JPS606192A - 安定化されたイソ酵素制御生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、臨床的環境に有用な安定化された制御ノド我
物に関し７、とくにＣＫおよびＬＤＨイソ酵素を包含す
る安定化されたイソ酵素制御試薬（ｉＳＯｅｎＺｙｍｅ
　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ）に関する。

未発明は、本願の発明者により同時に出願された。「安
定化されたマルチ・パラメーター制御生成物」ど題する
同時係属出願に関係する。その出願は、ここに引用によ
って加える。

イソ酵素類（ｉ　ｓｏｅｎｚｙｍｅｓまたはｉｓｏｚｙ
ｍｅｓ）は、選択的に：”ン及するとき、同一の　般的
機能をなすことかできるが、速度が異る多Φ、形の酵素
類である。それらは化学的組成が１−分に異るので、そ
れらは一般に′屯気泳動的に分離Ｏｆ能である。１つの
このようはイソ酵素、乳酸ヒドロゲナーゼ（Ｌ　Ｌ）　
Ｈ）は５つの７に電泳動的に明確な分画で見い出される
。ＬＤＨのこれらの電気泳動の分画の各々は、異る比率
で存在する２つのポリペプチド鎖弔位ＨおよびＭから成
るテトラマーである：Ｈ４、ＭＨａ　、Ｍ２　Ｈ２、Ｈ
ＭｓおよびＭ４゜これらの５種類のイソ酵素は触媒活性
（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ定数により′Ａ１１ｌ定したとき
基質、ピルビ〉・酸基［エステル］に対する親和性）、
アミノ酸組成、熱不安定性、および免疫学的応答が異る
。こうして、存在する酵素の型は、遺伝的制御のちとに
あり、そして細胞−伺ｔされる環境の条件により調節さ
れる。

同様に、り１／アチンキナーゼ（ＣＫ）は、ＭまたはＢ
のサブユニットを含有し、こうしてＭＭ、ＢＢ、または
ＭＢとして存在しうる。ＭＢ形は臨床的に心筋情報の指
示体として意味をもつが、この形は不安定であり、解離
してＭＭまたはＢＢ型に出形成する傾向がある。ＭＢ形
を有する制御試薬を安定化することが目的である。

ｉｖＩ織中に存在するイソ酵素類の種々の比率または組
み合わせは、問題の細胞の特別の要件に関係することが
あり、こうして分化の程度および細胞の発育のような因
子、ならびに細胞内におこる代謝のレベルおよび型によ
り影響を受ける。したかって、イソ酵素類の種々の形量
の分Ｉｒｊは診断的に意、味のあるデータを提供する。

例えば、ＬＤＨは解糖について有意な制御を示す。詳し
くは、ＭＭ３およびＨ４イソ酵素型は、純粋に好気性ま
たは呼吸する代謝をもつ組織中において主要比率を−１
める。したがって、それらは筋肉、例えば、心臓−一と
くにＣＫイソ酵素類を使用して、アラニンアミノトラン
スフエラーｔ！（ＡＬＴ）またはアスパルターセアミノ
トランスフェラー・ゼ（ＡＳＴ）の場合において脳、肝
臓および他の器官の状ｆハ；を決定するときの診断道具
として使用することができる。有意ななお他のイソ酵素
は、アルカリ性フォスファターゼガンマートランスベプ
チターゼである。

このような注意をイソ酵素類のレベルの１１１１１定、
とくに心臓の危険な治療の患名の重要性に向けるど、適
切な制御はこれらのレベルを決定するように設に１され
たマニュアルな方法および自動化された方法の適切な操
作を確保するために存在しなくてはならないことは自明
である。従来、このような制御は存在し、典型的には、
酵素自体が高度に不安定な性質をもつため不安定であっ
た。

本発明の目的は、安定化されたフォーマットで必要なレ
ベルのイソ酵素が内部に存在する制御試薬を提供するこ
とである。

本発明の他の目的は、イソ酵素制御試薬を安：Ｉｉ：化
することができる方法を提供することである。

本発明の目的および原理に従えば、別状安定化１”；ｊ
９（ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ　ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｍ
ｅａｎｓ）の添加により実質的に安定化される、クレア
ナンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アラニンアミノ
トランスフェラーゼおよびアスパルターゼアミノトラン
スフェラーゼのためのイソ酵素制御試薬が提供される。

好ましい別状安定化手段は、マルトース、マンニトール
、セロビオースおよびラクト−スから成る群より選ばれ
、ラクトースは最も好ましい。網状安定化手投はイｊ利
には約２％〜８％の最終濃度範囲で提供され、理想的濃
度は約６％である。理想的イソ酵素制御試薬は実質的に
すべての水が除去され、例えば、凍結乾燥されて、長期
間の貯蔵および安定性が促進されている。

結局、本発明の制御試薬生成物は、患者の方法により類
似する方法で作用しかつ挙動するようにすることができ
、ｊｌ（実、本９５す１の試薬は現在使用されている３
つの分離系のいずれにおいても存／］ミすることができ
る：カラ１、クロマｉ・グラフィー、および免疫にノ１
（づく分離系。

１１１１から知られているように、このようなイソ酵素
制御試薬を安定化すること、とくに種々のイン酵素サブ
ユニット、例λばＣＫイソ酵素中位ＭＢを、他のサブユ
ニ、ト成分またはまたはその試験１こ悪影響を及ぼさな
いで、安定化することは従来非常に困難であった。本発
明の別状安定化手段を添加すると、これらのイソ酵素類
およびそれらのサブユニンＩ・構成成分はここで安定化
され、かつ従来ｎｆ能であったよりも有意に長い期間溶
液中に維持されることができる。実質的にすべての水が
例えば凍結乾燥により除去されたーとき得られる、乾燥
した形において、安定な期間はなおさらに大きく増大さ
れる。

未発明の網状安定化手段の添加は、実際の凍結点を低ド
させる。凍結点は一般により遅い凍結速度に閏がトする
が、本発明の生成物のより速い凍結が観測された。しか
しながら、網状安定化手段は本発明の生成物の物質へ添
加されると、共融点のプラト−を損失させ、こうして実
際に凍結速度を増大さける。この現象に関連して、凍結
の間に形成されるケーキ１走、しばしば生ずる粉末の形
と反力に、均　な結晶であることが観察される。このこ
ｋにより、網状安定化手段は成分を安定な３次元の「結
晶」構造で保持し、これにより水の除去および構成成分
自体の安定化を促進し、ならびに凍結された物質の再構
成を加速することが理解される。−れらおよび他の複雑
の相互作用は、４及しかつ詳しく説明する前述の同時係
属出願中に詳述されている。

本発明のイソ酵素制御試薬を作るために、特別のヒトの
組織を生産すべき酵素含有生成物の型に従って選択した
。例えば、ＣＫＭＨのサブユニットには、心１藏の組織
を選択し、ＣＫＭＭの酵素サブユこントには、筋肉の組
織を用いるが、ＣＫＢＢのサブユニットには脳の組織を
使用する。同様に、これらの組織および人間以外の組織
を含む他の組織をよく知られた知識に従ってイソ酵素類
またはそれらのサブユニットのための原車１として使用
することができる。

次いで、組織を、よく知られた技術に従い、粉砕などに
より処理して、クロマトグラフィー、電気泳動または他
の免疫学に基づく系によるイソ酵素のｌｉｔ　＃に適す
る形にする。このようにして単離された酵素成分は、診
断的に有意な比率で、好ましくは前もって浄化したヒト
血清基剤へ添加することができる。ヒト血清は１２口利
には、濾過、凍結、ｔｌｒ構成および濾過により、ある
いはシリカ化合物例えばアエロジル（ａｅｒｏｓｉｌ′
ｊの添加により脂質を除去される。これらのすべては、
よく知られている。

次いで、この物質に、必要に応じて、安定化コファクタ
ーを添加して、結合部位の活性の維持を促進する。例え
ば、ＣＫイソ酵素について、スルフヒドリＪし含有化合
物、例えば、グルタチオンまたはジチオトレオＩ・−ル
またはｎ−アクチル−シフティンは有用である。さらに
、理想的生成物は、また、酵素活性を妨害しうる金属イ
オンが存在する場合、それを除去するキレ−１・手段を
含む。酵素活性が金属イオンの存在によって影響を受け
ない場合、このキレ−１・剤は含有させる必要はない、
同様に、金属イオンが存在しない場合、このキレ−１・
剤は再び祷除することができる。このよなキレート剤の
例はエチレンジアミン四酢酸（Ｅｌ）ＴＡ）である。

最後に、本発明のイソ酵素生成物は、弱い非すノ酸塩緩
衝剤をさらに含むであろう。非リン酸塩緩挿■剤は、そ
うでなけれは反応のあるもの、とくにアテニントリフォ
スフェート（ＡＴ’Ｐ）サイクルを含むものを妨害しう
るリン含有化合物を回避するために、使用することがＩ
ｔｒましい６絆衝剤は、「弱く」あるべきである、すな
わち、約１０〜２００５９モルの濃度の範囲内であるべ
きである。この緩働剤のｐＨは、好ましくは活性を最適
化しかつ安定性を最高にするために選択しあるいは調節
することが理想的である。例えば、ＣＫおよびＬＤＨイ
ソ酵素では、はぼ７のｐＨは右利であるが、アルカリ性
ホスファターヤイソ酵素についての理想的なｐＨは約７
．６〜７．８の範囲内である。

最後に、別状安定化手段は、ここに記載しあるいはここ
に引用によって加える安定性および他の前述の利点を提
供するために添加する。このような網状安定化り段は、
単糖類および三糖類の還元性糖類から成る群より選ばれ
、好ましくはマンニト−ル、マルト−ス、セロビオース
およびラクト−ヌから成る群より選ばれる。参考として
引用した出願に記載されているように、ラクトースは安
定性の利点および経済性の考慮から最も好ましい。本発
明名は、網状安定化手段を約２％〜８％の範囲、最も奸
才しくはほぼ６％の最終濃度で存在さげることが望まし
いことを発見した。

網状安定化り段はサブユニットかむしろ容易に解１１ｉ
１トする傾向のあるイソ酵素の解離を〃延するばかりで
なく、またイソ酵素の電気泳動パターンを安ｙ化する。

ｊｌＱ状安定化手段の濃度は、生成物が凍結乾燥される
場合でさえ酵素活性を保持するように選択され、そして
＆ｆましくは最高の酵素活性のために最適化される。網
状安定化手段の添加量が少な晶ぎると１．誘導される保
護は不十分であるが、多過ぎる網状安定化手段の添加は
望ましくなく、網状安定化手段は高濃度において溶液か
ら沈殿するばかりでなく、またタンパク質の活性部位を
遮断することがある。こうして、高濃度の網状安定化手
段は酵素活性を実際に減少させる傾向かあ、す、結局回
避される。

増大した安定性の一例を下表１に記載する。ここのデー
タは、３７℃において水性形で貯蔵したＣＫイソ酵素の
制御試薬の活性を４、表わす。この表は、第ＯＦ＋ない
し第３０［１の安定化されたイソ酵素の制御試薬に対す
る安定化されないイソ酵素の制御試薬を用いて観測され
たデータを比較する。

なおξらに大きい安定性の増大は、より低い温度、すな
わち、５℃における貯桟ならびに凍結乾燥したフォーマ
ットにおいてＩＩＪＩ待することができる。

表１ ＣＫイソ酵素制御試薬 安定化されていない　安定化された ＩＩ　ＣＫ　ＣＫ （１９８４９４５ ９８４９３１ ３９４４９４５ ９４４９５６ ５９８１９８１ ９７２９３０ ９９３８９０’１ ９４２　６７２’ １２　９６１　９４、、２ ９６５　９’４８ １６　６９５　６７９ ７０２　６７゜ ３０　４０３２　４６６２ ４０８２４６２２ １１（７い試料。

２　ｌ：２の希釈の結果。

特、１′ｆ出願人　オーツ・ダイアグノスティック・シ
ステ１、ズ−インコーポレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、、ａ）Ｍ、ＢおよびＭＢ形のサブユニットを含有す
   るＣＫイソ酵素；および ｂ）還元性単糖の糖類および還元性三糖の糖類から成る
   群より選ばれた網状安定化手段、前記網状安定化手段は
   約２％〜８％の最終容量百分率で存在し、これにより溶
   液中の前記ＣＫイソ酵素の活性は少なくともｉ　ｏ　ｔ
   Ｊ間維持される；からなることを特徴とする安定化され
   たＣＫイソ酵素制御試薬。 ２、網状安定化手段はマルト−ス、マンニト−ル、セロ
   ビオースおよびラフ１−スから成る群より選ばれる特許
   請求の範ｌ１Ｆ４第１項記載の試薬。 ３、網状安定化１段はラクトースである特許請求の範囲
   第１項記載の試薬。 ４、ラクＩ−スは約６％の最終濃度で存在する特許請求
   の範囲第１項記載の試薬。 ５、タンバグ賀および非タンパク賀の分析物の水溶液お
   よびマルトース、マンニトール、セロビ・オースおよび
   ラクトースから成る群より選ばれた網状安定化手段から
   なり、前記網状安定化手段は最大の酵素活性を保存する
   ために最適化ごれた濃度で存在することを特徴とする安
   定化されたＣＫイソ酵素制御試薬。 ６、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第１項記載
   の試薬。 ７、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第３項記載
   の試薬。 ８、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第４３ｆｊ
   記載の試薬。 ９、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第５　ｔ：
   ＋＋記載の試薬。 】０、ａ）組織から中離されたＬＤＨイソ酵素； ｂ）約２％〜８％の最終容量百分率で存在し。 これにより溶液中の前記ＬＤＨ酵素の活性は少なくとも
   １０Ｉ」間維持される、非リン酸塩含有緩衝剤： Ｃ）ヒト血ｈ’ｒ　；および ｄ）還元ｔｌ「ｐ−＄１！ｊの糖類および但元性−糖の
   糖類から成る群より選ばれた網状安定化ｆ段、前記網状
   安定化ｆ段は約２％〜８％の最終審ｊ、１百分−（ｌで
   −（ｆ在する： ことを４１−徴とする安定化されたＬＤＨイソ酵素制４
   ７５試薬。 １１、別状安定化り段はマルト−ス、マンニトールール
   、セロビオースおよびラフｉ・−スか」う成る群より選
   ばれる特許請求の範囲第ｉｏ項記載の試薬。 １２、網状安定化ｆ段はチクド−スであり、前記組織は
   と１・の組織であり、そしてさらに酵素活性を最高にす
   るためのコファクターおよび、金属イオンが存在する場
   合、酵素結合部位の活性を保存するために、前記金属イ
   オンを実質的に結合するだめに、必要に応じて、添加さ
   れたキレート剤−？含む特許請求の範囲第１Ｏ項記載の
   試薬。 Ｊ３、ラクト−スは約６％の最終濃度で存在する′持１
   負請求の範囲第１２項記載の試薬。 ］４、タンパク賀および非タンパク質の分析物の水溶液
   およびマルトース、マンニトール、セロビオースおよび
   ラクト−スから成るｌ：ｌより選ばれた別状安ｉ！化ｒ
   段からなり、前記網状安定化ｆ段は最大の酵素活性を保
   存するために最適化されたｅ：度でイｆ７ｒするこｋを
   特徴とする安定化されたＬｌ）　Ｈイソ酵素制御試薬。 １５、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第１ｏｓ
   （Ｈ記載の試薬。 １６、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第１２ザ
   １記載の試薬。 １７、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第１３勇
   記載の試薬。 １８、神鮎乾燥された形である特許請求の範囲第１４ゲ
   １記載の試薬。 １９、ａ）組織から単離されたＡＬＴイン酵素： ｂ）非リン酸塩含有緩衝剤； Ｃ）ヒト血清：および ｄ）還元性単糖の糖類および還元性二軸の糖類から成る
   群より選ばれた網状安定化手段、前記網状安定化手段は
   約２％〜８％の最終容驕百分率で存在する； ことを特徴とする安定化されたＡＬＴイソ酵素制？Ｉ’
   ｌｌ試薬。 ２０　、　別状安定化ｊ一段はマルト−ス、マンニト−
   ル、セロビオースおよびラクト−スから成る群より選ば
   れる特許請求の範囲第１９項記載の試薬。 ２１、別状安定化り段はラクト−スであり、前記Ｍ）織
   はヒトの組織であり、そしてさらに酵素活性を最高にす
   るためのコファクターおよび、金ＪＫＳイオンが存在す
   る場合、酵素結合部位の活性を保存するために、１１１
   記金属イオンを実質的に結合するだめに、必要に応じて
   、添加されるキレ−１・剤を含む特許請求の範囲第１９
   項記載の試薬。 ２２、ラクト−スは約６％の最終濃度で存在する特許請
   求の範囲第２１項記載の試薬。 ２３、タンパク賀および非タンパク質の分析物の水溶液
   Ｈよびマルトース、マンニトール、セロビオースおよび
   ラクトースから成る群より選ばれた網状安定化り段から
   なり、前記網状安定化手段は最大の酵素活性を保存する
   ために最適化された濃度で６在することを特徴とする安
   定化されたＡＩ−Ｔイソ酵素制御試薬。 ２４、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第１９項
   記１１表の試薬。 ２５、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第２１項
   記載の試薬。 ２６、凍結乾燥された形である＃詐請求の範囲第２２項
   記載の試薬。 ２７、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第２３づ
   １記載の試薬・ ２８、ａ）組織から単離さ拮たＡＳＴイソ酵素； ｂ）非り：／酸塩含有緩衝剤； Ｃ）ヒト１ｒ１［清；および ｄ）還元性単糖の糖類および還元性二二糖の糖類から成
   る群より撰ばれた１別状安’ｊｉｌ化丁段、＋ｉｉｊ記
   網状安定化Ｆ段は約２％〜８％の最終容に百分率で存肴
   二する： ことを１＾徴とする安定化されたＡＳＴイン酵素制イ卸
   試薬。 ２９　、　Ｍ４　状安ｋ　化「段はマルｈ−ス、マンニ
   ト−ル、セロビオースおよびラフ１−スかも成る群より
   選ばれる！Ｐｆ詐５．請求の範囲第２８ザＪ記・成の試
   薬。 ３０、網状安定化手段はラクトースであり、前記ｆ【織
   はヒトの組織であり、そしてさらに酵素活性を最高にす
   るためのコファクターおよび、金属イオンが存在する場
   合、酵素結合部位の活性紮保存するために、前記金属イ
   オンを実質的に結合するだめに５必要に尾：じて、添加
   されるキレート剤を含む特許請求の範囲第２８項記載の
   試薬。 ３１、ラクトースは約６％の最終濃度で存在する特許請
   求の範囲第３０項記載の試薬。 ２３、タンパク質および非タンパク質の分析物の本ｕ　
   諦７３よびマルトース、マンニトール、セロビオースお
   よびラフＩ・−スから成る群より選ばれた１網状安定化
   丁段からなり、前記網状安定化、ｒ段は最大の酵素活性
   を保存するために最適化された濃度で存在することを特
   徴とする安定化されたＡＳＴ−イソ酵素制御試薬。 ３３、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第２　ｓ
   　、ｆ４記枝の試薬。 ３４、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第：ｓ　
   ｏ　ＩＪ’ｉ記載、の試薬。 ３５、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第３１１
   記枝の試薬。 ３６、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第３２項
   記載の試薬。 ３７、ヒトの組織から単離されかつ診断的に有７ａ、な
   濃度で存在するイソ酵素を含有する溶液および約２％〜
   ８％のＲｋ終容ダ百分率で存イ（しかつマルト−ス、マ
   ンニトール、セロビオースおよびラクト−スから成る群
   より選ばれた別状安定化−ｒ段からなることを特徴とす
   る安定化されたイソ酵素制御試薬。 ３８、微生物の生長を実質的に阻害するために抗微生物
   ＋段をさらに含む特許請求の範囲第３７ユｆ１記載の試
   薬。 ３９、安ンｅ化すべきイソ酵素を含有する水溶液に、網
   状安定化手段を添加することからなり、前記網状安定化
   手段は還元性単糖の糖類および還元性７−糖の糖類から
   成る群より＼選ばれかつ約２％〜８％のｆｉｌ終容積百
   分率で存在することを特徴とする・イン酵素〃制御試薬
   を安定化する方法。 ４０、網状安定化１段はマルトース、マンニト−ル、セ
   ロビオースおよびラクト−スから成る群より選ばれる特
   許請求の範囲第３９項記載の方法。 ４１４１１１状安定化手段はラクトースである特許請求
   の範囲第３９項記載の方法。 ４２、ラクト−スは約６％の最終濃度で存在する特許請
   求の範囲第４１項記載の方法。 ４３、網状安定化手段はラクト−スである特許請求の範
   囲第３７ザ１記載の試薬。 ４４、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第３７　
   Ｊ！ｒ記・依の試薬。 ４５、凍結乾燥された形である特許請求の範囲第３８１
   Ｃ１記載の試薬。 ４６、そのように形成された試薬を凍結乾燥する［−程
   をさらに含む特許請求の範囲第３９項記載の方法。 ４′仁　そのように形成された試薬を凍結乾燥する１程
   をさらに含む特許請求の範囲第４１項記載の方法。