JPS605900B2 - 抗原性物質の定量法 - Google Patents
抗原性物質の定量法Info
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- JPS605900B2 JPS605900B2 JP51040908A JP4090876A JPS605900B2 JP S605900 B2 JPS605900 B2 JP S605900B2 JP 51040908 A JP51040908 A JP 51040908A JP 4090876 A JP4090876 A JP 4090876A JP S605900 B2 JPS605900 B2 JP S605900B2
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- Japan
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗原怪物質（但し、免疫グロプリンおよびァル
プミンは除く）の定量法に関するものであり、特に臨床
検査の上では先天性異常症、腎炎、貧血などの重症度の
判定、その他の疾患との鑑別に必要な血清蛋白質を迅速
かつ精度よく判定する為の定量法の発明である。
プミンは除く）の定量法に関するものであり、特に臨床
検査の上では先天性異常症、腎炎、貧血などの重症度の
判定、その他の疾患との鑑別に必要な血清蛋白質を迅速
かつ精度よく判定する為の定量法の発明である。
一般に用いられている血清蛋白質の定量法としは、一元
平板免疫拡散法または試験管内単純拡散法の二つがある
。
平板免疫拡散法または試験管内単純拡散法の二つがある
。
これらの方法はいずれもゲル内拡散法を応用したもので
ある。一元平板免疫拡散法は、特異抗血清を含む寒天平
板の小孔に一定量の抗原（血清）を加え、一定の時間と
温度下におくと抗原はゲル内の抗体と反応しつつ拡散し
て小孔のまわりに白い沈降論を作る。
ある。一元平板免疫拡散法は、特異抗血清を含む寒天平
板の小孔に一定量の抗原（血清）を加え、一定の時間と
温度下におくと抗原はゲル内の抗体と反応しつつ拡散し
て小孔のまわりに白い沈降論を作る。
その論の直径を測定し抗原量を定量する方法である。ま
た、一方の試験管内単純拡散法は、抗血清を寒天でゲル
化し、ガラス管につめ、その上に抗原（血清）を童層し
て抗原抗体反応により沈降物を生起せしめる。
た、一方の試験管内単純拡散法は、抗血清を寒天でゲル
化し、ガラス管につめ、その上に抗原（血清）を童層し
て抗原抗体反応により沈降物を生起せしめる。
この場合沈降物はゲル内を移動しないが抗原過剰の状態
で解離し、さらに抗散した抗原が抗体と沈降物を作る。
こうして沈降線は鮮明な前線を保ちつつ抗体ゲル層中を
進行する。抗原と抗体が最適比となったところで沈降帯
が形成されるので、その拡散距離を測定することにより
抗原量を測定する方法である。しかし、これらいずれの
方方法も拡散や完全な沈降反応を起させるために長時間
、少くても１〜２日を必要とし、スケールを越えた抗原
量の場合にさらに１〜２日間もかかる。
で解離し、さらに抗散した抗原が抗体と沈降物を作る。
こうして沈降線は鮮明な前線を保ちつつ抗体ゲル層中を
進行する。抗原と抗体が最適比となったところで沈降帯
が形成されるので、その拡散距離を測定することにより
抗原量を測定する方法である。しかし、これらいずれの
方方法も拡散や完全な沈降反応を起させるために長時間
、少くても１〜２日を必要とし、スケールを越えた抗原
量の場合にさらに１〜２日間もかかる。
またその測定も直径をルーペ等によって肉眼で読みとる
ために誤差を生じるという欠点があった。また、濁度計
を用いる方法も考えられているが、それは抗原量と沈降
物量との相関性を利用するものであるが、一般には抗原
抗体反応による沈降反応は抗体量を一定としたとき、抗
原量と沈降物量との間には第１図に示すような曲線で表
わされる関係があることが知られている。
ために誤差を生じるという欠点があった。また、濁度計
を用いる方法も考えられているが、それは抗原量と沈降
物量との相関性を利用するものであるが、一般には抗原
抗体反応による沈降反応は抗体量を一定としたとき、抗
原量と沈降物量との間には第１図に示すような曲線で表
わされる関係があることが知られている。
そのために同一沈降物量Ａで算出される抗原量は、実際
には抗原不足域Ｘと抗原過剰城Ｙと測定点が二点存在す
ることになり、得られた値についての確認がさらに必要
になり多数の検体を正確に測定できる方法としては採用
し得ない。本発明者らは、これらの欠点を補うべく種々
研究した結果、あらかじめ各種抗原について、それぞれ
対応する一定量の抗体に対して抗原抗体反応沈降物量が
最大となるために必要な抗原量（以下「最適比量」とい
う）を求めておき、この量の抗原を反応系に加えて抗原
抗体反応を行なわせることにより濁度計から読みとれる
沈降物量から直接検体中の抗原量を知ることが可能とな
ることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成した
。
には抗原不足域Ｘと抗原過剰城Ｙと測定点が二点存在す
ることになり、得られた値についての確認がさらに必要
になり多数の検体を正確に測定できる方法としては採用
し得ない。本発明者らは、これらの欠点を補うべく種々
研究した結果、あらかじめ各種抗原について、それぞれ
対応する一定量の抗体に対して抗原抗体反応沈降物量が
最大となるために必要な抗原量（以下「最適比量」とい
う）を求めておき、この量の抗原を反応系に加えて抗原
抗体反応を行なわせることにより濁度計から読みとれる
沈降物量から直接検体中の抗原量を知ることが可能とな
ることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成した
。
すなわち本発明は「被検抗原およびその抗体からなる抗
原抗体反応の反応系に、最適比量を少し越した量の抗原
を共存せしめて抗原抗体反応を行なわせ、生成した抗原
抗体反応沈降物量を比濁法により測定することからなる
抗原性物質（但し、免疫グロプリンおよびアルブミンを
除く）の定量法である。本発明において「最適比量を少
し越した量」とは第１図において沈降物生成量が最大で
あるときの抗原量（最適比量）Ｚを少し越した量であっ
て沈降物生成量が減少いまじめるときの抗原量を指す。
原抗体反応の反応系に、最適比量を少し越した量の抗原
を共存せしめて抗原抗体反応を行なわせ、生成した抗原
抗体反応沈降物量を比濁法により測定することからなる
抗原性物質（但し、免疫グロプリンおよびアルブミンを
除く）の定量法である。本発明において「最適比量を少
し越した量」とは第１図において沈降物生成量が最大で
あるときの抗原量（最適比量）Ｚを少し越した量であっ
て沈降物生成量が減少いまじめるときの抗原量を指す。
本発明でいう抗原性物質とは、抗体を作ることのできる
物質であり、例えば補体成分「パプトグロビン、トラン
スフエリン、ば，一アンチトリプシンなどの血清蛋白質
である。
物質であり、例えば補体成分「パプトグロビン、トラン
スフエリン、ば，一アンチトリプシンなどの血清蛋白質
である。
本発明によれば、第１図に示すように抗原過剰城Ｚ以上
の曲線のみを使用することにより、各検体について濃度
変動をとる必要なく、その上従来行なわれていた抗原不
足域Ｘを利用した方法より検出感度が非常に良好である
。
の曲線のみを使用することにより、各検体について濃度
変動をとる必要なく、その上従来行なわれていた抗原不
足域Ｘを利用した方法より検出感度が非常に良好である
。
本発明を実施するに当っては、まず「各種抗原性物質に
対する抗体原液を緩衝液例えばリン酸塩緩衝液、トリス
緩衝液、ベロナール緩衝液を含む生理食塩水で抗体力価
に応じて希釈する。
対する抗体原液を緩衝液例えばリン酸塩緩衝液、トリス
緩衝液、ベロナール緩衝液を含む生理食塩水で抗体力価
に応じて希釈する。
また、抗原性物質は、上記希釈抗体に対して最適比量を
少し越した量になるように緩衝液で希釈する。さらに、
測定する検体も測定範囲内濃度になるように緩衝液で希
釈する。次いで、希釈された検体、最適比量を少し越し
た抗原性物質および抗体を混合し直ちに濁度を測定する
。
少し越した量になるように緩衝液で希釈する。さらに、
測定する検体も測定範囲内濃度になるように緩衝液で希
釈する。次いで、希釈された検体、最適比量を少し越し
た抗原性物質および抗体を混合し直ちに濁度を測定する
。
（０時間測定値。検体の希釈倍率によっては、その濁り
を無視できる場合があり、その時は０時間測定する必要
ない。）その後ト１０〜４０００好ましくは２０〜３７
Ｃで一定時間放置後再び濁度を測定し、その差を真の抗
原抗体反応による濁度とする。このようにして得られた
値をあらかじめ各抗原性物質について各濃度の標準液に
ついて同機に濁度計で測定し作成された検量線から読み
取り検体中の抗原性物質量を迅速にかつ精度よく求める
ことができる。
を無視できる場合があり、その時は０時間測定する必要
ない。）その後ト１０〜４０００好ましくは２０〜３７
Ｃで一定時間放置後再び濁度を測定し、その差を真の抗
原抗体反応による濁度とする。このようにして得られた
値をあらかじめ各抗原性物質について各濃度の標準液に
ついて同機に濁度計で測定し作成された検量線から読み
取り検体中の抗原性物質量を迅速にかつ精度よく求める
ことができる。
濃た、本発明の方法を実際に用いるに当っては、次のよ
うな試薬キットにするとよい。
うな試薬キットにするとよい。
すなわち、｛ａー 検体を希釈するための緩衝液
‘ｂ｝ 至適量の抗原
‘ｃ｝ 抗原抗体反応に適当な濃度の抗体液‘ｄー 既
知量の抗原を含む各種濃度の標準抗原液をそれぞれの抗
原性物質について１セットとして取揃えることにより、
また、複数種の抗原性物質の測定用上記セットを同時に
組込むことによって使用者は所望のキットを選択し簡便
に同一検体について複数の抗原性物質を同時に測定する
ことも可能となる。
知量の抗原を含む各種濃度の標準抗原液をそれぞれの抗
原性物質について１セットとして取揃えることにより、
また、複数種の抗原性物質の測定用上記セットを同時に
組込むことによって使用者は所望のキットを選択し簡便
に同一検体について複数の抗原性物質を同時に測定する
ことも可能となる。
次に後述の実施例１および２における「最適比量を少し
越した量」の定め方を代表例として、本発明における「
最適比量を少し越した量」の定め方を「参考例」で説明
する。
越した量」の定め方を代表例として、本発明における「
最適比量を少し越した量」の定め方を「参考例」で説明
する。
抗原濃度が各々５，７，９，１１，１２，１３，１４，
１５，１７および１９仏夕／血はとなるように濃度変化
させたトランスフェリン液に、それぞれリン酸塩緩衝液
で６Ｍ音‘こ希釈した抗トランスフェリン抗体液１．０
の‘を加えて総量を２．０舷とし、３７００で約６０分
間インキュベートした。
１５，１７および１９仏夕／血はとなるように濃度変化
させたトランスフェリン液に、それぞれリン酸塩緩衝液
で６Ｍ音‘こ希釈した抗トランスフェリン抗体液１．０
の‘を加えて総量を２．０舷とし、３７００で約６０分
間インキュベートした。
各抗原濃度における抗原抗体反応沈降物の生成量を濁度
計で測定し、その中での最大値を１００としたときの割
合（沈降生成率）を第６図の如くグラフに表わした。こ
のグラフにおいて、沈降生成率１００のときの抗原量１
３仏夕／ｔゆｅが最適比量であり、「最適比量を少し越
した量」とは、沈降生成率が降下しはじめるときの抗原
量「 つまり１４ムタ／ｔｕ戊とした。尚、「最適比量
を少し越した量」は抗体によって異なるので、抗体が変
わる毎に定める必要がある。次に実施例を挙げて説明す
る。
計で測定し、その中での最大値を１００としたときの割
合（沈降生成率）を第６図の如くグラフに表わした。こ
のグラフにおいて、沈降生成率１００のときの抗原量１
３仏夕／ｔゆｅが最適比量であり、「最適比量を少し越
した量」とは、沈降生成率が降下しはじめるときの抗原
量「 つまり１４ムタ／ｔｕ戊とした。尚、「最適比量
を少し越した量」は抗体によって異なるので、抗体が変
わる毎に定める必要がある。次に実施例を挙げて説明す
る。
実施例 １
トランスフェリン１４〃タ含有する０．００１Ｍ−リン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘「最適比量を少
し越した量」に、濃度変化させたトランスフェリン液０
．０５私を添加し、０．０１Ｍ−リン酸塩緩衝液（餌７
．４）を含む生理食塩水で６ぴ部こ希釈した抗体１．０
の‘を加え総量２．０泌とし３７こ０で６０分後にその
濠度を測定すると第２図に示すような、添加トランスフ
ェリンと沈降物量（濁度）との相関が求められた。
酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘「最適比量を少
し越した量」に、濃度変化させたトランスフェリン液０
．０５私を添加し、０．０１Ｍ−リン酸塩緩衝液（餌７
．４）を含む生理食塩水で６ぴ部こ希釈した抗体１．０
の‘を加え総量２．０泌とし３７こ０で６０分後にその
濠度を測定すると第２図に示すような、添加トランスフ
ェリンと沈降物量（濁度）との相関が求められた。
実施例 ２
ヒト血清３０検体を０．００１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）を含む生理食塩水でそれぞれ２０倍に希釈し、
その各３０ｒ〆を試験管に探り、さらに１．０の‘のト
ランスフェリン液（１４ｒタ相当量）を加え混合する。
７．４）を含む生理食塩水でそれぞれ２０倍に希釈し、
その各３０ｒ〆を試験管に探り、さらに１．０の‘のト
ランスフェリン液（１４ｒタ相当量）を加え混合する。
それぞれに１．０の‘の６針音希釈抗体液を加えて３７
ｑ０で反応せしめる。６０分後に濁度計で測定して得ら
れた濁度から実施例１で求めたグラフよりヒト血清中の
トランスフヱリン量が測定され、その平均値は２９１の
９／ｄ‘であった。
ｑ０で反応せしめる。６０分後に濁度計で測定して得ら
れた濁度から実施例１で求めたグラフよりヒト血清中の
トランスフヱリン量が測定され、その平均値は２９１の
９／ｄ‘であった。
これは健康人の平均値に一致している。また、ここで用
いたヒト血清から１検体を任意にとりだし、これに既知
量のトランスフェリンを添加し上記と同様に測定し、そ
の回収率を調べた結果、高い回収率が得られた。
いたヒト血清から１検体を任意にとりだし、これに既知
量のトランスフェリンを添加し上記と同様に測定し、そ
の回収率を調べた結果、高い回収率が得られた。
実施例 ３
ハブトグロビン１５ムタ含有する０．００１Ｍ−リン酸
塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘「最適比量を少し
越した量」に濃度変化させたハプトグロビン液０．０５
の‘を添加し、０．００１Ｍ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７
．４）を含む生理食塩水で２０倍に希釈した抗体１．０
の‘を加え総量２．０泌とし３７００で６０分後にその
濁度を測定すると第３図に示すような添加ハフ。
塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘「最適比量を少し
越した量」に濃度変化させたハプトグロビン液０．０５
の‘を添加し、０．００１Ｍ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７
．４）を含む生理食塩水で２０倍に希釈した抗体１．０
の‘を加え総量２．０泌とし３７００で６０分後にその
濁度を測定すると第３図に示すような添加ハフ。
トグロビンと沈降物量（濁度）との相関が求められた。
また、実施例２と同様にして回収率を調べた結果、高い
回収率が得られた。実施例 ４ 補体の第３成分に３１８〃タ含有する０．００１Ｍ−リ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５叫「最適比量を少
し越した量」に、濃度変化させた補体の第３成分Ｃ３液
０．０５の‘を添加し、０．００１Ｍ−リン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で２ぴ部こ希釈した抗
体１．０の‘を加え総量２．０の上とし３７０で６０分
後にその濁度を測定すると第４図に示すような、添加補
体の第３成分Ｃ３と沈降物量（濁度）との相関が求めら
れた。
また、実施例２と同様にして回収率を調べた結果、高い
回収率が得られた。実施例 ４ 補体の第３成分に３１８〃タ含有する０．００１Ｍ−リ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５叫「最適比量を少
し越した量」に、濃度変化させた補体の第３成分Ｃ３液
０．０５の‘を添加し、０．００１Ｍ−リン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で２ぴ部こ希釈した抗
体１．０の‘を加え総量２．０の上とし３７０で６０分
後にその濁度を測定すると第４図に示すような、添加補
体の第３成分Ｃ３と沈降物量（濁度）との相関が求めら
れた。
また、実施例２と同様にして回収率を調べた結果、高い
回収率が得られた。
回収率が得られた。
実施例 ５
Ｑ，一アンチトリプシン２８ムタ含有する０．００１Ｍ
−べロナール緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘（最適
比量を少し越した量）に、濃度変化させたＱ，ーアンチ
トリプシン液０．０５泌を添加し、０．００１Ｍ−べロ
ナール緩衝液（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で２０倍
に希釈した抗体１．０の‘を加え総量２．０Ｍとし、３
７ｑ０で６■ふ後にその濁度を測定すると第５図に示す
ような、添加Ｑ，ーアンチトリプシン量と沈降物量（濁
度）との相関が求められた。
−べロナール緩衝液（ｐＨ７．４）０．９５の‘（最適
比量を少し越した量）に、濃度変化させたＱ，ーアンチ
トリプシン液０．０５泌を添加し、０．００１Ｍ−べロ
ナール緩衝液（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で２０倍
に希釈した抗体１．０の‘を加え総量２．０Ｍとし、３
７ｑ０で６■ふ後にその濁度を測定すると第５図に示す
ような、添加Ｑ，ーアンチトリプシン量と沈降物量（濁
度）との相関が求められた。
また、実施例２と同様に回収率を調べた結果、高い回収
率が得られた。
率が得られた。
実施例 ６
次のようにハプトグロビン定量用試薬キットを作成した
。
。
【ａ）緩衝液試験管：０．００１Ｍーベロナール緩衝液
（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水０．９の‘を収容した
小試験管。
（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水０．９の‘を収容した
小試験管。
‘ｂ｝抗原液試験管：１５メタの抗原を含む抗血清０．
９８の‘を収容した小試験管。
９８の‘を収容した小試験管。
【ｃ｝抗 体 液 瓶：抗体原液を０．００１Ｍーベロ
ナール緩衝液（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で抗原抗
体反応に適し た濃度に希釈した抗体液１．０泌 を収容した瓶。
ナール緩衝液（ｐＨ７．４）を含む生理食塩水で抗原抗
体反応に適し た濃度に希釈した抗体液１．０泌 を収容した瓶。
‘ｄレ・プトグロビン標準液：種々の異なった濃度のハ
プトグロビン標準血清液を収容した小説験管。
プトグロビン標準血清液を収容した小説験管。
このように構成した定量用試薬キットは、次のようにし
て用いる。
て用いる。
すなわち、０．１の‘の検体を緩衝液試験管【ａ｝に採
取し、よく混合する。この混合液０．０２叫を更に抗原
液試験管‘机ことり混合し、抗体液瓶‘ｃーから１叫の
抗体液をとり出し、試験管‘ｂ｝の混合液に添加し３７
０で６０分間放置する。次いで濁度計を用いて濁度を測
定する。別に検体に代え各種濃度のハプトグロビン標準
０液‘ｄーを用いて上記と同様の実験を繰り返し標準曲
線を得て、この標準曲線より検体中のハプトグロピン量
を求める。
取し、よく混合する。この混合液０．０２叫を更に抗原
液試験管‘机ことり混合し、抗体液瓶‘ｃーから１叫の
抗体液をとり出し、試験管‘ｂ｝の混合液に添加し３７
０で６０分間放置する。次いで濁度計を用いて濁度を測
定する。別に検体に代え各種濃度のハプトグロビン標準
０液‘ｄーを用いて上記と同様の実験を繰り返し標準曲
線を得て、この標準曲線より検体中のハプトグロピン量
を求める。
第１図は抗原抗体反応における沈降物量の変化を示す曲
線であり、第２図は実施例１のトランスフェリン量と沈
降物量との相関性を示す曲線であり、第３図は実施例３
のハプトグロビン量と沈降物量との相関性を示す曲線で
あり、第４図は実施例４の橘体の第３成分に３量と沈降
物量との相関性を示す曲線であり、第５図は実施例５の
Ｑ，一アンチトリプシン量と沈降物量との相関性を示す
曲線である。 第６図は「参考例」における「最適比量を少し越した量
」を定めるためのグラフである。第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図
線であり、第２図は実施例１のトランスフェリン量と沈
降物量との相関性を示す曲線であり、第３図は実施例３
のハプトグロビン量と沈降物量との相関性を示す曲線で
あり、第４図は実施例４の橘体の第３成分に３量と沈降
物量との相関性を示す曲線であり、第５図は実施例５の
Ｑ，一アンチトリプシン量と沈降物量との相関性を示す
曲線である。 第６図は「参考例」における「最適比量を少し越した量
」を定めるためのグラフである。第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図
Claims (1)
- １ 被検抗原およびその抗体からなる抗原抗体反応の反
応系に、最適比量を少し越した量の抗原を共存せしめて
抗原抗体反応を行なわせ、生成した抗原抗体反応沈降物
量を比濁法により測定することを特徴とする抗原性物質
（但し免疫グロブリンおよびアルブミンを除く）の定量
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51040908A JPS605900B2 (ja) | 1976-04-13 | 1976-04-13 | 抗原性物質の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51040908A JPS605900B2 (ja) | 1976-04-13 | 1976-04-13 | 抗原性物質の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS52125623A JPS52125623A (en) | 1977-10-21 |
| JPS605900B2 true JPS605900B2 (ja) | 1985-02-14 |
Family
ID=12593594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51040908A Expired JPS605900B2 (ja) | 1976-04-13 | 1976-04-13 | 抗原性物質の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS605900B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60188846A (ja) * | 1984-03-08 | 1985-09-26 | Hitachi Ltd | 自動分析方法 |
| JPS63246667A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-13 | Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk | 糞便中のヘモグロビンの検出方法 |
| JPS63246668A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-13 | Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk | 糞便中の潜血検出方法 |
| JPH0635976B2 (ja) * | 1988-09-24 | 1994-05-11 | 株式会社島津製作所 | 免疫反応におけるプロゾーン判定方法 |
| CN1307422C (zh) * | 2005-01-31 | 2007-03-28 | 上海市血液中心 | 一种质控品稀释液及其形成的质控品 |
| CN107966567B (zh) * | 2017-11-21 | 2018-12-18 | 浙江夸克生物科技有限公司 | 一种触珠蛋白测定试剂盒 |
-
1976
- 1976-04-13 JP JP51040908A patent/JPS605900B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS52125623A (en) | 1977-10-21 |
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