JPS60501859A - 酵素誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素誘導体 本発明は酵素誘導体に関し、そして特に静脈血栓症の工うな血栓症を治療するの Ｋｉ用な凝固防止剤活性を有する蛋白質Ｃの誘導体に関する。蛋白質０Ｆｉ２個 のジサルファイＰ結合ボ１１ペプチｒ鎖からなるビタミンに依存性血漿蛋白質で ありそして凝固防止剤としての壁能を働らカ）せるためにはそれはまず既知の方 法に従って活性化されて一活性化蛋白質Ｃ″Ｃ以降、蛋白質（’３ａ　と云う） にされなければならない。凝固防止剤としての蛋白質（Ｅａ　の欠点はそれが内 因性血漿阻止蛋白質ｒ、ｃる阻止に工り循環において短かい寿命を有することで ある。

蛋白質Ｃ１ａ　の欠点は、その蛋白質をアシル化して、１−国防止剤活性が隠蔽 されるがしかし生″体内で徐々に加水分解’１Ｊｆｌで活性な酵素を再生する誘 導体を形成プせることにエリ兎服これるかあるいは減少されることができると゛ とが今や見出された、そのよりなアシル化はそれにＬｒ）蛋白質Ｏａ　について の持ｆｊ？、性放出作用を達成しそして凝固防止過程の動力学上の化学的コント ロールを達成する、 したがって、本発明は、凝固防止剤活性に必須的な活性部位がアシル基にエリ封 鎖されてｐ！ｌｌ＃素加水分解にエリ生体内でそのアシル基が除去されて蛋白質 Ｏａ　の持続した且つコントロールされた放出を与えることが可能である、蛋白 質Ｃａ　を含む酵素誘導体を提供する。好ましいアシル基は場合にニジ置換され たベンゾイルまたはアクリロイル基である。

適当な置換きれたベンゾイル基はノ・ａゲンアミノ”　１−６アー　ｇ８ノ屯日 ｙ　ＧＯ−５０１８５９（２）ルキルアミノ、Ｃ１−６アルキル、ｃｌ−６アル コキシ、０２−７アルカ、ノイルオキシ及び（または）　ａ２−７フルカノイル アミノ（ＦＬＣＯＮＨ−）あるいはアルヵノイルヒＰラジ／　（ＲＯＯＮ［−Ｔ ＮＨ−１で置換されたベンゾイル基を包含する。−利け４−フルオロベンゾイル 、２−１３−１または４−トルオイル、２−１または４−メトキシベンゾイル（ 即ち、アニンイル）、２−、−またけ４−エトキシヘンソイ”、２　ｔ　４　） メトキシベンゾイル、３゜４−ジメチルベンゾイル、４−ブチルベンゾイル、３ −メチル−４−メトキシ４ンゾイル、２−アセトキンベンゾイル（即ちアセチル ナ＋１チロイル）、ｚ−ｔたけ４−アミノヘン２イル、及び４−アセトキンベン ゾイルを包含する。適当な場合により置換されたアクリロイル基はｃｌ−６アル キル−アク１１０イル、フ１１ルーアクリロイル、シナモイル及ヒｃ、−６−ア ルキル−ンナモイルを包含する。

本発明の誘４体は蛋白質ｃ〕ａ　をアシル化剤Ｂ （式中、八は試薬を触媒作用部位に配置させる配置用基でありそしてＢｌｄアシ ル基、好ましくは上に記載したとおりのベンゾイル基またはアクリロイル基であ る）と反応享せることに、Ｃ９つ（られることができる。

基Ａの例は４−アミジノフェニル及１−ｈ４−アセトアミジノフェニルあるいは ３−また１−ｔ４−位置において正電荷部分を含有する構造的に類似の置換され たフェニル基を包含する。

適当なアシル化剤の例み４−アミジノフェニル４′フルオロベンゾエート、４− アミジノフェニル４′−トルエート、４−アミジノフェニル４′アニセート、４ −アミジノフェニルベンゾエート、４−アミジノフェニルシナメート、４−アミ ジノフェニル３−〔２−）１１ル）−アク１ル−ト、４−アミツノフェニル２− ナフトニート、４−アミノジノフェニル３．３−ジメ千ルア／７１１＋ｚ＝）、 ４−アミジノフェニル４’ｔ−プールペンツエート、４−アミジノフェニル２’ 、４’−ジメトキシベンゾエート、４−アミジノフェニルアセチルサリチレート 、４−アミジノフェニル４′−エトキシベンゾエート、４−アセトアミ・ジノフ ェニル４′アニセート、ｌ−７ミジノフエニル２′−トルエート、４−アミジノ フェニル２′アニセート、４−アミジノフェニル３１．４１　）メチルＲンゾエ ート、４−アミジノフェニル３′−メチル−４′〜メトキシベンゾエート、４− アミ２ノワエニル４′−アミノベンゾニー）及び４−アミジノフェニル４′−ア セトアミロペンツエートである。

アシル化反応は蛋白’ｌ’ｔ　”’ａ、アシル化剤まだ汀生我遭にＭ害でないｐ Ｈ範囲、例えばｐＨ６〜ｐＨ９そして好ましくけ約ｐ）−１７で緩衝された水性 媒体中で行なわｎ−るのが適当である。

反応はおだやかな温度でアシル化剤を蛋白・直Ｏａ　と混合することにエリ一般 に行なわれる。アシル化剤の良度１’：Ｉ’　＋１．０５〜１．０ｍＭが好まし い。

反応を進行させる時間は使用ざｎるアシル化剤及び反応を行なう温度に工って左 右きれる。都合よい時間は０℃で約０５〜１時間であるが工Ｖ長（反応を続けさ せても工い。

反応が完了した労、誘導体は透析、親和力クロマトグラフィ及び限外濾過の工う な標儒の方法によ！ｌｌ精製されそしてその汝、水性媒木刀１ら凍結乾燥のよう な標愚の方法にＬり回収きれる。

必要な場合、本物質は、例えば殺菌にエリヒトへの静脈内投与に適合させること ができる。

本発明の誘導体を製造するのに使用するだめのアシル１ヒ１￥Ｉは公知の化合物 である刀）あるいは１−〇ツバ特許第９８７９号及び同第２８４８９号に開示き れている方法のような公知の方法にエリ公印の化合物からつくられることができ る、本発明の誘導体は好ましくけ製薬組成物として投与これる。

したがって、本発明はまた製薬的に許容でさる担体と絹み合わせて本発明の誘導 体を含む製薬組成物を提供する。

本発明による組成物はヒトへの静脈内投与に適合された製薬組成物として慣例的 な方法に従がって調合されることができる。

代表的には静脈内投与用組成物は無菌の等張水性緩論液中の無菌誘導体の溶液で ある。必要ｆｘ場合、溶液中に誘導体を維持するだめの町溶化剤及び注射の畢所 での痛みケやわらげるためのリグノカインのような局所麻酔薬をまた含んでもよ い一一般に酵素誘導体は例えば活性単位中の酵素の扉ならひに遊離の酵素が放出 ばれる時間を記載しているアンプル、小袋贅たけ小びんのような密閉的に封をし た容器中の乾燥粉末または無水濃縮液として単位投与量形で供給されるであろう 。誘導体が注入にニジ投与されるべきである場合、誘導体は無菌製楽級の一注射 用水”を含有する注入びんを用いて調合されるだろう。誘導体が注射にエリ投与 されるべきである場合誘導体は無菌注射用水のアンプルを用いて調合される。注 射可能なまたは注入可能な組成物は投与前に成分を混合することにニジつくられ るだろう。

本発明はまた、本発明の酵素誘導体の有効量を補元動物に投与することからなる 、ヒトを包含する哺乳動物における血栓症の治療及び（または）予防の方法を提 供する。

投与される物質の量は必要とされる凝固防止の量及びそれを必要とする速さ、血 栓塞栓症状の重大さ、そしてもし存在するならば血餅の位置及び大きさにエリ左 右される。使用されるべき正確な投与量及び投与方法は症状の訴えの性質からみ て医師監督治療によＶ環境に従って必然的に決定享れなければならない。しかし ながら、一般に患者は、５回までの注射による〃）または注入にエリ００５〜２ ．０！／吟　体重の１日ごとの投与量を受け入れるだろう。

次の例は本発明を例示する。

蛋白質Ｏａ　の製造及び可逆的不活性化、ビタミンに依存性ヒトの凝固性因子の 市販の濃縮物から蛋白質を部分的に精製することができる。

一つのびんの濃縮物（〜１００■全蛋白質）ｋ　２０　ｍＭのくえん酸ナト１１ ウム、ｐＨ６（〜１５−）に溶解しそしてデキストラン−サルフェート−アガロ ース（下記の製造法参照）の２×３５菌のカラムに流し；次にさらに蛋白質が溶 離さｎな（ｆｘるまで〜３０−／時の割合で２０ｍＭ（えん酸ｔｉ／ｐＨ６，９ （〜３７５ｉ）で完全にカラムを洗浄した。次に増大していく一度のＮａＯ＃　 （０−Ｉ　Ｍ　）を含有する一定勾配の（えん酸塩後ｌ＃液を８時間にわたって カラムに適用した。カラム上のＮ　ａ　ＯＥ＃匿が〜０．２Ｍに達した時、蛋白 質Ｃを溶離しそして５−分画として集めた。蛋白質Ｃの存在は、選ばれたカラム 分画の５μ１分別量を、抗−蛋白質Ｃ抗体を含有するアガロースゲル中に電気泳 動させ、蛋白質Ｃを含有するこれらの分画が蛋白′面のクマシーブルー染色ｉロ ケット形の免疫沈降素線に上昇を与えるラウレルｌ　Ｌａｕｒｅ口）ロケット免 疫電気泳動分析〔アナＩＩ　ｆカル１９６６中のラウレル、シー、ビー、［Ｌａ ｕｒｅｌｌ　、　Ｏ，Ｒ，１による〕を行なうことに工９立証された。

蛋白質Ｃを含有するこれらの分画が集められそして一４０℃で１ｍＭベンズアミ ジンの存在下に貯蔵するために分別ばれた。

デキストランサルフェートルキル レス、　（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、）、６８７−６９２．１１　１．９ ７７中にデー、ニス、ペノξ−（Ｄ、Ｓ、Ｐｅｐｐｅｒ）及びンー、プローゼ（ ０，Ｐｒｏ７ｓｅ　）に記載−され芒とおりにして臭化ンアン活叶化セファｏ− ス４　Ｂ　（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　）にデキストランサルフェートをカ ップ１１ングさせることにエリつ（られた。

ｔｂ）　蛋白質Ｏａへの蛋白質Ｃの活性化ｉ白質ｃはヒトのα−トロンビン、ラ ッセルのパイノξ−（Ｒｕ５ｓｅｌｌ’ｓ　Ｖｉｐｅｒ　）毒液力らのファクタ ーＸ−活性化剤因子−またけト１１ゾシンを用いてインキュベートすることにエ リ蛋白質Ｏａ　ｓセリンプロテアーゼに活性化されることができる。その活性化 法は重アミノ酸鎖からＮ−末端ρデカペゾチＰを除去することにエリ蛋白質Ｃの 分子量を〜６２．０００刀）ら〜６１．０００まで減少きせる。

トロンビンを用いる活性化法を以下に記載する、Ｏｌにの牛の血清アルブミンを 含有するｐＨ１３，ｏの（１，１Ｍのト１１スｆＴｒｉｓ）中の蛋白質Ｃの溶液 をヒトのα−トロンビン（蛋白質Ｃの量の約１１５０　）でインキュベートした 。

活性化処理の進行に続いて蛋白質０−トロンビン　インキュベート混合物の２０ λ分別量を周期的に取り出し、ヘパ１１ンとアン壬トロンビン■との混合物（Ｈ ＡＴニトロンビンのｕｖあタリ各々〜２μＶ）を用いてトロンビンを中和しそし て５ｍＭの基質Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ　−ＰｉＤ　−Ａｒｇ−ｐ−＝ド ロア＝ｌＩ）７）の１００　Ａｌｌ及び（１，１、Ｍ　トＩＩス／′（１，０５ Ｍ　Ｎａ０／＝／ｐＨ８の８８０μｌの添加にエリアミＰリチツクｆａｍｉｄｏ −ＩｙｔｉＣ）活性について４０５　ｎｍで分光光度計的に評価することができ る。３〜４時間後活性度は定常的水進に達しそして蛋白質Ｏけ十分に活性化され 蛋白質Ｃ３にきれた。

トロンビンは上に記載したとおりにしてヘノξ１１ン及びアンチトロンビンｍで 中和させることによる〃）あるいけインキュベート混合物をスルホゾロピル　セ ファデックス０−５０［５ｕｌ−ｐｈｏｐｒｏｏｙｌ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｏ− ５０）のカラム中に通過きせる（即ちトロンビンはカラムに結合されるがしカル 蛋白質０ａ　は２０ｍＭのＭＢＳ　、）リス／　５０　ｍＭのＮａＯ／？　／’ 　１　ｍＭのペンズアｉジン／ｐＦ４６．０で洗浄することにエリ溶離される） ことによる〃１のいずれかにニジ蛋白質Ｏａ　溶液力）ら除去きれることができ る。別法としては不溶性トロンビン−セファロース（！’ｔｅｐｈａｒｏｓｐ　 ）が蛋白質Ｃを活性化するために使用されることが出来、この場合においてトロ ンビンの除去におだや刀１に遠心分離することにエリ簡単に行なわれる。

蛋白質０３　けファクター■及び■を蛋白質分解しそれに工り外因性及び内在性 の両方の凝固経路によるトロンビンの生体内生産を封鎖する。この効果はカオ１ １ンーセファ１１ン凝固時間（ＫＯＴＴ）Ｅ験（１９７５年オツクスフォーｒの ブラックウェル　サイエンチフィツク　）ｑｆＩＩケーションス（Ｂｌ　；Ｉｃ ｗｅ　Ｉ　ｌ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）発行のオー ステン、デー、イー、ジーＩ　Ａｕ５ｔｅｎ　、　Ｄ、Ｅ、ｎ、　）及びリメス 、フイ、Ｉ＃。

Ｊ　Ｒｈｙｍｅｓ　、　Ｉ　、Ｌ、　）著°血液凝固の実験室手引［ＡＬａｂ− ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏ＋Ｉｇｕｌａｔｉｏｎ 　１　−　］の手段にニジ試験管内で調べることができ、次のとおりにして行な われた。

トロンビンがヘノξ１１ンーアンチトロンビンｌｆｔにエリ確実に中和された刀 ・あるいけ除去これた蔭性化蛋白質Ｃのサンプルを１００ｘＯ，０５Ｍ）リス／ 　＋１．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ（３＃　／　１１．１　％　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｉ牛血清アル ブミンＩ／ｐＨ７，５で希釈しそしてこの４ｘ１００μルの分別寸を３７℃で新 しく集められたヒトの血漿の４×１００μｌに加えた。市販のカ第１１ンー小仮 置換物（脳のクロロホルム抽出物）懸濁液のｌＯＯμ１分別量を分別上してその ４混合物を確実に２分間インキュベートした。次にｆｌ、　０２　Ｍｆ′・ａＯ ル、のｌＯＯμ１分別奮を分別上して血漿が凝固するのが認められる時間を計っ た。これは自動化凝固針を用いて都合、ｊ：（行なわれることができる。

活性化蛋白質Ｃの代りに〜［１，０５Ｍ　ｌ−リス、　Ｉ−ＴＯ＃　／　ｆｌ、 　Ｉ　ＭＮ　ａＣ＃　／　１１．１％ＢＳＡ／ｐＨ７，５の１００μ４を用いた 場合、４５〜５５秒の範囲にあるＫ　ＯＯＴの俤悪の生理学的値が得られた。ラ ウレル免疫電気泳動分析及びア４ｙｕチックｆａｍｉ−ｄｏｌｙｔｉｃ　、＞　 活性からの確証と組み合わせてこの値のなんらかの有意義な延長は活性な蛋白質 Ｏａの存在を示す。

ＨＡＴ処理されたトロンビン活性化粗製濃縮液の５０μｌを１時間３７℃で５０ ０μＭ　ＡＰＡＮの存在下にインキュベートした（このインキュベートはときど き分別量を取り出しそしてＳ−２２３８ｆ：％用いてアミｔリチック活性を調べ ることにより観察されることができる）。次に１１．０５　Ｍ　トリスＨＣＩＩ 　／　（１，Ｉ　ＭＮａ（）＃　／’　ｐＨ７，５の添加に工り混合物をｉｏｏ λの容１に希釈しそしてＫＯＯＴＫ験に干渉する過剰のＡＰＡを除去するために （蛋白質トレーサーとして　Ｉ−牛血＝／１アルブミンを用いて）セファデック ス（）−２５ｌ５ｅｏｈａｄｅｘＧ−２５１のｎ、　７　ｓ×５１カラム中に通 過させた。溶離−Ｊｎたアシル化蛋白質を１−の全容量に希釈した。Ｋ　ｌ〕（ ｊ　Ｔ試験においてこの溶液は瞭蕩の範囲内にあるＫ　ＯＣＴ値を有する、第１ 表に示されるとおりに挙動した、即ち蛋白質ＯａけＡＰＡＮ処理にエリ不活性化 きれ７？　ＡＰＡＮを用いてインキュベートきれなかった活性化級縮液は延長化 されｆｃＫＯＯＴを示した。

２００ｍＭとＰロキシルアミンを用いて（ＤＨ８，０で４℃で７２時間）インキ ュベートすることに、ｃｖアニソイル−蛋白質の脱アシル化を行ないこれは蛋白 質Ｃの凝固防止剤活性及びアミｒリチツク活性に部分的に戻した。

第１表 Ｉ＃縮液＋トロンビン＋ＨＡＴ　１１７３．５ｅ　ＩＩ　Ｉ＋ｋＰＡＮ　５１． ０ 〃’＋８２ＮＯＨ？５．０ ＃　＃　＋ＡＰＡＮ＋Ｈ２Ｎｏｔ−１６４，５略語 ＨＡＴ　：　へ／ξりントアンチトロンビンＡＰＡＮ：　４−アミジノフェニル ４′−アニセート例２ 蛋白質Ｄａ　溶液（例１におけるとおりにつくられた、５０薬に依存して）２〜 １６時間アシル化剤Ｉ　ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ）の２５μｌでインキュベートし た。２５μｌのＤＭＳＯだけが加えられた対照サンプルをまたつ（つた。ときど き、分別量を取り出しそして上に記載したとおりにしてＳ−２２３８に対するア ミＰリチツク活性を測定することにエリアンル化の程度を観察した。残留活性度 が対照値の５イエリ低い力４たは等しい場合、過剰のアシル化剤は、１１．ＩＭ ＩＩス／゛２０％ｆｖ／ｖ）グ１１セロール／゛１１．９　％塩水／ｐＨ７，４ ｆＴｎｓ緩衝剤）で平衡化はれたセファデックス■Ｉ　５ｅｏｈａｄｅｘ■１（ ）−２５カラムに通過させそして同じ緩衝剤の３．５　ｍ／中に溶離きせること に除去された。溶液を氷上で貯蔵しそ（−７て５分以内に使用した。

（２）　脱アシル化速度定数の測定 アシル化サンプル及び対照サンプルを３７℃でインキュベートしそしてときどき （ｔ＝０で始する）分別量を取り出してアミｒリチツク活性（０，Ｉ　Ｍ　トＩ Ｉエン（Ｔｒｉｅｎ　ｌ　／　１１．０３９１Ｆ：アジ化−）−）　リウム／ｐ ＨＳ中（７）　５０　、ｕＥ　Ｏａ　＋　５００μＡ　ｌ　ｍＭ’ｌ−２２３８ ）を試験した。脱アシル化速度は〔式中、ｋｔｒｉ３７℃でのインキュベート前 のアシル−＋Ｅａ　の活性度であり、Ａ１　は時間ｔでの活性度でありそしてＡ ｍａｘけｍ２５℃で例えば１６時闇アシル化Ｃａの＊粛ｉ再生された最大活性度 （Ｋ５＞２Ｘ１０−’Ｓ−’の場合の速い脱アシル化用１次速度プロットからの 線形回帰に工９計算きれた。

（３）結果 第２表は蛋白質Ｃａ　の６種の置換ベンゾイル４導体の各々について３回の脱ア シル化速度定数の結果を要約する。他のセリン蛋酵素と同様に〔アーク、ビオケ ム、ビオフイズ、ＩＡｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、−Ｂｉｏｐｌｈｙｓ、１　、２５９−２６８　、１５０　、１ ９７２中のワンプシー・シー（Ｗａｎｇ　［３−０１及びンヨウ　イーｉｓｈｏ ｗＥ）の記事を参照）、説アシル化速度定数は・ξう置換１鏝導体のためのハメ ットシグマ定数（ｔｈｅＨａｍｍｅｔ　Ｓｉｇｍａ　Ｔ！ｏｎｓｔａｎｔｌの相 関することが見出ζｌｒした。電子放出性置換基は説アシル化を遅らせそして電 子求引性基は加水分解を促進させた。ｌｏｇ。

（脱アシル化速度定数）／σＰのゾロットのスロープは３．１６（相関係数（１ ，９９）であることが分かり、これはペンゾイルトのワンプ　アンＰノヤウ（西 ａｎｇ　＆　Ｓｈａｗ　ｌによる〕のスロープに類似するがしたしアシル化線維 素溶解酵素にエリ示享れたスロープ〔刊行予定のニー、ジエー、ガルマンＦ　Ａ 、Ｊ、ｎａｒｍａｒ＋）、ジー、ニス、モルガン１　ｎ、ｓ、Ｍｏｒｇａｎ）及 びアル、ニー、ジー。

スミス（Ｒ，、Ａ、Ｇ、　Ｓｍ１ｔｈ　）による〕エリ大きい。

（４）結論 データは蛋白質Ｏａ　の種々のアシル化誘導体がつくられそしてアミＰリチツク 活性を保持しながら脱アシル化ばれることができることを示す。構造−活性度関 係は動力学的挙動についての有用な程度の予測性を提供する。

例］　３ 活性の本質的に十分な回復の立証 ｐＨ７，４のＴＧＳ緩衝液中の４−トルオイル−（’ｉａ３．５ｒｎｌが例２に おいて記載されたとおりにしてつくられそして非−アシル化対照の３５−と−緒 に０℃に保持された。

両方のサンプルのＫＯＯＴ値が自動比四−管凝固計を用いて４回（４倍にして） 測定された、 両方のサンプルは次に３５時間３７℃でインヤニベートこれそしてＫＯＴＴ値が 再測定された。

（２）結果 結果が第３衣に示される。Ｋ　Ｏ＋’！　Ｔ時間（４×４測定の平均）がＴＧＳ 単独についてのＫ〔肩〕Ｔ時間（７３５〜８３５秒）にまた、例２において記載 これたとおりの１ｍＭＳ−２２３８を用いて測定ばれたＳ　Ｕ　／　ｍｌでの、 サンプルのアミ１１１チツク′活性が示される。

（３）結論 （４−トルオイル誘導体にエリ例示これた）データーは活性な蛋白質Ｄａ　のア シル化が酵素のアミＦ％　Ｉ＋チック及び凝固防止剤活性の両方を無効にし、そ してアシル化誘導体の完全な加水分解後これらの活性が十分に再生これることを 示す。したがってアシル化は可逆性でありそして酵素の生理学的（凝固防止剤） 活性に応答しうる活性部位の機能の全体σ）一時的保護を与える。

昭和３０年３　月２７日 特許庁↓宝　殿 １、事件の表示 １ 居　所　東京都中央区日本橋兜町１２番１号大洋ビル７、補正の対象　１相１． ｉ或°、ｌ！ｐ９号−龍欠国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　凝固防止剤活性に必須な活性部位がアシル基にエリ封鎖ばれており、このア シル基が酵素加水分解にニジ生体内で除去されて蛋白質ｑａ　の持続さｎｆｃ且 つコントロールされた放出を与えることが可能である、蛋白質Ｃａ　を含む酵素 誘導体。 ２　アシル基が場合によ！ｌｌ置換されたベンゾイルまたはアク１１０イル基で ある請求の範囲第１項に従う酵素誘導体、３、　アシル基が、ハロゲン、アミノ ％０１−６アルキルアミノ、Ｃｌ−６フルキル、Ｃ１−６アルコキシ、０２−７ 　フルカッイルオキシ及び（または）Ｃ２−７アルカノイルアミノにＬり場合に 、Ｃり置換されたベンゾイル基である請求の範囲第２項に従う酵素誘導体。 ４４ンゾイル基が４−フルオロベンゾイル、２−．２−１もしくけ４−トルオイ ル、２−１もしくけ４−メトキシベンゾイル（即ちアニソイル）、２−１もしく は４−エトキシベンゾイル、２．４−Ｘ）メトキシ４ンゾイル、３．４−ジメキ ルペンゾイル、４−ブチルベンゾイル、３−メチル−４−メトキシベンゾイル、 ２−アセトキシベンゾイル、即ち（アセチルサＩＩチロイル）、２−もしくけ４ −アミノベンゾイル渣たは４−アセトキシベンゾイルである請求の範囲第３項に 従う酵素誘導体。 ５、蛋白質０．１　をアシル化剤 Ｂ （式中、Ａは試薬を触媒作用部位に配置させる配置用基でありそしてＢはアシル 基である）と反応させることからなる、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１ 項に従う酵素誘導体の製造方法。 ６、基Ａが４−アミジノフェニルまたは４−アセトアミジノフェニルである請求 の範囲第５項に従う方法。 ７　製薬的に許容できる担体と組み合わせて請求の範囲第１項〜第４項のいずれ か１項に従う酵素誘導体を含む製薬組成吻。 ８、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に従う酵素誘導体の有効量を補元 動物に投与すること力）らなるヒトを含む補元動物の血栓症の治療及び（または ）予防の方法。 浄書（内容に変更なし）