JPS60501562A - ヒトカルシトニン関連ペプチドおよび医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチド、医薬組成物、ペプチドの製造法、ペプチドをコードする遺伝 子、この遺伝子を含むベクターとこのベクターで形質転換させた宿主生物体、お よび診断に使用する遺伝子プローブと抗体に関する。

発明の背景 カルシトニン遺伝子系は近年かなりの研究の首題であった。特に、ラットカルシ トニン遺伝子発現の研究により証明されたことは、単一遺伝子から各種ペプチド ホルモンを産生ずるために、明かに組織特異的に選択的ｍＲＮＡ種の、ＲＮＡプ ロセッシングによる、発生である（クレイグ、アール、ケイ等（１９８３）、ジ エネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ〜２４４）。各ｍＲＮＡ種は ポスト翻訳プロセッシング結果により分裂したポリクン白質をコードし、ラット カルシトニン又はラットカルシトニン遺伝子関連ベプチ１（ラン）　ＣＧＲＰ　 ）を産生する。ラン）　ＣＧＲＰは中枢神経系と末梢神経系の不連続領域に広く 分布していることは公知であり、そこで潜在的生物活性を有するこ係属中のヨー ロッパ特許出願ＢＰ　−ＡＩ　−００７０１８６号とＢＰ　−Ａ１−００７０６ ７５号（アール、ケイ、フレイブとアイ、マツキンタイプ）Ｋは、ヒトカルシト ニンおよびＰＤＮ　−２１と称するカルボキシ末端ペプチド（カタカルシン）の 製造法が記載されている。ヒトカルシトニンおよびカタカルシンはヒトカルシト ニンｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドとして生成される（フレイブ等（ １９８２）ネイテヤ本発明者は、ヒト髄質癌腫細胞に転写されかつヒトカルシト ニンｍＲＮＡの３′翻訳領域末端に位置するヒトカルシトニン遺伝子領域を見出 した。この領域は転写イントロン領域、スプライス接合部、従来未知のヒトペプ チド配列をコードする開放読み取り枠、およびボＩＪ　Ａ残基の域を末端とする ６′未翻訳領域から成る。このペプチドの１つは明かにマツ）　ＣＧＲＰの類似 体であり、以後これをヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ヒトＣＧＲＰ　） と呼ぶ。

発明の要約 本発明の第１特長によれば、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドを供する。

本発明の第２特長によれば、構造： Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ−Ｔｈｒ −Ｈｉ　ｅ−Ａｒ　ｇ−−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ− Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−Ｖａ’１−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡＳｎ−Ａｓ ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌ ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミド　（１）を有するペプチドを供することである。

この新規ペプチドは、側面に位置する塩基性アミノ酸残基を認識するタン自分解 酵素により分泌経路内部で生体内特異的に切断されるポリタン白質の一部として 形成される。このペプチド（タテモトおよびマット（１９８１）　ＰＮＡＳ　７ ８　、６’６０３〜６６０７の命名によりＰＡＦ　−３７と記述された）は心血 管機能の調整に潜在的生物学的効果を有することが分った。特に、このペプチド は血圧降下を誘因しかつ６傳度数と力を増進させることが分った。

本発明の第２特長において、このペプチドは医薬として、望ましくは高血圧の治 療に使用するのに供される。主たる心臓外科（例えば開放心臓バイパス手術）の 手術後段階では、患者にとって、広範囲の血管収縮により手術のストレスに感応 するのが普通である。このことは患者の血圧を上げる作用となるから、心臓を緊 張させる。本発明のベプチＰは降圧剤として作用しかつ心褥度の力を増すことが 分った。これらの連結効果により、手術後の処理に潜在的用途を有する。多くの 人々は高血圧症に罹っており、高発生率の心臓病にけ高い原因ファクターとなっ ている。このペプチドは高血圧管理に使用することができる。

本発明の第３の特長において、構造（１）のペプチドおよび医薬的に許容可能な 賦形剤から成る医薬組成物を供ずろ。本組成物は注射可能なものがよい。医薬組 成物は体内に緩徐放出型の組成物又はペプチドの系内に含有させることができ、 あるいはその一部を形成することもできる。斯様な緩徐放出型は長期間の高血圧 管理に使用さハろ。

更に本発明は有効量の構造（１）のペプチドを投与する、高血圧の治療法を供す る。また、本発明の第６の特長では、構造（Ｉ）のペプチドを医薬的に許容可能 な賦形剤と一緒にする医薬組成物の製造法を供する。

構造（１）のペプチドは各種の方法により製造することかできる。

当業界で公知の技術を使って、ペプチド化学合成法によりこのペプチドを製造す ることができる。ペプチドの精製はイオン、逆相クロマトグラフィ技術を使って 行なうことができる。

本発明の別の特長では、少なくとも下式のアミノ酸配列 Ａｌａ−Ｃｙｑ−Ａｓｐ−Ｔｂｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ− Ｈｉｓ−−Ａｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　］、］ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ Ａｒ　ｇ−８ｅｒ　−Ｇ　１ｙ−（式中、Ｒ′は−Ｈ又はアミノ酸残基である） を有するペプチド又は生体内あるいは試験管内でアミドに転換可能なペプチドを 供する。Ｒ′は　−０１７−１−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ又は −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇでよいが、−０１７が望ましい。カルボキシ 末端残基Ｒ′は生体内又は試験管内で隣接のフェニルアラニンアミノ酸残基のア ミげに酵素転換することができる。Ｒ′が−ＧｌｙＯ時、この転換に適する酵素 は酵母カルボキシペプチダーゼＹ又は哺乳動物アミド化酵素である（ブラッドベ リー、エイ、エフ、クイニー。エム、デー、エイおよびスミス、ディー、ジー（ １９８２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、　２９８　、６８６〜６’　８８ 　）。

別法としておよび望ましくは、このペプチドは組換えＤＮＮ入荷術より製造する 。

本発明の第４の特長として、中間ペプチドが本発明の第４特長に係るペプチドで ある中間ペプチドをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換させた宿主生物 体を培養して、中間ペプチドを得、ついでＲ′をアミドに転換させる、構造（１ ）のペプチドの製造法を供する。

中間ペプチドは形質転換さねた宿主生物体に生成された′タン白質の少なくとも 一部および上記（Ｉｌｌに記載したアミノ酸配列を含む融合タン白質であるのが よい。

望ましくは、この融合タン白質は形質転換宿主生物体により高レベルで産生され るタン白質を含む。適当なタン白質は少なくとも一部分クロラムフエニコールア セチルトランスフェラーゼ（ｃＡＴ　）タン白質又は少なくとも一部β−ガラク トシタ゛−ゼタン白質を含む。融合タン白質は形質転換宿主生物体に高レベルで 産生じたタン白質のカルボキシ末端基に結合した上記（■）に記載のアミノ酸配 列を有するペプチドを含むのがよい。

ペプチドは選択的化学又は酵素分解しうる結合を介してタン白質に連結するのが よい。この結合はメチオニン又はグルタミン酸残基でよい。メチオニンは臭化シ アンにより選択的に切断することができかつグルタミン酸はツルガム由来の酸プ ロテアーゼ（Ｅｃ３．．４゜２３．１４）、ウニプロテアーゼ（Ｋｃ３．４．２ ４゜１２）又は望ましくはスタフィロコッカスプロテアーゼ（ＥＣ３，４，２１ ，１９）を使って選択的に切断することができる（ヒ）　Ｃ０ＲＰ配列はＭｅｔ 又はＧｌｕ残基を含まない）。結合はりジン−アルギニンペプチド２官能基でよ い。この結合の切断はマウス顎下腺プロテアーゼ又は望ましくはクロストリパン （ＥＣ３゜４．２１．６．）を使って行なうことができる。

本発明の第１と第２特長に係るペプチドは体内にてポリタン白質として産生さハ る。このポリタン白質は体内で処理され、本発明の第１又は第、２特長のアミド 化３７アミノ酸ペゾチドを残すアミンおよびカルボキシ末端基を切断する。本発 明の第６の特長として、少なくとも以下のアミノ酸配列。

Ａｒｇ−工１ｅ−エコーｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｃｙｓ −Ａｓｐ−−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒ ｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ＝Ｓｅｒ−Ａｒｇ−８ｅｒ４１ ｙ＝Ｇｌｙ−Ｖａｌ−■ａ１．−Ｌｙｓ−を含む中間ペプチドをコードする遺伝 子を含むベクターで形質転換した真核宿主生物体を培養して、中間ペプチドを得 、この中間ペプチドを宿主生物体によりプロセッシングさせ、ついでペプチドを 単離する、構造（１）を有するベゾチ１の製造法を供する。真核宿主生物体はア ミノ酸配列■を含むポリタン白質から構造Ｉのペプチドを製造しうるタン自分解 酵素とアミー化酵素を含有しうる組織培養した晴乳動物のセルラインであるのが 望ましい。望ましくは中間ペプチドは融合タン白質として生成される。

ポリタン白質のプロセッシングにおいて、テトラペプチドが製造される。このテ トラペプチドも生物活性を有し、本発明の特長でもあり、下式の配列：Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ　（■）を有する。このペプチドは’ＰＤＡ−４と表示 され、心血管機能の調整に関し生物活性を有することが分った。特に、このペプ チドは血圧低下を誘発しかつ心傳度を増大させることが分った。

本発明の第８の特長として、配列■のペプチドを医薬として、望ましくは高血圧 の治療に使用することである。

本発明の第９の特長として、配列ｆｆＶ）のペプチドと医薬として許容可能な賦 形剤から成る医薬組成物を供することである。この組成物は注射可能であるの力 １よし・。

医薬組成物は生体中緩徐放出型の組成物又むまペプチドの系内に含有させること ができある℃・はその一部を構成することもできる。本組成物は構造Ｉのペプチ ドと配列■のペプチドの併用および医薬上許容可能な賦形剤を含有してもよい。

本発明の第９の特長として、ＰＡＦ−５７をコードする遺伝子（構造Ｉ）、ＰＡ Ｆ　−３７−Ｒ’　（構造■）、ＰＤＡ　−４（構ｍ　ＰＪ　）　又は［非プロ セツシンク゛」ペン０チド（構造■）を供する。望ましくは、本発明０１次のア ミノ酸、図２の下半分１）１〜３７．１ｉ）−３〜−７，１ｉｉ）＋６〜＋９又 はｉｖ）　”７〜＋９のアミノ酸に相当するヌクレオチドにより記載される特定 遺伝子を供する。また本発明はヌクレオチド１〜１２５６まで図２に実質的に示 すヌクレオチド配列を供する。更に本発明はこわらのいずれかの遺伝子を含むベ クターおよびこのベクターで形質転換した宿主生物体を供する。適当な宿主生物 体にはバクテリア（例え（子大腸菌）、酵母（例工ばサツカロミセス・セレビシ ェ）および組織培養の浦乳動物細胞である。

ヒ）　ＱＧＲＰの生産は選択的仲介組織、ｍＲＮＡプロセッシングによる組織で ある（ニドプルツク、エム、アール等、ネイー１−ヤ−（Ｎａｔｕｒｅ）　（１ ９８４）−提起）。

髄質甲状腺癌腫や肺癌にみられるようなある細胞では、ヒ）　Ｃ０ＲＰは各種レ ベルで産生される。したがって、ヒトＣＧＲＰの存在は異常組織の診断となり得 る。更に本発明はヒ）　Ｃ０ＲＰ遺伝子発現と異常遺伝子組織の試験に使用する 診断薬（抗体と遺伝子プローブを含む）を供する。

本発明の第１１の特長として、本発明は構造Ｉのペプチド、又は抗原性決定子を 含むその一部（検出可能なラベルを有する）を供する。このラベルは酵素、発色 団、発螢光団又は化学ルミネセンス群でよい。しかし、最も望ましいのは放射性 同位元素で、例えばペプチドのアミノ酸配列の５位のヒスチジンアミノ酸残基に 結合する１２５１である。ラベルしたペプチドは構造Ｉのペプチド又は１２５工 で任意にラベルしたチロジノアミノ酸残基を含むその一部を含むのがよい。ペプ チド部分はアミノ酸２５〜３７（アミド化フェニルアラニン）又はアミノ酸１〜 ８が望ましい。

本発明の第１２の特長として、構造■のペプチドの抗原性決定子に特異性を有す る抗体を供することである。この抗体はポリクローナルでもモノクローナル抗体 でもよい。抗体は検出可能なラベルで標識することができる。

本発明の第１１と第１２の特長の試剤は、イムノアッセイ、望ましくはラジオイ ムノアッセイのもの、試料中構造ｌのペプチド、又は組織部分の免疫細胞化学限 定のものでよい。

ＰＡＦ　−３７をコードするｍＲＮ　Ａ又はそのｍＲＮＡを含むヌクレオチド配 列について試験することも可能である。

したがって、本発明の第１１の特長として、図２（で示した１〜１２５６のヌク レオチド配列力）ら選んだ１５種以上のヌクレオチド配列を有するＤＮＡノ・イ ブリットプローブを供することである。プローブ（ま固体相に固定化することも でき、ある（・は検出可能なラベルで標識することもできる。

このようなプローブはＤＮＡ　＋ＲＮＡのプロッティング技術により遺伝子組織 や遺伝子発現を試験し、あるし・は遺伝子を発現する組織部分の正常在位（ｉｎ 　５ｉｔｕ　）のハイブリッド細胞により確認するのに使うこと力１できる。

本発明の第１６の特長の望ましいブロープレま、図２に示した１〜７２５のヌク レオチド配列力）ら選んだ配列を有する。この望ましい型のプローブＱ′１．ヒ トカルシトニン遺伝子組織又は発現とは反対に、ヒ）　ＣＧＲＰを試験するのに 使うことができる。特に、このプローブはヒトＣＧＲＰ　ｍＲ１１Ａおよびヒト Ｃ（）ＲＰ構造遺伝子にノ・メブリットする。

本発明の第１３の特長の別の望まし２℃・プローブ（・ま図２に示１．た７２６ 〜１２５６のヌクレオチド配列力・ら選んだ配列から成る。この望まし℃・型の ）０ロープＧマヒトカルシトニンＣ０ＲＰ遺伝子の生物体を試験するのに使うこ とができる。特に、このプロー　プはヒ）　ＱＧＲＰ構造遺伝子のイントロン領 域にノ・イブリッドする。

次の図面を参照しながら、本発明を次の記述により説明する。

図１は組換えシラスミドｐｈＴ１３　”、　、ｐｈＴＢ　ｔ５およびｐｈＴＢ　 ５８にてクローンした重複ｃＤＮＡ配列の概略図である。

図２は組換えプラスミドｐｈＴＢ　３　、ｐｈＴＢ　（５およびｐｈＴＢ　５８ から誘導した完全なヌクレオチド配列である。

図６はシラスミドｐｃＴ　２０１、ｐＣＴ　２０２、ｐｃＴ２０３およびｐＣＡ Ｔ　−ＣＧＲＰの構造の概略図である。

ＨＢ　１Ｑ　１の抽出物におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣＡＴ　）とヒ）　ＣＧＲＰの融合タン白質の存在を示すポリアクリルア ミ−デルである。

図５はｐＣＡＴ　−Ｃ０ＲＰで形質転換した大腸菌ＨＢ１Ｑｉのタン白質抽出物 におけるヒ）　（！ＧＲＰ抗原性決定子の存在を示すラジオイムノアッセイの結 果を証明するグラフである。

図６はラットにおける６搏度数および平均動脈圧の薬物感応曲線を示す（・＝食 塩水、○＝ヒ）　ｃＧＲＰ　。

△＝ラランｃＧＲＰ、ロニヒトＣ０ＲＰ＋プロプラノロール、−二ヒトＣＯＲＰ ＋メビラミン＋シメチジン）。

図７はラットに静脈注射したＰＤＡ　−４（およびヒトＣ０ＲＰ）の６褥度数と 平均動脈圧に及ぼす影響を証明するタコグラフトレースである。

図８はモルモットの６褥度数と力の薬物感応曲線を示す。

図９は髄質甲状腺癌組織、髄質甲状腺癌腫患者の血漿の抽出液におけろヒ）　Ｑ ＧＲＰの存在および肺癌セルラインによるＣｃｕｐの産生を示すラジオイムノア ッセイ結果を証明するグラフである。

し１１０は髄質甲状腺癌腫および肺癌腫セルラインにおけるカルシトニンとヒト ［：！ＧＲＰ　ＲＮＡ　Ｏ）各種発現な証明するＲＮＡプロットを示す。

図１１はヒト胎盤組織のＤＮＡを髄質甲状腺癌腫組織又は単一患者のリンパ球の ＤＮＡを比較した時、ヒトＣＧＲＰ遺伝子と相同遺伝子の各種生物体を証明する ＤＮＡプロットを示す。

係属中のヨーロッパ特許出願第ＥＰ　−Ａｉ　−００７０６７５号には、ヒト髄 質甲状腺癌組織から単離した全細胞ボ！Ｊ　（Ａ　）−含有ＲＮＡを使５　ＣＤ ＮＡライブラリィ−の構成（アリスン、ジエイ等、バイオケミストリイ　ジャー ナ＃（ＢｉｏｃｈｅｍＪ、　）　（１９８１）１９９　７２５〜７３１参照）お よびこのライブラリィ−＝、ｐｈ’ｒ　＝Ｂ　３およびｐｈＴ　−Ｂ　６から単 離した２つのプラスミド内でクローンしたヒトカルシトニンｍＲＮＡ６ の大部分のヌクレオチド配列分析（フレイブ、アール・ケイ等、ネイチャー　（ Ｎａｔｕｒｅ　）　（１９８２）　２９５．６４５〜３４７参照）が記載さ４て いる。この研究中、約１６００ｂｐの挿入ｃＤＮＡ断片を含有する１つの組換え プラスミドｐｈＴ　−Ｂ　５３が予備スクリーニングを介して同定されたが、そ ４以上の分析はされなかった。

非常に大分子なのでカルシトニンｍＲＮＡを示ストは思われなかったからである 。このシラスミドに挿入されたｃＤＮＡの続く制限酵素分析（図１参照）によハ ば、ｐＨＴＢ　３に共通の位置を示し、更にｐｈ’ｒ−８５３内でクローンした ｃＤＮＡは予め確立された配列から下流の配列を示し、ヒトカルシトニンｍＲＮ Ａの完全な３′未翻訳領域を示すことを指摘した。図１は、配列特異性ノ・イブ リットプローブとして使われる配列の領域を分離する制限部位およびカルシトニ ン、Ｃ０ＲＰおよび共通のアミン末端ペプチドの相対位置を示す。垂直の破線は ｃＤＮＡとプラスミド配列を分離するＰｓｔ　１部位を示す。ｐｈＴ　−Ｂ　５ ８　’１７ｃ挿入された全ｃＤｎＡ配列のヌクレオチド配列分析は既述した方法 （フレイブ・アール・ケイ、ホール・エル、ニドプルツク・エム・アール、アυ スン・ジエイおよびマツキンタイア・アイ（１９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ　）　２９５．３４５〜３４７）−図２参ｈｄを使って行なった。数値はヒ トとラットカルシトニンおよびＣＧＲＡ　ＲＮＡ転写の公知ヌクレオチド配列と 相同を最大化するのに導入されたギヤツデとを比較する。ヒトヌクレオチド配列 の直ぐ上の数はｐＨＴ　Ｂ　５３にクローンしたポリ（Ａ）テイルからのヌクレ オチドの相対徐を示す。ヒトタン白質配列上の数はカルシトニン又はＱＧＲＰに 対するアミノ酸の位置を意味する。ヒト配列に対するラット内に存する別の又は 新たなアミノ酸又はヌクレオチドは問題のコ１ンの直ぐ下に示さハている。潜在 的ボリアデニール化記号は下線が付されている。矢印（↑）は成熟カルシトニン ｍＲＮＡの６′末端を意味し、（ム）印はヒトケゞツム配列における付加イント ロンの可能な位置を指す。破線はラットカルシトニン遺伝子のないヒト配列の領 域を示−′４−ｏ挿入されたｃＤＮＡ配列は１６１５　ｂｐを含み、６′末端の ボＩＪ　（Ａ　）残基の域で終る。これらのうち、５′末端から最初の３５６　 ｂｐは上記したものと同じで、カタカルシンをコードするヒトカルシトニンｍＲ ＮＡの一部およびＡＡＴＡＡＡボックスと成熟カルシトニンｍＲＮＡにおけるポ リ（Ａ）テイルに先立つように示した１２ヌクレオチドを含む６′未翻訳領域の 全体を示した。残りの配列の分析は５３アミノ酸、続いて末端コドンをコードす る単−開放読み取り枠を含むことを示した。

これはスジライス接合受容体部位（Ｃ）　ＮＡＧ　／　Ｇ　（マウント・ニス・ エム、ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌθｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　 ）　（１９８２）　１　口　４５０〜４６３）により５′側の直前にあり、「イ ントロン」一様配列の６４５ヌクレオチドは６つのアデノシン残基により公知の カルシトニンｍＲＮＡ配列から分離した。

しかし、認識可能なドナースプライス接合はイントロン一様配列とヒトカルシト ニンｍＲＮＡ　Ｋ存在することが知らｔている配列の間には存在しなかった。新 規の開放読み取り枠は２つのボリアデニール記号を含む４５１ヌクレオチドの域 に続き、最初の（ＡＡＴＡＡ　）は末端コドンの下流の２６塩基および第２の（ ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡ　）は末端ポリ（Ａ）域前の１８ヌクレオチドに位置し た。コー　ド配列は対の塩基性アミノ酸（−１，−２）、更には５つのア１ノ酸 （−６〜−７）によりアミン末端およびグリシン残基（＋１）、４つの塩基性ア ミノ酸（＋２〜＋５）およびテトラペプチド（＋６〜＋９）によるカルボキシル 末端の側面にあるヒトＣ０ＲＰ　（３７個のアミノ酸のペプチド）を含んだ。グ リシンの存在はアミド化カルボキシル末端フェニルアラニンの生体内要件を反映 しくプラトベリー　・エイ・エフ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９８２ ）−２９８、６８６〜６８８　）、アミド化ヒトｃＧＲＰについて３７８６の計 算Ｍｒとなった。予言したヒトアノ酸配列とラットのそねとを比較（アマラ等、 ネイチした結果、配列保存を示し、７つのアミノ酸は５３のアミノ酸から変化し 、４つはヒｌ−ＣＧＲＰ　（アラニン１、アスパラギン酸６、アスパラギン２５ 、リジン３５）内にあり、残りの６つ（−７、−６、−５）は５アミノ酸アミン 末端リーダー配列にある。後者のうち、最初のアミノ酸（アルギニン−７）につ いて、本発明者はスプライス接合の位置に基づいてかつラットカルシトニン遺伝 子との相同により指定した。有意な配列保存はコード領域内のヌクレオチドレベ ルで明らかであるが、ヒト配列と利用できるラットＣＧＲ，Ｐ　ｍＲＮＡ配列と の比較により３′非コード領域で顕著に減する。ヒトＣＧＲＰアミノ酸配列と他 のタン白質配列とを比較（ウィルバー　・エフ・ジエイ等、ＰＮＡＳ　（１９８ ３）８０゜７２６〜７３０）して、カルシトニンを含めて他の公知のペプチドを 有する有意な相同はないことを示した（ラットのＣ０ＲＰを除く）。精々、９つ の匹敵するアミノ酸がサケカルシトニンを有するヒトＣ０ＲＰの整列により同定 された。

ｐｈＴ−Ｂ　３とｐｈＴ−Ｂ　５　Ｆ３から単離したＣＤＮＡ断片を使って、本 発明者はｐｈＴ　−８５８Ｋクロー　ンしたｃＤＮＡが部分的にフ０ロセツシン グしたボリアデニール化ＲＮＡ転写を示すことを制限ヒトケゞツムＤＮＡのすず ン法により確立した。ヌクレオチド配列分析により同定した「イントロン」に加 えて、１つのイントロンをｃＧＲＰコ−ド配列の６′側にマツプし、他はラット のカルシトニン遺伝子のものに酷似するｒツム構成（ｇｅｎｏｍｉｃｏｒｇａｎ ｉｓａｔｉｏｎ　）を示唆するカルシトニンヨー１配列ノ５’ｌｌｌにマツプし た（ローゼンフエルト・エム・ジー、マーモッド・ジエイ・ジエイ、アマラ・ニ ス・シー、７ スツンンン・エル・タフリュー、ソーチェンコ、　ヒ、−。

イー、リビエール・ジエイ、ベール・ダブリュー・ダフリューオヨヒエバンス・ アール・エム（１９８３）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ　）、６０４．１２９ 〜１３５）。

しかし、カルシトニンエクソンとＣ！ＧＲＰコード配列を分ける「イントロン」 様配列は実際ケ８ツム構成を示し、ｐｈＴ−８５３から単離したカルシトニン、 イントロンおよびＣ０ＲＰ配列を含む１１２５　ｂｐ　Ｓｐｈ　Ｉ　／　Ｐｖｕ 　ｌ’ｌＤＮＡ断片（図１参照）は、「イントロン」特異性・・イブリッドプロ ーブに対するハイブリッドにより決定した様Ｋ、Ｓｐｈ　ｌ　／　Ｐｖｕ　■で 制限したヒト胎盤ＤＮＡのザポン法分析後の同一ザイズのケゞツム断片で電気泳 動する。

組換えＤＮＡ技術によるヒト（：！ＧＲＰの産生組換えＤＮＡ技術によりヒ）　 ｃＧＲＰを産生するために、クロラムフェニコールアセチルトランフェラーゼタ ン白質（ｃＡＴ　）と所望の中間ペプチドの活性部分から成る融合タン白質を産 生じ得るベクター　を作った。（このベクターは係属中の国際特許出願ＰＣＩＴ 　／　ｔ）Ｂ　８４１００１７９号、英国特許出願第８４１３６０１号、１９８ ４年５月２４日出願に開示されている）。

プラスミドは、クロラムフェニコール弱耐性Ｒ１口ＯＲ−プラスミ　ド突然変異 体のＤＮＡをＰｓｔ１消化し、続いて単−Ｐｓｔ　１断片をプラスミドｐＢＲろ ２２のＰｓｔ１部位に連結して単離した（イイタゞ等（ｉ　９３２）　ＦＭＢＯ Ｊ、１．７５５〜７５９）。シラスミド、ｐＢＲ３２２：Ｃｎ１０４を得、欠失 により除いたカルボキシ末端の最後の７つのアミノ酸残基を有したｃＡＴ工　酵 素をコードする。この除去は挿入エレメントエＳ１を含む自然発生的生体内変異 によった。し２かし、生成したＤＮＡ分子はＣＡＴ工構造遺伝子の終りに末端コ ドンを有しない。

したがって、リポソームはタン白質に翻訳し、相末端コドンに適合するまで、Ｒ ＮＡは工ｓ　ｉ　ＤＮＡから転写した。正味の結果は自然の酵素より長いＣＡＴ □タン白質１９アミノ酸残基であり、最後の２６個のアミノ酸残基は工Ｓｉ　Ｄ ＮＡ配列により向けられる。この構造遺伝子も所望の融合タン白質を創製するの に有用な適当な制限部位を欠くから、一連のＤＮＡ操作を行なった。

上記の変異ｃ　ＡＴ　Ｉ遺伝子を含有するＰＳｔ１制限断片をプラスミドＩ）Ｂ Ｒ３２２：　Ｃｎ　１０４から単離し、プラスミドｐＡＴ　１５３の脱リン酸化 Ｐｓｔ　１部位に結合させた。この方向では、ＣＡＴＩとβ−ラクタマーゼプロ モー　ター双方は同一方向で転写するから、プラスミドｐＡＴ　／　Ｃｎ　１０ ４　ｂ　（図６）を選んだ。このクローニング手法はユニークなＴｔｈ　１１１ 　■制限部位を有するプラスミドを主として構成することであった。、この切断 部位はＣＡＴ１構造遺伝子の末端に結合した］、ＳＩ　ＤＮＡから誘導され、上 記の２６個アミノ酸残基エクステンションの１９個アミノ酸コドンにある。

シラスミドｐＡＴ　／　Ｃｎ　１０４　ｂはＴｔｈ　１１１．　Ｉで直線化サレ 、ＢＡＬ　３１エクソヌクレアーゼで消化した。一連の時点の試料を取り出し、 過剰のＥＤＴＡを使って反応をとめた。ＢＡＬ　３１消化により生じたどの非平 滑末端もＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を使って充たした。ついでこれら のプラスミドＤＮＡ分子を子牛の腸内ホスファターゼを使って脱リン酸化した。

次に、配列５’　−ＴＣＡ　ＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡ　− ３’を有するキナーゼ処理したリンカ−１Ｒ１４’Ｏを各プラスミド時点試料（ Ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔ　Ｓａｍｐｌｅ　）に連結した。連結後 、プラスミドＤＮＡをＳｓｔ　ｌ制限エンドヌクレアーゼで消化し、再連結して 、唯一のリンカ−を各シラスミドに存在させた。

これら−組のＤＮＡ分子を大腸菌ＤＨ１に形質転換させ、融合ベクタープラスミ ドを２０　ｔｔ、Ｑ　／　ｒｒｒｅクロラムフェニコール含有のし一寒天に顕著 に生育することを根拠に選択した。

小規模のプラスミド調製物を作った。単一の５ｉｉｔ　１制限部位（リンカ−Ｄ ＮＡから誘導）を有しかつ同時にＥｃｏＲＩとＢｇｌ　１１で消化した時に比較 的小さいＤＮＡ断片を生じた多くのプラスミドを単離した。ＤＮＡ配列分析によ り、プラスミドｐＡＢ　７、ｐＡＢ　８およびｐＡＢ１９では、リンカ−ＤＮＡ は各６つの読みとり枠のＣＡＴ工構造遺伝子の３′末端に付着したことが分った 。

プラスミドｐＡＢ　７、ｐＡＢ　８およびｐＡＢ　１．９を各々制限酵素Ｓｅｔ 　Ｉで消化させ、Ｓ１エクソヌクレアーゼでインキュベーションした。フェノー ル／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱後、これらの平滑末端プラスミド分 子を’ｒａｑ　ｌで消化させ、約７５０塩基対のＤＮＡ断片を即離した。これら の断片は６つの読みとり枠中Ｂｇｌ　１部位をもつ完全ＣＡＴ融合構造遺伝子を 含むが、ｃ　Ａ　Ｔｓ−プロモーターを欠く。

ライでこれらのＣＡＴ工遺伝子をシラスミドｐＣＴ　５４のｔｒｐプロモータ　 の調整下においた（エムテーゾ等、ゾロシーディング・ナショナル・アカデミ− ・サイエンス、ｖ、、　−工ｘ−■−（（Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　）８０．３６７１〜ろ６７５．１９８３）。このプラスミドは転 写ターミネータ−配列を有する利点があるから、高レベルの発現はこの配列の上 流およびｔｒｐブロモ　ターの下流でクローンしｊ二遺伝子に限定される。

プラスミドｐｃＴ５４はＥｃｏＲＩで消化し、５′粘着末端はＤＮＡ　Ｈｒ　＋ ）メラーゼＩのフレノウ断片を使って充たｔ７た。この分子を酵素ｃ１ａ１で制 限し、続いて脱リン酸化して、上に単離したＣＡＴ１融合ベクター遺伝子カート リッジを受容する分子を得た。この分子を６倍モルの各Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｔ遺伝子カ ー　トリシンで連結し、続いて大腸１ＨＢｉ０１を形質転換して、クロラムフェ ニコール耐性融合ベクタープラスミドｐＣＴ　２０１、ｐＣＴ　２０２およびＩ ）ＣＴ　２０３　（図３）を得た。（これらの６つの場合、操作によりｐＣＴ　 ５４のＥｃｏＲＩ部位を再形成した）。

シラスミドベクターｐＣＴ　２０６をＨｉｎｄ　Ｉで切断し２ま た。これにより、Ｈｌｎｄｌ［粘着末端を有するプラスミドＤＮＡを得、ついで ＤＮＡポリメラーゼでイ滑にした。

ついで生成したプラスミドＤＮＡを更にＢｇｌ　■で切断し、Ｂｇｌ■粘着末端 とＹ滑末端を有するＤＮＡ分子を得た。

生成したＤＮＡをプラスミドｐｈ、Ｔ　−８５３のＢｇｌ、　ｌ　−Ｐｖｕ　１ １断片と連結しく図１と６参照）、プラスミド環状分子を得た。これらのプラス ミド分子を大腸菌ＨＢ１０１細胞に形質転換させ、大腸菌ＨＢ　Ｉ　Ｑ　１　／ 　ｐＣＡＴ−ｃＧＲＰ形質転換体は７７ビシリｙ＜　１００４７ｍ１）含有培地 に生育させて選択した。培養により、大腸菌ＨＢ　Ｉ　Ｑ　１　／ｐｃＡＴ　− ＣＧＲ睡胞は、ＳＤＳポリアクリルアミ１ケゞル電気泳動とコマツシイプルー染 色（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ　ｓｔａｉｎｌｎｇ　）　（図４ａ）により、 又は１分間３５Ｓメチオニンで細胞をパルスした後、ＳＤＳポリアクリルアミド デル電気泳動続いてオートラジオグラフィ（図４ｂ）により判断して、予期した 大きさを有する融合タン白質を産生じた（エムテーゾ・ゾエイ・ニス等、ＰＮＡ Ｓ　（１９８３）　８０．６６７１〜３６７５　）。

ｐＣＡＴ　−ＣＧＲＰ構成では、ＣＡＴタン白質単独と比較して、新規タン白質 が得られる一図４　（ａ）　、　４　（１１））　、レーン１，２）−図４（ａ ）　、　４（ｂ）　、レーンろ参照。レーンＭは分子量マーカータン白質とそれ ぞれの分子量を示す。

産生じた融合タン白質がＣＯＲＰメタン質配列を含む証拠は、ＨＢ　１０１　／ 　１）ＣＡＴ　−ｃｏＲｐ細胞抽出物のラジオイムノアッセイにより測定した。

５０口ｍｌ培養細胞をとり、リゾチーム／デオキシコール酸ナトリウム混合物（ ５ｍｌ　）で溶解させ、ＤＮアーゼで５°Ｃ／３０分間処理した（エムテージ・ ジエイ・ニス等、ＰＮＡＳ（１９８３）、８０．３６７１〜６６７５）。等容量 の０．１　Ｍ　）リス塩酸ｐＨ８，０、０，１ｍＭ　ＥＤＴ、Ａ　、　５　％（ Ｖ／）グリコールを加え、ヒ）　ＣＧＲＰ配列の存在は抽■ 出物にて測定した。ラジオイムノアッセイは肌０’５　Ｍリン酸バッフ了−ｐ） １７．４中最終容量４００μｌで行なった（ガージス・ニス・アイ等、ジャーナ ル、エンドクＩＪ　／　Ｄジー（Ｊ、　Ｆｉｎｃｌｏｃｒｉｎｏｌ、　）　７８ 　、３７２〜３８２）。Ｔｙｒ　−（ＣＧＲＰ’アミノ酸２５−　’３７　）　 −７ミｒに対し、公知技術を使って、抗血清をウサギで作り、１２５１Ｔｙｒ− （ＣＧＲＰアミノ酸２５−５７）−アミドトレーサーに対して、ヒナオボアルブ ミンに抱合させた（レイチリンーエム、１９８０、メソッド・エンザイモロジー （Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ７ｍｏ１．　）　７０，１５９−１６５）。

トレーサーはハンターとグリーンウッドのクロラミンＴ法を使って沃素化した。

図５から分ることは、ＨＢｌ　０１　／　ｐＣＡＴ　−ｃＧＲＰタン白抽出物は ヒトＱＣ）ＲＰスタンダード（化学合成した）のものに類似の置換曲線により１ 　：１００００血清稀釈を使ってトレーサー（５Ｃ１００ｃｐｍ　）を置換した 。トリプシン（０，５ｍｐ−／ｍｌ）で−晩６７°Ｃで予め消化し、続いてトラ シロールでトリプシンを不活性化したタン白抽出物を使って置換はみられなかっ た。ヤギ抗ウサギ血清を使って、ウサギ１ｇＧを定量的に沈澱させ、キャリアー として予備−免疫ウサギ血清１μｌを添加後１２５エトレーサーを結合させ（フ レイブ・アール・ケイ等１．１９７６゜バイオケミストリー・ジャーナル（Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）１６０．５７〜７４）、そして沈゛澱１２５１をγ−カ ウントにより定量した。これはＨＢ　１０１　／　Ｉ）ＣＡＴ　−ＣＧＲＰ　Ｋ よりヒ）　ＣＧＲＰペプチド配列の産生を証明する。

ｐＯＡＴ　−ＣＧＲＰシラスミド、の構成は５ｃａｌ消化によりチェックした。

これは予期した量により、ｐＣＴ２０３から得た相当するバンドより大きいＤＮ Ａバンドをゲル上に得た。プラスミドの構成はＨａｅ　ｌ消化によってもチェッ クした。ｐ’ｈ’ｒ　−８，５Ｆ３由来のＢｇｌ　］ｌ　−Ｐｖｕ　ｌＩｃＤＮ Ａ　′Ｉｆｒ片はｐＯＴ　２０３に存しなイＨａｅ■部位を含み、りゞルは予期 した大きさのｃＤＮＡバンドを示した。

ｐＯＡＴ−ＣＧＲＰにより産生じた融合タン白質はカルホキキシル末端とアミン 末端に付加的アミノ酸残基を有するＣ０ＲＰのアミノ酸配列から成る（図１）。

アミノ末端はＱＧＲＰの直前に配列Ｌｙｓ　−Ａｒｇを含む。これはクロストリ パイン切断部位を供するが、ＣＧＲＰ内の潜在齢クロストパイン部位からみて、 考慮されねばならない。他のユニークな切断部位を使用することができる。

化学的合成によるヒ）　ＱＧＲＰの産生そのアミド形の断片又はその類似体のヒ ）　ＱＧＲＰおよびＰＤＡ　−４はセロチック社２４４−２５０パスロ〜ド、ス ロー、パークシャー、ニスエルアイ、４０７英国により、又はペニンスラ・ラボ ラトリ−社、６１テイラー・ウェイ、ベルモント、カリポルニア９４００２米国 により合成された。ペプチド合成の標準技術を使用することができ、例えばメリ フィールド固体相ペプチド合成又は所謂ＦＭＯＱ操作（「固体相ペプチド合成　 ２−再評価（５ｏｌｌ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｌｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ−八 Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　）　Ｊ　７−／Ｉ／　−シー・シｘパート−モンキ ュラー・エンドクリノロジー版、マツキンタイヤとゼルケ、エンゼビアー（１９ ７７）４３〜５６：イー・７”ｉ−）ン等、シエ−・シー・ニス・ケム・コム（ Ｊ、Ｃ，Ｓ、　Ｃ！ｈｅｍ、　ｃｏｍｍ、　）　（１９８ｊ）　１１５１〜１１ ５２；およびジー・パラニーとアール・ビー・メリフィールド−、ザ・ペプチド （Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）、イー・グロスとジエイ・ジエイエンホウファ −、アカデミプレス、ニューヨーク（１９８０）ろ参照）。

ヒトＣＧＲＰの心血管作用 ｐｈＴ　−８５８のヌクレオチド配列分析により予期されたアミノ酸配列を使っ て、アミド化ヒトＣＧＲＰを化学的に合成しついでイオン・逆相クロマトグラフ ィの併用により精製した。最終ヒ）　（：！ＧＲＰ調製物は質量分析で判断して 純粋であり、単一イオンが観察された（Ｍｒ３７８６）。本発明者はこの調製物 の心血管効果を類似純度の合成マツ）　Ｃ！ＧＲＰ調製物と比較した。

スプレイグードウリイラット（２８５〜３１５１９）４〜６匹の離解はベンドパ ルビトン（６０をに！９−↓、腹腔内）で麻酔した。気管、左頚動脈および左頚 静脈にカニユーレを挿入した。血圧はスティタム・Ｐ２３ＩＤ圧力ドランスジュ ーサーによりガラスポリグラフ上の頚動脈から記録し、平均動脈圧はトレースか ら誘導した。心持度数は血圧シグナルにより誘導させたタコグラフ（ガラスモデ ル７Ｐ４　）ＩＣより測定した。ヒ）　ＣＧＲＰは栃脂から粗製し、ついで精製 するが又は後者ではペニンシュラ・ラボラ・トυ−がら精製形で得た。

精製ラン）　Ｃ０ＲＰは同一起源のものであった。すべての合成調製物は質量分 析にかけ（Ｍ−スキャン社）、使用する前に構造と純度を確認した。ヒ）ＣＧＲ Ｐ、ラットＣＧＲＰ　、プロパツール塩酸塩（シグマ）、マレイン酸メピラミン （シグマ）、シメチジン塩酸塩（ニス・ケイ及エフ）、ヒスタミンシリン酸塩（ シグマ）を０．９係ｗ／ｖ食塩水に溶解した。すべての化合物はメピラミン（ニ ス・シー）を除いて静脈内に投与した。食塩水（・ＸヒトＣ（）ＲＰ　（０）お よびラットＣ！ＧＲＰ　（△）は２分間隔でラットに対しＱ、１ｍｌ：容量で累 積的に投与した。

平均動脈圧力（ＭＡＰ　）のピーク落ちと２分後の心得度数（ＨＲ）を測定した 。食塩水の投与はＭＡＰ又はＨＲを変えず、ヒラ）　ＣＧＲＰとラットｃＧＲＰ 双方はＭＡＰの薬量依存性落ちとＨＲの増大を誘発した。ヒ）　［：！ＧＲＰ　 ５分前、プロプラノロール、６．４μモルに９−１（ロ）は心持度数の増大を妨 げなかった。メｔラミン（１２，４μモルｋｇ−１）とシメチジン（３０分間注 入として５９．５１ｒ＋ルｋｇ−１’：１（ｉｌｉ）はヒスｙ６ンに対する低血 圧感応を有恣に下げた（１０−ε１〜１０−５モルｋｙ’）が、ヒＩ−ＣＧＲＰ ｉ低血厘効果を有意に＝変えなかった。実験期間中食塩水を７回注入しても、プ ロプラノロール又はメビラミンとシメチジンの存在下ＭＡＰ又はＨＲを有意に変 えなかった。

ベンドパルビトンで麻酔したラットては、静脈内のヒｌ−Ｃ０ＲＰは血圧の、急 速な薬物関連下落をひき起こし、１分以内で最大となり、ｏ、２ｓｎモルｋｇ− １の投与量で５０チの血圧低下を示した。これは図５のラツ）ＣＯＲＰ（０，２ ６ｎモルｋｇ−１）で得た結果とは有意に異ならなかった（ｐ口、０５、ｔ−テ スト）。低血圧は心持度数の増大と少ないが有意な関係を示した。抽圧の低落は ヒスタミンの放出へ・通じて塩基性ペプチド（Ｃより間接的にひぎおこされうろ （ゴス・エイ（１９７ろ）ヒスタミンと抗ヒスタミンにオｉ〕ｕ”て（Ｉｎ　Ｈ ｉｓｔａｍｉｎｅ　ａｎｄａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅｓ　）　（シャヒフ−・ エム著）、第１巻、薬理と治療の百科事典（Ｉｎｔ、　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅａｉ ａ　ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａ、ｐｅｕｔｉｃｓ　、 セクション７４゜２５〜４ろペルガモンプレス、オックスフォード）シかつヒ） 　（、ＩＧＲＰは比較的塩基性ペプチドであうから、本発明者はヒ）　Ｃ０ＲＰ を投与する前に、ヒスタミンＨエーレセゾクー拮抗剤メピラミンとヒスタミンＨ ２−レセプタ　拮抗剤シメチジンによる予備処理効果を試験した。拮抗剤はヒ） 　ＣＧＲＰ　Ｋ対する低血圧感応（図６）又は関連の頻脈（デ　タ（よ不１−て な（・）　Ｉｃ対し有意な効果はなかった。増大１〜た交感神経ドライブを通じ て、ラツ）　ＣＧＲＰは心持度数を増大しうろことも示唆された（フィッシャー ・エル・コニイ、キラカワ・ディ　−・オー、リビエール・ジエイ・イ　、アマ ラ・ニス・ジー、エバンス・アール・エム、ローゼンフエルド・エム・ジー、ペ イル・ダブリュー・ダプリュ＆ブラウン・エム・アール（１９８３）、ネイチャ ー（ＩＪａｔｕｒｅ　）、３０５．５３４−５３６）。本発明者は、α−アドレ ノセプター拮抗剤プロプラノロール（２１０ｇ単位により右側にイソプレナリン 薬物−感応曲線をシフトするに十分な量で）で予備処理ｌ〜た後、ヒトＣＧＲＰ の静脈内投与により仁の可能性を研究した。プロプラノロールより、基礎心持度 数は有意に減じたが、ヒ）　ｃＯＲＰは頻脈をおこし続け、更に食塩水対照処理 （図６）と比較して、この効果の制限薬量は未変化のままであった。これらの結 果から、ヒトｃ（）ＲＰによりおこる血圧の低下と心持度数の増大は、ヒスタミ ンやセタコールアミンの放出により間接に仲介しない。ヒ）　（：１ＧＲＰに対 する感応期間は単−薬投与により測定し、た。ヒトＣ０ＲＰ　１　ｎモルｋｇ− 〕は動脈圧を１２５±７．６　ｍｍ　Ｈｇから６８．６±９．３　ｍｍ　Ｈｇに 低下させ、血圧を５０係まで回復するに要する時間は３−８　＋０．５分であっ た。

上記したフエノバルビトンで麻酔したラットＫ　：にける静脈内ＰＯＡ　−４０ 心抽管作用の試験は小であるが、有意な効果を示した。図７から分るように、７ ＰＤＡ−４はヒトＣ（）ＲＰより５０〜１００倍低い能力を有した。

したかつて、１μＩ／キロヒ１．　ＣＧＲＰは平均動脈圧において急な５０ｉＴ ｎＨｇ低下と心持度数の２５〜３０　ｂｐｍの増大となった。一方、１０μｇ／ キロＰＤＡ　−４は平均動脈圧の１５〜２０ｍｍ　Ｈｇの低下と、心持度数の１ ５〜２０　ｂｐｍの増大の原因となった。ＰＤＡ　−４の作用機構は試験しなか った。

生体内の血圧低下をおこす反射又はその他の因子の影響のｈ］能性な除くために 、ヒ）　Ｃ０ＲＰの心臓作用も試験管内で研究した。

ダンキン・ノ・−トレイモルモットｍ（２８０〜４００、！７）ば頚部をひねっ て殺し、除血した。心臓を取り出し２、右心房を細断し、クレプス溶液（ｍＭ） ＮａＣｆ　１１３　、　Ｋｃｉ４．７　、　ＣａＣｊ！２２．５　、　ＫＨ２Ｐ Ｏ４１−１８。

ＮａＨｃｏ３２５　、　ＭｇＳＯ４，ｉ　、１３　％よびグルコース１１．１に ３４°Ｃ，０，５，９の張力で取りつげ、９５：５　０２ＣＯ２で泡立てた。ガ ラスＦＴ　Ｑろトランスジューサーにより等ｉ１目的に心房力と心房速度を測定 し、ガラスポリグラフに記録した。ヒト（・）又はラット（ム）　Ｃ０ＲＰをラ ンダムに単一投与した。予備実験では、ＣＧＲＰＪで対する２つの連続投薬−感 応曲線は再現可能な結果を示しＬ−０ ３０分間平衡したプロプラノロール（○）（３０［］ｎＭ）又はシメチジン（１ ００ｚｍ）は同一実験でそれぞれ９ インプレナリン（３−３０ｎＭ　）又はヒスタミン（５００ｎＭ　）の効果を中 和した。これらの拮抗剤はＣＧＲＰによりひきおこされた増大した心房速度と心 房力を有意に減じなかった。拮抗剤単独は単離した心房５の基礎率（１８７土９ 　ｂ、分−１）又は力（２６４ｆ二３４ｍｐ）を有意に変えなかった。

モルモットの右心房調製物では、ヒトＣ０ＲＰは収縮時の率と力において濃度依 存性増大を示した（図８）。

生体内で得た結果と一致して、プロプラノロール又はヒスタミンＨ２−レセプタ ー拮抗剤シメチジンのβ−アドレノセプター有効ブロック濃度はヒ）　Ｃ０ＲＰ に対する感応を変えなかった。興味のあることは、ラットＣ０ＲＰは心房力（ａ ｔｒｊ、ａｌ　ｆｏｒｃｅ　）の増大をおこ−ｔ−ｈでヒ）　ＣＧＲＰと等能力 であったが、増大する心房速度では約１０倍の能力があった（図８）。ラッ）　 Ｃ０ＲＰにより生ずる氾・房速度又は力の増加はプロプラノロールによりブロッ クされなかった。したがって、ラットとヒ）　ＣＧＲＰは単離した心房に直接作 用するようであり、その作用はカテコールアミンとヒスタミン受容体機構に依存 しない。

本発明者の研究で証明したことは、麻酔したラットにおけるヒトとラットＣＣＩ ＲＰの末梢心血管作用は意識のある動物に末梢的に投与したラットＣ０ＲＰにつ いて報告１〜だ点を類似しているが、ラツ）　Ｃ０ＲＰは本発明者の実験で麻酔 により心血管の反射の多分鈍さにより意図的な調製物において心得度数が大巾に 増大した（モリスン・ジエイ・エル、ウォーカー・工・ｒチ・エイ＆リチャー　 ドスン・エイ・ピー（１９５０）アーチ・インター・ファーマコダイン（Ａｒｃ ｈ、工ｎｔ。

研究では、ＣＧＲＰの血管拡張作用はヒスタミン又はカテコールアミンにより仲 介されないことが証明されている。したがって、ＣＧＲＰは新しいりセプター機 構により直接心血管系に作用し、他のメジエータ−の放出により作用しないこと を証明している。同様に、プロプラノロールやシメチジンにより影響されなかっ た単離心房に対する０ＧＲＰの活性は血管系に加えて心組織におけるＣ０ＲＰリ セプタ一機構の概念を支持している。

生体内の血圧の低下および試験管内の心房の収縮力を増大させた、ヒトとラツ） 　Ｃ０ＲＰの類似能力は、心房の収縮速度を上げた場合のそれらの各種能力と対 照的である。試験管内で得た結果では、ラツ）　ＣＧＲＰは多分側われた異なる 種又は麻酔薬の存在により、生体内で明らかでなかった性質、望ましい変時性効 果（変力性と比較して）を有することを示唆している。本発明者はＰＤＡ　−４ を静脈投与した時、同時の頻脈と共に低血圧効果を有することを証明している。

診断用途 図２においてヒ）　ＣＧＲＰで予期したアミノ酸配列を使ッテ、アミド化ＣＧＲ Ｐおよびチロシン化類似物；オボアルブミンに接合したＴｙｒ　−（ＣＧＲＰ− アミノ酸２５−３７）−アミドに対してウサギに抗体を作った（レイチリン・エ ム（１９８０）、メンロド・エンずイム（Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｅｎｚｙｍ、　）　 ７０．ｉ’５９−１６５）。

１２５１　Ｔｙｒ　−（ｃＧＲＰ　−アミノ酸２５−３７）−アミドを結合する 能力により測定して、両方共抗原性を証明した。本発明者は、上記した様に、１ 　：１２５００の血清稀釈と４００μｌ試験におけろ１８０　口ｃｐｍ１２５Ｉ 　−Ｔｙｒ　−（ｃｅｐｐ−’アミノ酸２５−３７）−７ミドトレーサーを使っ て、インタ（工ｎｇ　）　Ｃ０ＲＰ　／管に感受性のラジオイムノアッセイを行 なうために、Ｔｙｒ　−（Ｃ０ＲＰ−アミノ酸２５−３７）−アミドに対する、 抗体を使用した。この試験（図９）を使って、この抗体はヒトカルシトニン、チ ロシン化ＰＤＡ　−４、カタカルシン、Ｔｙｒ　−ＣＧＲＰ　−（アミノ酸１− ８）又はサケカルシトシンとは交差反応しないが、抗体はラッ）　Ｃ０ＲＰにお ける抗原決定子を認識しがっヒ）　ＣＧＲＰの増加量で滴定した時、予期した置 換曲線を示すことを本発明者は証明している。この試験を使って、ヒト髄質甲状 腺癌組織からの抽出物（ベネット・エイチ・ピー等、１９７８、パイオケミスト リイ・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　１７５　、１１３９−１１４ １　）およびヒト小細胞癌セルライン（ＤＭＳ　１５３　）から誘導した組織培 養媒質および低レベルのカルシトニンを生成することが分っている剖検による肝 転移（肺初期）から誘導したセルライン（ペソテンジル等（１９８０）キャンサ ー（Ｃａｎｃｅｒ　）　４５　、９０６−９１８　）において本発明者はヒ）　 Ｃ０ＲＰの存在を同定した。組織培養媒質単独では抗血清と反応せず、ＤＭＳ５ ３細胞から取り出した媒質、高レベルのカルシトニンを産生ずることが知られて いる小細胞癌セルライン（ソレンソン等、１９８１、キャンプ−（Ｃａｎｃｅｒ 　）　４７．１２８９−１２９６）はほんのわずかのヒ）　Ｃ０ＲＰを有した。

平行置換曲線はＭＣＴ抽出物とＤＭＳ　１５３媒質について観察された。正常な ヒト血漿は試験の範囲内で検出可能量のＣ０ＲＰを含まず、何人かのＭＣＴ患者 の血漿は測定可能量を含有しまた。

本発明者は、パーオキシダーゼ−抗パーオキシダーセ法（スタンバーガー・エル ・エイ、１９７９、免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ）第２版、ジエイ・ヮイリイ＆ザン、Ｎ、Ｙ、　）による免疫染色を使って、ヒ ト髄質甲状腺癌組織を包埋したパラフィンワックス中ライトレベルで免疫細胞化 学法によりヒトＣＣ）ＲＰ産産生胞をおき、ヒト腫瘍病理学の分類上これらの抗 体の診断上の応用を立証し７た。全ポ！Ｊ　（Ａ　）含有ＲＮＡを２つの異なる 髄質甲状腺癌腫とＤＭＳ　５３と１５３セルラインから単離した（アリスン等、 （１９８１）バイオケム’ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）１９９，７２５ −７３１およびホール等、１９７９、ネイチャー３ ＣＯＲＰおよびイントロン特異性転与（図１参照）の分布は、１．１　％　（ｗ ／ｖ　）アガロースデルで電気泳動にかけ、続いてバイオディン（Ｂｉｏｄｙｎ ｅ　）膜に移して分離を含むＲＮＡブロッティングにより研究した（ティラー・ ジエイ・ピー等、１９８４、パイオヶム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、： ｒ、　）　２１９　、２２３−２３１　）　ｏ別の実験では、Ｂｇｌ　ＩＩ　／ 　Ｐｓｔ　Ｉ　３２　ｐ−ラベルカルシトニン特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓｐ、　Ａ ｃ、　３．２　Ｘ　Ｉ　Ｑ８ｃｐｍ　／　ａｊ９’　）、Ｂｇｌ　ｌ　／　Ｐｓ ｔ　ｌ　ＣＧＲＰ　１％異性ｃＤＮＡ断片（Ｓｐ、　Ａｃ、　７．９Ｋ　１０” 　ｃｐｍ／　４　）およびＢｇＩ　ＩＩ　／　Ｂｇｌ　ＩＩ　”イントロ７　” 特異性ｃＤＮＡ断片（Ｓｐ、　Ａｃ、　２−８　Ｘ　Ｉ　Ｑ”　ｃｐｍ　７８ｇ ）を使ってこの膜をプロ　ブした一図１参照。フィルターを洗ってから、オート ラジオグラフィにがけた。この結果はＲＩＡデータと一致し、カルシトニンとＣ ＧＲＰ　ｍＲＮＡ種がセルラインと腫瘍中各種レベルで発現されかつカルシトニ ンとＣＧＲＰ　ｍＲＮＡは多分各種プロセラソング経路により通常の写しからプ ロセッシングされたことを立証した（図１０）。また、イントロン特異性配列は 成熟したプロセスカルシトニン又はＣＧＲＰｍＲＮＡ種に存在しなかった。

正常の胎盤ＤＮＡおよび患者のＭＴＣ組織ＤＮＡと血液リンパ球ＤＮＡを制限エ ンドヌクレアーゼで消化した後（図１１）、ヒトＣＧＲＰ遺伝子配列のデノム生 物体の研究も遺伝子構成（ｇθｎｅ　ｏｒｇａ、ｎ１ｓａｔｉｏｎ　）の差を生 んだ。したがって、各ＤＮＡ試料２０４をＢａｍＨＩで制限し、断片を１％（ｖ ｙ／ｖ　）アガロースゲルで電気法ｉして大きさ別に分け、遺伝子スクリーンプ ラス膜（ＮＥＮ）にプロットし、ついでＩ　Ｑ”　ｃｐｍ　／μｇの比活性にラ ベルしたＢｇｌ　ＩＩ　／　Ｐｓｔ　ｌ　ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡプローブを使 ってプローブした。ハイブリッド化は５０ｍｍ）リス−ＨｃＪ、ｐｔ（７，５中 ５０％（ｖ／ｖ　）ホルムアミド、１チ（Ｗ／Ｖ　）　ＳＤＳ　％　１０　％　 （ｗ／ｖ　）デキストランサルフェルト中−晩行なった。フィルターは順次２× ＳＳＣ／ＲＴＰ、２　ｙ　ｓ’ｓｃ、１　％（ｗ／ｖ　）　ＳＤＳ、６５°Ｃ７ ３０分、および０．１　Ｘ　ＳＢＣ，６５°Ｃ／１５分で洗い、ついで４８時間 オートラジオグラフにかけた。これはすべてのＤＮＡ試料において・・イブυツ ゛ドの単−主バンド（２，８，Ｋｂ）とマイナーバンド（２，６Ｋｂ　）を証明 した（図１１）が、胎盤ＤＮＡでは付加マイナーバンド（３，０Ｋｂ）であった 。したがって、ＣＧＲＰ特異性ｃＤＮＡプローブを使って、本発明者は遺伝子再 配列を確認した。この場合遺伝子は相同であるとは反対に、プローブとの相同を 示す。このような知見は腫瘍組織の遺伝子再配列の研究において配列特異性プロ ーブの診断上の価値を示すものである。この場合、髄質甲状腺癌の一族に特有な 形の結合制限酵素多形性、を研究するためＫｃｏＦｕＦ遺伝子ゾロ−ブを使用す る可能性を示特表日’Ｑ　ＧＯ−５０１５６２（１１）本発明、および合成ヒ） 　ｃＧＲＰの心血管活性の研究はモデル系としてラットカルシトニン遺伝子を使 う他人による研究を確認しかつ拡げるものである（アマラ・ニス・ジー、ジョナ ス・ヴイー、ローゼンフェルド・エム・ジー、オンゾ・イー・ニス＆エバンス・ アール・エム（１９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、２９８゜２４１ ］−２４４）（ローゼンフェルド・エム・ジー、マーモツド・ジエイ・ジェイ、 アマラ・ニス・ジー、スワンソン・エル・タフリュー、ソウチェンコ・ピー・イ ー、リビエール・ジェイ、ベール・ダブリュー　・ダフリュ＆エバンス・アール ・エム（１９８３）ネイチビエール・ジエイ・イー、アマラ・ニス・ジー、エバ ンス・アール・エム、ローゼンフェルド・エム・シー、ベール・／”−１リユー 　・ダブリニー表ブラウン・エム・アール（１９８３）ネイチャー（Ｎａｔｕｒ ｓ　）、３ｏ５゜５５４−’５３６　）。本発明者はヒト甲状腺および肺癌にお けるＣＧＲＰ　ｍＲＮＡ配列とカルシトニンを同定した。

その知見はヒ、トＣ０ＲＰ又はその断片、肺癌セルラインおよび髄質甲状腺癌組 織と血漿のｃＧＲＰに対する抗体を使って同定された。したがって、血漿Ｃ０Ｒ Ｐレベルの測定、現場でのハイブリッド又は免疫細胞化学技術を使う歴史的組織 試験、又はＤＮＡやＲＮＡブロッティングを使う遺伝子構造および発現の試験は 髄質甲状腺癌の管理上有用なものである（ヒル・シー・ニス、イパネツ・エム・ エル、サマーン・エフ・エイ、アハーン・エム・シエイ＆クラーク・アール・エ ル（１９７３）、また肺癌や異常なカルシトニン遺伝子発現と関係があることが 分っている病気、例えば骨粗も症の管理上も有用である。

アミド化ヒ）　Ｃ０ＲＰペプチドＰＤＡ〜４が心血管系に作用を有し、心臓収縮 速度や力の増大をおこし、かつ血圧低下効果を有するという本発明の知見は高血 圧の臨床管理においてこのペプチドの役割を示唆Ｉ−ている。

ｃＧＲＰの末梢作用はカテコールアミンβ−リセゾタ−およびヒスタミンリセプ タ−に依存しないことを本発明は立証している。ペプチドによる低血圧感応の急 速な開始からみて、Ｃ０ＲＰが他のメディエータ−に依存しない新しいυセプタ ー機構を通じて心血管系に直接作用しうるという見解と本発明の効果は一致する 。

カーＬシＵ：、＞ 〕−Ｉあ妨１」 １□ ＦＩＧ、　１ 浄書（内８１こ変更なし） ＦＩ６．２ 符表昭ＧＯ−５０１５Ｇ２θ？） ・官・舘末 ＦＩＧ、　８ ６　ｒｔ−ｙ　）−：ｙ−、（−ｑ９１）　、ｘ−ｇ−”イ＞　ｔ−ｐ　嘗ａ、 　’ｌ的７ｏｏ　−’ｒ□□　Ｆ；イＹ”＞Ｒ−ｂｔｌ　ｔへ）１毛！しＪＡ　 、、ノＩ７１・Ｎ、−トキ ＦＩＧ、　１０ ｉ　ｉｉ　ｉｉｉ 手続補正書咋発） 昭和６０年タ月　２日。

特許庁長官殿 １、事件の表示 ２・発明０名称　イ’＃−）’、５エッ１１．−１え、ツー、宿主生物体、その 製造法および診断薬 ３、補正をする者 小作との関係　特許出願人 昭和　年　月　日 手続補正書（方式） 昭和６０年６月を日 特許庁長官殿 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付 昭和ｂｏ年を月ム／日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の翻訳文のｈＤ　（内容に変更なし）国際調査報告 ＩｎＬｕｎ５＋ｌｏ、ａｌ　ＡｐｐＨｃａ＋ｌｏｎ　Ｎ。ＰＣＴ／ＧＢ　８４１ ００２１０第１頁の続き ＱＩｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号優先権主張　０１９羽年１１月１ 日［相］イギリス（ＧＢ）［株］８３２９０９３＠発　明　者　ニドプルツク、 マーク　ロバ−イギリス国ダブ０出　願　人　ニドプルツク、マーク　ロバ−イ ギリス国ダブバイオケミスト 特表昭６０−５０１５６２　（１６） ７゛リユ１ピー　７ピーエヌ、ロンドン、モーティマー（番地なし）　ミドルセ ックス　ホスピタル　メデル、サ　コートウルド　インスチチュート　オブリイ 内 ７゛リユ１ピー　７ピーエヌ、ロンドン、モーティマー（番地なし）　ミドルセ ックス　ホスピタル　メデル、サ　コートウルド　インスチチュート　オブ・リ イ内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒト力ルシトニノ遺伝子関連ペフ０チド。 ２　構造 Ａｌａ　−Ｃｙ　５−Ａｓ　ｐ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ　−Ｃｙ　ｓ−Ｖａ 　１−　Ｔｈｒ−Ｈｉ　ｓ−Ａｒｇ−−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−Ｖａｌ、　−Ｖａ　１−Ｌｙ ｓ−Ａｓｎ−Ａｓ　ｎ−Ｐｈ　ｅ−Ｖａｌ、−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−−Ｖａ ｌ、−Ｇ］、ｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミド　（１）を・イーＪ ずて）ペン０チド。 ７１Ｆ）、駅とし２て使用す６、ｉｆ’ｔ’ｌ永の範囲第２加記載のペプチド。 ４　高面１＝冶療（、こ使用す請求の範ド１」枇ろ〕（１記載θ）ペプチド。 ５　請求の１・］）囲第２項記載のベノチドオｊよひ［２昌・−的（・コ許芥Ｆ ｊ］能な賦形剤を子１する、し１．・７・組成物。 ６　少ｔ、ｘ　くとも下記の如きアミノ酸配夕１］ＡＪａ、−Ｃｙｓ−Ａｓｐ− Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−′ｒｊｉｃ−−Ａｒｇ−Ｌ 　ｅｕ−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｔ、＋０Ｌ１−８　Ｃ１ｒ　−Ａｒ　 ｇ−Ｓ　ｅｒ　−ｔ）ｌｙ−−０１ｙ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ−ＬｙＳ−Ａｓｎ−Ａ ｓｎ−Ｐｈｅ−’Ｖａｌ−Ｐｒｏ−−Ｔｈｒ　−ＡＧ　ｎ−ｖａ　１−Ｇ　１ｙ −８ｅｒ−ＬｙＳ−Ａ　１ａ、−Ｐｈｅ　−Ｒ１（１１）（式中、ｒり′は−Ｈ 又はアミノ献残基てあイ・）又：よ生餌、内パ・、るいは試験、ぞ；内で了ミド ：、二転換ｎ］耐なペプチドを１１才るペプチド。 ８ ＺＲ′は−Ｇｌｙである、請求の範囲第６８１記Ｒａｙのペプチド。 ８　構造（１）を有するペプチドの製造ｄ、にオ◇いて、１、請求の範囲第６項 又は第７項記載（））ペプチドであイ、中間ペプチドをコードする遺伝子を含む ベクタ　で形’ｌ」４＋！、換させた宿主生物体を培養して、中間ペプチドる・ １：）、ついでＲ′をアミドに転換さぜること右−９徴と一４′イ）、−１記方 法。 ９　中間ペプチドは、形仙転換さ才ｉた宿主４１物体にて高レベルで産生きオし た少ｊｃ　くとも−Ｆ＋（ｌｖ）クン白ｔｒ１：ｔ、・よび請求の範囲第６８′ ！又（上第７１）ｊ　；ｉＥ’、載θ）ベゾー／トイト１６む融合タン白質でル 〕す１．−の融合タン白質会・分角・ｌし、−（＝、５ｉ′１求σ゛範囲第６項 又は第７　！Ｌｉ　ｇ［：　ｉｌ＆　（４＋ベゾチドイ＋”　７：ｊ　ｌ）、− 占　求　θ）面２　ｐｔｌ　ｇｆ４．　Ｒｌｒｊ急　ご−：　ｊｉ）９　／バカ θ　−１０形質転換され−た宿主り１物体Ｌ＃、−ｔ：バｒ　１４：　Ｌ　５イ ′、少ｌＩ・くとも一部のタン白質、ｔ℃・９Ｌυ’　請求の而」間第６珀又（ １第７項記載のペプチドをイ１．１．二のタン白Ｉｆｊ　、トベゾブドは化掌的 又は酵素的選択分解しつる結合に１り沖結、゛ねていイ）、融合タン自信。 １１　結合は−Ｍｅｔ−１−（）］Ｉｌ−おＬひ−ｂｙ３−Ａｒ（、ｙ−からす ｖ択されイ）、晶求σン範囲第’　Ｏｆｉｌ　！ｉＬ：載の融イ１゛夕／ｃｌ　 ｆｉ、）１２　構ｊ１１、（１）を有−十イ、ペプチド（７）　Ｄｌｉ　Ｊ／、 ：、−、、、、ｌ：、　ｒ、、−オ、イー（、少なくとも下８［−１のアミノ酩 配列 Ａｒｇ−工１ｅ−工１ｅ−Ａ１ａ−Ｇ］、ｎ−Ｌｙｓ７Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｑｙｓ −Ａｓｐ−−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−八ｒ ｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−−Ｇ　１ｙ−Ｌ　ｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ ｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−８ｅｒ　−を含む中間ペプチド をコー　ドする遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主真核生物体を培養して 、中間ペプチドを得、この中間ペプチドを宿主生物体によりプロセッシングし、 ついでペプチドを単離することを特徴とずろ、上記方法。 １６　次のアミノ酸配列。 Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−八ｌａ　（ｌｖ）を有するテトラペプチド。 １４、医薬として使用する、請求の範囲第１６項記載のテトラペプチド。 １５　高血圧の治療に使用する、請求の範囲第１３頂記載のテトラペプチド。 １６、請求の範囲第１３項記載のテトラペプチドおよび医薬的に許容しうる賦形 剤を含む、医薬組成物。 １７　請求の範囲第１項、第２項、第６項、第１０項〜第１６項のいずれか１項 に記載のペプチドをコードする遺伝子。 １８１）アミノ酸１〜６７． １１）アミノ酸−６〜−−−７， １１１）アミノ酸＋６〜＋９又は ｉｖ）　アミノ酸−７〜＋９ をコードする、図２の低部に記載の遺伝子。 １９　請求の範囲第１７項又は第１８項記数の遺伝子を含むベクター。 ２、特許請求の範囲第１９項記載のベクターで形質転換させた宿主生物体。 ２１　抗原性決定子を含む構造Ｉのペプチド又はその部分であり、そのペプチド 又はその部分はそれらに何着した検出可能なラベルを有する、上記ペプチド。 ２２　抗原性決定子を有する構造■のペプチド又はその部分であり、ペプチド又 はその部分は１２５工で任意にラベルされたチロシンアミノ酸残基を含む、上記 ペプチド。 ２３．１２５１でＴｙｒを任意にラベルした、構造。 Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−−Ｖａｌ −Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミドを有する、請求の範囲第２ ２項記載のペプチド。 ２４、１２５１でＴｙｒを任意にラベルした、構造：Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ− Ａｓｐ−Ｔｈ、ｒ−Ａｌ−ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌを有する、請求の範囲第 ２２項記載のペプチド。 ２５、１　’２５工でチロシンを任意にラベルした、チロシン化ＰＤＡ　−４゜ ２６　構造Ｉのペプチドの抗原性決定子に特異性を有する抗体。 ２Ｚ　配列■のペプチドの抗原性決定子に特異性を有する抗体。 ２８　図２に示した１〜１２５６のヌクレオチド配列から選んだ１５以上のヌク レオチド配列を有するＤＮＡハイブリッドプローブ。 ２９　図２に示した１〜７２５のヌクレオチド配列から選んだ配列を有する、請 求の範囲第２８項記載のＤＮＡハイブリッドプローブ。 ３０　図２に示した７２６〜１２５６のヌクレオチド配列から選んだ配列を有す る、請求の範囲第２８項記載のＤＮＡノ・イブリッドプローブ。 浄書（内容に変更なし）