JPS6050302B2 - 蛋白質検出器具およびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的粒子同士が免疫学的または非免疫学
的に特異的な相互作用を示す現象の利用によつて生物学
的粒子の臨床的検出を行うための器具に関するものであ
る。

蛋白質の免疫学的検出において使用すべき検出器具の構
造は、１９７′３１ｆ：．７月３０田こ提出され（そし
て現在では放棄され）たギアエバー（Ｇｉａｅｖｅｒ）
の米国特許出願第３８４１１３号およびギアエバーの米
国特許第３９２６５６４号明細書中に記載されている。

これら両者の構造においては、その外面が目的の蛋白質
に対して特異的な相互作用を示す所定の蛋白質層から成
つている。米国特許出願第３８４１１３号の場合、所定
の蛋白質層を付着させる基体表面はガラス基体上の金属
被膜であることが好ましい。また米国特許第３９２６５
６４号の場合には、所定の蛋白質層を付着させる表面は
主として金属酸化物から成るが、かかる金属酸化物は微
細な金属粒子を含有することもある。なお、上記の米国
特許出願は本発明の場合と同じ譲受人に譲渡されており
、また上記の米国特許出願および米国特許の明細書はい
ずれも引用によつて本明細書の一部を成すものとする。
ギアエバーの米国特許第３９７９１８４号明細書中に．
記載された更に別の検出器具においては、光反射度の比
較的低い不透明な金属表面（固体の金属または別種基体
上の不透明な金属被膜の表面）が誘電体から成る薄くて
透明な第１の層で被覆される。次に、かかる第１の層の
外面上に金属から成ｊる透明な第２の層が設置される。
なお、米国特許第３９７９１８４号明細書もまた引用に
よつて本明細書の一部と成すものとする。大部分の抗原
は蛋白質であるが、あるいは必須成分として蛋白質を含
有するのに対し、全ての抗ク体は蛋白質である。

蛋白質は分子量の大きい巨大分子であつて、換言すれば
様々な数のアミノ酸の連鎖から成る重合体である。一定
の蛋白質は様々な実体（たとえば蛋白質分子、細胞など
）を構成するが、それらは互いに付着することがない。
それ故、蛋白質を基体と接触させた場合、れは一重の層
を成して沈着する。実体の大きさが分子レベルである場
合、こうして得られた一重の層は単分子層を成す。既に
沈着した蛋白質層に任意の蛋白質が付着することはない
。とは言え、基体上に吸着された蛋白質に対して特異的
に反応する蛋白質だけは免疫学的な結合を生じる。上記
の米国特許出願および米国特許明細書の記載に従えば、
このフような発見の利用によつて医学的検出器具が得ら
れる。すなわち、ある蛋白質の層を表面上に吸着させた
スライドを使用すれば、それに対して特異的に反応する
蛋白質の存在が疑われる溶液を試験することができるの
である。もし特異的に反応す７る蛋白質が溶液中に存在
すれば、（溶液に暴露した後の）スライドは表面上に蛋
白質の二重層を有することになる。また、特異的に反応
する蛋白質が溶液中に存在しなければ、（溶液に暴露し
た後の）スライドは最初の蛋白質層のみを有するに過・
ぎない。本明細書中て使用される１生物学的粒子ョとい
う術語は、動物に注射した場合に抗体産生を引起すこと
ができかつ（あるいは）免疫学的または非免疫学的に特
異的な相互作用を示す性質を持つた蛋白質分子（たとえ
ば血漿蛋白質、抗原、抗体、植物凝集素）および蛋白質
性の物体（たとえばウィルス、細菌、細胞など）を包括
するものとする。

また、１抗原物質ョおよび１抗原的に活性の物質ョとい
う術語は、ウィルス、細菌などから誘導し得るような抗
原部位を含む物質を指す。

更にまた、本明細書で１視覚的読取リョと言えば、れは
正常な視力（すなわち２０／４０にまで矯正し得る視力
）を有しかつ色盲でない人間が肉眼で行なうことのでき
る読取りを意味する。

さて下記の一連の工程に従えば、商業的に入手可能な金
属薄板素材から臨床的に有用な検出器具が製造される。

その場合の金属は表面上に強固な酸化物層を生成し得る
ようなものである。かかる製造に際しては、金属基体の
表面領域を粗面にして乱反射性を付与し、ある第１の所
定反射率が得られるように表面領域を化学的に腐食し、
表面領域の処理によつて第２の所定反射率を持つた艶消
しの乱反射性酸化物表面を生成し、次いでかかる艶消し
の表面領域上に蛋白質層を付着させる諸工程が実施され
る。好適な金属はチタンであり、また処理後における表
面領域の反射率は検出すべき免疫反応に応じて選定され
る。処理後の表面領域において得られた乱反射性の艶消
し仕上げは、特．別な照明を行わなくても（たとえば抗
原抗体反応によつて）表面上に生じた二重層の斑点をあ
る角度から肉眼で容易に観察できるという明確な利点を
有している。保護を受けたいと願う本発明の要旨は、本
明細，書の冒頭に特許請求の範囲として示された通りで
ある。

以下、本発明の製造方法および使用方法を添付の図面に
関連して詳細に説明しよう。先す第２図を参照すれば、
主として表面上に強固な酸化物層を生成し得る能力に基
つき、商業的に入手可能な薄い（たとえば厚さ約１０ミ
ルの）固体の金属薄板素材１０が選ばれる。

適当な単独金属の実例としては、チタン、タンタル、ニ
オブ、タングステン、ジルコニウムおよびビスマスが挙
げられる。各種の合金もまた有用であることが予一想さ
れる。酸化物層の強固性すなわち密着性（および化学的
不活性）は、それが検出器具の製造および使用に耐えて
残存し得るかどうかに基づいて評価される。適切な金属
基体を選んだ後、その表面領域に微細なグリッド（たと
えば３２０番アルミナ粒子ないし６０幡カーボンランダ
ム粒子の範囲内のもの）を吹付けて乱反射性を付与する
のが第１の工程である。かかる表面処理後の金属は比較
的一様に分布したビットを有する。これらのビットの直
径および深さは約７００００オングストローム以下（大
部分は５０００〜７００００オングストロームの範囲内
）であるように思われる。次に、この表面を酸で化学的
に腐食することにより、ある第１の所定反射率が得られ
るように粗面の程度（すなわち粒子の衝突によつて金属
が元の表面から隆起した度合）が削減される。適格な検
出器具の製造のために所望される粗面の程度および着色
の濃淡を再現させることを目的とした何らかの客観点基
準を得るため、米国ニューヨーク州ニユーバーグ所在の
マクベス●インストルメント コーポレーション（Ｍａ
ｃ？ＴｈＩｎｔｔｕｒｍｌｅｎｔＣＯｒｐＯｒａｔｉＯ
ｎ）製の適切に較正されたマクベスＲＤ−１０罎度計を
用いて処理後の金属表面の反射率が測定された。

反射率は米国規格協会（ＡＳＡ）の拡散反射濃度の形で
測定された。この測定器の計器目盛によれば、光学的な
拡散反射濃．度の直線的な尺度が得られるのであつて、
濃度目盛同士の間隔が等しくなる。使用する特定の光源
に応じてフィルターの選択が行われる。本明細書中に示
された濃度単位の値は、ゼネラル・エレクトリツク社製
の無疲労タングステン電球ＮＯ．４Ｏ（６．３■，０．
１５Ａ）を１視覚ョフイルターすなわちイーストマン●
コダツク社製のラツテン（Ｗｒａｔｔｅｎ）ＮＯ．ｌＯ
６Ｗと組合わせた場合に得られたものである。

使用した測定条件はＡＳＡ規格ＰＨ．２．ｌ７−１９５
８に基づくものであつた。勿論、本明細書中に示された
に相当する値を他の濃度計につて求めることは容易であ
る。マクベスＲＤ−１０α農度計を使用した場合、化学
的腐食によつて得られる第１の所定反射率として約０．
３〜０．鏝度単位（Ｄ．Ｕ．）の範囲内の値が適当であ
ると判明した。

なお、Ｄ．Ｕ．の値が小さくなるほど表面の外観は明る
くなる。化学的腐食は酸浴中において実施されるが、か
かる酸浴はＨ２ＳＯ４，ＦＩＮＯ３および唾から成る群
より選ばれた２種以上の酸を含有する加熱酸浴であるこ
とが好ましい。

選ばれる酸の種類および比率並びに浴の温度は、基体と
して選ばれた金属の種類および製造工程にとつて最適と
考えられる処理時間に依存する。有用な腐食浴は本明細
書中に示された指針に基づく通常の実験によつて決定す
ることができる。なお、腐食工程中に超音波振動を加え
れば、一層清浄な製品の得られることが判明ノしている
。チタン、タンタルおよびニオブ基体にとつて有用であ
ることが判明した酸浴の一例としては、等容のＨＦおよ
びＨＮＯ３の３（容量）％溶液を３５℃に加熱したもの
が挙げられる。その後、化学的腐食後の基体に陽極処理
を施；し、それによつて約１００〜約５００オングスト
ロームの範囲内の厚さを有する酸化物層１１を生成させ
れば、予め処理済みの表面は乱反射性の艶消し仕上を受
けることになる。

かかる酸化物層の好適な厚さは約２５０〜約３００オン
グストロームの範囲内にフある。使用すべき酸化物層の
厚さは第２の所定反射率が得られるように決定されるが
、後者はまたその上に付着させるべき蛋白質層の種類お
よび検出すべき反応から生じることが予想される色の変
化に応じて決定される。

一般に、大きな蛋白質分子にとつて有用な陽極処理後の
反射率は最低０．５０Ｄ．Ｕ以下までの値を取り得る一
方、小さな蛋白質分子にとつて有用な陽極処理後の反射
率は最高約０．８５Ｄ．Ｕ．までの値を取り得ることが
判明している。特異反応の検出用の検出器具を製造する
場合、第２の所定反射率は数値的に第１の所定反射率よ
りも大きいものとする。酸化物層の生成は陽極処理によ
つて行うのが簡便であるけれど、酸化性環境内での加熱
によつて酸化工程を実施することも可能である。

陽極処理に関する有用な参考書としては、エル・ヤング
（Ｌ．ＹＯｕｎｇ）著０陽極酸化被膜ョ（カデミツク・
ブレス、１９６１年）並びにエム●アール・ライフおよ
びエフ●コビツツ（Ｍ．Ｒ．Ｒｉｆｅ＆Ｆ．ＫＯｖｉｔ
ｚ）著０有機電気化学概論Ｊ（マーセル・デツカー社、
１９７祥）が挙げられる。一定の陽極処理浴を用いて様
々な所望反射率を得るためには、電圧を変化しさえすれ
ばよい。

その際には、電圧が低いほど淡色の基体が得られる。た
とえばタンタル基体の場合、圧を０．２■だけ変化させ
れば酸化物層の厚さが３〜４オングストロームだけ変化
する。このように電圧変動に対する感度が高いため、適
当な回路部品の使用によつて電圧変動を最小限に抑える
べきである。第２の所定反射率として一定の値を設定し
たならば、以後はこの値が得られるように陽極処理を行
えばよい。次に、このようにして酸化物で被覆された金
属表面の少なくとも一部分に対し、特定の生物学的．粒
子に暴露するとそれに対して特異的な相互作用を示すよ
うな蛋白質（たとえば抗原的に活性の物質）の層１２が
付着させられる。

それを洗浄すれば、検出器具１３は完成したわけである
から、包装して販売することができる。使用に当つては
、特定の生物学的粒子の有無を試験すべき液体試料が最
初の（特異的な）蛋白質層の一部分上に（たとえば互い
に分離した液滴として）滴下される。

もし特定の生物学的粒子が存在すれば、れは特異的な蛋
白質層と反応するかくら、かかる接触が起つた部位には
蛋白質の二重層が生じる。このような二重層区域は、第
２の所定反射率として適切な値が選定されていれば、乱
反射性かつ淡色の艶消し表面上に存在する蛋白質の一重
層に対する色のコントラストによつて肉眼で容易に観測
されるはずである。なお、特定の生物学的粒子が存在し
なければ第２の層が生じないことは勿論である。このよ
うな操作手順は、独立した金属片（たとえば縦２インチ
×横１インチ×厚さ１０ミルのもの）にも連続した金属
リボン（たとえば幅１インチ×厚さ１０ミルのもの）に
も適用可能である。

処理後の基体（すなわち蛋白質層を付着させてノ本発明
の検出器具を得る直前の基体）は、生物学的粒子同士が
特異的な相互作用を示すような現象の検出において広く
応用できる。なお、本発明の検出器具の好適な構造は蛋
白質層１２が抗原物質の層から成るようなものである。
陽極処理を受ける表面に付与すべき第２の所定反射率を
一定の特異反応について選定することは非常に簡単な作
業である。

すなわち、所望の特異反応を選び、それから先ず０．８
０Ｄ．Ｕ．の反射率を持つた陽極処理表面が得られるよ
うに金属基体を上記のごとく処理した後、適当な第１お
よび第２の生物学的粒子層を付着させて検査を行えばよ
い。コントラストが不十分である場合、反射率を（もつ
と淡色の表面が得られるように）上昇させるべきか（も
つと暗色の表面が得られるように）低下させるべきかに
ついて推論を行うことは容易である。その後、製造され
る基体の反射率を通常のやり方で変化させれば、最大の
コントラストを与える最適の反射率を確定することがで
きる。（上記のごとき）粗面の形成および（上記のごと
き）陽極処理のみによつて金属基体を処理した場合、得
られたのは暗色のスライドであり、そのため斑点のコン
トラストは不十分であつた。

また、（上記のごとき）化学的腐食および（上記のこと
き）陽極処理のみによつて金属基体を処理した場合にも
同じ結果が生じた。極めて平滑な表面を有するチタン基
体の場合には、陽極処理のみによつても良好なスライド
が得られた。しかし、表面上に生じた二重層の斑点がち
ようど旨く観測できるようにスライドを傾けて光を反射
させる必要があるため、視覚的読取りは面倒であつた。
本明細書中に記載された方法によれば、乱反射性表面上
における二重層の斑点がある角度から容易に観測できる
。なお、乱反射性表面という特徴は言うまでもなく粗面
の形成および化学的腐食の両工程に起因するものである
のに対し、着色の濃淡は陽極処理時の印加電圧に依存す
るものである。次に、本発明の最も好適な実施例を述べ
ることにする。

厚さ１０ミルの固体のチタン薄板に対し、３２０番アル
ミナ粒子を用いて蒸気吹きが施される。そのためには、
微細なアルミナ粒子を水中に連行させて加圧下て噴出さ
せればよい。こうして得られた表面は暗色の乱反射性粗
面である。かかる極めて一様な粗面の典型的な反射率は
約０．７０Ｄ．Ｕ．であつて、拡大すれはその表面の輪
部は第３図に示された通りである。次に、約３５部Ｃに
加熱されたほぼ等容のフッ化水素酸および硝酸の３（容
量）％溶液の使用により、チタン粗面の化学的腐食が行
われる。腐食溶液の濃度に応じ、（超音波振動を伴つた
）腐食を３０〜９Ｃ＠間（好ましくは約（４）秒間）に
わたつて行えば、淡い銀色の乱反射性表面が得られる。
処理後の表面の輪部は第４図に示される通りであつて、
その反射率は０．４０±０．０２Ｄ．Ｕ．となる。次に
、０．２９Ｍ五ホウ酸アンモニウム溶液中において、約
１１．５■の電圧下で約１５８７間にわたりチタン基体
の陽極処理が行われる。このようにして陽極処理された
チタン基体は厚さ約３００オングストロームの酸化物層
を生じる。かかる基体は０．８０±０．０２Ｄ．Ｕ．の
反射率を有しかつ青銅色または黄色／橙色を示す。特定
の用途に従えば、こうして処理されたチタン基体土にウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）から成る１の層を付着させ
た後、洗浄および乾燥が行われた。

陽極処理表面上のＢＳＡ被覆領域はほとんど検出不可能
であつた。次に、マイルズ・ラボラトリー（Ｍｌｌｅｓ
レＢＯｒａｔＯｒｙ）から入手したウサギ拍追ＳＡ血清
の１滴ないし数滴をＢＳＡ層に接触させた後、約４時間
にわたつて保温が行われた。その結果、二重層の斑点が
明瞭に現われた。すなわち、かかる斑点は赤味がかつた
色を示し、従つて青銅色のＢＳＡ被覆領域に比べて全く
対照的であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の製造方法を示す工程系統図、第２図は
本発明の検出器具を示す略断面図、第３図は製造された
金属基体の表面が粗面を成すこと・を示す略断面図、そ
して第４図は腐食工程によつて生じた変化を示す第３図
と同様な略断面図てある。 図中、１０は金属基体、１１は酸化物層、１２は蛋白質
層、そして１３は検出器具を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 表面上に強固な酸化物層を生成し得る固体の金属基
   体の表面領域を粗面にして乱反射性を付与し、第１の所
   定反射率が得られるように前記表面領域を化学的に腐食
   し、前記表面領域の酸化によつて約１００〜約５００オ
   ングストロームの範囲内の厚さを持つた乱反射性の酸化
   物層を生成させかつ前記第１の所定反射率をそれより大
   きい第２の所定反射率に変化させ、次いで前記酸化物層
   の少なくとも一部分上に特定の生物学的粒子と特異的に
   反応する蛋白質層を付着させる諸工程から成ることを特
   徴とする、液体試料中における前記特定の生物学的粒子
   の有無を検出するための器具の製造方法。 ２ 前記第１の所定反射率が視覚フィルターを用いなが
   らマグベスＲＤ−１００濃度計で測定した場合における
   約０．３０〜約０．５０濃度単位の範囲内の値に相当す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記粗面が約７００００オングストローム以下の直
   径および深さを持つたピットの形成によつて得られる、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 前記金属がチタン、タンタル、ニオブ、ジルコニウ
   ムおよびビスマスから成る群より選ばれる、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５ 前記酸化物層が陽極処理によつて生成される、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 前記陽極処理工程が五ホウ酸アンモニウム溶液中に
   おいて実施される、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 前記第２の所定反射率が視覚フィルターを用いなが
   らマグベスＲＤ−１００濃度計で測定した場合における
   約０．５０〜約０．８５濃度単位の範囲内の値に相当す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。８ 前記腐食工
   程がフッ化水素酸、硝酸および硫酸から成る群より選ば
   れた少なくとも２種の酸を含有する酸浴中において実施
   される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ 前記酸化物層の厚さが約２５０〜約３００オングス
   トロームの範囲内にある、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 １０ 前記蛋白質が抗原的に活性の物質である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １１ 粗面にされた化学的に腐食された表面領域を持つ
   た固体の金属基体、前記表面領域の酸化によつて該表面
   領域上に約１００〜約５００オングストロームの範囲の
   厚さで形成された乱反射性の酸化物層、及び前記酸化物
   層の少なくとも一部分上に付着され特定の生物学的粒子
   と特異的に反応する蛋白質層からなる、液体試料中にお
   ける前記特定の生物学的粒子の有無を検出するための器
   具。