JPS6069554A - 固体表面上の比色免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的流体、例えば血清又は尿、の中の抗゛原或は抗
体の未知量の測定技術が多数公知されている。汎用の二
方法は標識された免疫化学剤を利用する拮抗結合式免疫
検定法及びサンドイッチ式免疫検定法である。例えば試
料中の未知抗原の検出のための代表的サンドインチ技法
においては未知抗原検出用抗体を固体表面に結合させ、
これと抗原と反応させる。固体表面の洗浄後に該表面と
標識抗体とを反応させ、徐脈抗体の結合量を測定し、こ
れを血清試料中の抗原最の目安とする。拮抗技法におい
ては固体表面に結合した抗体と未知量の被検抗原含肩試
料とを接触させると共に同じ型の標識抗原とも接触きせ
る。洗浄後に、該表面上に結合した徐織抗原鷲を測定し
、これを試料中の未知抗ｌｔａ量の間接的な目安とする
。公知の標識は放射性の型又は螢光測定型の標識であっ
てこれらは器具使用下に検出され、又比色標識は代表的
には酵素標識であってこれは対応基質を着色基質に転化
させる。

拮抗技法のひとつにおいては酵素標識抗原及び抗体被覆
管の使用下に抗原を検定する（　Ｅｎｇｖａｌｌｅｔ　
ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、８ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ、　２　！；　／（ｌり７／）、≠ｊ７−ＩＡ３≠〕
。この技法において試験性壁に結合した抗体と未知抗原
含有流体試料と接触させ、又既知量のＢツ識抗原とも接
触させ、かようにして免疫学的反応生成物を生成させる
。洗浄後にこの試験管に基質含有宕液を満たすと基質は
抗原上酵素標識の存在下に変色を起す。

この反応を停止させるための化学的停止剤を加え、可溶
形の基質を含む基質溶液をミクロキュベツトの中に入れ
る。溶液中の基質の変色度を特定波長における溶液の輻
射線吸収の測定によって検定する。ところがこの系には
いくつかの欠点、即ち個々の検定器具使用の必要、試験
成績記録の永久化不可能、酵素反応の化学的停止用溶液
の必要、及び基質溶液中に洗い落とされて基質を変化さ
せた表面非結合の標識抗原にもとづく不正確さが含まれ
る点でするのである。

池の免疫検定法においては標識物質を−表面上に沈積さ
せてこれを直接読み取る。・・ルテ（Ｈａｒｔｅ　）の
米国特許第≠／３３乙３タ　号明痴１晦に開示されてい
る系の主事項によれば螢光色素で標識された物質を不浸
透性の連続表面上に沈積させ、この表面を螢光計で読み
取る、−２この糸は又放射線免疫検定法における放射能
標識の検出及び分光光度計による検出へ適用可能である
と該明細書に記載されている。更に上記米国特許明細書
第７欄、２３〜３ｇ行において酸系が、例えばペス等の
文献（Ｐｅ５ｃｅ　ｅｔ　ａｔ−ｓ　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、　２０／　３　＋３３；３−３３；り）に開示さ
れているような酵素標識系の使用にも又適用され得るこ
とが示唆されている。この糸においては可溶性基質を呈
色形基質へ転化させることによって発色させ、この色度
を溶液中で分光光度計によって読み取る。−・・ルテの
特許明ｍ書は診−１剤が試験管（支持体）に吸看されて
いる（共有結合ではなく）点で該・・ルテの方法がペス
の方法と異ることを述べている。・・ルテの特許方法の
主特徴は器具使用下の直接的読み取りにあるけれどもペ
スの方法を表面の直接読み取りへ適用するためにどうす
るかについてハルテは何も示唆しない。

本発明に従えば固体表面上の色の目による直接観察にも
とづく抗原又は抗体の比色免疫検定法・が提供される。

流体試料中の抗原の検出のためのサンドイッチ式免疫検
定法によれば未知抗原含有試料と１固体表面へ層状に結
合した固定化抗体を含有する固相１とを接触させ、又可
溶性の酵素標識抗体とも接触させる。同相を洗って未反
応可溶性の酵素標識抗体を除去するっ次にこの固相と１
＃ｆ素に対する可溶性基質を含有する溶液１とを接触さ
せてこの基質を不溶性着色基質へ転化させ、これを同相
上に沈積させる。その後に固相を基質溶液から分離し、
これを肉眼で読み取って被検抗原の半定量的表示とする
。この糸は又同様なサンドイッチ式技法による未知抗体
の検出にも適用可能である。好ましい固体表面は浸漬片
の不浸透性連続表面である。けれども他の固体表面例え
ばビード（ガラス玉）を使用し得る。この系は又拮抗式
の比色免疫検定法にも適用可能で゛ある。この系は被検
抗原がヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモンである妊嫂の検
出に、及び抗原が黄体形成ホルモンである排卵の検出に
適用可能である。

本発明の免疫検定法の使用によって下記の諸利益が達成
される。抗体又は抗原の直接標識化とは反対に酵素−基
質の拡大されたシグナルにもとづく増大された感度が提
供される。酵素標識の洗浄不完全にもとづく１基底値に
よる妨害（バッグラウンド　ノイズ）ｌは基質溶液の読
み取りでなく固体表面の直接読み取りによって最少化さ
れる。

その理由は該基質溶液は未結合の酵素標識物質を含有し
、この物質は洗浄によって除去されなかったものである
ことにある。更に、浸漬片上の酵素反応は浸漬片を溶液
から取り出して水ですすぐこと、任意に吸取紙で水を吸
取ることにより容易に停止する。このことは可溶性基質
を溶液中で読み取る場合には化学停止剤溶液を必要とす
ることと対照的である。更に呈色した浸漬片を試験成績
の永久記録として使用し得る。浸漬片上の色の濃度を肉
眼観察し、これを呈色図表又は対照浸漬片と比較するこ
とにより試験成績の半定量的測定を達成する。更に本発
明方法は実施に際し器具を必要としないので家内試験市
場（ｈｏｍｅ　ｔｅｓｔ　ｍａｒｋｅｔ　）に使用し得
る。かようなことから器具不使用の池の検定方法例えば
凝集反応試験による方法におけるよりも比色定量終点を
容易に読み取り得る。

本発明は酵素標識を用いる免疫検定法に関するものであ
って未知物質を直接に固体表面上で比色定量方式で検出
する。更に詳細には本方法は血清又は尿の如き生物学的
に誘導された流体試料中の抗原或は抗体の検出に関連す
る。

本方法は慣用のサンドインチ技法又は拮抗技法を使用す
る。酵素標識診断剤を固体表面へ免疫学的に結合させ、
酵素と可溶性基質とが相互作用を行う結果として基質が
不溶性着色形に転化して固相上に沈積物として析出する
ようにする。同相を反応容器から取出して任意にこれを
洗浄する。同相表面上色を直接肉眼観察することにより
試料中の未知物質量を測定し得る。

説明を簡単にするために本発明方法を抗原のすンドイツ
テ型比色式免疫検定法に関して先ず記述する。酵素標識
使用の有効なサンドイッチ型方式は文献（Ｗａｄａ＋　
）−１，Ｇ、ｐ　ｅｔ　ａｌ−ｓ　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ
ｍ。

、２ど／り、／ど２ノ〜／♂乙乙）に述べられている。

このサンドインチ系は生物学的誘導試料中の抗原の検出
について記載されている。

サンドイッチ技法においては周体表面例えば浸漬片の反
応部分の上で抗体を結合層として固定化する。次にこの
固相を抗原含有流体試料と接触させ、及び抗原と免疫学
的に反応する酵素標識抗体と接触させる。抗原は同相上
の固定化抗体に対して結合し、及び固相上の標識抗体と
結合し、かようにして固体表面＊抗体＊抗原＊酵素標識
抗体から成るように反応生成物を形成する。但し１＊１
印は結合を意味する。例えば表面と抗体との結合は共有
結合又は吸着結合であり得る。固定化抗体と抗原との結
合、抗原と標識抗体との結合は免疫学的結合から成る。

反応生成物の形成後に未反応可溶性酵素標識抗体から同
相を分別し、好ましくは洗浄する。次に酵素に対する可
溶性基質を含有する溶液と固相とを反応させて基質を不
溶性着色形に転化させ、これを面相上に沈積させて肉眼
で識別し得る色を固相に与える。この表面を基質から分
離し、試料中の抗原社の表示としての色を観察する。該
表面から吸取紙で残留基質を除くか又は該表面を水です
すぐことにより残留基質を除き酵素反応を完了させると
共に反応したＭ　ｒｔＪ片の貯蔵を果す。

抗原又は抗体によって積層化された固体表面は非膨潤性
、不浸透性の連続表面から成る。１不浸透性１という用
語には洗浄の際に試薬類を実質的に吸収し保持し得る表
面を意味し、例えばｐ紙は含まれない。換言すれば固体
衣・面は液体に対して充分に不浸透性であって洗浄によ
り未結合試薬を有効に除去し得るものであらねばならな
い。浸漬片の色は白色又は池の色であって着色を強調す
るものである。所望ならばｆ２漬片以外の固相として例
えばガラス基の固状表面をも使用し得る。

積層される表面の化学的性質は例えば抗原又は抗体の結
合を可能にする性質である。共有結合のために適切な表
面はグラスチック例えばプリメチルメタクリレート、ポ
リメチ１フン、ｌリエチレンポリーテレ７タレート、エ
チレングリコールポリエステル、ヂリグレビレン、及び
類似物を包含する。典型的な場合において診断剤（抗原
又は抗体）をプラスチックシートに結合させ、これを反
応容器例えば試験管の中への浸漬に適する浸漬片の好適
形状に切断する。′浸漬片１という用語は把持部分と反
応表面部分とを具えた用具を意味する。

共有結合のためには間接的カップリング即ち陽断剤の官
能にと反応し得るカップリング剤がポリマー表面と診断
剤との間の架橋として役立つ該カップリングを使用し得
る。該官能基はアミン基、ヒドロキシル基、メルカプト
基、アミド基及ヒカルボキシル基を包含する。ポリマー
と診断剤とをカンプリングさせる適切なカップリング技
法はぺ二ヒ（８ｅｎｎｌｃｈ　）等の米１１％ｆｆｍ３
７２０７乙０　号明細書に記載されているＵ成場合に固
定化されるべき診断剤を共有結合的に結合させずにこれ
を固体表面上に吸着によって被覆し得る。

特殊技法において浸漬片に対する抗体の共有結合による
結合はアガロース又はその池の親水性ポリマー例えばポ
リサッカライド、ポリエチレングリコール　ｆリペプチ
ド及び類似物のフィルムを用いてプラスチック表面を予
（ｆ、ｄ　Ｍ　ｆｆｉすることによって達成される。次
にこの親水性被覆物に対し抗体又は抗原を共有結合によ
って付着させる。親水性被覆はプラスチック表面に対す
る分析物又は酵素−接合物の疎水性相互作用による非特
異的結合を回避するものである。従ってこの型の浸漬片
は基底結合（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　
）を最少化する。

次工程として、固定化された抗体−含有固相と被検未知
抗原含有の生物学的誘導流体試料、代表的には血清又は
尿とを接触させる。固定化抗体と酵素標識抗体とは共に
抗原と免疫学的に反応して固体表面＊抗体＊抗原＊酵素
標識抗体から成る反応生成・物を生成する。このサンド
イッチ技法に対しいかなる既知の慣用の添加順序方式を
使用してもよい。例えば抗原、固定化抗体、標識抗体を
同時に相互に加えてもよい。この技法において＠識抗体
としてモノクロナル抗体の使用が好ましく、かようにし
て固定化抗体と標識抗体とによる交差封Ｍ　（ｃｒｏｓ
ｓ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　）　の問題を最少化する。

他の技法即ち１７オアワード（ｆｏｒｗａｒｄ　）　’
サンドインチ式検定法においては抗原と原鉱抗体との反
応以前に抗原と固定化抗体とを反応させる０この場合に
抗原と固定化抗体とを恒温保持した後に表面を洗って未
結合物質を除き、その後に標識抗体を加える。

更に１リノゞ−ス（ｒｅｖｅｒｓｅ　）　”サンドイン
チ弐検定法が使用されてもよく、この場合においては抗
原と標識抗体とを混合し、恒温保持を行い又蚤よ行わず
、その後に固定化抗体と接Ｍ　ｇせる。６Ｊ１究者らは
添加順序を上記のようにすると感度を増し、恒温保持時
間を減する利益があることをピアノ（Ｐｉａｓｓｏ　）
　Ｑの米国特許ｍ　４ＬＯり、！ｉ′♂７６号明細書中
で示唆している〇 固定化抗体−抗原一酵素勘荒抗体を含有する固相を形成
させる反応の後に末反応可溶性酢素徴詭抗体含有溶液か
ら該同相を分別する。好ましくはこの工程に続いて洗浄
工程を行って同相表面から未結合標識抗体を除去する・
〕 その後に、分別された固相と酵素に対する可溶性基質含
有溶液とを接触させる。本発明の重要な一郭様として酵
素存在下に基質は可俗形から不溶形へ転化するタイプの
基質である。酵素は同相表面上に存在するので同相上の
酵素によって活性化された不溶性基質は直接同相上に沈
積する。この目的のために基質溶液含有試験管中で浸漬
可能な浸漬片の反応表面を固相として使用することが好
適である。

沈積した基質は肉眼で職別される着色型のものである。

本発明の一郭様において基質は本来無着色のものであり
、酵素存在下に着色型に転化される。池の一郭様におい
て可溶性基質は初めは有色又は暗色であり、沈積時には
第二の色又は第二の暗色へ転化する。

酵素が基質を不溶性有色基質へ転化させるために充分な
反応時間の経過後に固相を基質溶液から分別する□同相
上の肉眼識別可能色の存在は生物学的誘導流体が被検抗
原を含有することの表示である。同相上の色度は生物学
的流体中の抗原濃度の半定量的成績に資するものである
。即ち該色度は抗原濃度に比例する。同相上の色と色度
図表又は対照固相例えば浸漬片表面とを比較することに
より試験結果について半定量的成績を得る。器具例えば
不透明浸漬片を用いる反射光測定器、又は光学的に透明
な浸漬片を用いる分光光度計の使用はこの試験法の定シ
的性格を強化し得る。

酵素と接合した抗原又は抗体は７個又は複数個の共有結
合によって結合される慣用の技法によって生成されるこ
とが好ましい。共有結合は外部からのカンプリング分子
又は架橋分子の添加により、又は存在する側鎖の直接的
な縮合により遂行される。この目的達成のための２価架
橋剤は当業界で周知されている。

本発明方法の一利点は洗浄工程が特に迅速であることで
あり、酵素の恒温保持後及び基質との接触前に固相（浸
漬片）を迅速にすすぎ得ることである。本性において未
結合酵素は臨界的でなく、洗浄不充分であった酵素−抗
体は基質溶液中へ拡散するので固相上に直接沈積するこ
とはない。従って洗浄不充分による基底値による妨害は
最少化される。

基質溶液の読み取りに比する本発明方法の他の利点は所
望の終点のところで酵素−基質反応を容易に停止させる
ことである。即ち基質反応を停止させる適当時開のとこ
ろで浸ｉＷ片を酵素溶液から取出す。これは停止用化学
剤溶液を使用する場合の溶液の読み取りと対照的である
。

本発明方法のその他の利点は基質としての染料が充分な
安定性をもつ限り試験結果の永久記録として呈色浸漬片
を使用し得ることである。

上記のサンドイッチ式技法は固定化抗体と可溶性酵素標
識抗体とを用いる生物学的誘導流体中の未知抗原の測定
に関して記述された。本方法は被検抗原がヒトの絨毛膜
生殖腺刺激ホルモンである妊娠の検出のために特に有効
である。更に本方法は被検抗原が黄体形成ホルモンであ
る排卵の検出に使用され得る。又本方法は或抗原に対し
て適切な抗体が生成される場合の該抗原の測定に適用可
能である。

サンドインチ式技法は本性において抗体の測定にも適用
可能である。この場合に固体表面に固定された抗体の代
りに固定化抗原を用い、酵素標識抗体の代りに酵素標識
抗−免疫グルブリンを用いる。その他の点においては既
述の事柄が適用される。

サンドイッチ式技法によって生成された最終反応生成物
の一好適例は免疫検定法に用いる反応済みの浸漬片であ
る。この浸漬片において固体の反応表面部分は結合した
連続層であって次の通りである。第１層は抗原に免疫学
的に結合した抗体である。この抗原は酵素弊履抗体に免
疫学的に結合している。この連続層の表面上に肉眼識別
可能の着色基質が沈積している。この基質は酵素存在下
に可溶形から沈積有色形に転化した型の基質である。既
述の通り適切な抗原にはヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモ
ン（ｈｃＧ）及び黄体形成ホルモン（ｈＬ＋）が包含さ
れる。

本発明は生物学的誘導流体試料中の被検抗原の比色免疫
検定法のためのいわゆる拮抗式結合技術にも又応用ｉｆ
能である。この場合に層内の固定化抗体は既述の方式と
同じ方式で固体表面に結合して固相を形成する。固相は
被検抗原含有の生物学的誘導流体と接触し、及び被検抗
原と同型の酔素標職抗原とも接触する。固定化抗体と１
（ｊ）被検抗原及び（ｂ）酵素ｍ識抗原１の双方との間
に拮抗式免疫学的反応が起ることとなる。即ち生物学的
誘導流体中の被検抗原の濃度は同相に結合している酵素
標識抗体と逆比例する。

上述の拮抗式の反応の後に工程（ａ′、からの固相を液
相から分別する。好ましく（二表面を洗って表面から未
結合の酵素標識抗体を除去する。

次に分別された固相を可溶性の酵素用基質を含有する溶
液と接触させ、基質を不溶形に転化させて固相上に沈積
させるとこれは着色して肉眼識別可能となる。固相を基
質溶液から分別し生物学的誘導試料中の被検抗原量に対
する逆比例的表示を読み取る。即ち固体表面上の色度は
被検抗原の存在量の減少につれて増加する。

サンドインチ式技法に関する本発明の操作及び利点の詳
細についてなされた上文中の説明は同様に拮抗式技法に
対しても又適用される。

浩抗式技法における同様な反応生成物は固体の反応表面
部分をもつ反応性の浸漬片を包含する。

表置部分に結合しているものは抗体層であってその少く
とも一部分は酵素標識抗体に対する免疫学的結合層、及
び該層上に沈積した肉眼識別可能の着色基質である。基
′ぽは酵素存在下に可溶形から沈積有色形へ転化される
型のものである。

上述の通り適切な基質溶液は浸漬片又はその他の固体の
表面上に沈積する不俗性反応牛成物を生成する型のもの
である。特に有効な酵素−基質の組合せはアルカリホス
ファターゼ酵素とその基質、Ｉａｌ　も、ｆ　−７”　
ｏ　モー≠−りロロー３−イントリルホスフェート（通
常はＢＣＩＰと称される）である。

このものは著しく安定なホスファターゼ基質であって組
織切片のホス７ｒターゼ活性検出用の組織化学用蒲色剤
として使用される。アミノ−アルコール緩衝液中のＢＣ
ＩＰの酵宏化学的脱ホスフオリル化はインドリル−３−
オール誘導体を生成し、このものは二魚体化して青色不
溶性生成物を与えるＯ アルカＪｊホスファターゼ用のその他の基質を第１表に
示す： 本発明の例示のために以下に路側を示す。

例　／ 二 本例は寒天を積層したポリテレ７タレートエチレングリ
ｊ　−ｋ　［？イラー（Ｍｙｌｅｒ　）　：］の００１
．２ｍｍのシート（以下に１シート１という）上のα−
ヒト−黄体ル成ホルモンに対する抗体の固定化及びそれ
に次ぐ浸漬片製造を示すものである。

シートはＦＭＣビオゾロプロツ（ＦＭＣＢｌ。

Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｌ　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　ｓ　Ｍａｌ
ｎｅ　）により商標名Ｇｅｌ　Ｂｏｎｄの下に供給され
る。

シートを水に３分間浸漬し、カップルされるべきアガロ
ース被覆部分を２０−．２弘℃において３０分間メタ−
過ヨウ素酸ナトリウムの２０　ｍＭ水溶液中に浸漬した
。過ヨウ酸ナトリウム溶液から取出されたシートを脱イ
オン水で３回洗ってからヒトの黄体杉成ホルモン（ｈＬ
Ｈ）のα−サブユニット及びヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホ
ルモン（ｈＣＧ）に特異的なモノクロナル抗体のｊＯｐ
ｖ’−を含む緩＠溶液（０，／　Ｍ　ＮａｚＣＯｓ　、
０．！；　Ｍ　ＮａＣｔ−＃９．２＞中に２〜ｇ℃で終
夜恒温保持した。該抗体は肺臓す／・９球とマウス骨髄
腫細胞との交雑及びそれに続く分校糸形成（クローン化
）〔コーレル及びミルシーＬ　／イｙ　（Ｋｏｈｌｅｒ
　ａｎｄ　ｒＡｉｌｓｔｅｉｎ　）の文献Ｎａｔｕｒｅ
、　２３　Ａ　、　１１−９　！；−４１ター４１タタ
Ｃ）記載の方法〕によって得ら、ｔシた。恒温保持に次
（１でこのシートを水素化ホウＺ　ｌ＝す）　＋７つｌ
、水溶液（／、　ＯＴｎ９／　ｍ／’）により≠℃で３
０分間処理し、既述のリン酸塩緩衝食塩（ＰＢＳ）溶液
で３回洗ったＯ 反応済みのシートはシートに永久的に結合した均一な抗
体層を南していた。

このシートを真空下に終夜脱湿処理してから乾燥貯蔵し
た。紙切刃を世いてこのシートを乙ｍｍ　Ｘ≠ｉｎ　（
Ａｒｎｍ　Ｘ／　０．／６鐘）の浸漬片に切断してから
脱湿貯蔵した。

例　２ 吸着抗体を有する浸１．′７片の製造 ポリステレｙ（Ｄｏｗ　−４’ｌ’Ａ又はＣｏ５ｄｅｎ
ｉ　Ｊ　Ｊ　Ｅ　；ｆｔリスチレン）から押出により成
形さｉｌ、油脂類を洗去された≠ｉｎＸ／　／−ｄｉｎ
Ｘぬ１ｎ（１０，／乙ぼ×２ｇ、！；７ｃｍＸ０．０７
１　ｃｒｎ）の白色ポリスチレンシートの幅広端部（２
ｇ、　５７　ｃｍ　）を！ｒ　ＯｍＭのリン酸ナトリウ
ム、０．９　ｗ／ｖ　ＮａＣ１、ｒＪ４７０及びｈＬＨ
のα−サブユニットとｈ　ＣＧとに対して’ｌ＋！異的
なモノク【コカル抗体の！ｒｐｇ／−を含有するＰｕＳ
の中に汗漬することにより該白色ポリスチレンシートを
被覆した。被償用溶液中で７５ｍｍの高さにまでこのシ
ートを浸漬してから室温下におよそ２１１．時間恒温保
持した。過剰の抗体を洗去しシートをＰＢＳＫ浸漬する
に際しＰＢＳを３回取替えた。洗浄後のシートを真空下
に終夜脱ｉした。乾燥シートを紙切刃を用い乙ｍｍ　Ｘ
　４ｔｉｎ（乙ｍｍＸ１０．／乙儂）の浸漬片に切断し
てから脱湿貯蔵した。

例　３ 本例は試料固体相及び標識抗体の１同時的１恒温保持に
よるｈＬＨに対する非拮抗型検定法に用いられる検量線
を設定するための例！で製造された浸漬片の使用例を示
す。

ｈＬＨ（Ｄβ−サブユニットに特異的ナモ／　ｙ　。

ナル抗体の貯蔵溶液を例／に引用されたコーレル及びミ
ルシュタインの文献記載に従って調製した０次にこの抗
体をエングバル［Ｅ、　Ｅｎｇｖａｌｌ　ＩＭｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７０　＋弘／ター
弘と３（／りにＯ）〕の方法に従って牛腸内アルカリホ
スファターゼと接合させた。得られた接合物は約２：ｌ
の酵素一対一抗体比を有し最終的に得られた接合物溶液
は≠００ｍｍ　）リス（Ｔｒｉｓ　）　ＨＣｔ中希釈の
活性抗体にもとづき濃度約３乙ｎ　ｇ　／　ｔｎｌ　。

ｐｉ−１７，！；、／ｍ９／−牛血清アルフミン、０．
　Ｏｌｌ−％ト・ウィン（Ｔｗｅｅｎ　）　−２０（ポ
リオキシエチレンンルビタン七ノラウレート：このもの
はＡｔｌａｓＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
　、　Ｉｎｃ、＊　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　＊Ｄｅｌａ
ｗａｒｅ　から提供される非イオノ性界活である）を有
していた。この溶液のｊＯＯμｌを／　Ｏｍｍ　Ｘ　７
３　ｍｍの培養管へ入れた。

次にｈＬＨの既知量を添加された人尿溶液（５００μｔ
）を加えてこの混合物を攪拌した。７個の人尿溶液試料
を０６０〜７．Ｏｎｇ／ｍｔ（０−乙θｍ　ｌ　Ｕ　／
ｍｌ　）の濃度変化において１０ｍ１Ｕ／−の間隔を置
いて使用し夫々試料／〜７と標示した。

一端から／、　！ｒ　ｃｍの長さだけ隔てられた部分の
両側面をα−抗体で被覆した長さＩＡＯｉｎ　（１０，
ｌｌ。

ｃｌｎ、　）幅Ａ　ｍｍの浸漬片を例２で製造されたシ
ートから切り取った。この浸漬片の抗体被覆部分が充分
に浸漬されるようにこの浸漬片を反応管中へ入れて￥温
に３０分間恒温保持・した。それから浸漬片を取出して
水道水流で浸漬片の両側をすすいだ。

過剰水を振り落して浸漬片をｐｌ（り〜ｌ／において／
　Ｏｍｍ　Ｘ　７３　ｍｍ培養管内の４０ｍ９／艷のＢ
ＣＩＰ（ｊ−プロモーグークロロ−３−インドリル−ボ
スフェート）及び適宜のアミノアルコール緩彷剤即ちア
ミノメチルプロ／４ノールから成る基質溶液の４０−中
へ入れた。反応物を室温下に３０〜ｔｏ分間放置し、そ
の時点で浸漬片を基質溶液から取出し水ですすいでから
風乾した。

上記の７試料の夫々から得られた結果は欠配の通りであ
った： 試料／浸漬片は呈色しなかった。試料！浸漬片は淡青色
を示した。色度はｈＬＨ濃度に直接比例して試料！から
試料７まで漸増した。未知試料のｈＬＨレベルは既述の
対照浸漬片と肉眼ｏ：ｌこ比較することにより半装置的
に検定され得る０例　弘 透明なマイラーの浸漬片の代りに例二で製造された浸漬
片を用いこれを例３記載のサンドイッチ式検定法に使用
した。浸漬片の呈色端部を分光光度計の光路内に置いて
浸漬片上に沈積した青色染料を分光光度Ｎ１使用下に読
み取った。ＢＣＩＰ基質使用の場合にはその吸収を６２
０　ｎｍにおいて読み取った。

基質の恒温保持１時間の場合の一連の試験における分光
光度計による透明浸漬片の読みの値を第２表に示す： 例　ｊ 本例はｈＣＧに対する非拮抗式検定のための検量線を作
る目的で例／製造による浸漬片の使用を示す例であって
試料及び固相の１７オアワード（ｆｏｒｗａｒｄ　）　
”順次恒温保持の方式並びに標識抗体使用Ｆの第二恒温
保持の方式を用いる。

例／に引用されたコーレル及びミルシュタイ／の方法に
従いｈＣＧのβ−サブユニッ（・に特異的なモノクロナ
ル抗体の貯蔵溶液を調製した。次に例３に引用されたエ
ングパルの方法に従って該抗体を牛腸内アルカリホスフ
ァターゼと接合させた。

得られた接合体は酵素−討一抗体比約、２：／を有し、
最終的な接合体溶液はｊＯｍＭ）！ＪスーＨＣＩ　。

０．０６’＋％　（ｗ／ｖ　）　ＮａＣ１、／　ｍ９　
／　ｍｌ　（Ｄ牛面清アルフミｙ　、　ｐｉ（７，５、
０，０４ｔ％ト’）イア−２０中に希釈された活性抗体
にもとづき濃度的／θＯｎｇ／−を有していた。

この溶液／−を１０　ｍｍ　、ｘ　７　！ｒ　ｍｍ　＠
養背へ人れた。長さｌ／ｌｉｎ　（１０，／乙ｃｍ　）
　幅乙ｍｍを有しその一端から／、　、！ｊ　ａｎ離れ
た個所でその両側がα−抗体で被覆されている浸漬片を
側御で製造されたシートから切Ｊ１につた。この浸漬片
を０〜．２　’００　ｎｇ／ｆｎｌのｈＣＧ（θ〜１０
００　ｒｒ＋ｌＬｌ／ｍ　）を含有する６個の尿試料の
夫々の中へ、抗体被覆部分が完全に浸漬されるようにし
て浸漬し、室温で５分間恒温保持し／こ。次にこの浸漬
片を尿試料から取出し酵素接合体を有する／□ｍｍＸ７
ｊ＋ｎｍ培養管中で室温下にｊ〜１０分間恒湿保投１．
た。次いで浸漬片を取出しビーカー内で、う、歎留水又
は水道水で浸漬片が渦＠き状を呈するよう釦し１洗った
。過剰水を撮り切ってから？！漬片をＡθ−の基質溶液
中に入れた。この基質溶液は７０ｍｍＸ７５ｍｍ培養’
ｉｆ　内テ／　ｍ９／　ｔｎｌのＢＣＩＰ及び適宜のア
ミノアル：ｚ　−ル緩ｉ剤例えばアはノ〆チルプａ／や
／　−ルｉｐら成るμｍ２−／／の溶液であったＵ室温
で１０〜２０分１）ｆ１反応を行い、この時点で浸漬片
を基質溶液から取出して水を吸敞紙で吸取るか又は水で
すすいだ後に風乾した。

試料・中のｈ（、Ｇ量に直接比例する青の呈色により尿
中ｈＣＧ　の夫々の量が浸漬片に示された。

ｈＣＧ不含尿試料については浸漬片が白色又は無色であ
った。未知試料又は希釈未知試料は上述の対照浸漬片を
１［」いて肉眼的に比較することにより半定量的に測症
され得る。所望のカプトオフ（ｃｕｔ　ｏｆｆ　）によ
る検量線の単用にもとづきこの肉眼検査を用いて妊娠検
出用の定性帖果を測定し得る。定性試験用の所望のカッ
トオフに肉眼検査を限定するように試験感度を調節する
ことも可能である。

例　乙 本例はマウスのＩｇＧに対する拮抗式の酵素免疫検定法
に用いる検量線作成のために例２に従って製造された浸
漬片の使用を示す。

クサギ抗血清から硫酸アンモニウム分画により調製され
た抗−マウスＩｇＧ　（Ｆｏ　％異的）を例１の操作に
従う列？リスチレンシート被覆に用いた。

例３記載のようにして七ノクロナルマウスＩｇＧ□を牛
腸内アルカリホスファターゼと接合させた。

このアルカリホスファターゼ結合マウスＩｇＧ工を試験
用緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣ７、声Ｚｊ。

０．０６≠　％ＮａＣ１、０，０’Ａ’ｌＡ　）　ウ（
７−２゜。

７ｍ９／−牛血清アルブミン）中で／：、２０θθに希
釈した後にこれを下記のマウスＩｇＧに対する拮抗型Ｅ
ＩＡにおける標識抗原として使用した。

異る夫々の量のＩｇＧ工を含むリン酸塩緩衝食塩溶液（
７０ｍＭ　リｙｒｒｚナトリｓｔ　ム、、ｐＨ７０、０
，９％ＮａＣｔ）中のマウス１ｇＧ溶液＜１ｏｏｐｔ）
を試験用緩衝液中のりｏ　ｏ　ｐｔのＷ織抗原を有する
／　Ｏｍｍ　Ｘ　７　！ｉ’　ｍｍ　＠養管中に加えた
ｏＯ−０，ｉ〃ノ９／−の範囲に変化する濃度を有する
６個のマウスＩｇＧ１溶液を使用した。

長さ１Ａｉｎ（１０，／乙ｃｒｔｔ）幅乙ｍｍを有し一
端から！、θ（１ｍ隔てた個所を抗−マウスＩｇＧ（Ｆ
　％異的）で両側共に被覆された浸漬片を既述のように
して製造されたシートから切取った。この浸漬片を反応
管の中へ入れて抗体被覆個所が充分に浸漬するようにし
、室温で３０分間恒温保持した。

それから試験片を取出してその両側を水道水で短時間す
すいだ。過剰水を振って落としてから適宜のアミノアル
コール緩術剤例えばアミノメチルプｏ　ｐ４　／　−ｎ
、中１）／、０１ｎＪ９／ｍｌＢ　ＣＩ　Ｐ含有のｐｉ
イア〜ｌ／の基質溶液／、　Ｏｍｔの中に入れた。反応
を室温で７０分間行ってその時点で浸漬片を基質溶液か
ら取出した。静かに吸取紙で水を吸取った後に浸漬片を
風乾した。

浸漬片上の宵の呈色強度と試料中のマウスＩｇＧ量との
間に反比例の関係があった。対照浸漬片を用いる肉眼的
比較により未知試料又は希釈未知試料の半定量的検定が
可能である。

上文において本発明を例示により幾分＋１π細に記述し
たけれどもこれらは理解を明かにするためであり、本発
明の範囲内において成程度の変改と修整とを施し得るこ
とは自明であろう。

第１頁の続き ０発　明　者　ダグラス　ディ　ラン　アドル ｏ発　明　者　ケニス　シー　カスパ　アール ０発　明　者　ジョン　シー　ランク　アフオード　ス メリカ合衆国　カリフォルニア州　９４３０１パロ　ア
ルトリンカーン　アベニュー８１７ メリカ合衆国　カリフォルニア州　９４０８６サニーヴ
エイサウス　フランセス　５８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）固体表面使用による生物学的誘導流体試料中の被
   検抗原のサンドイッチ式の比色免疫検定方法において、 ｆａ）　被検抗原含有の生物学的誘導流体試料と、固体
   表面上に層状に結合した固定化抗体を有する同相とを接
   触させ、及び上記流体試料と可倍性酵素標識抗体とを接
   触させ、固定化抗体と酵素−脈抗体とを上記抗原に対し
   免疫ｉ的に反応させ、かようにして固相上の固定化抗体
   と標識抗体との双方に対して抗原を免疫学的に結合させ
   ： （ｂ）　未反応可溶性酵素標識抗体を含有する溶液から
   固相を分別し； （Ｃ）　上記工程（ｂ）から分別された同相と酵素に対
   する可溶性基質を含有する溶液とを接触させて基質をそ
   の不溶性有色形に転化させこれを同相上に沈積させて生
   物学的誘導流体試料中の被検抗原の存在を示すために肉
   眼識別可能に着色させ；そして （ｄ）　該固相を基質溶液から分別する各工程を包含す
   ることを特徴とする前記の方法。 （２）酵素−標識抗体の該抗体がモノクロ−Ｆル抗体で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）工程（ａ）において固定化抗体及び酵素標識抗体
   と抗原とを同時に反応させる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 （４）抗原と標識抗体とを反応させる以前に該抗原と固
   定化抗体とを反応させる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 （５）　固定化抗体との反応後に、及び標識抗体との反
   応前に、固相の洗浄工程を伴う特許請求の範囲第を項記
   載の方法。 （６）工程（ｂ）の後に、及び工程（Ｃ）の前に固相の
   、洗浄工程を伴う特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７ン　固体表面が浸漬片の反応表面部分である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 （８）　固体表面がガラス玉である特許請求の範囲第７
   項記載の方法。 （９）　同体表面が液体に対し充分に不浸透性であって
   未結合試薬が洗浄により実質的完全に除去されるもので
   ある特ａｌｔ請求の範囲第１項記載の方法。 ＱＱ　被検抗原がヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモンであ
   ってこの方法が妊娠検出に使用される特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 α役　被検抗原が黄体形成ホルモンであってこの方法が
   排卵検出に使用される％許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （２）生物学的流体が血清及び尿から成る群から選ばれ
   る特許請求の範囲８１項記載の方法。 （６）　基質の色度が流体試料中の被検抗原量に比例す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ０４　基質と酵素との接触前に基質が発色せず、酵素の
   存在により基質が有色不溶形に転化する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ０時　基質と酵素との接触前に基質が有色であって酵素
   の存在により基質が有色゛不溶形に転化する特許請求の
   範［７１１第１項記載の方法。 ＯＱ　固体表面が透明であってこの方法が色度読取り用
   具を用いて該表面を読み取る追加工程を包含する特許請
   求の範囲第１項記載の方法〇（１７）　固体表面使用に
   よる生物学的誘導流体試料中の被検抗体のサンドイッチ
   式の比色免疫検定方法において、 （ａ）　被検抗体含有の生物学的誘導流体試料と、固体
   表面上に層状に結合した固定化抗原を有する同相とを接
   触させ、及び上記流体試料と可溶性酵素標識抗−免疫グ
   ロブリンとを接触させ、固定化抗原と可ｍ性酵素標識Ｉ
   Ｋ、−免疫グロブリンとを該抗体に対し免疫学的に反応
   させ、かようにして同相上のＩ；！ｉｔ定化抗原と標識
   抗−免疫グロブリンとの双方に対して抗体を免疫学的に
   結合させ； （ｂ）　未反応ａ（溶性酵素標識抗−免疫グロブリンか
   ら同相を分別し； （Ｃ）　上記工程（ｂ）から分別された固相と酵素に対
   する可溶性基質■を含有する溶液とを接触させて基質を
   その不溶性有色形に転化させこれを固相上に沈積させて
   生物学的誘導流体試料中の被検抗体の存在を示すために
   肉銀縁別可−能に着色させ；そして （ｄ）　該同相を基質溶液から分別する各工程を包含す
   ることを特徴とする前記の方法。 Ｑ樽　固体表面使用による生物学的誘導流体試料中の被
   検抗原の拮抗式の比色免疫検定方法において１ （ａ）　被検抗体含有の生物学的誘導流体試料と、固体
   表面に層状に結合して面相を形成する固定化抗体とを接
   触させ、及び被検抗原と同じ型の遊離型酵素標識抗原と
   上記固定化抗体とを接触させ、かようにして固定化抗体
   と被検抗原と酵素仁識抗原との間に拮抗型免疫学的反応
   を起させ； （ｂ）　上記工程（ａ）の反応固相を液相から分別し；
   （Ｃ）　上記工程（ｂ）から分別された固相と酵素に対
   する可溶性基質を含有する溶液とを接触させて基質をそ
   の不溶性有色形に転化させこれを固相上に沈積させて生
   物学的誘導流体試料中の被検抗原量を反比例的に示すた
   めに肉眼識別可能に着色させ；そして （ｄ）　該固相を基質溶液から分別する各工程を包含す
   ることを特徴とする方法。 （至）　固定化抗体がモノクロナル抗体である特許請求
   の範囲第１を項記載の方法。 に）　被検抗原がヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモンであ
   ってこの方法が妊娠検出に使用される特許請求の範囲第
   １ど項記載の方法。 Ｑυ　固体表面が液体に対し充分に不浸透性であって未
   結合試薬が洗浄により実質的完全に除去されるものであ
   る特許請求の範囲第１♂項記載の方法。 翰　被検抗原が黄体形成ホルモンであってこの方法が排
   卵検出に使用される特許請求の範囲第１に項記載の方法
   。 （ハ）　基質の色度が流体試料中の被検抗原ｈ＋に反比
   例する特許請求の範囲第１ｒ項記載の方法。 （ハ）基質と酵素との接触前に基質が発色せず、醇素の
   存在により基質が有色不溶形に転化する特許請求の範囲
   第１ざ項記載の方法。 に）　固体表面が透明であってこの方法が色度読取り用
   具を用いて該表面を読み取る追加工程を包含する特許請
   求の範朋第１ｇ項記載の方法。 似ン　酵素標識抗体に免疫学的に結合する抗原に対し免
   疫学的に結合する抗体の連続相が結合する固体反応表面
   部分を有し、該連続相上に沈積する肉眼識別可能の有色
   基質であって該酵素存在下に可溶形から沈積着色形に転
   化する該基質を有する免疫検定法に使用されるための反
   応性浸漬片。 に）抗原がヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモンである特許
   請求の範囲第２乙項記載の反応性浸漬片。 （ハ）抗原が黄体形成ホルモンである特許請求の範囲第
   、２乙項記載の反応性浸漬片。 に）抗体層が結合する固体反応表面であってその少くと
   も一部分が酵素標識抗原と免疫学的に結合する該固体反
   応表面を有し、該層の上に沈積する肉眼識別可能有色基
   質であって該酵素存在下に可溶形から沈積着色形に転化
   する該基質を有する免疫検定法に使用されるための反応
   性浸漬片。 に）抗原がヒトの絨毛膜生殖腺刺激ホルモンである特許
   請求の範囲第２７項記載の反応性浸漬片。 ０埠　抗原が黄体形成ホルモンである特許請求の範囲第
   コタ項記載の反応性浸漬片。