JPS6066989A - Ｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Ｌ−アルギニンの製造法

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JPS6066989A
JPS6066989A JP58176758A JP17675883A JPS6066989A JP S6066989 A JPS6066989 A JP S6066989A JP 58176758 A JP58176758 A JP 58176758A JP 17675883 A JP17675883 A JP 17675883A JP S6066989 A JPS6066989 A JP S6066989A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を
含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの絹換え体ＤＮＡを
コリ矛バクデリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物に保有せしめ、該微生物を培地中で培養し、
培養物中に生成蓄積したし一アルギニンを採取すること
を特徴とするＬ−アルギニンの製造法に関する。
コリネバクデリウム属やブレビハクテリウム属などのい
わゆるグルタミングル産閑により直接発酵法でＬ−アル
ギニンを生産する方法については野生株から誘導された
Ｌ−アルギニン生産性の突然変異株を用いる方法が知ら
れている。Ｌ−アルギニン生産性変異株としては、たと
えばＡｇｒ。ＢｉｏｌＣｈｅｍ．、３６．１６７５〜１
６８４（１９７２）、特公昭５４−３７２３５、特公昭
５７−１５０３８１などに記載されているようにアミノ
酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれらに核酸塩
基の要求性を付与した菌株が知られている。
本発明者らはコリネバクテリウム属あるいはブレビバク
テリウム属の細菌を用いるＬ−アルギニン生産法におい
て、従来のし一アルギニン生産性変異の付与による育種
とは全く異なる組換えＤＮＡ技法によるＬ−アルギニン
の生産方法について研究を重ねた結果、Ｌ−アルギニン
の生合成に係わる遺伝子とこれら菌種のベクタープラス
ミドとの組換え体を保有せしめた菌株が組換え体非保有
株に優るＬ−アルギニン生産能を有することを見出し本
発明を完成するに至った。
コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム麿に
属するＬ−アルギニン非生産性菌株にアルギニン生合成
に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入したとき、
該閑がＬ−アルギニン生産菌株となることについては、
本発明者らが初め見出した知見である。
以下、本発明の詳細な説明Ｊる。
本発明によれば、アルギニン生合成に係る酵素の遺伝子
を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
を保有せしめたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に
Ｌ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ〜ア
ルギニンを採取することによりＬ−アルギニンを製造す
るこＬができる。
宿主微生物きして用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全て用いる
ことができるが、好適には下記の菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣＩ３０３２
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣＩ
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８
コリネバクゾリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０ブレ
ビバクテリウム・テイバリカツムＡＴＣＣ１４０２０ブ
レヒバクブリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７プレヒ
バクデリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフアーノンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレヒバクテリウム・チオゲンタリスＡＴＣＣ１９２４
０宿主としては、Ｌ−アルギニン生合成能を有しない野
生株を用いることもできるが、既にＬ−アルギニン生産
性を有する菌株を用いるこきもできる。
アルギニン生産性を有する菌株としては、アミノ酸アナ
ログ耐性変異株など公知の菌株が適用できる。
Ｌ−アルギニン生合成に係わる酵素としては、Ｎ−アセ
チルグルタミン酸シンセターゼ、Ｎ−アセチルゲルタモ
キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸−Ｔ−セミアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチルオルニチン−δ−
アミノトランスフェラーゼ、アセチルオルニチンデアセ
チラーゼ。
Ｎ−アセチルグルタミン酸−γセチルオルニチンアセチ
ルトランスフェラーゼ、オルニチンカルバモイルトラン
スフェラーゼ、アルギノコハク酸シンセターセ、アルギ
ニノサクンナーゼがある［Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．４３，１８９９−１９０３（１９７９）〕。
本発明におけるアルギニン生合成に係る酵素の遺伝子と
しては、これら酵素のうし少なくとも一つの酵素の遺伝
情報を担うＤＮＡがあげられる。
該ＤＮＡは、原核生物、真核生物、バクテリオフアージ
、ウィルスまたはプラスミドに由来するいずれをも用い
ることができる。就中、原核生物である細菌たとえばエ
ツシエリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテ
リウム属、ミクロバクゾリウム属、バチルス属、スタフ
ィロコッカス属。
ストレプトコツカス属またはセラチア属に属する菌株の
アルギニン生合成に係る遺伝子が望ましくとくにこれら
の細菌から誘導れさたアルギニン生産性変異株由来の遺
伝子が好適である。具体的に好適な一例としては、大腸
菌Ｋ−１２株のアルギニン生合成に関与する遺伝子があ
げられる。
該ＤＮＡを組込む為のベクターとしては、本願発明者ら
の開発に係る、ｐｃＣＩ、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４．ｐｃＧ
ｌｌ、ｐＣＥ５３．ｐＣＥ５４およびｐｃＢｌｏｌなど
が好適に用いられ、これらベクターの製造法は特開昭５
７−１３４５０ｔｌ、特開昭５７−１８３７９９．特開
昭５８−３５１９７および特開昭５８−１０５９９９な
らびに特願昭５８−２５３９８に記載がある。
アルギニン生合成に係る酵素の供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限
酵素で切断した後ＤＮＡリガーセで再連結反応し、この
結合反応物を用いてアルギニン生合成にあずかる酵素を
コードする遺伝子が欠損したコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属の変異株を形質転換し、欠損形
質が相補された形質転換株を２択する絹換えＤＮＡ技法
によって得ることができる。この組換えＤＮＡ技法は特
開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４８
９に記載の方法に従って行うこきができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のごとく既に遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。ずなわら、アルギニ
ン生合成に係わる酵素の供与体ＤＮＡと大腸菌ベクター
ＤＮＡとの試験管内結合反応物を用いアルギニン生合成
にあずかる酵素をコードする遺伝子が欠損した大腸菌の
変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株
を選択することによって目的遺伝子をクローン化するこ
とができる。
クローン化したＤＮＡとコリネバクテリウム属およびブ
レビバクゾリウム属菌種のベクターＤＮＡを試験管内で
制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガ−セで再結合反応さ
せ、この結合反応物を用いて再度、前述のアルギニン生
合成酵素が欠損した大腸菌変異株を形質転換し、コリネ
バクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種のベ
クターＤＮＡの選択マーカーを有し、しかも欠損形質が
相補された形質転換株を選択することによっても同様な
組換え体ＤＮＡが取得できる。宿主大腸菌でクローン化
したＤＮＡとコリネバクテリウム属あるいはブレビバク
ゾリウム属菌種のベクターＤＮＡとの組換え体の選択は
、大腸菌を用いず、アルギニン生合成にあずかる酵素を
コードする遺伝子が欠損したコリネバクテリウム属ある
いはプレビバクテリウム属菌種の変異株を形質転換し、
欠損形質が相補された形質転換株を選択することによっ
ても行うことができる。
本発明で用いるアルギニン生合成に係わる遺伝子を含む
ＤＮＡの具体的に好適な例として、大腸菌Ｋ−１２株の
染色体地図上、９０分近傍に収束して位置するアヤチル
オルニチンデアセチラーセ（ａｒｇＥ）、Ｎ−アセチル
グルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドＵゲナーセ（
ａｒＨＣ）、Ｎ−アセチルクルタモキプーセ（ａｒｇＢ
）およひアルギニノサクシナーゼ（ａｒｇＨ）を含む遺
伝子群［Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ．Ｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、５１、１６７（１９６５）］が挙げられる。大腸菌Ｌ
−１２株のこのアルギニン生合成遺伝子群のＤＮＡを含
む組換え体プラスミドｐＥａｒｇ１を例にあげて本発明
をさらに詳細に説明する。
ｐＥａｒｇｌは大腸菌の遺伝子組換え系を用いてｐＬｃ
２０−１０とｐＣＥ５３の組換え体として取得できる。
ｐＬｃ２０−１０は大腸菌Ｋ−１２株のシーンバンク中
から得られ、上記アルギニン生合成遺伝子群を有するこ
とが知られている［Ｃｌａｒｋｅ、Ｌ．ｅｔ　ａｌ．：
Ｃｅ１ｌ、９、９１（１９７６）〕。
ｐＣＥ５３は本発明者らが出願明細書（特願昭５８−２
５３９８）に示したプラスミドでコリネバクテリウム・
グルタミクム２２５−５７株（ＡＴＣＣ３１８０８、Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ５８６５）から分離されたプラスミドｐｃＧ
１（特開昭５７−１３４５００）における制限酵素Ｂｇ
ｌＩＩのただ一つの切断部位に大腸菌のベクタープラス
ミドｐＧＡ２２〔Ａｎ．Ｇ、ｅｔ　ａｌ：Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、．１４０、４００（１９７９）〕の２カ所
ある制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位のうぢ、１カ所で切
断して直鎖状化したＤＮＡを一者の同一接着末端を利用
して結合せしめたプラスミドであり、コリネバクテリウ
ム属やプレビバクテリウム属などのグルタミン酸生産菌
および大腸菌の両方で複製でき、選択マーカーとして、
カナマイシンの耐性遺伝子をもっている。ｐＬＣ２０−
１０はそれを保有する大腸菌から常法〔Ａｎ，Ｇ．ｅｔ
ａｌ：Ｊ．Ｄａｃｔｅｒｉｏｌ、．１４０，４００（１
９７９）〕にまり単離できる。ｐＣＥ５３はそれを保有
するコリネバクテリウム・グルタミクムＬ−２２の培養
菌体から本発明者らが特開昭５７−１８６４９２に開示
したと同じ方法で濃縮単離する。
両プラスミドを制限酵素ＰｓｔｌとＢａｍＨＩで２重消
化した後、Ｔ４リガーセを作用させる。
この混成液を用いて公知の方法［Ｄａｇｅｒｔ、Ｍ、ａ
ｎｄＳ．Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｈ：Ｇｅｎｅ、６２３−２８
（１９７９）］により大腸菌Ｋ−１２株亜株ＣＨ７５４
［メチオニン、トリプトファンおよびアルギニン（ａｒ
ｇＨ、アルギニノサクシナーゼの欠損変異）要求性〕［
ＣＩａｒｋｅＬ．ａｎｄＪ、Ｃａｒｂｏｎ：Ｃｅ１ｌ、
９、９１−９９（１９７６）〕を形質転換し、アルギニ
ンを除いた他の要求物質とカナマイシンを含む最小培地
上で生育する形質転換株を選択する。出現したアルギニ
ン非要求性となった形質転換株の保有するプラスミドは
その培養菌体から常法［Ａｎ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、．１４０、４００（１９７９））に
より分離でき、次いでＰｓｔｌとＢａｍＨＩの二重消化
で生育するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析
してｐＣＥ５３に挿入された断片を検知することができ
る。
こうして得られたプラスミドの一つが第１図に示すｐＥ
ａｒｇＩで、両端がＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩ断部位を
有する８．０ＫｂのＤＮＡ断片がｐＣＥ５３に挿入され
ていることがわかる。第１図にはその作製工程も示しで
ある。
このｐＥａｒｇｌを用いて大腸菌Ｋ−１２株の変異株Ｃ
Ｈ７５４を再形質転換すると、カナマイシン耐性形質と
連関してアルギニン要求性が相補されるが、大腸菌Ｋ−
１２株の別の変奴株Ｃ３Ｒ６０３〔スレオニン、ロイノ
ン、プロリン、ザイアミン、およびアルギニン（ａｒｇ
Ｅ、アセチルオルニチンデアセチラーセの欠損変異）要
求性〕［ＳａｎｃａｒＡ．ａｎｄＣ．Ｓ．Ｒｕｐｅｒｔ
：Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、５１、１３９−１４３（１９
７８）〕を形質転換してもそのアルギニン要求性が相補
される。大腸菌Ｋ−１２株の染色体地図上で、９０分近
傍に位置するアルギニン合成系遺伝子はａｒｇＥ、ａｒ
ｇＣ、ａｒｇＢおよびａｒｇＨの順に存在〔Ｇｌａｎｓ
ｄｏｒｆｆ、Ｎ．：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５１．１６７（
１９６５）］していることが知られており、両端のａｒ
ｇＥとａｒｇＩＩの相補能を示ずｐＥａｒｇ１はａｒｇ
ＣとａｒｇＢも含んでいることが確かである。
ｐＥａｒｇｌはｐｃＧＩ由来の複製機能を保持しでおり
、コリネバクテリウム属およびブレビバクゾリウム属菌
種で安定に遺伝できるので、ｐＥａｒｇｌに含まれる大
腸菌のアルギニン生合成系遺伝子のコリネハクゾリウム
属およびプレビハクデリウム属菌種内での形質発現はｐ
Ｅａｒｇｌのもつアルギニン生合成系遺伝子に対応する
アルギニン生合成系路の欠損したコリネバクゾリウム属
およびブレビバクゾリウム属菌柿のγルギニン要求性変
異株に導入したときのアルギニン要求性の回復で確認す
ることができる。この確忍のため、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ２９１（フルギニン要求性）を形質
転換する。コリネバクテリム・グルクミクムＬＡ２９１
は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８
３３（特開昭５７−１８６４９２）由来のリゾチーム感
受性変異株Ｌ−１５株（特開昭５７−１８６４８９）か
ら通常用いられる変異処理により誘導されたアルギニン
要求性の変異株であり、アルギニン生合成系路上アルギ
ニンの２段階前の前駆体であるントルリンでも生育応答
しないことから、その欠損変異は、アルギノコハク酸シ
ンセターセ（大腸菌のａｒｇＧに対応）あるいはアルギ
ニノサクシナーセ（大腸菌のａｒｇＨに対応）の欠損変
異に基づいていることが察知される。形質転換は本発明
者らが先に発明し、特許出願されたコリネバクテリラム
属あるいまブレビバクテリウム属菌種のプロトプラスト
を使用する形質転換法（特開昭５７−１８６４９２およ
び特開昭５７−１８６４８９）により実施することがで
きる。
本状を用いコリネバクテリウム・タルタミクトＬＡ２９
１株のプロトプラストを形質転換後、一旦カナマイシン
を含む再生培地に塗布し、生育したコロニーが同時にア
ルギニン非要求性を獲昔しており、また各種制限酵素切
断部位で特徴づけられるｐＥａｒｇｌを保有しているこ
とから、コリネハクゾリウム・グルタミグムＬＡ２９１
株のアルギニン要求性がｐＥａｒｇＩにより、非要求性
に回復したことは明らかである。
このことは、ｐＥａｒｇ１の大腸菌由来のアルギニン生
合成系遺伝子がコリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ
２９１中で形質発現できることを示しＣいる。
コリネバクゾリウム属またはブレビバクテリウム属に属
し、ｐＥａｒｇ１を保有するＬ−アルギニン生産菌は前
記と同様にｐＥａｒｇｌを用いてコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌のプロトプラストを形質
転換し、ｐＥａｒｇｌの有するカナマイシン耐性マーカ
ーで選択した形質転換株として得られる。形質転換株が
ｐＥａｒＨｌを保有していることは、それから抽出単離
したプラスミドの構造を前記のごとく各種制限酵素とア
ガＤ−スゲル電気泳動で解析することによって確認でき
る。具体的に作製したＬ−アルギニン生産株としてコリ
ネバクゾリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｐ
Ｅａｒｇｌ保有株Ｋ４６（ＦＥＲＭＢＰ−３５６）、コ
リネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８の
ｐＥａｒｇ１の保有株Ｋ４７（ＦＥＲＭＢＰ−３６７）
およびプレビパクデリウ・フラブムＡＴＣＣ１４０６７
のｐＥａｒｇ１保有株Ｋ４８（ＦＥＲＭＢＰ−３５７）
をあげることができる。これらの菌株は昭和５８年９月
１２日および２１日付で工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
ｐＥａｒｇｌ保有形質転換株によるＬ−アルギニン生産
は、従来の発酵法によるＬ−アルギニン製造に用いられ
る培養方法により行うことができる。ずなわら、該形質
転換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミン
などを含有する通常の培地中、好気的条件下、温度、ｐ
Ｈなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中にＬ−アル
ギニンが精製蓄積するので、これを採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、ンユークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭化化物、ポリアル
コール、ビルヒン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用でｋる。更に菌の資化性によつて、炭化
水素、アルコール頚なども用いうる。とくに廃糖蜜は好
適に用いられる。
窒素謔としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウムなどの各種無幾および有機アンモニウム塩類あるい
は尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ
−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・
リカー、カセイン加水分解物、フィツシュミールあるい
はその消化物、脱脂大豆油あるいはその消化物、輛加水
分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
さらに無機物としては、隣酸第−水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウト
、硫酸マク不グラム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微生
物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前
記したような他の培地成分に従って培地に供給されれば
特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５１ヨ間で培地中にＬ−アル
ギニンが蓄積する。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニンを
回収する。
かくしてｐＥａｒｇ１を保有ゼしめたコリネバクゾリウ
ム属およびブレビバクテリウム属菌株を用いることによ
り、非保有株に較べ高い収率てＬ−アルギニンを生産す
ることができる。
本発明では、コリネバクゾリウ１．居あるいはプレビハ
クテリウ属菌種の野性株でのｐＥａｒｇ１の生産性への
寄与を示したが、元来アルギニン生産性を有する変異株
にｐＥａｒｇ］を導入すればより高い生産性が得られる
。
本発明の有用性は、アルギニン生合成に係わる遺伝子と
コリネバクテリウム属あるいはブレビハクゾリウム属閑
秤のベクターＤＮＡとを形質発現できる形で組換えた組
換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビハク
ゾリウム属菌種に導入すればＬ−アルギニン生産能を付
与あるいは強化できる点にある。本願明細Ｍでは大腸菌
のアルギニン生合成遺伝子ｍを用いる例を示したが、代
わりに他の生物のアルギニン生合成に係わる遺伝子を用
いＣも目的が達成される。それゆえ、アルギニン生合成
に係わる遺伝子は本明細書で例示した大腸菌のアルギニ
ン生合成遺伝子群に限定されるものではない。またベク
タープラスミドは組換え体さしで連結されたアルギニノ
生合成に係わる遺伝子を安定に遺伝せしめるために、そ
の自律複製能を提供しているにすぎない。従って、本明
細書に例示したｐＣＥ５３に限らずコリネバクゾリウム
属あるいはブレビバクテリウム属で自律複製できるプラ
スミドも本願発明方法のプラスミドに包括される。
グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から、各研究者により、種々の菌名
が付されており、属名までも、コリネバクテリウム属あ
るいはフレビバクデリウム属など、種々である。しかし
ながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮ
Ａの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であ
ることが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種
間には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があること
が明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白
である。
〔Ｋｏｍａｔｓｕ、Ｙ．：Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｂｅ
　ＰｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ、Ｎｏ．５５、１（１９８０）およびＳｕ
ｚｕｋｉ、Ｋ．、Ｋａｎｅｋｏ、Ｔ．、ａｎｄ　Ｋｏｍ
ａｇａｔａ、Ｋ．：Ｉｎｔ．Ｊ　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏ１．，３１、１３１（１９８１）参照〕。
本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣｌ３０３２．コリネバクテリウム・ハーキュリスＡ
ＴＣＣ１３８６８およびブレビバクゾリウム・フラブム
ＡＴＣＣ１４０６７にアルギニン合成に係わる遺伝子の
ｍ換え体を導入し、その遺伝子の形質発現に基づくし一
アルギニン生産性の向上について例示したが、上記の事
実を踏まえればグルタミン酸生産菌全般での効果が容易
に類推される。その効果の有無は組換え体ＤＮＡがグル
タミン酸生産菌全般で自律的に複製し、アルギニン合成
に係わる遺伝子が形質発現できるか否かに係わり、グル
タミングル産閑間のＤＮＡ相同性などにおける若干の相
違は何ら関係ない。
しかるにこれらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発現
に係わる機能を等しく保持していることは、本発明者ら
が先に特許出暉（特開昭５７−１８３７９！ｌ）したコ
リネバクゾリウム・グルタミクム２２５−２５０株から
分離され、スペクチノマインンおよび／またはストレプ
トマイシン耐性遺伝子を自するプラスミドｐＣＧ４がコ
リネバクテリウム属およびブレビハクデリウム属菌種な
どグルタミングル産閑内で同しく複製でき、またその耐
性遺伝子が発現される（特開昭５７−１８６４９２）ご
とから明らかである。従って、本発明のアルギニン生合
成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入すること
によるＬ−アルギニン生産菌の作製法を適用し得る菌種
は、コリネバクゾリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２．コリネバクテリウム・バーキュリスＡＴＣＣ１３
８６８およびブレビハクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１
４０６７に限らずコリネバクテリム属およびプレビバク
テリウム属を含むグルタミン酸生産閑全てが含まれる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ （１）ｐｌｃ２０−１０とρＣＥ５３の試験管内組換え
：ｐＬＣ２０−１０はそれを保有する大腸菌Ｋ１２株亜
株の培養菌体からアンらの方法［Ａｎ、Ｇ、ｅｔａｌ、
：Ｊ．Ｂａｃｔｃｒｉｏ１．、１４０、４００（１９７
９）〕に従い単離した。ｐＣε５３はそれを保有するコ
リネバクプリウド・グルタミクムＬ−２２の培養菌体か
ら濃縮単離した。即ちｐＣＥ５３保有菌株を４００ｍ１
ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１
ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）でＯＤ約０．８に
なるまで生育させた。培養液から菌体を集菌し、ＴＥＳ
緩衝液［トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン（
以下トリスと略す）０．０３Ｍ、ＥＤＴＡ０．００５Ｍ
、ＮａＣｌ０．０５Ｍ、ｐＨ８．０〕で洗浄後、リゾチ
ート液（２５％ショ糖、０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍ
トリス、０．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム：ｐＨ８．０）で
１０ｍｌに懸濁し、３７℃で４時間反応させた。
反応液に５ＭＮａＣｌ２．４ｍ１，０．５ＭＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）０．６ｍｌ、および４％ラウリル硫酸ナト
リウムと０．７ＭＮａＣｌからなる溶液４．４ｍｌを順
次添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間置い
た。溶解物全量を遠心管に移し、４℃で６０分間６９．
４００×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した。これに
重量６分率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）６．０００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混
和して溶解後、氷水中に置いた。
１０時間後、１．５００×ｇで１０分間遠心分離してペ
レットを回収した。ＴＥＳ緩衝液５ｍｌを加えてペレツ
トを静かに再溶解してから１．５ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド２．０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを
加えて静かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。こ
の溶液を１０５．０００ｘｇ、１８℃で４８時間超遠心
分離にかけた。この密度勾配遠心により共有結合で閉し
られた環状のＤＮＡは、紫外線照射することによって茄
心チューブ中下方の密度の高いハンドとしＣ見出された
。このハンドを注射器で遠心チユーブの側面から抜きと
ることによつてプラスミドｐＣＥ５３が分離された。つ
いて分離液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量
百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）
〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、
しかる後にＴＥＳ緩衝液に対して透析した。こうしてｐ
ＣＥ５３プラスミドＤＮＡを得た。
このｐＣＥ５３ＤＮＡを用い、各種制限酵素による単独
消化および複数の制限酵素による多重消化で生成するＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析し、分子量お
よびプラスミド分子中の各制限酵素に対する切断部位を
めた結果、第１図に示す制限酵素切断地図を有すること
がわかった。
ｐＬＣ２０−１０プラスミドＤＮＡ５Ｍｇを含む制限酵
素ＰｓｔＩ、ＢａｍＨ１１用反応緩衝液（１５ｍＭトリ
ス塩酸、１０ｍＭＭｇＣｌ２５０ｍＭＮａＣｌ，２５ｍ
Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭメルカプトエタノール、
０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８．０）３０μｌ
に５単位のＰｓｔＩ（宝酒造社製、５単位／μｌ）と５
単位のＢａｍＨｌ（宝酒造社製、５単位／μｌ）を添加
し、３３℃で９０分間反応させた。ｐＣＢ５３プラスミ
ドＤＮＡ５μｇについても同じ反応を行った。雨滴化物
を６５℃で１０分間加温した後混合し、Ｔ４４リガーゼ
緩衝液（トリス・ＨＣｌ６６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２、６６
ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、ｐＨ７．６）１
０μｌ、ＡＴＰ（４０ｍＭ）１μｌ、Ｔ４リガーセ０．
３μｌおよびＨ２Ｏ３０μｌを加え、４℃で１２時間反
応させた。
（２）ｐＥａｒｇｌの取得： 形質転換は大腸菌Ｋ−１２株亜株ＣＨ７５４〔・メチメ
ニン、トリプトファンおよびアルギギニン（ａｒｇＨ、
アルギニノシクンナーセの欠損変異）要求性〕を用いて
行った。ＣＨ７５４のコンビプント・セルはタシェルト
らの方法［Ｄａｇｅｒｔ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ：Ｇｅｎｅ６
２３（１９７９）〕で調製した。即し、Ｌ培地（バクト
ドリブトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ブドウ糖１ｇおよ
び塩化ナトリウム５ｇを水１ｌに含み、ｐＨ７．２に調
整した培地）５０ｍｌにＣＨ７５４株を植菌し、東京光
電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が０．５
になるまで３７℃で培養した。
培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠心した。冷却
した０．１Ｍ塩化セシウム２０ｍｌに菌体を再懸濁し、
０℃に２０分間置いた。菌体を再遠心し、０．１Ｍ塩化
カルシウム０．５ｍｌに懸濁し、０℃で１８時間置いた
。塩化力ルンウト処理した菌液１５０μｌに前記リガー
ゼ反応混合物５０μｌを添加混合し、０℃に１０分間置
いてから３７℃で５分間加温した。次いでＬ培地２ｍｌ
を添加し、３７℃で２時間振盪培養した。
生理食塩水で２回遠心洗滌後、各４０μｇ／ｍｌのメチ
メニンおよびトリプトファンならびに２５μｇ／ｍｌ相
当のカナマイシンを添加したＡ寒天培地〔Ｎａ２ＨＰ０
４８ｇ、ＫＨ２Ｐ０４２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ、サイアミン塩酸塩４ｍ
ｇ、ブドウ糖１０ｇおよび寒天１６ｇを水１ｌに含み、
ｐＨ７．２に調整した培地〕に塗布し、３７℃で３日培
養した。出現した形質転換株の培養菌体から、前記のｐ
ＬＣ２０−１０を単離したのと同一の方法によりプラス
ミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤＮＡは制限酵
素消化とアガロニスゲル電気泳動で解析した結果、第１
図に示すようにｐＬＣ２０−１０のアルギニン生合成系
遺伝子群４含むＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＣＥ５３
のカナマイシン耐性遺伝子を含むＰｓｔｌ−Ｂａｍｈｌ
断片とが結合した構造を有していた。このプラスミドを
ｐＥａｒｇｌと命名した。
このプラスミドＤＮＡを用いてＣＨ７５４を前記と同様
に再形質転換した結果、アルギニン非要求性株が高頻度
で得られ、それらは全てカナマイシン耐性形質を獲得し
ていた。またアルギニン生合成経路上、アセチルメルニ
チンデアセチラーゼ（ａｒｇＥ）を欠損した大腸菌Ｋ−
１２株亜株ＣＳＲ６０３を形質転換した場合もカナマイ
シン耐性獲丙株は全てアルギニン非要求性を示した。
またこのプラスミドＤＮＡを用いてコリネバクデリウム
・グルクミンムＬＡ２９１（アルギニン要求性）を形質
転換した。コリネバクテリウム・タルタミクムＬＡ２９
１はコリネハタチリウム・クルタミタムＡＴＣＣ３１８
３３由来のリゾチーム感受性変異株Ｌ−１５から通常用
いられる変冗処理により誘導されたアルギニン要求性の
変異株であり、アルギニン生合成経路上アルギニンの２
段階前の前駆体であるントルリノでも生育応答しないこ
とから、その欠損変異はアルギニノコハク酸ンンブター
セ（大腸菌のａｒｇＧ遺伝子産物に対応）あるいはアル
ギニノカクシナーゼ（大腸菌のａｒｇＨ遺伝子産物に対
応）の部位にあると推察されるものである。コリネバク
テリウム・クルタミクムＬＡ２９１株の種培養をＮＢ培
地に植菌し、３０℃で振盪培養した。ＯＤ０．６になっ
た時点て集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔ブドウ糖５ｇ
、カヅミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４
３．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２
Ｏ０．４１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ４・４〜６Ｈ２Ｏ２ｍｇ、ＺｒＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．
９ｍｇ、（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ０．０４
ｍｇ、ビオチン３０μｇ、シイアミン塩酸塩２ｍｇ、コ
ハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（
分子量１０．０００）３０ｇを水１ｌに含む培地〕に１
ｍｇ／ｍｌのリゾチートを含む液（ｐＨ７．６）に約１
０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移し
て３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト
化した。このプロトプラスト菌液０．５ｍ１を小試験管
にとり、２．５００×ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ
緩衝液〔１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カル
シウム、５０ｍＭトリス、４００ｍＭ蔗糖、ｐＨ７．５
〕ｍｌに懸濁して遠心洗滌後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍ
ｌに再懸濁した。この菌液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液
とｐＥａｒｇｌプラスミドＤＮＡ溶液との１対１混合液
１００μｌを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に
２０％ＰＥＧ６．０００を含む液１．０ｍｌを添加して
混合した。３分後２．５００×ｇで５分間遠心分離にか
けて上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍ
ｌのＲＣＧＰ培地（ｐＨ７．４）に懸濁してから３０℃
で２時間緩やかに振盪した。ついでこのプロトプラスト
濁液の０．３ｍｌをカナマイシン４００μｇ／ｍｌを含
むＲＣＧＰ寒天培（ＲＣＧＰ培地に１６％寒天を含む培
地、ｐＨ７．４）に塗抹し、３０℃で６日間培養した。
出現したカナマイシン耐性形質転換株は全てアルギニン
非要求性を示した。
またこの形質転換株の培養菌体から前記のｐＣＥ５３を
単離したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した
結果、各種制限酵素切断様式て勃徴付けられるｐＥａｒ
ｇｌと同一の構造を有するものであることがわかった。
（３）ｐＥａｒｇｌ保有株によるＬ−アルギニンの生産
： コリネハタヴリウム・タルタミクトＡｔＣＣ１３０３２
、コリネバクブリウト・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８、およびブレビハクツリウム・フラブムＡＴＣＣｌ４
０６７のプロトブラストを形質転換してｐＥａｒｇｌを
導入した。
コリネバクゾリウム・グルタミクトＡＴＣＣ１３０３２
、コリネバクゾリウム・ハーヰユリスＡＴＣＣ１３８６
８、およびプレビバクブリウム・フラブムＡＴＣＣ１４
０６７をそれぞれＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪培
養し、その種培養０．１ｍｌをｌ０ｍｌのＳＳＭ培地〔
ブドウ糖１０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ４ｇ、尿素２ｇ、酵母エキ
ス１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、Ｋ２ＨＰ０４３ｇ、ＭｇＣ
ｌ８．・６Ｈ２Ｏ０．４ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０
ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ０．２ｍｇ、ＺｎＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ０．９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．４
ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ０．０９ｍｇ、（Ｎ
Ｈ４）６ＭｏＯ２４／４Ｈ２Ｏ０．０４ｍｇ、ビオチン
３０μｇ、サイアミン塩酸塩１ｍｇを純水１ｌに含みｐ
Ｈ７．２に調整した培地〕の入ったＬ字型試験管に接種
し、モノ−型培養槽にて３０℃で振盪培養した。ＣＤが
０．１５になった時点で０．５単位／ｍｌになるように
ベニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＤ約０
．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地に１
ｍｇ／ｍｌのリゾチートを含む液（ｐＨ７．６）２ｍｌ
に懸濁し、Ｌ字型試験管に移して３０℃で１４時時間緩
やか振盪してプロトプラスト化した。このプロトプラス
ト菌液１ｍｌを小試験管にとり２．５００×ｇで１５分
間遠心分離し、沈澱物をＴＳＭＣ緩衝液１ｍｌに懸濁し
て遠心（２．５００×ｇ）洗滌後、ＴＳＭＣ緩衝液の０
．１ｍｌを加えて再懸濁した。これに２倍濃度のＴＳＭ
Ｃ緩衝液と上記で単離したｐＥａｒｇｌＤＮＡ液の１対
１混合液１００μｌを加えて混和し、実施例１（２）と
同様にＰＥＧ６．０００を介した形質転換を行い、形質
発現さけた後、０．３ｍｌをカナマイシン４００μｇ／
ｍｌを含むＲＣＳＰ寒天培地に塗抹し、３０℃で１０口
間培養した。
出現したカナマイシン耐性形質転換株を４００ｍｌＳＳ
Ｍ培地て振盪培養し、ＯＤが０．１５になつだところで
０．５単位／ｍｌとなるようにページリンＧを添加し、
さらにＯＤが０．６５まで培養し、集菌した菌体から実
施例１（１）ｐＣＥ５３の単離法と同様な方法てプラス
ミドを単離した。
これらのプラスミドを制限酵素油化とアガロースゲル電
気泳動て解析した結果、各種制限酵素切断様式で肪徴付
けられるｐＥａｒｇｌと同−の構造を杓するものがある
ことがわかつた。このような形質転換株がコリネバタブ
リウド・グルタミクムＫ４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３５６）
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＫ４７（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−３６７）、およびブレビハクゾリウム・フラブ
ムＫ４８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３５７）である。
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣｌ３８６
８．ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７
およびそれらのｐＥａｒｇｌ保有株のＬ−アルギニン生
産試験を行った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培
養した種培養０．５ｍｌを生産培地〔廃糖蜜８０ｇ（グ
ルコース換算）、（ＮＨ４）２ＳＯ４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ
４０，５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＣａＣＯ３２０ｇ
を水１ｌに含み、ｐＨ７．０に調整した培地〕の入った
試験管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養
後、培養浦波をペーパークロマトクラフィーにかけ、ニ
ンヒドリン発色後比色定量してＬ−アルギニン生成量を
測定した。
結果を第１表に示す。
第１表
【図面の簡単な説明】
第１図は、ｐＥａｒｇｌの作製工程を示す。 制限酵素切断地図作製に用いた制限酵素は、Ｐｓｔｌ、
ＢａｍＨｌおよびＳａｉｌである。 プラスミドの分子量はキロベース（Ｋｂ）で表示されて
いる。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社手続補正書
（方式） 昭和５９年２月２０日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１７６７５８号 ２、発明の名称 Ｌ−アルギニンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係特許出願人 住所東京都千代ＩＢ区大手町−丁目６番１号名゛称（＋
０２）ｊｆｊ和醗酵］二業株式会社（ＴＢＬ：０３−２
＋１１−７２１１内線２７５＋）５、補正の対象 明細書 手続す１１正書 昭和５９年８月（０日 １事件の表示 昭和５８年特許願第１７６７５８号 ２発明の名称 Ｌ−アルギニンの製造法 ３、補正をする者 事イＺｌとの関係ｆ１丁許出願人 郵便番号１００ 住所東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称（１０２
＞＋Ｋｊ和醗酵工業株式会社（丁目、＋０３−２０１−
７２１１内線２７５１）明細古の発明の詳細な説明の憫 ５、補正の内容

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤ
    ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せ
    しめたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物を培地中に培養し、培養物中にＬ−ア
    ルギニンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アルギニ
    ンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法
    。
  2. （２）該遺伝子が原核生物、真核生物、バクデリオファ
    ーシ、ウィルスまたはプラスミドに由来することを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の製造法
  3. （３）該原核生物がエッシエリヒγ属、コリネバクテリ
    ウム属、ブレビバクゾリウム属、ミクロバクテリウム属
    、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッ
    カス属またはセラチア属に属する細菌由来の遺伝子であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の製造法
    。
  4. （４）該ベクターが、コリネバクテリウム属またはブレ
    ビバクテリウム属に属する微生物に由来するベクターな
    らびにその誘導体であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の製造法。
  5. （５）該ベクターがｐｃＧｌ、ｐＣＧ２．ｐＣＧ４、ｐ
    ｃＧｌｌ、ｐＣＥ５３．ｐＣＥ５４および、ｐＣＢｌｏ
    ｌから選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の製造法。
JP58176758A 1983-02-17 1983-09-24 Ｌ−アルギニンの製造法 Granted JPS6066989A (ja)

Priority Applications (25)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58176758A JPS6066989A (ja) 1983-09-24 1983-09-24 Ｌ−アルギニンの製造法
DE89108171T DE3486232T2 (de) 1983-02-17 1984-02-16 Verfahren zur Herstellung von L-Arginin.
EP89108172A EP0332234B1 (en) 1983-02-17 1984-02-16 Process for preparing l-tyrosine
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