JPS6052375B2 - 酵素活性の測定方法 - Google Patents
酵素活性の測定方法Info
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- JPS6052375B2 JPS6052375B2 JP53004638A JP463878A JPS6052375B2 JP S6052375 B2 JPS6052375 B2 JP S6052375B2 JP 53004638 A JP53004638 A JP 53004638A JP 463878 A JP463878 A JP 463878A JP S6052375 B2 JPS6052375 B2 JP S6052375B2
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は補酵素の電気化学的酸化還元を利用した酵
素活性の測定方法に関するものである。
素活性の測定方法に関するものである。
臨床化学分析における生体内の酵素活性を定量する新
規な方法の一つに、測定しようとする酵素に共役する補
酵素および基質を接触させ、その補酵素の酸化或いは還
元を利用してこれを電気的に検出する方法が開発されて
いる。 この分析方法は、試料通路内に一対の電極を設
け、この両電極間に補酵素を存在させた状態で基質およ
び酵素試料を試料通路に流し、電位を印加するようにし
たもので、酵素の存在により補酵素が基質と反応した結
果、補酵素が酸化あるいは還元され、この酸化或いは還
元型補酵素を電流の電気化学的循環作用により再び還元
或いは酸化させながら電流値の変化を読み取ることより
試料中の酵素活性の定量を行なうようにしたものである
。
規な方法の一つに、測定しようとする酵素に共役する補
酵素および基質を接触させ、その補酵素の酸化或いは還
元を利用してこれを電気的に検出する方法が開発されて
いる。 この分析方法は、試料通路内に一対の電極を設
け、この両電極間に補酵素を存在させた状態で基質およ
び酵素試料を試料通路に流し、電位を印加するようにし
たもので、酵素の存在により補酵素が基質と反応した結
果、補酵素が酸化あるいは還元され、この酸化或いは還
元型補酵素を電流の電気化学的循環作用により再び還元
或いは酸化させながら電流値の変化を読み取ることより
試料中の酵素活性の定量を行なうようにしたものである
。
しかし、上記分析方法に使用される補酵素は生体組織
外では極めて不安定な物質であり、特に溶液状態では長
期保存することが不可能であるとともに、これを試料溶
液と共に通路内に流して電極に接触させるようにした場
合には高価な補酵素を使い棄てとするため単位検体あた
りの検査コストが高価になりしかも電極感度が低いなど
の欠点があつた。 これに対し、上記補酵素をアガロー
スのビーズに固定化し、このビーズを電極近傍に浮遊さ
せ、かつこのビーズが電極から離散しないようこれを多
孔質隔膜で被覆するようにした方法も提案されているが
、上記のような方法は電極への装着が困難で取扱いが面
倒であるとともに、前述の方法と同様に補酵素自体の活
性も低いので精度のよい測定ができず、しかも可使時間
も短かい。
外では極めて不安定な物質であり、特に溶液状態では長
期保存することが不可能であるとともに、これを試料溶
液と共に通路内に流して電極に接触させるようにした場
合には高価な補酵素を使い棄てとするため単位検体あた
りの検査コストが高価になりしかも電極感度が低いなど
の欠点があつた。 これに対し、上記補酵素をアガロー
スのビーズに固定化し、このビーズを電極近傍に浮遊さ
せ、かつこのビーズが電極から離散しないようこれを多
孔質隔膜で被覆するようにした方法も提案されているが
、上記のような方法は電極への装着が困難で取扱いが面
倒であるとともに、前述の方法と同様に補酵素自体の活
性も低いので精度のよい測定ができず、しかも可使時間
も短かい。
したがつていずれの方法にあつても補酵素が不安定であ
ることおよび固定化法に問題があることがこの種の分析
方法を実用化する上での隘路となつてた。 本発明者ら
は上記のよう問題点を克服するために種々研究し、実験
を行つた結果、多孔質高分子膜に補酵素を固定化して固
定化補酵素膜を構成し、この補酵素膜で測定電極の先端
を被覆することにより上記問題点を解決し、もつて本発
明を完成するに至つた。すなわち多孔質高分子膜に補酵
素を固定化したものにあつては、強力な活性を有し、し
かも安定であるなどの特徴があり、またこの補酵素膜で
測定室内の比較電極と対向して設けられた作用電極表面
を被覆することにより分析装置の構造も簡単になり取扱
もきめて便利になるとともに、上記補酵素の特性とあい
まつて測定時間が短縮され、再現性のよい測定結果を得
ることができ、しかも耐久性、可使時間が長く、更に連
続的な測定ができる等優れた特性を有する。
ることおよび固定化法に問題があることがこの種の分析
方法を実用化する上での隘路となつてた。 本発明者ら
は上記のよう問題点を克服するために種々研究し、実験
を行つた結果、多孔質高分子膜に補酵素を固定化して固
定化補酵素膜を構成し、この補酵素膜で測定電極の先端
を被覆することにより上記問題点を解決し、もつて本発
明を完成するに至つた。すなわち多孔質高分子膜に補酵
素を固定化したものにあつては、強力な活性を有し、し
かも安定であるなどの特徴があり、またこの補酵素膜で
測定室内の比較電極と対向して設けられた作用電極表面
を被覆することにより分析装置の構造も簡単になり取扱
もきめて便利になるとともに、上記補酵素の特性とあい
まつて測定時間が短縮され、再現性のよい測定結果を得
ることができ、しかも耐久性、可使時間が長く、更に連
続的な測定ができる等優れた特性を有する。
本発明の測定方法は、測定室内に比較電極と作用電極を
設け、この作用電極表面を、多孔質高分子膜に補酵素を
固定化してなる固定化補酵素膜で被覆するとともに、上
記測定室内に被測定試料および基質を導入し、これらを
上記補酵素膜に接触せしめて酵素反応を行なわせ、この
結果上記被測定試料中の酵素の作用により基質と反応し
て酸化型あるいは還元型になつた補酵素を電気化学的に
循環させ、その時の酸化または還元電流を測定すること
により、上記被測定試料中の酵素活性を定量とするもの
で、先ず、上記測定方法に用いられる分析装置について
説明する。
設け、この作用電極表面を、多孔質高分子膜に補酵素を
固定化してなる固定化補酵素膜で被覆するとともに、上
記測定室内に被測定試料および基質を導入し、これらを
上記補酵素膜に接触せしめて酵素反応を行なわせ、この
結果上記被測定試料中の酵素の作用により基質と反応し
て酸化型あるいは還元型になつた補酵素を電気化学的に
循環させ、その時の酸化または還元電流を測定すること
により、上記被測定試料中の酵素活性を定量とするもの
で、先ず、上記測定方法に用いられる分析装置について
説明する。
第１図はこの発明を実施するための分析装置を示し、こ
の分析装置は比較電極プロツク１と作用電極プロツク２
を対向位置させ、この両プロツク１，２間に間隔を設け
て試料通路３を形成し、この両プロツク１，２をビス４
で気密に固着したものである。
の分析装置は比較電極プロツク１と作用電極プロツク２
を対向位置させ、この両プロツク１，２間に間隔を設け
て試料通路３を形成し、この両プロツク１，２をビス４
で気密に固着したものである。
上記比較電極プロツク１には上記試料通路３と連通する
入口側ポート５、及び出口側ポート６が形成されている
。
入口側ポート５、及び出口側ポート６が形成されている
。
そして上記各ポート５，６には供給および排出径路７，
８が接続されているとともに、その供給側７には試料タ
ンク９及び基質を含む緩衝液を収容するめのタンク１０
が設けられ、これら各タンク９，１０内の被測定試料及
び緩衝液は三方コツク１１により混合切換可能にされて
いる。
８が接続されているとともに、その供給側７には試料タ
ンク９及び基質を含む緩衝液を収容するめのタンク１０
が設けられ、これら各タンク９，１０内の被測定試料及
び緩衝液は三方コツク１１により混合切換可能にされて
いる。
また排出側８には定量ポンプ１２が配置され、このポン
プ１２によつて試料及び緩衝液を試料通路３に定速で流
通させるようにしている。上記各ポート５，６間には比
較電極１５が設けられている。
プ１２によつて試料及び緩衝液を試料通路３に定速で流
通させるようにしている。上記各ポート５，６間には比
較電極１５が設けられている。
この比較電極１５は試料通路側に向けて開口された開口
部１６に配設された透析膜或いはセラミツク隔膜等から
なる多孔性部材１７と、この開口部１６に封入された電
解液１８と、この電解液１８内部にＡｇ−ＡｇＣｌ電極
１９を挿入してなるもので、これにキヤツプ２０を冠し
て電解液１８の漏洩を防止するようにしている。上記比
較電極１５と対向して作用電極プロツク２には作用電極
２１が設けられている。この作用電極２１は作用電極プ
ロツク２に埋設された銅板２２の表面に貼着されたグラ
シーカーボンのプレート２３を備えている。
部１６に配設された透析膜或いはセラミツク隔膜等から
なる多孔性部材１７と、この開口部１６に封入された電
解液１８と、この電解液１８内部にＡｇ−ＡｇＣｌ電極
１９を挿入してなるもので、これにキヤツプ２０を冠し
て電解液１８の漏洩を防止するようにしている。上記比
較電極１５と対向して作用電極プロツク２には作用電極
２１が設けられている。この作用電極２１は作用電極プ
ロツク２に埋設された銅板２２の表面に貼着されたグラ
シーカーボンのプレート２３を備えている。
そしてこのプレート２３の通路対向面側は後述の補酵素
を多孔質高分子膜で固定化してなる固定化補酵素膜２４
で被覆されてり、かつこの周縁をＯ−リング２５で固定
することにより、この補酵素膜２４をプレート２３に密
着させている。また２６は両電極１５，２１の端部とリ
ード線２７を介して接続し、両電極１５，２１間に電圧
を印加するとともに、この電流値の変化を測定する測定
器である。
を多孔質高分子膜で固定化してなる固定化補酵素膜２４
で被覆されてり、かつこの周縁をＯ−リング２５で固定
することにより、この補酵素膜２４をプレート２３に密
着させている。また２６は両電極１５，２１の端部とリ
ード線２７を介して接続し、両電極１５，２１間に電圧
を印加するとともに、この電流値の変化を測定する測定
器である。
よつて本装置を用いて試料の定量分析を行うには、両電
極９，１３間に電圧を印加しておきながら三方コツク１
１を開いて被測定試料を緩衝液とともに試料通路３内に
通過させる。
極９，１３間に電圧を印加しておきながら三方コツク１
１を開いて被測定試料を緩衝液とともに試料通路３内に
通過させる。
この試料中に酵素が存在すればこの酵素は緩衝液中の基
質と補酵素との反応を促進し、補酵素を酸化型或いは還
元型のものに変化させるが、この補酵素は電気化学的循
環作用により再び元の型に変化する。そして基質と補酵
素は一定のフアクタ一となつているから、この時の電流
値の変化を測定器２６で読み取ることにより試料中の酵
素活性を定量できるのである。また上記分析装置を使用
した測定方法における酵素に対する感度・安定性および
再現性は固定化補酵素膜の活性および安定性に依存する
ものであるが、次にこの補酵素膜について更に詳細に説
明する。
質と補酵素との反応を促進し、補酵素を酸化型或いは還
元型のものに変化させるが、この補酵素は電気化学的循
環作用により再び元の型に変化する。そして基質と補酵
素は一定のフアクタ一となつているから、この時の電流
値の変化を測定器２６で読み取ることにより試料中の酵
素活性を定量できるのである。また上記分析装置を使用
した測定方法における酵素に対する感度・安定性および
再現性は固定化補酵素膜の活性および安定性に依存する
ものであるが、次にこの補酵素膜について更に詳細に説
明する。
上記補酵素膜は、再生セルロース、セルロースエステル
等セルロース系の多孔質高分子膜に補酵素を化学的に結
合したものである。
等セルロース系の多孔質高分子膜に補酵素を化学的に結
合したものである。
この場合単に物理的に吸着させるよりも上記高分子膜の
もつ官能基を利用して化学的に共有結合させる方法や、
架橋剤を用いて架橋させる方法およびこれら方法の組合
せが補酵素の活性上有利である。
もつ官能基を利用して化学的に共有結合させる方法や、
架橋剤を用いて架橋させる方法およびこれら方法の組合
せが補酵素の活性上有利である。
固定化する補酵素としては、測定しようとする酵素と共
役して基質と酵素反応を行う補酵素、すなわち被測定物
がＧＤＨ（グルコース脱水素酵素）、ＬＤＨ（乳酸脱水
素酵素）の場合にはＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニン
デイヌクレオチド）およびその還元型であるＮＡＤＨを
、ＩＣＤＨ（イソクエン酸脱水素酵素）、Ｇ−６−ＰＤ
（グルコース一６−リン酸脱水素酵素）に対してはＮＡ
ＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンデイヌクレオチドフオ
スフエイト）およびその還元型であるＮＡＤＰＨを使用
でき、更にＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＦＡ
Ｄ（フラピンアデニンデイヌクレオチド）等も夫々の酵
素に対応して使用できる。
役して基質と酵素反応を行う補酵素、すなわち被測定物
がＧＤＨ（グルコース脱水素酵素）、ＬＤＨ（乳酸脱水
素酵素）の場合にはＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニン
デイヌクレオチド）およびその還元型であるＮＡＤＨを
、ＩＣＤＨ（イソクエン酸脱水素酵素）、Ｇ−６−ＰＤ
（グルコース一６−リン酸脱水素酵素）に対してはＮＡ
ＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンデイヌクレオチドフオ
スフエイト）およびその還元型であるＮＡＤＰＨを使用
でき、更にＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＦＡ
Ｄ（フラピンアデニンデイヌクレオチド）等も夫々の酵
素に対応して使用できる。
したがつてこれら補酵素は分析しようとする目的の酵素
に対応して任意に選択できる。次に上記補酵素を多孔質
高分子膜に固定する場合の具体的な一例を説明する。
に対応して任意に選択できる。次に上記補酵素を多孔質
高分子膜に固定する場合の具体的な一例を説明する。
なお補酵素と多孔質高分子との反応時間、温度等は特に
限定されるものでないが、通常補酵素が−失活しない範
囲内で行われる。
限定されるものでないが、通常補酵素が−失活しない範
囲内で行われる。
製法例
（１）再生セルロース膜またはセルロースエステル膜を
活性化するために約５０℃のＩＭ−メタ過ヨウ素酸ナト
リウム溶液中に３時間浸漬し、反応させる。
活性化するために約５０℃のＩＭ−メタ過ヨウ素酸ナト
リウム溶液中に３時間浸漬し、反応させる。
反応後純水で洗浄する。（２）また上記（１）以外の活
性化法としては、約５％のブロムシアン溶液中に膜を浸
し、１紛〜１時間反応させる。
性化法としては、約５％のブロムシアン溶液中に膜を浸
し、１紛〜１時間反応させる。
この時溶液には高濃度の水酸化ナトリウムを加えてＰＨ
ｌｌ〜１２に保つとともに反応温度が３０℃を越えない
ようにする。反応後上記膜をすばやく純水で洗浄する。
（３） （１）または（２）の工程で得た膜に架橋剤を
付加する。
ｌｌ〜１２に保つとともに反応温度が３０℃を越えない
ようにする。反応後上記膜をすばやく純水で洗浄する。
（３） （１）または（２）の工程で得た膜に架橋剤を
付加する。
この架橋剤としてはＮＨ２・ （ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２の
化学式で示されるジアミン類や、ＮＨ２・ＮＨ４ｅＯＣ
● （ＣＨ２）ｎ●ＣＯ●ＮＨＩＮＨ２で示されるジヒ
ドラジド類のうち最適なものを選び、大過剰液を作成し
、｛１）または（２）の工程で活性化した膜をこれに漬
し、４℃長時間反応させれば、上記架橋剤の一端側官能
基が膜表面の活性化部分に結合する。
化学式で示されるジアミン類や、ＮＨ２・ＮＨ４ｅＯＣ
● （ＣＨ２）ｎ●ＣＯ●ＮＨＩＮＨ２で示されるジヒ
ドラジド類のうち最適なものを選び、大過剰液を作成し
、｛１）または（２）の工程で活性化した膜をこれに漬
し、４℃長時間反応させれば、上記架橋剤の一端側官能
基が膜表面の活性化部分に結合する。
（４）上記反応終了後、膜を０．？塩化ナトリウム溶液
で洗浄、保存する。
で洗浄、保存する。
｛５）補酵素液の調整。
ＮＡＤまたはその還元型のＮＡＤＨｌあるいはＮＡＤＰ
またはその還元型のＮＡＤＰＨを中性の冷溶液に０．０
１〜０．０′２Ｍの濃度で溶解し、これにメタ過ヨウ素
酸ナトリウムを０．０１〜０．０２Ｍに加え、０℃１時
間暗所で反応させる。
またはその還元型のＮＡＤＰＨを中性の冷溶液に０．０
１〜０．０′２Ｍの濃度で溶解し、これにメタ過ヨウ素
酸ナトリウムを０．０１〜０．０２Ｍに加え、０℃１時
間暗所で反応させる。
（６）この補酵素液に（１）〜｛４）の工程で得た膜を
浸漬し、４℃３時間以上反応させれば、膜に結合した架
橋剤の他端側官能基に補酵素が結合する。
浸漬し、４℃３時間以上反応させれば、膜に結合した架
橋剤の他端側官能基に補酵素が結合する。
なおこの時の溶液の液性は緩衝液を加えてＰＨ５に調製
しておく。（７）反応終了後？塩化ナトリウム溶液で洗
浄すれば固定化補酵素膜を得る。
しておく。（７）反応終了後？塩化ナトリウム溶液で洗
浄すれば固定化補酵素膜を得る。
次に上記製法例で得た固定化補酵素膜を上記実施例で得
た作用電極にセツトし、これを用いた具体的な定量方法
についてその実施例を詳細に説明する。
た作用電極にセツトし、これを用いた具体的な定量方法
についてその実施例を詳細に説明する。
実施例 １
ＧＤＨの測定
緩衝液は酵素反応に最適なＰＨに調整し、かつ基質とし
て上記ＧＤＨの存在下で補酵素と反応するグルコースを
最適濃度となるよう上記緩衝液中に混合、調製してタン
ク１０内に収容しておく。
て上記ＧＤＨの存在下で補酵素と反応するグルコースを
最適濃度となるよう上記緩衝液中に混合、調製してタン
ク１０内に収容しておく。
また補酵素膜２４には上記製法例で得た上記ＧＤＨと共
役して酵素反応を行うＮＡＤまたはその還元型のＮＡＤ
Ｈを多孔質高分子膜に固定化したものを用い、これを作
用電極２１に第１図に示すようにセツトする。そして作
用電極２１側を（＋）に、比較電極１５側を（−）とし
て夫々測定器２６に接続し、両電極１５，２１間に＋０
．５Ｖ〜＋１．０Ｖの電圧を印加しておく。
役して酵素反応を行うＮＡＤまたはその還元型のＮＡＤ
Ｈを多孔質高分子膜に固定化したものを用い、これを作
用電極２１に第１図に示すようにセツトする。そして作
用電極２１側を（＋）に、比較電極１５側を（−）とし
て夫々測定器２６に接続し、両電極１５，２１間に＋０
．５Ｖ〜＋１．０Ｖの電圧を印加しておく。
このとき補酵素膜２４中の補酵素は両電極間の電気化学
的循環作用によつて酸化型ＮＡＤ＋となつている。また
測定を行う前には三方コツク１１を緩衝液側タンク１０
側に切換え、ポンプ１２を作動して予め緩衝液を試料通
路３内に定速で流通させ、両電極間の電位を安定させて
おく。
的循環作用によつて酸化型ＮＡＤ＋となつている。また
測定を行う前には三方コツク１１を緩衝液側タンク１０
側に切換え、ポンプ１２を作動して予め緩衝液を試料通
路３内に定速で流通させ、両電極間の電位を安定させて
おく。
次に三方コツク１１を切換えて上記緩衝液ととＢもに被
測定試料を通路３内に導入する。
測定試料を通路３内に導入する。
この測定試料中の酵素および緩衝液中のグルコースは補
酵素膜２４に接触して以下の反応を行う。
酵素膜２４に接触して以下の反応を行う。
式１
グルコース＋Ｎ７Ｖ）＋９ρ月ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋グノレ
コノラクトンこの反応による還元型のＮＡＤＨは電極１
５，２１の電気化学的循環作用によつて再び酸化されＮ
ＡＤ＋に変化する。
コノラクトンこの反応による還元型のＮＡＤＨは電極１
５，２１の電気化学的循環作用によつて再び酸化されＮ
ＡＤ＋に変化する。
式２
従つてこの時の酸化電流の値を読み取ることにより測定
試料中の活竹ρＤＨの量を知ることがで．：第２図は上
記方法により各種濃度のＩＣＤＨの測定を同一装置を用
いて行いその結果を検量線に作成したもので縦軸には電
流値（μＡ）を、横軸にはＩＣＤＨの濃度（１−Ｕ／ｍ
ｌ）が示されている。
試料中の活竹ρＤＨの量を知ることがで．：第２図は上
記方法により各種濃度のＩＣＤＨの測定を同一装置を用
いて行いその結果を検量線に作成したもので縦軸には電
流値（μＡ）を、横軸にはＩＣＤＨの濃度（１−Ｕ／ｍ
ｌ）が示されている。
実施例 ３Ｇ−６−ＰＤの測定
緩衝液中の基質としてグルコン酸−６リン酸ラクトンを
、補酵素膜として上記Ｇ−６−ＰＤと共役するＮＡＤＰ
またはその還元型のＮＡＤＰＨを多孔質高分子膜に固定
化した補酵素膜を用いる。
、補酵素膜として上記Ｇ−６−ＰＤと共役するＮＡＤＰ
またはその還元型のＮＡＤＰＨを多孔質高分子膜に固定
化した補酵素膜を用いる。
そして上記実施例１，２とは逆に両電極１５，２１間に
−１．０〜−２．５Ｖの電圧を印加しておく。したがつ
て補酵素は通常還元型のＮＡＤＰＨとなつている。後は
実施例１，２と同様の操作により測定試料および緩衝液
を試料通路３内に導入すれば測定試料中のＧ−６ＰＤの
存在により、ＮＡＤＰＨはグルコン酸−６リン酸ラクト
ンと以下のように反応するとともに、電気化学的循環を
行う。
−１．０〜−２．５Ｖの電圧を印加しておく。したがつ
て補酵素は通常還元型のＮＡＤＰＨとなつている。後は
実施例１，２と同様の操作により測定試料および緩衝液
を試料通路３内に導入すれば測定試料中のＧ−６ＰＤの
存在により、ＮＡＤＰＨはグルコン酸−６リン酸ラクト
ンと以下のように反応するとともに、電気化学的循環を
行う。
式４
式５
従つてこのときの還元電流の値を読み取ることよる被測
定試料中の活性Ｇ−６−ＰＤの量を知ることができる。
定試料中の活性Ｇ−６−ＰＤの量を知ることができる。
実施例 ４１Ｊ）Ｈの測定
実施例３の測定条件と同じであるが、基質としてはピル
ビン酸を、補酵素としてはＮＡＤまたは８きる。
ビン酸を、補酵素としてはＮＡＤまたは８きる。
実施例 ２
ＩＣＤＨの測定
実施例１のＧＤＨの測定条件、方法と同じであるが、緩
衝液中の基質としてはイソクエン酸を、補酵素膜に用い
る補酵素として上記製法例て得たＩＣＤＨと共役するＮ
ＡＤＰまたはその還元型のＮＡＤＰＨを使用する。
衝液中の基質としてはイソクエン酸を、補酵素膜に用い
る補酵素として上記製法例て得たＩＣＤＨと共役するＮ
ＡＤＰまたはその還元型のＮＡＤＰＨを使用する。
その反応式を下記に示す。式３その還元型のＮＡＤＨを
多孔質高分子膜に固定化した。
多孔質高分子膜に固定化した。
補酵素を用いる。その反応式を下記に示す。式６
−ーー一第３図は上記方法より各種濃度のＬＩ）Ｈを
測定し、検量線を作成したもので、縦軸には電流値（Ｎ
Ａ）を、横軸にはＬＤＨの濃度（１−Ｕ／ｍｌ）がｌ示
されている。
−ーー一第３図は上記方法より各種濃度のＬＩ）Ｈを
測定し、検量線を作成したもので、縦軸には電流値（Ｎ
Ａ）を、横軸にはＬＤＨの濃度（１−Ｕ／ｍｌ）がｌ示
されている。
上記各実施例１，２，３，４において電流値と試料濃度
は第２図、第３図からも明らかなようにかなり広範囲に
わたつて直線的な比較例関係となり、極めて良好な測定
結果を得た。
は第２図、第３図からも明らかなようにかなり広範囲に
わたつて直線的な比較例関係となり、極めて良好な測定
結果を得た。
そしてこのことは上記固定化補酵素の活性が極めて高く
、かつ安定性があることを示唆するものであるとともに
、電極に密着した状態で電気化学的循環作用を行うため
酵素に対する感度が極めて高いことを示すものである。
、かつ安定性があることを示唆するものであるとともに
、電極に密着した状態で電気化学的循環作用を行うため
酵素に対する感度が極めて高いことを示すものである。
更に本発明による分析方法は補酵素の繰返し使用ができ
るので経済的であるとともに、緩衝液を流しながら試料
を注入するだけで迅速かつ連続的な分析ができるので操
作も簡単て測定時間も著しく短縮できる。また一回測定
後の洗浄も三方コツクを緩衝液側に切換るだけて簡単に
行え、洗浄性も良好である。なお、各実施例では補酵素
としてＮＡＤ，ＮＡＤＰを使用してなるものであるが、
他の酸化還元型酵素と共役して水素の授受を行う補酵素
、例えばＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＦＡＤ
（フラピンアテニンデイヌクレオチド）等の補酵素でも
上記実施例と同様な効果を得られることは言うまでもな
い。
るので経済的であるとともに、緩衝液を流しながら試料
を注入するだけで迅速かつ連続的な分析ができるので操
作も簡単て測定時間も著しく短縮できる。また一回測定
後の洗浄も三方コツクを緩衝液側に切換るだけて簡単に
行え、洗浄性も良好である。なお、各実施例では補酵素
としてＮＡＤ，ＮＡＤＰを使用してなるものであるが、
他の酸化還元型酵素と共役して水素の授受を行う補酵素
、例えばＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＦＡＤ
（フラピンアテニンデイヌクレオチド）等の補酵素でも
上記実施例と同様な効果を得られることは言うまでもな
い。
第１図はこの発明を実施するため分析装置の概略を示す
断面図、第２図、第３図は夫々ＩＣＤＨ，ＬＤＨの濃度
と電流値との関係を示すグラフである。
断面図、第２図、第３図は夫々ＩＣＤＨ，ＬＤＨの濃度
と電流値との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- １ 測定室内に比較電極と作用電極を設け、この作用電
極表面を、多孔質高分子膜に補酵素を固定化してなる固
定化補酵素膜で被覆するとともに、上記測定室内に被測
定試料および基質を導入し、これらを上記補酵素膜に接
触せしめて酵素反応を行なわせ、この結果上記被測定試
料中の酵素が基質と反応することより酸化型あるいは還
元型になつた補酵素を電気化学的に循環させ、その時の
酸化または還元電流を測定することより上記被測定試料
中の酵素活性を定量するようにした酵素活性の測定方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53004638A JPS6052375B2 (ja) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | 酵素活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53004638A JPS6052375B2 (ja) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | 酵素活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5497491A JPS5497491A (en) | 1979-08-01 |
| JPS6052375B2 true JPS6052375B2 (ja) | 1985-11-19 |
Family
ID=11589532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53004638A Expired JPS6052375B2 (ja) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | 酵素活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6052375B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56107154A (en) * | 1979-12-04 | 1981-08-25 | Technicon Instr | Produced articles and enzyme activity measuring method* enzyme reaction control method* analyzer* reactor* automatic electrochemical analyzer* and thin film enzyme measuring sensor |
| JPS6126851A (ja) * | 1984-07-17 | 1986-02-06 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | グルコ−スの自動測定方法及びその装置 |
-
1978
- 1978-01-19 JP JP53004638A patent/JPS6052375B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5497491A (en) | 1979-08-01 |
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