ
自体が還元開裂を起こす。天然物は、本来的にしばしば
多官能性であるので、反応が均一相で行なわれた場合に
は、しばしば分子間架橋を起こす。か）る望ましくない
副反応は、変性反フ応をポリマー相で行なつた場合に避
けることができる。温和な条件下での還元的ジサルフア
イド開裂の別の可能な用途は、生物学的会合−５離錯体
における成分の一つをジサルフアイドブリツジによつ・
て付着することにある。
次いで、還元段階では、吸着質と配位子との全錯体が開
放される。これは、特異な会合−解離錯体が、不均一管
能性分子によつて形成された場合に特別な利点があり、
かゝる錯体形成は、一定の生物学的活性を損うことはな
い。多くの金属イオンや金属−有機化合物は、本発明で
記載したチオールゲルと、多かれ少なかれ、安定な鎖体
を形成する。
従つて、これらのチオールゲルは、水−不溶性の錯化剤
又は金属含有蛋白質のクロマトグラフィーの媒体として
、使用できる。こゝにおいて、錯体形成に対する異なる
傾向は分離の主な原因となる。更に、本発明は二つの図
面と以下の実施例によつて例示される。
第１図は、アミルグルコシグーゼのチオールアガロース
による還元をＰＨの関数で示すものであり、第２図は、
活性化したチオールアガロースゲルを充填したカラムの
再生を示すものである。
第１図における、曲線１は、還元直後のＳＨ含有量を、
また曲線２は、還元過程２時間後のＳＨ含有畢を示す。
第２図における、ゲルの活性度は、最初の活性度のパー
セントを再生の繰り返しにおける日数の関数として示す
ものてある。Ｉ オキシラン構造に関して、種々の置換
度を有するオキシランー活性化したアガロースゲルの調
整（ａ）エピクロルヒドリン使用 ３ｙの洗浄し、吸引乾燥した、ビーズ状のアガロースゲ
ル（２〜６％のアガロース含有）を、ＩＭの水酸化ナト
リウム溶液２．４ｍιに懸濁させた。
室温下で攪拌しながら、エピクロルヒドリンを滴下して
加えた。温度を６０℃まで上げ、そして反応混合物を２
時間攪拌した。ゲルを、中性の反応が得られるまで、ガ
５ラスフイルター上で水で洗浄した。結果はテーブル１
に示される。（ｂ）２，３ージブロムプロパノール使用
実験は、上記（ａ）における記載と同様にして行なわれ
た。
１０ （ｃ）１，４−ブタンジオールージグリシジルーエーテ
ル使用３ダの洗浄し、吸引濾過した、ビーズ状のアガロ
ースゲル（２〜６％のゲルを含有）を、２．５Ｍの水酸
化ナトリウム溶液１．５ｍιに懸１５濁させ、次いでこ
れに１２ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えた。
ビスエポキサイドを激しく攪拌しながら、滴下して加え
た。反応時間は、室温で６時間であつた。次いで中性の
反応があるまで、ゲルをガラスフィルター上で２ｔ水で
洗浄し、次いで２０７７！ｌのアセトンを使用し、最後
にアセトンが完全に除去されるまで水で洗浄した。（ｄ
）１，３−ブタンジオールージグリシジルーエーテル使
用２実験は、上記（ｃ）における記載に従つて行なわれ
た。
（ｅ）ゲルに結合したオキシラン構造の定量１０〜１０
０μ当量のオキシラン構造を含むゲル部分を洗浄し、１
０７７１ιの蒸留水に懸濁した。二懸濁液のＰＨを７．
００に調整し、その１．００ｍ１をプラスチックのピペ
ットを有する滴定容器に移した。懸濁液をサンプリング
する瞬間は、磁力棒によつて、激しく攪拌した。ｙのチ
オ硫酸ナトリウム溶液１．００ｍιをＰＨ７．ＯＯて懸
濁液．に加え、その後ＰＨを固定した５０ｍＭの塩酸に
よつて連続的な滴定を行なつた。
滴定時間は、ゲルのオキシラン含有量に依存するが、３
０〜１２吟であつた。
懸濁液は、全滴定の間中、磁力棒で激しく攪拌した。ゲ
ル懸濁液の 一乾燥含有量は、５．０７７１Ｌの懸濁液
のサンプルから定量された。サンプルは、ガラスフィル
ター上で、まずアセトンと水の混合物で、次いで純粋な
アセトンで洗浄した後、五酸化リン上で、１００℃で２
峙間乾燥した。ビニルスルホン構造に関して、種々の置
換度を有する、ジビニルスルホンで活性化したアガロー
スゲルの調整ＰｈａｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａ
ｌｓ（Ｕｐｐｓａｌａ）の約６％の多糖類を含むビーズ
状のアガロースゲル、ＳｅｐｈａｒＯｓｅ？旧を、ガラ
スフィルター上で洗浄し、そして吸引乾燥した。
か）る１０ｙのアガロースゲルを、０．５Ｍの炭酸ナト
リウム溶液で１０ｍ１に、ＰＨＩＩで懸濁させ、その後
に、ジビニルスルホンを添加し、この系を攪拌しながら
７０分間反応せしめた。反応生成物をガラスフィルター
上で、水で洗浄し、次いで、過剰のチオ硫酸塩と反応さ
せ、上記Ｉ（ｅ）に記載したのと同じ方法で、生じた０
Ｈ−イオンを塩酸で滴定することによつて、ビニルスル
ホンを分析した。ビニルスルホンの量を変化させた結果
は、テーブル２に示される。■ 種々の置換度を有する
２，３−ジプロムプロピルエーテルーアガロースゲルの
調整通常の方法て調整され、約６％の多糖類を含むエピ
クロルヒドリンで架橋された、１００ｍιのアガロース
ゲルを洗浄し、吸引乾燥し、そして、５０ｍｇの水素化
ホウ素ナトリウムを含む固の水酸化ナトリウム溶液１０
０ｍ１と混合した。
その後に、か）る懸濁液に対して、一部の臭化アリルを
添加した。反応混合物は激しく攪拌し且つ還流冷却しな
がら７０℃で４時間加熱した。
反応後、ゲルはガラスフィルター上で、最初にアルコー
ルと水の混合物で、次いで９６％のエタノールで、その
後に四塩化炭素で洗浄した。
このゲルを１００ｍιの四塩化炭素に懸濁し、目に見え
る臭素の着色が持続するまで、臭素を加えた。実験の結
果はテーブル３に示される。■ 種々の置換度を有する
’’ブンテ塩（Ｂｕｎｔｅｓａｌｚ）’’アガロースゲ
ルの調製（ａ）エピクロルヒドリン、２，３ージブロム
プロパノール、１，４−ブタンジオールージグリシジル
エーテル及び１，３−ブタンジオールージグリシジルエ
ーテルで活性化したアガロースゲルからの４４Ｂｕｎｔ
ｅＳａ１ｚ゛’−アガロースゲルの調整上記１ａ，Ｉｂ
，Ｉｃ及びＩｄからの各３ｙの吸引乾燥したゲルを、Ｐ
Ｈ６．２５の０．５Ｍのリン酸ナトリウム塩の緩衝液で
洗浄し、その後、これを３ｍ１の上記したリン酸緩衝液
に懸濁させ、それに対して、次いで、洲のチオ硫酸ナト
リウム溶液３７ｒＬｔを加えた。
反応混合５物を、室温て６時間、振とうせしめ、次いで
生成物を水で洗浄した。生成物は、゜“ブンテ塩゛２ゲ
ルと呼ばれるテーブル１に硫黄の分析が示される。（ｂ
）ジビニルスルホンで活性化したアガロースＩＣゲルか
らの６４ＢｕｎｔｅＳａ１ｚ″アガロースゲルの調整
上記（ａ）による、エポキサイドで活性化したゲルの調
整と同様な方法で調整を行ない、その硫黄分析をテーブ
ル２に示す。
１５（ｃ）２，３−ジプロムプロピルエーテ
ルアガロースゲルからの４′ブテン塩′１アガロースゲ
ルの調整 蒸留水で洗浄した後に、吸引乾燥した５ｙの
２，３−ジプロムプロピルエーテルアガ狛２０ースを、
５ｍｔの水に溶解した３．７５ｙのＮａＳ２Ｏ３・５Ｆ
Ｉ２０の溶液中に懸濁した。
混合物を９５℃で５時間反応させ、その後に、ゲルをガ
ラスフィルター上で、塩が除去されるまで、水で洗浄し
た。
硫黄分析の結果は、テー２５ブル３に示される。■ “
ブンテ塩゛のジチオトレイトールによる還元によつて、
チオール構造に関して種々の置換度を有するチオールア
ガロースゲルの調整（ａ）エピクロルヒドリン、２，３
ージブロム３０プロパノール、１，４−ブタンジオール
ージグリシジルエーテル及び１，３−ブタンジオールー
ジグリシジルエーテルとの反応によつて得られた“゜ブ
ンテ塩゛ゲルから４６ブンテ塩３゛ゲルをガラスフィル
ター上で３５水で洗浄し、そして吸引乾燥した。
３ｑのゲ＊ルを０．３Ｍの重炭酸ナトリウム溶液に懸濁
させて、全容積を６ｍ１にせしめた。
反応に必要とされる還元剤（ジチオトレイトール）の量
を、オキシランの分析のために上記した方法に基ずいて
計算し、次いで、該試剤を少なくとも二倍過剰に加えた
。ジチオトレイトールは、１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ溶液３
Ｔｎｔに溶解し、室温で攪拌しながら、３粉間反応させ
た。
生成物は、ガラスフィルター上で０．１Ｍの重炭酸ナト
リウム溶液３０ｍＬで洗浄した。該重炭酸ナトリウム溶
液は、塩化ナトリウムに関して１Ｍであり、またＥＤＴ
Ａに関しては１ｍＭであつた。最後に生成物は１ｍＭ（
７）ＥＤＴ八容液１００ｍＬで洗浄した。
チオール基の置換の程度は、ＢｒＯＯｋｌｅｈｕｒｓｔ
等（ＢｌＯｃｈｅｍ．ｊ．ｌ３３，５７８（１９７３）
）による、２，２ージピリジルージサルファイドとの反
応によつて定量された。その手順は、トリスー緩衝液の
かわりに、０．１Ｍの重炭酸溶液が使用された点が修正
された。元素状の硫黄分析の結果は、テーブル１に示さ
れる。テーブル１には、６％のアガロースゲルのチオー
ル化からの結果の集成が示される。
そこでは、アガロースビーズは、エピクロルヒドリン、
２，３ージブロムプロパノール、１，４−ブタンジオー
ルージグリシジルエーテル及び１，３−ブタンジオール
ージグリシジルエーテルとの反応によつて程度を変えて
活性化されている。
オキシラン基を含むゲルは、チオ硫酸ナトリウムで処理
され、次いで得られた゜“ブンテ塩１′ゲルは、ジチオ
トレイトールで還元されている。
゜゜ブンテ塩゛ゲル及びチオールゲルの硫黄の含有量が
定量され、また後者のチオールの含有量は、２，２″−
ジピリジルジサルフアイド反応によつて定量された。素
、硫黄及びチオールの含有量の分析結果苓テーブル３に
示す。
架橋したアガロースビーズは、アリルエーテル構造に関
して種々の僧換の程度になるように、臭化アリルで処理
した。アリルエーテルゲルは、臭素で処理され、また２
，３ージブロムプロピルエーテルゲルは、チオ硫酸ナト
リウム溶液で処理され、その後に出じた゜“ブンテ塩゛
ゲルは、ジチオトレイトールで還元された。
肩 硫化ナトリウムを使用する、オキシランて活性化し
たアガロースからのチオールアガロースゲルの調整ます
３ｙの洗浄し、吸引乾燥された６％のアガロースゲルを
、ＩＭの水酸化ナトリウム２．４ＴｒＬｔ中に懸濁させ
た。
次いで、０．３５ｍＬのエピクロルヒドリンを加え、そ
の後に、上記１（ａ）に記載した手順によつて処理した
。生成物のオキシラン含有量を定量したところ、８５０
ｐ当量／ダ乾燥生成物であつた。Ｎａ，Ｓ令９Ｈ，０（
Ｍｅｒｃｋ．Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を使用して、ＩＭの
硫化ナトリウム水溶液を調整し、その１５ｍ１を、攪拌
しながら、３ダのオキシランと２時間反応させた。
生じたチオールの含有量は、４１０ｐ当量／ｙ乾燥生成
物てあつた。ｗチオール化したアガロースゲルのチオエ
ーテル構造を含有するゲルへの誘導化 〕以下の実験で
は、エピクロルヒドリン、チオ硫酸ナトリウム及びジチ
オトレイトールによる処理を通じて、ビーズ状の６％の
アガロースゲルから調製されたチオール化したアガロー
スゲルが使用された。
チオール基の含有量は、６５０ｐ当量／ｇ乾燥生成物で
あつた。（ａ） ヨードアセトアミドとの反応 反応混合物に存在する可能性のある金属イオンと錯体を
形成させるために、１ｙのゲルを、ＥＤＴＡに関して１
ｍＭである０．ＩＭの重炭酸ナトリウム溶液（ＰＨ８．
４）２蔵に懸濁させた。
１ｍ１のエタノールと１５ｍｇのヨードアセトアミドを
添加し、その混合物を、室温で１時間反応させた。
生じた生成物は、エタノールで洗浄し、その後に窒素分
析したところ、５８４ｐモルＮ／ダ乾燥生成物を示した
。
（ｂ）ジニトロクロルベンゼンとの反応 １ｙのゲルを、０．ＩＭの重炭酸ナトリウム溶液２ｍ１
（ＥＤＴＡに関しては１ｍＭである）と２ｎ１のエタノ
ールからなる混合物に懸濁させた。
１５ｍ９の２，４ージニトロクロルベンゼンを加した後
、混合物を室温で、１時間反応させた。
生じた生成物を、エタノールで洗浄した。窒素含有量の
分析は、９６４ｐモルＮ／ダ乾燥生成物を与えた。（Ｃ
）ビニルー２−クロルエチルエーテルとの反応１ダのゲ
ルを、２５％のエタノールと７５％の素、硫黄及びチオ
ールの含有量の分析結果をテーブル３に示す。
架橋したアガロースビーズは、アリルエーテル構造に関
して種々の置換の程度になるように、臭化アリルで処理
した。アリルエーテルゲルは、臭素で処理さ＊５１ｙの
ゲルを、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム４０溶液２ｍ１（
ＥＤＴＡに関しては１ｍＭである）と２ｎｔのエタノー
ルからなる混合物に懸濁させた。１５ｍ９の２，４ージ
ニトロクロルベンゼンを加した後、混合物を室温で、１
時間反応れ、また２，３ージブロムプロピルエーテルゲ
ルは、チオ硫酸ナトリウム溶液で処理され、その後に出
じた゜“ブンテ塩゛ゲルは、ジチオトレイトールで還元
された。
■ 硫化ナトリウムを使用する、オキシランで活性化し
たアガロースからのチオールアガロースゲルの調整
２θます３ｙの洗浄し、吸
引乾燥された６％のアガ狛−スゲルを、１Ｍの水酸化ナ
トリウム２．４ＴｒＬｔ中に懸濁させた。
次いで、０．３５ｍＬのエピクロルヒドリンを加え、そ
の後に、上記１（ａ）に記載した手順によつて処理した
。生成物のオキシラン２５含有量を定量したところ、８
５０μ当量／ダ乾燥生成物であつた。Ｎａ２ｓ異旧，Ｏ
（Ｍｅｒｃｋ．Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を使用して、１Ｍ
の硫化ナトリウム水溶液を調整し、その１５ｍ１を、攪
拌しながら、３ｙのオキシランと３θ２時間反応させた
。
生じたチオールの含有量は、４１０μ当量／ｙ乾燥生成
物てあつた。■ チオール化したアガロースゲルのチオ
エーテル構造を含有するゲルへの誘導化 ※
λＴ八以下の実験では
、エピクロルヒドリン、チオ硫酸ナトリウム及びジチオ
トレイトールによる処理を通じて、ビーズ状の６％のア
ガロースゲルから調製されたチオール化したアガロース
ゲルが使用された。
チオール基の含有量は、６５０ｐ当量／ダ乾燥生成物で
あつた。（ａ） ヨードアセトアミドとの反応 反応混合物に存在する可能性のある金属イオンと錯体を
形成させるために、１ｙのゲルを、ＥＤＴＡに関して１
ｍＭである０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（ＰＨ８．
４）２ｍ１に懸濁させた。
１ｍ１のエタノールと１５ｍｇのヨードアセトアミドを
添加し、その混合物を、室温で１時間反応させた。
生じた生成物は、エタノールで洗浄し、その後に窒素分
析したところ、５８４μモルＮ／ｙ乾燥生成物を示した
。
（ｂ）ジニトロク咀レベンゼンとの反応 （ｇ） コルチゾンとの反応 １ダのゲルを、ガラスフィルター上で、９Ｃ％のエタノ
ール水溶液で洗浄した。
次いで、２ｍ１の上記媒体にゲルを懸濁させ、該懸濁液
に対して、５０ｍｇのテストステロンを添加した。反応
混合物は、１時間、ｙ照射した。そして、洗浄後に生成
物は、２５ｍｇの置換コルチゾン／ｙ乾燥生成物を含む
ことを示した。比較のために、照射手順を省略した同様
の実験を行なつた。
その結果、コルチゾンの吸収は、検出できなかつた。塙
水不溶性の錯化剤としてのチオールアガロースの使用
（ａ）Ｐ−クロルメルクロ安息香酸との反応１ダのチオ
ールアガ狛一スを、０．３Ｍの塩化ナトリウム溶液に懸
濁し、そのＰＨを７．０に調整した。
２０蔵の全容積を有する懸濁液を、Ｎ，ガスで飽和させ
た。
０．３Ｍの塩化ナトリウムに、１４．４ｍ９のＰ−クロ
ルメルクロ安息香酸を溶かした溶液を、ＰＨを７．０に
、そして容積を１０蔵に調整した。
１．０Ｔｎ１のゲル懸濁液と１．０厩の試剤溶液とを、
０．０２０Ｍの水酸化ナトリウム溶液を連続して添加し
て、ＰＨを７．０に保持しながら、反応させた。
水酸化ナトリウムの消費量は、５８０ｐ当量／ダ乾燥生
成物に達した。（ｂ）ＣＬｌ２＋との反応 石英器による蒸留水に、ＣＵＳＯ４；５Ｈ２０を溶解せ
しめて、ＣＬｌ２ｔについて０．１２５ｍｇ／ｍｌの溶
液をつくつた。
３Ｔｎ１のチオールアガロースゲルを含む、断面積０．
７５ｄのカラムを蒸留水で洗浄した。
チオールアガロースゲルは、エピクロルヒドリン、チオ
硫酸塩及びジチオトレイトールによつて調整され、５０
０〜７００ｐ当量のＳＨ一基／ｙ乾燥生成物を含んでい
た。Ｃｕ２＋ −イオンは、光度的に２５４ｎｍで記録
され、またＦ．ＦｅｉｇｌのＲＳｐＯｔＴｅｓｔｉｎＩ
ｎＯｒｇａｎｉｃＡｎａｌｙｓｊｓＪ５ｔｈｅｄｐ．８
４に従う、Ｏ−トリジンと口タン酸アンモニウムからな
る、アセトン試剤によるスポットテスト反応によつても
記録された。この試剤は、稀釈度が１゜５×１Ｃｆ′に
おける銅を検出できる。カラムを通じて、銅溶液をポン
プで注入したが、２５．３ｍ１が通過するまでは、スポ
ットテスト法により、溶出液中には如何なる少量のＣｆ
ｔ４検出されなかつた。
これは、１２．６ｍ９のＣＵＳＯ４・５Ｈ２０の吸着に
相当する。吸着した硫酸第二銅は、ＥＤＴＡによつて示
される。（ｃ）Ｈｇ−パパインの活性化パパインは、分
子当ソーつのチオール基を含む酵素である。
チオール基は、酵素活性にとつて必要である。酵素は、
しばしばマーキユローパパインとして貯蔵され、また販
売される。そこでは、反応性のチオール基が、調整時に
酵素に対するＨｇＣｌ２の付加によつて保護されている
。マーキユローパパインは、酵素的に不活性で不活性で
あり、通常、システインとＥＤＴＡを含む溶液の付加に
より、活性化される。チオール化したアガロースが、マ
ーキユローパパインの活性化剤として使用できる。かく
して、調整されたパパインの活性度は、システインーＥ
ＤＴＮ容液によつて活性化した後に記録された値の８０
〜９０％に達する。これは、ベンゾイルーＬ−アルギニ
ンエチルエステルに対して、又は力ティンに対して測定
された場合も同じである。還元剤としての置換されたチ
オールアガロースの使用（ａ）メチレンブルー メチレンプルーは、赤らんだ結晶であり、容易に水に溶
解して、青の着色を与える。
反応によつて、溶液は無色のロイコ−メチレンブルーに
変化する。（ｇ） コルチゾンとの反応 １ｙのゲルを、ガラスフィルター上で、９０％のエタノ
ール水溶液で洗浄した。
次いで、２ｍ１の上記媒体にゲルを懸濁させ、該懸濁液
に対して、５０ｍｇのテストステロンを添加した。反応
混合物は、１時間、γ照射した。そして、洗浄後に生成
物は、２５ｍ９の置換コルチゾン／ｙ乾燥生成物を含む
ことを示した。 比較のために、照射手順を省略した同
様の実験を行なつた。
その結果、コルチゾンの吸収は、検出できなかつた。■
水不溶性の錯化剤としてのチオールアガロースの使用
（ａ）Ｐ−クロルメルクロ安息香酸との反応１ｙのチオ
ールアガロースを、０．３Ｍの塩化ナトリウム溶液に懸
濁し、そのＰＨを７．０に調整した。
２０ｍ１の全容積を有する懸濁液を、Ｎ２ガスで飽和さ
せた。
０．３Ｍの塩化ナトリウ２ムに、１４．４ｍ９のＰ−ク
ロルメルクロ安息香酸を溶かした溶液を、ＰＨを７．０
に、そして容積を１０ｍ１に調整した。
１．０ｍ１のゲル懸濁液と１．０ｍ１の試剤溶液とを、
０．０２０Ｍの水酸化ナトリウム溶液を連続して添加し
て、ＰＨを７．０に保３持しながら、反応させた。
水酸化ナトリウムの消費量は、５８０μ当量／ｙ乾燥生
成物に達した。（ｂ）ＣＵ２＋との反応 石英器による蒸留水に、ＣＵＳＯ４；５Ｈ２０を３．
溶解せしめて、Ｃｕ２ｔについて０．１２５ｍｇ／ｍｌ
の溶液をつくつた。
３ｍ１のチオールアガロースゲルを含む、断面積０．７
５ｄのカラムを蒸留水で洗浄した。
チオールアガロースゲルは、エピクロルヒドリン、チオ
硫酸塩及びジチオト４Ｃレイトールによつて調整され、
５００〜７００μ当量のＳＨ一基／ｙ乾燥生成物を含ん
でいた。Ｃｕ２＋−イオンは、光度的に２５４ｎｍで記
録され、またＦ．ＦｅｉｇｌのＲＳｐＯｔＴｅｓｔｉｎ
ＩｎＯｒｇａｎｉｃＡｎａｌｙｓｊｓョ５ｔｈｅｄＰ．
８４に従う、０−トリジンと口タン酸アンモニウムから
なる、アセトン試剤によるスポットテスト反応によつて
も記録された。この試剤は、稀釈度が１５×１σにおけ
る銅を検出できる。
カラムを通じて、銅溶液をポンプで注入したが、２５
．３ｍ１が通過するまでは、スポットテスト法により、
溶出液中には如何なる少量のＣｌｌ２ｔも検出されなか
つた。
これは、１２．６ｍ９のＣＵＳＯ４−５Ｈ２０の吸着に
相当する。吸着した硫酸第二銅は、ＥＤＴＡによつて示
される。（ｃ）Ｈｇ−パパインの活性化パパインは、分
子当ソーつのチオール基を含む酵素である。
チオール基は、酵素活性にとつて必要である。酵素は、
しばしばマーキユローパパインとして貯蔵され、また販
売される。そこでは、反応性のチオール基が、調整時に
酵素に対するＨｇＣｌ２の付加によつて保護されている
。マーキユローパパインは、酵素的に不活性で不活性で
あり、通常、システインとＥＤＴＡを含む溶液の付加に
より、活性化される。チオール化したアガロースが、マ
ーキユローパパインの活性化剤として使用できる。かく
して、調整されたパパインの活性度は、システインーＥ
ＤＴ八容液によつて活性化した後に記録された値の８０
〜９０％に達する。これは、ベンゾイルーＬ−アルギニ
ンエチルエステルに対して、又は力ティンに対して測定
された場合も同じである。（ 還元剤としての置換され
たチオールアガロースの使用（ａ）メチレンブルー メチレンプルーは、赤らんだ結晶であり、容易に水に溶
解して、青の着色を与える。
反応によつて、溶液は無色のロイコ−メチレンブルーに
変化する。約５０μ当量のチオール基に相当する。
１ｙのチオールアガロースを、０．１Ｍの重炭酸ナトリ
ウム溶液３ｍｔに、（試験管中で）懸濁させた。
上記重炭酸塩溶液は塩化ナトリウムについて０．３Ｍ１
そしてＥＤＴＡについて０．３ｒ１Ｖ４で５あつた。懸
濁液は、Ｎ２ガスと平衡にせしめられ、１ｍ１（２５１
１１Ｍ）のメチレンブルーが添加された。１０〜１紛内
に無色化が生じた。
反応中、窒素の流量は、一定に保持された。（ｂ）キモ
トリプシンのジサルフアイド結合の還１０元キモトリプ
シンを、１ＷＬｔ（７）ＨＣＩに溶解して、濃度２５ｍ
ｇ／ｍｌにせしめた。
床容積１５．４ｍｔのカラムを、エピクロルヒドリン、
チオ硫酸ナトリウム及びジチオトレイトールとの反応１
５によつて６％から調製された、高度に置換したチオー
ルアガロースで充填した。チオール基の置換の程度は、
約８００μ当量／９乾燥生成物であつた。１ｍＬのキモ
トリプシンを １ｍＭ（７）ＥＤＴＡに相当する０．１Ｍの重炭酸ナト
２０リウム溶液１ｍＬに混合し、次いで、チオールアガ
狛−スのカラムを通じて、流速１５ｍ１／ｈでポンプで
注入した。
カラムから溶出するキモトリプシンを過剰のヨード酢酸
と反応させ、該反応混合物をＰｈａｒ−ＭａｃｉａＦｉ
ｎｅ２５Ｃｈｅｍｊｃａｌｓ（Ｕｐｐｓａｌａ）のＳｅ
ｐｈａｄＯｘＧ−１０上でのゲル沖過によつて脱塩した
。
ヨード酢酸は、チオール基と反応し、そして、システイ
ンの炭酸チオエーテルは、酸加水分解に続くアミノ酸分
析によつて定量された。また還３θ元されないキモトリ
プシンも、ヨード酢酸と反応し、続く、Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−１０上でのゲル沖過によつて、アミノ酸分析され
た。結果は、以下のテーブルに示される。
８−カルボキシメチルシステインの含３５有量 μ当
量／２５ｍｇ蛋白質キモトリプシン
０ 環元されたキモトリプシン ２．５（ｃ）アミ
ログルコシダーゼの環元上記（ｂ）で使用したのと同じ
調製品である。
４０２．７ｍＬの高度に置換したチオールアガロースを
、１８Ｔ１Ｔ：ＦｒＬの内径を有するカラムに移した。
ア、ノログルコシダーゼ（ＳｉｇｍａＧｒａｄｅ■）を
、以下の緩衝系から、０．１％Ｗ／Ｖ濃度で調製した。
５０ｍＭの酢酸ナトリウム ＰＨ３．５５ＯｍＭのリン
酸ナトリウムＰＨ５．５ ５ＯｎｌＭのリン酸ナトリウムＰＨ７．５５ＯｍＭの重
炭酸ナトリウムＰＨ９．５ 全ての溶液は、ＥＤＴＡについて１ｍＭにせしめられ、
そしてＮ２ガスで飽和された。
酵素溶液を、流速１０ｍ１／ｈで、還元カラムを通過さ
せた。各々が２．５ｍ１の四つのサンプルがとられ、２
，２゛−ジピリジルジサルフアイドによつて、ＳＨ一基
の含有量を分析した。二つのサンプルはブランクとして
使用した。チオール含有量の定量は、直後及び２時間後
に行なつた。結果は、第１図に示されるが、チオールア
ガロースでなされたアミノログルコシダーゼの環元のＰ
Ｈ一依存性を示している。還元された酵素のチオール含
有量は、カラムを通過した直後と２時間後に定量された
。
チオールージサルファイド交換反応による、チオールア
ガロースの固定化を通じた酵素の不ｊ化ａ）２−ピリジ
ンジサルフアイドアガロースの調製ビーズ状の２％のア
ガロースゲルをエピクロルヒドリンで架橋した。
即ち、Ｉ８ＯＶの洗浄し、吸引乾燥したゲルを、１Ｍの
水酸化ナトリウム溶液１４２ｍ１に懸濁し、５ｍ１のエ
ピク畦レヒドリンを加えた。反応時間は、６０℃で１時
間であつた。次いで、ゲルは０．５ｒ１Ｖ４のリン酸塩
緩衝液（２０．５９のＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１４．
０ｙ（７）ＮａＨ２ｐＯ，・２１１２０（７）０．５ｅ
の溶液）１８０ｍｔ中に懸濁させた。洲のチオ硫酸ナト
リウム溶液１８０ｍＬを懸濁液に添加し、該混合物を室
温て、６時間反応させた。生じる生成物を、水て洗浄し
、ＥＤＴＡに関して１ｍＭにされた０．１Ｍの重炭酸ナ
トリウム溶液１８０ｍｔに溶解した２１６ｍ９のジチオ
トレイトールによつて還元した。生成物は、ＥＤＴＡに
関して１ｍＭに相当する１Ｍの塩化ナトリウム溶液て、
次いで１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ溶液で、そして最後に５０
％のアセトン水溶液で洗浄した。４ｙのピリジンジサル
フアイドを５０％のアセトン水溶液１８０ｍ１に溶解し
、ゲルと混合し、室温て３０分間反応させた。
生じた生成物は、ガラスフィルター上で、５０％のアセ
トン水溶液、そして最後に１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ溶液で
洗浄した。エピク咀レヒドリンによる処理の後のオキシ
ラン含有量の分析は、８０μ当量／ｙ乾燥生成物で＊あ
ることを示した。Ｎ一分析による定量によると、２ーピ
リジンジサルファイド構造の含有量は５０μ当量／ｆ乾
燥生成物であつた。（ｂ）アミログルコシダーゼの不動
化アミログルコシダーゼを、上記■（ｃ）に記載した方
法により、高度に置換したチオールアガロースによつて
還元した。
還元カラムは、長さが、１１ｃｍであり、エピクロルヒ
ドリン、チオ硫酸ナトリウム及びジチオトレイトールに
よつて、２％のアガロースから調製された、１７ｍ１の
チオールアガロースを含有している。
置換の程度は、約７５０ｐ当量／ｙ乾燥生成物であつた
。該還元カラムと直接に連結し４て内径２．１ＣＴ１を
有し、上記（ａ）によつて調製された３．２ｍ１の２ー
ピリジンジサルファイドを含む、カップリングカラムを
取付けた。ＥＤＴＡに関して、１ｍＭに相当する、０．
１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液６ｍ１に、４１．４ｍ９の
ア２ミログルコシダーゼを溶かした溶液を調製し、その
２ｍ１をとり出して、流速１０．７ｍ１／ｈにて還元カ
ラム、続いてカップリングカラムにポンプで注入した。
その後に、カップリングカラムを、同じ流速にて以下の
溶液によつ３て、指示された順序と時間で洗浄した。０
．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液／１ｍＭＥＤＴＡ２時間０
．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液ＰＨ４．８ｌ５〃０．５Ｍ酢
酸ナトリウム溶液、デンプン関して３１％
３〃０．０１Ｍ酢酸ナトリウム溶液、ＰＨ
４．８３〃カップリングカラムは、０．３２酵素ユニッ
ト／即共役に相当する活性物を吸着したことが示された
。
カラムに注入されたアミログルコシダーゼの活性量は、
８０ユニットであり、１．２５ユニット／Ｍｇ乾燥生成
物に相当する。アミログルコシダーゼの活性度は、ＲＭ
ｅｔｈＯｄｉｎＥｍ押０１−０舒ョ，ＶＯｌ，ｌ，沖，
ＮＥＷＹＯＲＫ，ｌ９５５，Ｐｌ４９にＢｅｒｎｆｅｌ
ｄによつて記載された、３，５ージニトロサリチル酸試
剤を使用することによつてデンプンに対して定量された
。酵素活性は、グルコースに基ずく標準曲線によつて定
量し、酵素ユニットは、３分間に生成されたグルコース
の量（Ｍ９）として表わされた。
比較実験の間は、２ｍ１のアミログルコシダーゼ溶液を
、前もつて還元カラムを通過させないで、ピリジンジサ
ルフアイドアガロースのカラムに直接にポンプで注入し
た。
洗浄手順は、上記と同様にして実施した。ピリジンジサ
ルフアイドカラムには、活性物が吸着されなかつた。（
ｃ）ａ−アミラーゼの不動化 結合サイトとして使用するために、酵素分子にチオール
基を有機化学的に導入した後、酵素とチオールゲルとの
不動化反応が行なわ，れた。
蛋白質へのチオール構造の導入は、例えばメチルー３−
ピロピオイミデートとの反応によつて行なわれる。０．
１〜１．０辺のａ−アミラーゼ懸濁液（Ｓｉｇ−Ｍａｔ
ｙｐｅＩＡ）２５ｍ９／ＭＬを、０．ＩＭの重炭酸ナト
リウム溶液５ｍ１に溶解した。
該溶液をＮ２−Ｔｅｎｔ中で１０分間ガス抜きをし、そ
の後に１〜３ｍｇのメチルー５−メルカプトピロピオイ
ミデートを添加した。窒素雰囲気中で印分間置いた後、
混合物は、流速６０ｍ１／ｈて、０．ＩＭ重炭酸ナトリ
ウム中、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（登録商標）上てゲ
ル胛過によつて分離し、かくして、低分子量の物質が脱
離した。２０ＴＩＬ１の留分が集められた。
それらは、ａ−アミラーゼ活性を示すが、０．ＩＭの重
炭酸ナトリウム溶液で前もつて洗浄された４ｍＬの２ー
ピリジンジサルファイドによつて誘導された。混合物は
室温で６〜１５ｉ１！間、攪拌しながら保持し、続いて
、ガラスフィルター上で、まずカップリング緩衝液で、
次いてカラム中で、以下の様式に従つて、１０ｍ１／Ｈ
ｎの流れによつて洗浄した。０．ＩＭ重炭酸ナトリウム
溶液、塩化 ナトリウムに関して０．２Ｍ２＠間 ０．ＩＭリン酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ ６．９ｓ塩化ナトリウムに関して０．２Ｍそしてデンプ
ンに関して１％２＠間 ０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ６．端化ナト
リウムに関して０．０ＩＭ ２瞬間 約１ｍ９の乾燥共役物１ｍ１懸濁液を含む酵素共役物は
、後者の洗浄緩衝液中に懸濁し、＋４゜Ｃで貯蔵した。
１ｍＬの適当に稀釈したａ−アミラーゼ溶液又はａ−ア
ミラーゼアガロース懸濁液に対して、塩化ナトリウムに
関して０．０ＩＭに相当する０．０２Ｍのリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ＰＨ６．９）の１％デンプン溶液１ｍ１を
添加した。生成された還元糖の量は、２３゜Ｃで３分間
、攪拌した後、上記した３，５ージニトロサリチル酸と
の反応によつて定量された。マルトースが標準物として
使用され、活性データは、テーブル５に示される。テー
ブル５はａ−アミラーゼのカップリングについてのデー
タをも含んでいる。メチルー３−チオールピロピオイミ
デートとの反応によつて、予めチオール化されていた酵
素は、２，２ーピリジンジサルファイドで活性化された
チオールアガロースに結合する。１％デンプン溶液に対
する活性が測定された。
これらの調製品の一つは、活性の減少が検出される前に
、室温で２０日間、デンプンを連続的に転換するカラム
に使用された。
操作温度の４５゜Ｃへの上昇は、直ちに活性度の減少を
招来し、かくして、約２日後には、最初の活性度の僅か
半分に、そして５日後には、実際上、カラムには活性が
残らなかつた。
しかしながら、反応カラムは、２０ｍＭのジチオトレイ
トールの０．ＩＭ重炭酸ナトリウム溶液によるパーコレ
ーシヨンによつて、その場所で再生された。これに続い
て、０．ＩＭの重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、０．Ｉ
Ｍの重炭酸ナトリウムに溶かした１．５ｎ１Ｍの２，２
゛−ジピリジルジサルフアイドによつてパーコレーシヨ
ンした。次いで、塩化ナトリウムに関しＩＭである０．
ＩＭの重炭酸ナトリウム溶液て洗浄し、そして最終的に
該物質は、チオール化されたａ−アミラーゼの溶液にさ
らした。再生度は、第２図によつて示される。第２図は
、カラムの一連の再生の繰り返しの間の日数の関数とし
て、最初の活性度のパーセントを示す。又 共有クロマ
トグラフィー （ａ） ウレアーゼの精製 ウレアーゼは、チオールを含む酵素であ る。
０．ＩＭのトリスーＨＣＩ緩衝液（ＰＨ７．２）５０ｍ
１に、ウレアーゼ（ＳｉｇｍａｔｙｐｅＩＶ）１５０を
溶解した溶液を、Ｘ（ａ）による。
２−ピリジンジサルフアイドアガロースを含むカラムに
ポンプで注入した。
ゲル床の高さは、２２ｗｎぃ直径は１０ｗｎであり、床
を通じる流速は、５ｍ１／時間である。カラムは予めト
リスーＨＣＩ緩衝液で前処理されており、そしてウレア
ーゼ溶液にさらした後、カラムは再び同じ緩衝液で洗浄
した。不動化したウレアーゼは、続いて５０ｎ１Ｍのジ
チオトレイトールの溶液によつて、ゲルから開放された
。開放した酵素をゲル枦過した後、その特異な活性度を
定量し、元の酵素調製品の値と比較した。
８．４倍の精製度が得られた。
（チオール含有蛋白質） （ｂ）メルカプトアルブミンの精製 牛科の血清アルブミンは、１チオール１モルを含むメル
カプトアルブミンとシステイン又はグルタチオンでチオ
ール基が遮蔽されている非メルカプトアルブミンの混合
物である。
市販のアルブミンは、メルカプトアルブミンについては
６０〜７０％である。ＳｉｇｍａＣｈｅｍ社（ＵＳＡ）
の牛科の血清アルブミンは、カーボンブラックでの処理
によつて脱脂されている。
単分子の血清アルブミンは、Ｓｅｐ−ＨａｄｅｙＧ−２
００（登録商標）上でのゲル枦過によつて調製される。
０．６チオール基１モルのチオール含有量を有する３８
０ｍｇの単分子のアルブミンを、０．ＩＭのトリスーＨ
ＣＩ緩衝液（ＰＨ７．５）の８０ＴＬ１に溶解した。
該緩衝液は、ＫＣＩに関しては０．３Ｍてあり、ＥＤＴ
Ａに関しては１ｍＭであつた。か＼る溶液を、２ーピリ
ジンジサルファイドゲルを充填した３．２×１８ｃｍの
カラムに、１１７７！ｌ ／ｈの速度で注入した。溶出
をＡ２７８〈０．０３まで続けた。溶出緩衝液に溶解し
た２５ｎ１Ｍのシステインの導入によつて、共有的に結
合した物質が開放された。ＫＣｌ関して０．３Ｍであり
、ＥＤＴＡに関して１ｍＭである、０．１Ｍの酢酸ナト
リウム緩衝液（ＰＨ５．４）中で、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５（登録商標）上のゲル沖過の後に、か）る物質は
１．００〜１．０２チオール基１モルを５含むことが示
された。■ エピクロルヒドリンで架橋したデキストラ
ンに基ずいたチオ硫酸塩ゲル及びチオールゲルの調製５
ｙのエピクロルヒドリンで架橋したデキス１０トラン（
ＰｈａｒＩＴｌａＣｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，
Ｕｐｐｓａｌａの登録商標、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５
０）を、０．５Ｍの水酸化ナトリウム２００ｍ１に懸濁
した。
該懸濁液に対して、２５０ｍｇのＮａＢＨ４及び１５ｍ
ｔのエピクロルヒドリンを添加した。混合物を１二攪拌
し、反応容器の温度を３紛間にわたつて、徐々に２３応
Ｃから６０℃に上げた。反応を６００Ｃにて２時間続け
た。続いて、生成物をブフナー漏斗上で、最初に水で、
次いで０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７）で
洗浄した。ゲル生成物２（を？のチオ硫酸ナトリウム溶
液１００ｍ１に懸濁させ、反応容器をゆるやかに振とう
させながら、室温で２烏間反応させた。生じる゜゛ブン
テ塩゛は、水そしてＥＤＴＡに関して１ｍＭ（７）０．
２ＭのＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。続いて、ゲルは２
０．２Ｍ（７）ＮａＨＣＯ３／１ｍＭ（７）ＥＤＴＡの
２０ｍＬに溶解した３００ｍ９のジチオトレイトールで
還元した。チオールの分析は、２３０μモルＳＨ／ｙの
乾燥生成物を示した。チオール基の４０％が、２，３−
ピリジンジサ３ルフアイドによる処理によつて活性化さ
れた。
メルカプトアルブミンのＰＨ８．Ｏでの結合は、２．６
ｐモルアルブミン／ｙ乾燥生成物を含むアルブミンーＳ
ｅｐｈａｄｅｘ共役物を生じた。６′ブンテ塩゛ゲルは
、２，２−ピリジンジサ！ルフアイド又はテトラメチル
チウラムジサルフアイドによる処理を通じて直接活性化
された。
これらの生成物は、それぞれ４．１及び２．４μモルア
ルブミン／ｙ乾燥生成物を生じるメルカプトアルブミン
を共役するのに使用できる。Ｘ■ エピクロルヒドリン
で架橋したポリビニルアルコールに基くチオ硫酸塩ゲル
及びチオールの調製３０ｍ１のエピクロルヒドリンで架
橋したビーズ状のポリビニルアルコールゲルを、１Ｍの
水酸化ナトリウム２４ｍｔに懸濁させた。
該懸濁液に対して、４．５ｍ１のエピクロルヒドリンを
加えた。他の反応条件は、対応するデキストラン誘導体
の調製に対して記載したのと同じである。ゲルは、？の
チオ硫酸ナトリウム溶液３０Ｔ１Ｌｔで、２時間処理し
た。
生成物の還元は、５００ｍ９のジチオトレイトールを１
０ｍ１の１ＭＮａＨＣ０３／１ｍＭＥＤＴＡ溶液で行な
つた。チオールの分析は、３００μモルＳＨ／ｙ乾燥生
成物を示した。
ゲルを、ＰＨく１でアニスアルデヒドと反応させて、メ
ルカプタールを生成させた。チオ−アルデヒドは、Ｈｇ
Ｃｌ。の水溶液によつてゲルから解放できた。Ｋ■ セ
ルロースに基ずく生成物（ａ） ゛ブンテ塩゛セルロー
ス及びチオールセルロースの調製５ｙの粉末状のセルロ
ースを、窒素雰囲気中、０゜Ｃで２４時間、痔の水酸化
ナトリウム中でマーセル化した。
生成物を、ガラスフィルター上で、０．５Ｍの水酸化ナ
トリウムで洗浄し、次いて０．５Ｍの水酸化ナトリウム
２５ｍ１に懸濁させた。該懸濁液に対して、２５０ｍ９
のＮａＢＨ４及び５ｍ１のエピクロルヒドリンを添加し
た。反応混合物を攪拌し、且つ該混合物の温度を（３０
分間かけて）徐々に６０℃で上げ、そこで（２時間）持
続して、残りの反応を行なつた。生じた生成物を、フィ
ルター上で、最初に水で、次いで０．５Ｍのリン酸ナト
リウム緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）で洗浄した。その後に、生
成物を？のＮａ２ｓ２Ｏ３溶液２５ｍｔ中に懸濁させ、
攪拌しながら、室温で２吟間反応させた。この後、ポリ
マーを水、続いて０．２ＭＮａＨＣ０３／１ｍＭＥＤＴ
Ａで洗浄した。
還元は、２００ｍ９のジチオトレイトールを１０ｍＬの
０．２ＭＮａＨＣ０３／１ｍＭＥＤＴＡに溶かした溶液
で行なつた。チオール含有量の分析は、４６０μモルＳ
Ｈ／ｙ乾燥生成物を示した。チオ−ルーセルロース誘導
体は、硫酸第二銅又は硝酸第二水銀の極めて稀薄な溶液
から、銅又は水銀イオンを見事に吸着した。金属イオン
は、ＥＤＴＡのニナトリウム塩に脱着てきた。
（ｂ）隣接するＳＨ一基を含むセルロースの調製５ｙの
粉末状のセルロースを、上記と同様にしてマーセル化し
た。
マーセル化生成物を固の水酸化ナトリウム１０ｍｔ中に
懸濁させ、該懸濁液に対して、２５０ｍ９のＮａＢＨ４
を１ダの臭化アリルといつしよに添加した。混合物を攪
拌し且つ還流冷却しながら、７０℃で６時間５保持した
。生じた生成物をエタノールと水の混合物で、そして９
６％のエタノールを最終洗浄媒体として洗浄した。その
後、セルロース生成物を、１０ｍ１の四塩化炭素に１―
濁させ、該懸濁液に対して、臭素をワニス色が得られな
１０くなるまで添加した。次いで、付加物をエタノール
及び水で洗浄した。Ｎａ２Ｓ９９Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｅｋ，
Ｄａｍｓｔａｄｔ）から、１Ｍの“゜硫化ナトリウム゛
の水溶液をつくつた。
か）る５ｍ１の゛硫化ナトリウム゛３溶液を１５使用し
て、臭素化セルロースエーテルを、室温て６時間培養し
た。生じる生成物を、最初に水で、次いで１ｍＭＨＣ１
で、最後に再び水で洗浄した。生成物は、４１０ｐモル
ＳＨ／ｇ乾燥生成物のチオール含有量を示した。セルロ
ー２０ス誘導体は、硫酸第二銅又は硝酸第二水銀の極め
て稀薄な溶液から銅又は水銀イオンを見事に吸着した。
吸着した金属イオンの約４０％が、ＥＤＴＡのニナトリ
ウム塩によつて脱着できた。残りは、隣接するＳＨ一構
造によつて２５結合されたものとみなされなければなら
ない。
ｘ■２−ピリジンジサルフアイドアガロースの調製２０
９の洗浄し、吸引乾燥されたアガロースゲ３θル（２％
の炭水化物を含有）を、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液１
６．５ｍ１に懸濁させた。
これに水を加えて、全容積を５０ｍ１にせしめた。該懸
濁液に対して、３．１ｍ１のエピクロルヒドリンを加え
、混合物を、室温で２吟間、次いで６０℃で２３５時間
、反応させた。ゲルはガラスフィルター上で、最初に水
、次いで０．５Ｍのリン酸塩緩衝液（ＰＨ６．３）で洗
浄した。その後、これを洲のチオ硫酸ナトリウム溶液２
０ｍ１と、室温で６時間反応させた。生じた生成物を、
ガラスフィルター４０上で、１Ｍの塩化ナトリウム溶液
、次いで水で洗浄した。その後、硫黄を分析したところ
、１７６０ｐモルＳ／ｑ乾燥生成物を示した。生成物を
、メタノール５０％と、ＥＤＴＡに関して１ｍＭである
、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム５０％とからなる５０ｍ
１の溶液中に懸濁させた。該懸濁液に対して、１．２ｑ
のピリジンジサルフアイドを加した後、混合物を６０℃
で４８時間反応させた。生成物をメタノールと水で注意
深く洗浄した後、窒素を分析したところ、５２６μモル
Ｎ／ｙ乾燥生成物を示した。（ｂ）グルタチオンのカッ
プリング 実施例ｘ■（ａ）に記載した２−ピリジンジサルフアイ
ドアガロース３．４ｍＬを、カラムに充填した。
５ｒｒ１Ｍのグルタチオンを、０．１Ｍの酢酸ナトリウ
ム／０．１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ＰＨ４．Ｏ）に溶か
した溶液を、上記カラムに、５ｍ１／ｈの速度でポンプ
注入した。
全体で４３ｍｔのグルタチオン溶液を使用した。生成物
は最初は、塩化ナトリウムに関して０．１Ｍである、０
．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ４．ｌ）で、次い
で０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液て洗浄した。生成物
は、ダ乾燥生成物あたり、４１５μモルのグルタチオン
を含むことがわかつた。（ｃ）コエンチームＡのカップ
リング ２−ピリジンジサルフアイドアガロース （イ）．９ｙ）を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（
ＰＨ４．Ｏ）で洗浄し、そして吸引乾燥した。
次いで、ゲルを５ｍ１の酢酸塩緩衝液に懸濁させた。該
懸濁液は、今度はＥＤＴＡに関して０．１ｍＭにされた
。
該懸濁液に対して、２７糀９のＣＯＡ（コエンチームＡ
）を加えた。混合物を２３℃で４時間反応させ、次いで
生じた生成物を塩化ナトリウムに関して１Ｍである、０
．１Ｍの酢酸塩緩衝液で５時間洗浄した。
引き続いて、水で２時間、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム
ー１Ｍの塩化ナトリウム溶液て２４時間、そして最後に
水て２時間卆浄した。τＹ（］≠？？９仲；（ た。
１）ウレアーゼのカップリング ２−ピリジンジサルフアイドアガロースによつて、ウレ
アーゼ（Ｓｉｇｍａ，ｔｙｐｅｌＶ）を飽和するまで吸
着した。
懸濁媒体は、ＰＨ７．２の０．１ＭトリスーＨＣｌ緩衝
液であつた。 生成物を激しく洗浄したところ、それは
、３６０ｍ９蛋白質／ｙ乾燥共役物を含むことがわかつ
た。酵素は、５０ｒＴ１Ｍのジチオトレイトールで脱着
できた。ゲル？過の後、ウレアーゼ調製品は出発物質の
それの６．２倍の特異活性５度を示した。Ｘ■ （ａ）
アリルチオ硫酸エステルゲルのテトラメチルチウラムー
ジサルフアイドによる処理を通じてのジサルフアイドー
アガロースゲルの調製
１Ｃ上記したＸ■（ａ）に記載した、２ーピリジンジ
サルファイドゲルの調製と同様にして、調製を行なつた
。
（ｂ）グルタチオンのカップリング ２ーピリジンジサルファイドゲルへのカツ１！プリング
と同様にして、カップリング反応を行なつた。
グルタチオンの含有量の分析は２３０μモルのグルタチ
オン／ｆ乾燥生成物を示した。
５０ｒｒ１Ｍのジチオトレイトール溶液による還元の後
、同様な分析をしたところ、グ２（ルタチオン基の完全
な除去が示された。Ｘ■ アゾジカルボン酸ジエチルに
よるチオールアガロースの活性化以下の一連の実験では
、上記１（ａ）、■（ａ）及び■（ａ）による、６％の
アガロースを含むビーズか２．ら得られたチオールアガ
ロースゲルが使用された。
該生成物は、７３０μモルＳＨ一基／ｙ乾燥生成物のチ
オール含有量を有することを特徴とする。（ａ）活性化
３・５ｙの吸引乾燥し
たチオールゲルを、５ｍ１の９６％エタノールに懸濁さ
せ、該懸濁液に対して、０．５ｍ１のアゾジカルボン酸
ジエチルを加えた。
攪拌混合物を、２７Ｃで１．峙間反応させた後、これを
、５０％エタノール、１Ｍの３塩化ナトリウム溶液、そ
して水て洗浄した。生成物を真空中１００℃で１５時間
乾燥した後、それは１．６％の窒素を含有することが示
された。（ｂ）グルタチオンのカップリング
４ 上記に記載した調製品のうち、１ｙの活性ゲルを、
１ｍ１の１Ｍ酢酸塩緩衝液（ＰＨ４．５）に懸濁させた
。
これに２０ｍ９のグルタチオンを加え、攪拌しながら、
２２゜Ｃで４時間反応させた。生成物は、最初に塩化ナ
トリウムに関して１Ｍである、０．１Ｍの酢酸塩緩衝液
で、二番目に０．１Ｍ重炭酸溶液／１Ｍの塩化ナトリウ
ムで、三番目に水で、そして最後にアセトンで洗浄した
。アミノ酸分析を行なつたところ、グルタチオンの含有
量は６１０μモル／ｙ乾燥生成物を示した。同様な実験
では、カップリング反応をＰＨ７．Ｏで行なつた。
その結果、６５ｐモル／ｙ乾燥生成物のグルタチオン含
有量の生成が得られた。活性ゲルは、水性懸濁液として
、＋４℃で貯蔵された。
−ケ月後、そのカップリング能力は６％減少した。（ｃ
）ウレアーゼの吸着を脱着 吸着をＰＨ６．９で行なつた点を除いて、上記Ｘ［（ａ
）の記載と同様にして、実験を行なつた。
ジチオトレイトールによる脱着及びゲルｐ過の後、ウレ
アーゼ蛋白質に対する特異活性度を定量した。５．２％
の精製が行なわれていることが判明した。
〔■ アゾジカルホン酸ジイソプルピル又はアゾギ酸メ
チルフェニルによるチオールアガロースの活性化とグル
タチオンのカップリング（ａ）アゾジカルボン酸ジイソ
プロピル 上記ｘ■（ａ）の記載と同様にして、活性化を行なつた
。
生成物の窒素含有量は１．３％を示した。上記ｘ■（ｂ
）と同様にして、ＰＨ４．５でグルタチオンのカップリ
ングを行なつた。
生成物のグルタチオンの含有量は、３９５μモル／ｙ乾
燥生成物を示した。（ｂ）アゾギ酸メチルフェニル 上記実施例と同様にして、活性化を行なつたところ、０
．５％の窒素を含む生成物が得られた。
上記実施例と同様にして、グルタチオンのカップリング
を実施したところ、１１ｐモル／ｙ乾燥生成物のグルタ
チオンの含有量を有する生成物が得られた。
Ｘ■ 蛋白質■の付着によるジサルフアイドで不動化し
た蛋白質の化学的変成と蛋白質１一蛋白質■錯体の還元
的解放か）る実験は、゜“蛋白質１゛としてパパインを
、そして“蛋白質■゛としてキモトリプシンを使用して
行なつた。
５、Ｌ（７）０．１ＭトリスーＨＣｌ緩衝液（ＰＨ８．
２）に溶解した、２０ｍ９のパパイン（０．５ＳＨ一基
１モル）を、（同じトリスー緩衝液で）洗浄し、且つ吸
引乾燥した、ピリジルジサルフアイド活性化メルカプト
ヒドロキシピロピルエーテルーセフアロースゲル５ｙと
混合した。
室温で温和な攪拌下に５時間、反応を行なわせた。生じ
たパパインーセフアロース共役物は、次いでガラスフィ
ルター上で、以下の溶液で洗浄した。１０．１Ｍトリス
ーＨＣｌ緩衝液、１ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８
．２（２００ｍｔ）２０．１ＭＮａ一酢酸塩緩衝液、１
ＭＮａＣ１，１ｍＡＥＤＴＡｐＨ４．５（２００ｍ１）
３０．１Ｍ，．Ｎａ−リゾ酸塩緩衝液ＰＨ６．５次いで
、過剰の液をゲルから吸引して、その後、ゲルを１５ｍ
ｔの０．１ＭＮａ−リン酸塩緩衝液（ＰＨ６．５）に懸
濁させた。
これに、１５ｍｇのα−キモトリプシン、１００Ｐｅの
シクロヘキーシルイソニトリル及び１００ｍ１のアセト
アルデヒドを添加し、反応混合物を攪拌しながら、２３
℃で２時間保持した。ゲル酵素共役物をカラムに充填し
、以下の溶液により、流速１０ｍ１／ｈで洗浄した。１
０．１ＭＮａ−リン酸塩緩衝液ＰＨ６．５２時間２０．
１ＭＮａ一酢酸塩緩衝液，１ＭＮａＣ１ｐＨ４６時間３
水 ３時間４０．１Ｍ．．
ＮａＨＣ０３−１／ＭＮａＣｌ３時間こ５０．１ＭＮａ
ＨＣ０３−１／ＭＭＥＤＴＡ３時間次いで、パパインー
α−キモトリプシン共役物は、２０ｒＴ１Ｍシステイン
の０．１ＭＮａＨＣ０３−１／ＭＭＥＤＴＡ溶液を、カ
ラムにポンプ注入することによつて還元して、ゲルから
開放した。
３２８０ｒ１ｍ（７）ＵＶ吸収を示す部分を集めて、Ｓ
ｅｐ−ＨａｄｅｘＧ−７５上で、ゲル淵過した。
（この過程は、過剰の還元剤及び開放された２−チオピ
リジンなどを除去するために導入した。）パパインーα
−キモトリプシン共役物（分子量に基ず４く）に相当す
る部分は、キモトリプシン活性（Ｎ−アセチルーＬ−チ
ロシンーエチルエステルの加水分解で測定）とパパイン
活性（Ｎ−ベンジルーアルギニンーエチルエステルの加
水分解で測定）との両方を示した。本発明の実施態様を
挙げれば次のとおりてある。
（１）チオ硫酸塩基（−Ｓ２Ｏ３−ー基）又はこの基の
誘導体を各々一以上含む有機側鎖を持ち、水酸基又はア
ミノ基を含む水不溶性ポリマーからなる分離用、イオン
交換用又は酵素抑制剤若しくは例えばレドックス反応を
行なうための粒子のような生化学的特異性を有する種々
の化合物を吸着若しくは固定化するために調製される分
離用の種々の誘導体の基礎物質に用いられる生成物およ
びこの生成物の誘導体から成る生成物。
（２）上記ポリマーがゲルである実施態様（１）の生成
物。（３）上記ポリマーがアガール又はアガール誘導体
である実施態様（１）〜（２）の生成物。
（４）上記ポリマーが、ポリビニルアルコールである実
施態様（１）〜（２）の生成物。
（５）上記ポリマーがセルロースである実施態様（１）
〜（２）の生成物。
（６）上記ポリマーが、デキストランのような架橋した
多糖類である実施態様（１）〜（２）の生成物。
（７）上記ポリマーが、アミノー置換されたポリアクリ
ルアミドである実施態様（１）〜（２）の生成物。（８
）上記有機側鎖が、下記の一般式を有する実施態様（１
）〜（７）の生成物式中、Ｒは、ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ
２−ＳＯ２又はＣＨ２−ＣＨ（０Ｈ）−ＣＨ２−０−Ｒ
２−０−ＣＨ２を表わし、Ｒ２は、直鎖又は分岐したア
ルキレン基であり、Ｚは、Ｈ及び／又はアルキル基を表
わし、Ｒ″は、Ｈ１アルキル、アルケニル又はアリール
基を表わし、またＹがＳ２Ｏ３−であるとき、Ｘは０Ｈ
．．Ｈ又はＳ２Ｏ３−であり、Ｙが、０Ｈ．．Ｈ又はＳ
２Ｏ３−であるとき、ＸはＳ２Ｏ３−である。
（９） 一般式、Ｐ−０−ＣＨ２−ＣＨ（０Ｈ）−ＣＨ
２一Ｓ２Ｏ３−で表わされる実施態様（１）〜（８）の
生成物。
ＱＣｊｉ一般式、Ｐ−０−ＣＨ２−ＣＨ（０Ｈ）−ＣＨ
２一０−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ（０Ｈ）−ＣＨ２
−Ｓ２Ｏ３−で表わされる実施態様（１）〜（８）の生
成物。（１１）一般式、Ｐ−０−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ
２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ２Ｏ３−で表わされる実施態様
（１）〜（８）の生成物。（１２）一般式、Ｐ−０−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ（Ｓ２Ｏ３−）−ＣＨ２一（Ｓ２Ｏ３−）で
表わされる実施態様（１）〜（８）の生一成物。
（１３）Ｓ２Ｏ３一基の一部又は全部が−ＳＨ基に転換
されるか又は−ＳＨ基で置換されている実施態様（１）
〜（１１）の生成物。
（１４） −ＳＨ基の全部又は一部が−Ｓ−Ｓ−（ジー
サルフアイド）基に転換されている実施態様（１３）の
生成物。
（１５）チオ硫酸基の全部又は一部が、−ＳＨ基に転換
されているか又は−ＳＨ基によつて置換されている実施
態様（１３）の生成物。
（１６） 一般構造、Ｒ−Ｓ−Ｙ（こ）でＰ−Ｓ−は、
実施態様（１）〜（１２）によるチオ硫酸塩ポリマー又
は実施態様（１３）のチオールポリマーの残基を表わし
、またＹは、一般式Ｈ−Ｓ−Ｐ″を有する有機チオール
化合物又はチオール含有粒子に対して、生成物を極めて
反応性にさせる基を表わす）を有し、上記種類のチオー
ル含有生成物と接触させることにより、該生成物Ｐ−Ｓ
−Ｙは、Ｐ−Ｓ−Ｙ＋Ｈ−Ｓ−Ｐ″→Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｐ″
＋Ｙ″なる型の反応（こ）で、Ｙ″は、ＹＩに極めて有
利なＹ″二Ｙ″の平衡に関与するか又は活性ポリマーに
本来不活性であることによつて逆反応に関与できる）に
あすかる実施態様（１）〜（１３）の生成物から誘導さ
れた生成物。
（１７）Ｙが−Ｓ−Ｒの構造を有し、チオールとチオン
との間の一ＳＲ：ーＳ＝Ｒ− なる平衡がチオンに極めて有利であるような性質をＲが
有する実施態様（１６）の生成物。
一Ｓ−℃−Ｎ（Ａ）２（１８）Ｙが式、
１１を有し、こ）で Ｓ Ａは、アルキル基、即ち、テトラアルキルチウラムジサ
ルフアイド分子の一部を構成する実施態様（１７）の生
成物。
（１９）Ｙが、構造式、−Ｎ（Ｅ）−Ｎ（Ｈ）上を有し
、ここでＥは、電子吸引性基である実施態様（１６）の
生成物。（２１Ｙが、構造式、−Ｎ（ＣＯＯＡ）−Ｎ（
Ｈ）一ＣＯＯＮを有し、こ）で、Ａ及びＡ″は、同一又
は異なる性質のアルキル基である実施態様（１６）及び
（１９）の生成物。（２１）構造式、Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｐ″
で表わされ、こ）で、Ｈ−Ｓ−Ｐ″は、チオールを含有
する蛋白質、ペプチド、アミノ酸、アミン、ヌクレチオ
ドなどの有機チオール化合物又はチオール基を含有する
粒子を表わす実施態様（１６）の生成物から誘導された
生成物。
（２２）二つの官能基を有する活性化試剤を用い、該試
剤の分子の少なくとも一つの官能基が上記ポリマーと結
合し、残りの官能基のうちの相当数を未反応かつ活性状
態に保持することによつてまず上記ポリマーを活性化し
、次いで過剰の試剤を除去した後に、上記活性化したポ
リマーをチオ硫酸塩溶液と反応させる実施態様（１）〜
（８）の生成物の調製方法。
（２３）活性化試剤が、エピクロルヒドリンのアルカリ
性溶液又はアルカリ性溶液中でジプロムプロバノールの
ような化合物を生成する物質からなる、実施態様（９）
の生成物の調製方法。
（２０活性化試剤が、ビスエポキサイドのアルカリ性溶
液又は、問題とする条件でそのような化合物を生成する
物質からなる実施態様（１０の生成物の調製方法。（２
５）活性化試剤が、ジビニルスルホン又はその誘導体の
アルカリ性溶液からなる、実施態様（１１）の生成物の
調製方法。
（２６）ポリマーを最初に臭化アリルと反応させ、生じ
たアリルポリマーに対して臭素を付加させ、その後に生
じた生成物をチオ硫酸塩の溶液と反応させることからな
る、実施態様（１２）の生成物の調製方法。
（２７）チオ硫酸塩ポリマーを、−Ｓ２Ｏ３基を−ＳＨ
ノ 基に転換する能力を有する化合物の溶液と反応させ
ることからなる、実施態様（１３）及び（１５）の生成
物のチオ−ルーポリマーへの転換方法。
（２８）チオ硫酸塩のチオールへの転換が、１，４ージ
メルカプトブタン又はその誘導体の溶液との反応によつ
て起ることからなる、実施態様（２７）の方法。
（２９）還元剤が、トレオ又は工リトロー１，４ージメ
ルカプトー２，３−ブタンジオール（それぞれ、ジチオ
トレイトール及びジチオエリトロイトールと呼ばれる）
の溶液である、実施態様（２８）の方法。
（３０）実施態様（２３）〜（２６）で活性化されたゲ
ルを、水硫化ナトリウムの溶液と直接反応させる、チオ
ール化合物の調製方法。
（３１）チオールポリマーを、適宜の酸化剤に接触させ
る、実施態様（１４）の生成物の調製方法。
（３２）懸濁液又はカラム中のチオ硫酸塩ポリマーを、
２，２″−ピリジルサルファイドの溶液と直接反応せし
め、その後、生成物を洗浄して、過剰の試剤及ひ溶解性
の反応性成物を分離せしめる、実施態様（１６）及び（
１７）の生成物の調製方法。（３３）懸濁液又はカラム
中のチオ硫酸塩ポリマー７又はチオールポリマーを、テ
トラアルキルチラウムジサルフアイド、特にテトラメチ
ルチラウムジサルフアイドの溶液と反応せしめ、その後
生成物を洗浄して、過剰の試剤及ひ溶解性の反応生成物
を分離せしめる、実施態様（１９）及び２（２０）の生
成物の調製方法。
（３４）実施態様（２７）〜（２９）のようにして、最
初にチオ硫酸塩ポリマーをチオールポリマーに転換し、
その後、該チオールポリマーをアゾジカルボン酸エチル
のような適宜のアゾジカルボ３ン酸エステルの溶液と反
応させ、次いでポリマーを回収し、洗浄せしめる、実施
態様（１９）及び（２０）の生成物の調製方法。
（３５）実施態様（１６）〜（２０）のポリマーで、一
ＳＨ基を含むことが予め推定されるポリマー３を、共有
的に結合される化合物（ＨＳ−Ｐ″）の溶液と反応させ
、それが、ジサルフアイド基を含む楊合には、実施態様
（１３）又は（１５）のようにして、高度に置換した−
ＳＨ−ポリマーとの反応によつて、か）る基をチオール
基に転換４、することからなる実施態様（２１）の生成
物の調製方法。
（３６）実施態様（２７）〜（２９）のようにして、ポ
リマーを還元溶液に接触させて、−Ｓ−Ｓ一結合を破壊
してチオールポリマーを生成させ、活性化の後、基−Ｓ
−Ｐ″の更新した固定化を生じさせることからなる、実
施態様（２１）のＰ−Ｓ−Ｓ−Ｐ″型ポリマーからのチ
オールポリマーの回収方法。
（３７）溶液中で使用されるのと同様な反応をチオール
ポリマーに受けさせ、かくして、該ポリマーの物理的構
造の認知できる変化なしに、上記反応ポリマーのＳＨ基
を含むことを特徴とする、既知の方法によつて、溶液中
でチオール基に導入できるような有機ラジカルによつて
、一ＳＨ基のＨを置換するようにして、実施態様（１）
〜（１３）又は（１５）のポリマーを使用して置換生成
物を調製する方法。
〔３８）クロマトグラフィー技術における、ジサルフア
イド又はチオールポリマーを含む、チオールジサルフア
イド交換反応が使用されることからなる、化学吸着によ
つて、チオール又はジサルフアイド基を含む生成物の分
離を行なう方法。
［３９）ポリマーをクロマトグラフィーの分離プロセス
に対して有用にせしめるように、ポリマーの置換基を選
択することからなる、実施態様（３８）の方法。
４０）水をチオールポリマーと接触させることによつて
、金属イオンを事実上定量的に結合させ、その後、所望
の飽和度にせしめた後、該ポリマーを、上記金属イオン
と錆体を形成する強い性質を有する化合物の溶液で処理
することによつて再生する実施態様（１３）又は（１５
）のポリマーを使用して、極めて少量の重金属イオン又
は金属一有機化合物を除去し、水を精製する方法。
４１）一つ又は全部の過程を、カラム中で連続的に実施
する実施態様（４０）の方法。
４２）水が、都市水又は適宜の方法で前処理した下水で
ある、実施態様（４０）〜（４１）の方法。
４３）除去される金属イオンが、低溶解度の金属硫化物
を生成する金属イオンのグループに属する実施態様（４
０）〜（４２）の方法。
（支）溶液をチオールポリマーと接触させ、かくして該
ポリマーの還元及び／又は金属錆化性質によつて、微生
物の生長を防ぎ、且つ多かれ少なかれ除去することが困
難な溶解性の生長禁止剤によつて、上記生物学的溶液の
混入を防止することからなる、実施態様（１３）又は（
１５）のチオールポリマーを使用して、微生物の生長に
対する、生物学的溶液を保護する方法。
（４５）ポリマーのイオン交換性質に依存する、実施態
様（１）〜（１３）及び（１５）のチオポリマーを分離
のために使用する方法。
（４６）ポリマーが、レドックス系に関与する、実施態
様（１）〜（１５）のチオ硫酸塩ポリマーを分離のため
に使用する方法。
（４７）チオールージサルファイド交換反応が使用され
る、チオール含有蛋白質又はチオー蛋白質含有粒子を実
施態様（１３）及び（１５）のポリマーに不動化する方
法。
（４８）その溶液又は懸濁液を、最初に、高度に置換さ
れたチオールゲルの還元力にさらし、おそらく−Ｓ−Ｓ
ブリッジの還元を引き起こし、その後、生じたチオール
含有生成物をジサルフアイドポリマーと反応させること
からなる、実施態様（４７）の不動化方法。
（４９）有機物質が−ＳＨ基を含むときには直接に、ま
た−Ｓ−Ｓ基を含むときには還元後に、更にはこのよう
な基を含まないか又は不充分なときにはチオール化した
後に、か）る有機物質を、実施態様（１６）〜（２０）
のポリマーに対して、チオールージサルファイド交換反
応によつて不動化せしめ、その後、該不動した有機化合
物上で化学吸着を行ない、該有機化合物は、過剰の試剤
を除去した後、例えばジチオトレイトールによる−Ｓ−
Ｓブリッジの還元開製によつて、ポリマーから遊離する
ことからなる、溶液中で行なつた場合、分子間架橋反応
を起す、ペプチド、蛋白質、糖類又はポリヌクレオチド
のような有機化合物の共有変性の支持相として、実施態
様（１６）〜（２０）のポリマー生成物を使用する方法
。
（５０）蛋白質、糖類若しくはヌクレオチド、又はその
相補的物質を、ジサルフアイド結合によつて、チオール
ポリマーと共役させ、かくして、第一の場合には、上記
相補的物質をポリマーに付着した蛋白質、糖類又はポリ
ヌクレオチドによつて吸着させ、第二の場合には、溶液
中の蛋白質、糖類又はポリヌクレオチドを、ポリマーに
付着した相補的物質で吸着させ、その後、担体ポリマー
から上記錆体を、実施態様（２８）又は（２９）の適宜
の還元剤を付加することによつて解放させることからな
る、蛋白質、糖類又はポリヌクレオチドと生特異性の相
補的物質との間の吸着錆体の調製方法。
（５１）試剤として、１，４ージメルカプトブタン又は
その誘導体ジチオトレイトール又はジチオエリトレイト
ールを使用することを特徴とする、実施態様（１４）若
しは（２１）のポリマー又は、蛋白質、ペプチド、アミ
ノ酸、アミン、ヌクレオチド又はそのような化合物を含
む粒子からなる他の有機化合物のジサルフアイド結合を
チオール基に転換する方法。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アミルグルコシダーゼのチオールアガロース
による還元をＰＨの関係で示すものであり、第２図は、
活性化したチオールアガロースゲルを充填したカラムの
再生を示すものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ アガールまたはアガール誘導体、ポリビニルアルコ
    ール、セルロース、デキストラン、アミノ置換されたポ
    リアクリルアミドからなる群から選ばれた水溶性ポリマ
    ーの側鎖として、チオ硫酸塩基（−Ｓ＿２Ｏ＿３＾−基
    ）またはこの基の誘導体を各々１以上含む下記一般式▲
    数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲはＣＨ＿２、ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−ＳＯ＿２
    またはＣＨ＿２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ＿２−Ｏ−Ｒ＿２
    −Ｏ−ＣＨ＿２を表わし、Ｒ＿２は直鎖または分岐アル
    キレン基であり、Ｚは、Ｈおよび／またはアルキル基を
    表わし、Ｒ′はＨ、アルキル基、アルケニル基またはア
    リール基を表わし、またＹがＳ＿２Ｏ＿２であるとき、
    ＸはＯＨ、ＨまたはＳ＿２Ｏ＿３＾−であり、ＹがＯＨ
    、ＨまたはＳ＿２Ｏ＿３＾−であるとき、ＸはＳ＿２Ｏ
    ＿３＾−である。 〕で示される有機側鎖を、上記水不溶性ポリマーに対し
    て結合してなるクロマトグラフィー用支持体。 ２ 二つの官能基を有する活性化試剤を用い、該試剤の
    分子の少くとも一つの官能基を、アガールまたはアガー
    ル誘導体、ポリビニルアルコール、セルロース、デキス
    トラン、アミノ置換されたポリアクリルアミドからなる
    群から選ばれた水不溶性ポリマーと結合させ、残りの官
    能基のうちの相当数を未反応かつ活性化することによつ
    て、まず上記水不溶性ポリマーを活性化し、次いで過剰
    の活性化試薬を除去したのちに、上記活性化した水不溶
    性ポリマーをチオ硫酸塩溶液と反応させてなるクロマト
    グラフィー用支持体の調製方法。
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