JPS6070071A - 農業用化学物質生産性細菌の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は農業用化学物質生産性細菌に関し、さらに詳
しくは宿主植物と内共生関係に入ることができる農業用
化学物質生産性細菌に関し、この細菌は植物の費業用化
学物質要求の幾らか又はすべてを満たすものである。

発明の背景 現代の商業的農業は、植物の性能を強化するために用い
られる農業用化学物質に犬きぐ依存している。明らかに
、化学肥料、特に固定化窒業肥料は、作物生産において
最も共通外制限栄養素であシ、そしてしばしば農民にと
って最も高価な単独購入物である。他の農業用化学物質
が植物害虫を殺すため、病気を予防するため、又は植物
の生育環境を改良するために大きな出費を伴って広く使
用されている。他の農業用化学物質は、自然の性質を弱
め又は強めるため、あるいは植物又は作物の外観又は官
能性を変化せしめ又は改良するために生育中の植物又は
収穫された作物に加えられるであろう。農業用化学物質
にはホルモン及びそれに類するものを含む天然の又は合
成的植物生育制御物質が含まれる。これらの化学物質は
農業の分野における当業者によく知られておシ、そして
以後、「農業用化学物質」として一般的に言及する。

細菌のごとき微生物は、農業用化学物質の天然源である
。例えば、大豆、アルファルファ−及びクローバ−のご
とき豆科植物は、リゾビウム属の細菌との共生関係を通
してそれらの固定化窪素の要求のいくらかを獲得する。

リゾビウムの特定の種は豆科植物に感染して結節を形成
し、この中で細菌は酸素から遮断されそして炭水化物栄
養の供給を受ける。この嫌気的過程において根粒菌は空
中窒素を固定し、この窒素は次に植物によシ利用される
。

細菌はまた、人によって合成され又は製造され、そして
噴霧又はこれに類する方法によシ農場、生育中の植物又
は収穫された作物に適用される農業用化学物質の入手源
となっている。例えば、抗カビ性抗生物質、抗細菌性抗
生物質及び殺虫性抗生物質が種々の細菌によシ製造され
てきた。抗カビ性抗生物質には、ストレプトミセス・ｍ
±オスロモグネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｌ
ｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）によって生産される
プラスチサイジンＳ１ストレゾトミセス・カスガエンシ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎａｉｓ
）Ｉｃよシ生産されるカスガマイシン、により生産され
るポリオキシンが含まれる。抗細菌性抗生物質には、ス
トレプトミセス・ブリセラｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｇｒｉｇｅｕａ）によシ生産されるストレプトマ
イシン、及びストレプトミセス・ビリディファシェンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｌｄｉｆａｃｉｅ
ｎｓ　）により生産されるテトラサイクリンが含まれる
。

５ｔｒａｉｎ　Ｓ　−３４６６）により生産されるテト
ラるβ−エンドトキシン及びδ−エンドトキシンかに、
アイザワｒ　Ｍｌｃｒｏｂｌａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏ
ｆ　Ｉｎ＠ｅｃｔＰｅｓｔｓＪ及びＴ、ミサト及びに、
ヨネヤマ［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｓ　Ｊを参照のこと。

これらを特に引用によシこの明細書に組み入れる。

同様に、微生物は除草用抗生物質の入手源ともレデトミ
セス・サガノエンシスによシ生産されるバービシジンＡ
及びＢは除草活性を示す。

Ｔ、タケマツｒ　Ｈｏｗ　ｔｏ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｎ
ｅｗＡｎｔｉｂｉｏ　ｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｈｅｒｂｉｃ
ｉｄａｌ　Ｕｓｅ　Ｊを参照のこと。これを特に引用に
よシこの明細書に組み入れる。

さらに、微生物が植物生前制御物質、例えば種々のビタ
ミン、オーキシン、サイトカイニン、ソベレリン様物質
、及びその他の促進物質又は抑制物質を生産することが
知られている。Ｂｒｏｗｎは、下に引用するｒｓｅｅｄ
　ａｎｄ　Ｒｏｏｔ　ＢａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＪに
由来するものとしている。

微生物はまた、抗生物質、例えばストレゾトミ１ａｖｅ
ｎｄｕｌａｅ　）から分離されたラウルシン、及びｍ１
ｂａｒｕｅｎｓｌｓ　）から分離されたミハラマイシン
をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ
　２１　、（１９７７）中Ｔ、ミサト、Ｋ、コー及び工
、ヤマグチ「Ｕｇｅｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａ
ｎｄ　Ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｊ　ｆ参照のこ
と。これを特に引用によりこの明細書に組み入れる。

他のタイプの細菌が、可溶化されなければ植物に利用さ
れ得ない燐酸化合物を可溶化する能力を有することが知
られている。これらの細菌には、バシルス属及びシュー
ドモナス属に属する細菌が含まれる。これらの細菌を種
子又は植物に接種することによってこれらの細菌の上記
の能力を利用する試みは再現性のない結果をもたらして
いる。

Ｎ−８，Ｓ、Ｒａｏ編（１９８２）中Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｒａ
ｏ。

ｒＰｈｏｓｐｈａｔｅ　５ｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
　ｂｙ　ＳｏｌｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　Ｊ　
ｆ参照のこと。これを特に引用によりこの明細書に組み
入れる。

農業用化学物質生産性細菌と多数の作物種、例えば小麦
及びトウモロコシとの共生関係については、科学文献に
ほとんど記載されていない。これらの細菌種と種々の作
物との間の共生関係の開発は、化学物質の人為的合成と
適用に卓越する多くの利点を有するであろう。このよう
な共生関係の利点は固定化窒素肥料の分野において特に
明白であり、このことは、この発明の実施によシ得られ
る利益の例示として後に詳細に記載する。しかしながら
、細菌による固定化窒素肥料の生産に関するこの明細書
中に含まれる教示は当業者により、細菌により生産され
る他の農業用化学物質、例えば前記したものに拡張適用
され得るものと理解すべきである。

窒素固定細菌と多くの作物種との間の共生関係の開発に
よシ、非豆科植物の固定化窒素の要求量の少部分、例え
ば１０〜２０％が提供され、現在窒素肥料の製造に消費
されている化石燃料エネルギーが光合成的に得られるエ
ネルギーによシ置き換えられ、この置き換えは経済的に
重要であると予想される。最近、非豆科作物のための固
定化窒素の大部分の供給源が人工生成物、例えば無水ア
ンモニア、無機窒素塩及び合成有機窒素化合物である。

米国における窒素肥料の現在における年間消費量は１２
００万トンであると予想される。これらの窒素肥料は主
として、空中窒素をアンモニアに転換するだめのエネル
ギー集約的方法によシ製造される。

近年における窒素固定研究の多くが根粒菌及び他の窒素
固定細菌からの窒素固定遺伝子の分離、特徴付け、植物
への形質転換及び発現に向けられておシ、植物自体の遺
伝的変性によるものである。

この技法は、窒素固定の遺伝学及び生化学の完全な理解
を必要とし、それには将来ｌＯ〜１ダ年又はそれ以上を
必要とすると予想される。一般に、Ｊ、Ｅ、Ｂｅｒｌｎ
ｇｅｒｒＭｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎ
ｄＢＩｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａ
ｔｌｏｎＪ、ＡｄｖａｎｃｅｓＩｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ＋Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｒ
ａ。

編（１９８２）：及びＧ、Ｐ、Ｒｏｂｅｒｔｓ等丁Ｇｏ
ｎｅｔｉｃｓａｎｄ　Ｒａｇｕｌａｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ　ＦｌｘａｔｉｏｎＪ。

を参照のこと。これらを特に引用によシこの明細書に組
み入れる。

他のタイプの細菌が空中窒素固定能力を有することが知
られている。これらの細菌には、好気的ム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ）のように嫌気的に窒素を固定するクレブシー
ラ（Ｋｌｅｂｓ　Ｉｅ　１１　ａ）属の細菌が含まれる
。

文献は、リゾビウム−豆利殖物の関係のように、前記の
細菌と非豆科植物との間の共生関係を開発するための不
成功の試みの報告で満たされている。

例えば、先に１９４０年においては、ソビエト連邦及び
他の地において、非豆科作物の固定化窒素要求の幾らか
又は全部を供給するために窒素固定細菌を土壌接種剤と
して使用することができる旨報告された。たしかに、こ
のような接種によシ作物の収量が増加したという主張が
拡がった。しかしながら、初期に得られた結果の統計的
解析の結果、有意な積極的効果は試行の約１／３におい
て生ずるのみであることが明らかになった。後になって
、アゾトバクタ一種の接種のごとき細菌の接種に関連す
る収量の増加は、主として、根圏微生物相の変化、接種
菌による病気の抑制、植物生育促進物質の生産及び土壌
燐酸化合物の鉱物化によるものであることが確立された
。非豆科植物における窒素固定細菌との連携的共生関係
を確立する能力は証明されていない。Ｍ、Ｅ、Ｂｒｏｗ
ｎ　［５ｅｅｄ（１９７４）を参照のこと。これを特に
引用によシこの明細書に組み入れる。

組織培養における非豆科植物細胞と好気的窒素共生が生
じ得ることは証明されている。この証明は、高等植物細
胞と細菌細胞との間の強制された連携に関するものであ
って、このような窒素固定細菌と生育中の植物との間の
共生的連携を生じさせる技法を提供するものではなかっ
た。ｐ、ｓ。

Ｃａｒｌｓｏｎ等［Ｆａｒｅｅｄ　Ａｓａｏｃｉａｔ、
ｔｏｎ　ＢｅｔｗｅｅｎＨｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔ　ａ
ｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ＩｎＶＩｔｒ
ｏＪ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ　２５２　＋　Ｎｏ、５４
８２　＋３９３−３９５頁（１９７４）を参照のこと。

これを特に引用によりこの明細書に絹み入れる。

自らの窒素を固定することができる高等生物を創成する
ための他の試みは、窒素固定能力を有する下等生物の同
様に強制された連携により高等生物中に新規なオルがネ
ラを形成する試みに関する。

公知のオルがネラの理論的生物学的開発と並行するこれ
らの試みには、窒素固定青−緑簾類ゾロエカプザ・昨・
（Ｇｌｏｅｅａｐａａ　ｓｐ、）の植物細胞による取込
みを誘導しようとするＢｕｒｇｏｏｎ及びＢｏｔｔｌｎ
。

ディーのエクトミコリザル菌（ｅ　ｃ　ｔｏｍｙｃｏｒ
ｒｈｉｚａｌｆｕｎｇｉ）による取込みを誘導しようと
するＧ１１ｅｓ植物細胞への取込みを誘導しようとする
Ｄａｖｅｙ及びＣｏｃｋｉｎｇの試みが含まれる。Ａ、
Ｃ，ＢｕｒｇｏｏｎＹｏｌ　６７　、２．２３−２２６
頁（１９７２）：Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ及びに、Ｃ，Ｃｏ
ｃｋｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ２３９．４５５−４
５６頁（１９７２）；並びにに、Ｌ、Ｇ１１ｅｓ、ｒＴ
ｈｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　Ｎｌｔｒｏｇｅｎ−Ｆ
ｉｘｉｎｇ　Ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　Ｎｏｎｌｅｇｕｍ
ｉｎｏｕｓ　ＰｌａｎｔｓＪを参照のことｏ　Ｂｕｒｇ
ｏｏｎ及びＢｏｔｔｉｎｏの研究、並びにＤａｖｅｙ及
びＣｏｃｋｉｎｇの研究のいずれも窒素固定高等生物を
創成することに成功しなかった。

Ｇｉ　ｌｅ　ｓの方法が成功した場合、これはまだ結論
的に確認されていないが、最も良い結果において、窒素
を固定することができるオルがネラ様構造を有する糸状
菌が得られたが、このものは多くの作物と内共生的に生
存するのではなく、むしろ森林種の根の外側でのみ生存
することができた。

窒素固定細菌と非豆科植物との間に共生関係を生じさせ
るための他の試みは、土壌中で好気的悩−と連携するこ
とができる幾つかの植物品種を同定する試みにおける雑
種植物のスクリーニング及び選択に関する。しかしなが
ら、これらの試みは商業的に有用とは認められない根粒
菌を接種された大豆の約０．５％の活性を有する植物種
を同定するに過ぎなかった。Ｓ、Ｗ、Ｅｌａ等、ｉｓｃ
ｒｅｅｎｉｎｇａｎｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ
ａｉｚｅ　ｔｏ　ＥｎｈａｎｃｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｌａｌ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａ
ｔｉｏｎＪＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　７０：１
５６４−１５６７（１９８２）を参照のこと。これを特
に引用によりこの明細書に組み入れる。

窒素固定細菌と非豆科植物との間の連携的共生関係を生
じさせようとする多くの不成功の試みは、遺伝的操作及
び解析のための多くの技法の開発をもたらした。これら
の試みはさらに、アゾ−バクターのごとき窒素固定細菌
の遺伝的構成の非常に広範囲の特徴付けを提供した。例
えば、アゾトバクタ−・ビネランデイ−の空素固定遺伝
子を欠失した変異株が、リゾビウム由来の遺伝物質の導
入により窒素を固定する能力を有する細菌に形質転換さ
れ得ることが見出された。Ｇ、Ｐ、Ｒｏｂｅｒｔｓ。

ｒＧｅｎｅｔｌｃａ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ＮｉｔｒｏｇｅｎＦｉｘａｔｉｏｎＪ、Ａｎｎ　
、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　＋３５　：　２０７−
３５（１９８１）。さらに、細胞壁が除去された２種類
の異なる細胞の融合による種間の遺伝的組換の促進に関
する新規なプロドプラスト融合技法が、基礎的な遺伝学
の理解を必要としないで商業目的の新規な株を得るため
の潜在的に魅力的な技法を提供することが認識された。

しかしながら、グラム陰性窒素固定細菌の遺伝的研究の
ためにプロトプラスト融合が使用し得るか否かがすでに
決定されたということは科学文献中には認められない、
　Ｊ、Ｅ、Ｂｅｒｉｎｇｅｒ＋ｒＭｌｃｒｏｂｉａｌ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｉ
ｔｒｏｇｅｎ　ＦｉｘａｔｌｏｎＪ。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｒａｏ＋編（１９８２）１３’ｅ参照のこ
と。

たしかに、この発明に先行する窒素固定細菌のプロトシ
ラスト融合に関する実験は、高等植物と窒素固定細菌の
融合体との間に非病原柱内共生関係が生じ得ることを証
明しなかった。例えば、Ｄｕ　Ｑｉｌｎ−ｙｏｕ及びＦ
ａｎ　Ｃｈｅｎｇ−ｙｉｎｇｒＡ　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａ
ｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ　Ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｓｔａｂｌｌｓ
ｈｍｅｎｔｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ
　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣｒｏｗｎＧａｌｌ　
ｏｆ　Ｔｏｍａｔｏ　ＰｌａｎｔＪＡｃｔａ　Ｂｏｔａ
ｎｉｃａＳｉｎｉｃａ、Ｖｏ１２３．Ｎｏ６（１９８１
）（これを特に引用によりこの明細書に組み入れる）は
、特許（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）　（Ｐｅｒｒ、Ｔｉ）とｃｈｒｏｏｃｏｃｃ
ｕｍ）　（Ｐｅｎ’、Ｈ１ｆ＋）との間でプロトシラス
ト融合を行う試みを記載している。雑種が窒素固定及び
ペニシリンｕ性について選択され、そしてその後トマト
植物の茎に接種された。この接種によりクラウンゴール
（ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌｓ）又は腫瘍が形成され、この
ものはアセチレンレダクタゼ試験において好気的条件下
でニトロゲナーゼ活性を有することが見出された。この
実験の融合生成物は宿主植物中で病原反応を生じさせ、
そして植物と内共生関係に入り得ることは示されなかっ
た。

特に、多数の腫瘍中で生産された固定化窒素が窒素源と
して植物によシ利用されたか否かが確認できなかった。

最後に、観察された二）ｏダナーゼ活性が病原性雑種の
結果であるか混合接種物中に残留するアゾトバクタ−の
ペニシリン耐性変異株の結果であるか決定できなかった
。さらに、ＤｕＱｉａｎ−ｙｏｕ等の試みは、雑種中に
腫瘍形成Ｔｌシラスミドが集約的に含有されることによ
るリゾビウム−豆科植物間の相互作用の結節形成機構に
類似しておシ、植物宿主と有効な内共生関係に入ること
ができる雑種細菌を形成するのに必要とされる方向と逆
の方向に向けられていたことが、今や見出されている。

窒素固定リゾビウム種の範囲を拡張するための他の不成
功の試みには、選択されたりゾビウム株ＴＩプラスミド
の挿入が含まれる。Ｊ、Ｊ、Ｊ。

Ｈｏｏｙｋａｇｇ等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ
ｏｇｙ＋　９８　：４７７−４８４（１９７７）を参照
のこと。これを特に引用によりこの明細書に組み入れる
。これらの研究によシ、非豆科双子葉植物上にゴール（
ｇａｌｌ）を形成することができるリゾビウム株が得ら
れた。このものはこれらの植物において自然には在存し
ない嫌気的条件下においてのみ窒素をｒ２７） 固定するであろう。前項において概略を記載した批判は
この研究にも該当する。

実質的な経済的動機にもかかわらず、従来技術によって
は、非豆科植物宿主と内共生関係に入ることができる雑
種窒素固定細菌、又は植物宿主と内共生関係に入ること
ができる他の農業用化学物質生産性雑種細菌を得ること
ができなかった。

発明の要約 植物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化学物
質生産性雑種細菌の製造方法が見出された。この方法は
、農業用化学物質生産性細菌と前記植物種についての植
物感染性細菌種（以後、「感染性細菌」と称する場合が
ある）とを融合せしめ、そしてこの融合過程の生成物か
ら、農業用化学物質を生産することができそして植物宿
主に病気を起こすことなく該植物宿主と内共生関係に入
ることができる細菌を選択することを含んで成る。この
明細書において使用する「感染性細菌」は、植物に入り
そして中で生存し、そして通常は病気の症状を生じさせ
る生物のみならず、植物に入りそしてその中で生存し、
共生的 （ｓｙｍｂｉｏｔｉｃａｌｌｙ）又は共動的（ｃｏｍｍ
ｅｎａａｌ　ｌｙ）である生物をも意味する。たしかに
、この発明に従って使用される植物感染性細菌の多くは
、通常は幾種類かの植物宿主においては病原性反応を発
生せしめるが、通常はすべての植物宿主においてはその
ような反応を発生せしめない。この明細書において使用
する「細菌」なる語は、細菌、細菌様生物及びこれらと
均等なものを含み、これらにはグラム陽性細菌、グラム
陰性細菌、放線菌類、及びこれらに類するものが含まれ
る。この発明に従って使用される生物の菌学的分類上で
の唯一の限定は、これらがプロトプラスト融合を行い、
両親法の表現形質を発現する生存可能な雑種生物を形成
することができるということのみである。

この発明の方法によシ得られる細菌は種々の方法、例え
ば注入によシ作物に導入することができ、そして農業用
種子を被覆するため、農業用種子に感染せしめるため、
土壌浸とり液の製造において、そしてこれらに類似する
用途において使用するこ（２８） とができよう。この発明の雑種細菌は、作物と組合わせ
た場合、植物の農業用化学物質要求の幾らか又はすべて
を満たすことができる。この発明の雑種細菌によシ生産
され得る農業用化学物質には、肥料、特に固定化窒業肥
料；抗生物質、例えば抗細菌性物質、抗ウイルス性物質
、抗カビ性物質、殺虫性物質、殺線虫性物質、殺ダニ性
物質及び除草物質：植物生育制御物質、並びにこれらに
類するものが含まれる。

特に、植物宿主と内共生的関係に入ることができる農業
用化学物質生産性雑種細菌の製造方法が見出された。こ
の方法は次の段階から成る。

（４）任意の便利な順序において、 （１）前記植物宿主を同定し； （２）該植物宿主に感染する感染性細菌を同定し； （３）該植物宿主に感染する能力のほかに１又は複数の
選択可能な性質を有する前記感染性細菌の変異株を選択
し：そして、 （４）１又は複数の選択可能な性質を有する農業用化学
物質生産性細菌を選択し； ０）前記感染性細菌と前記將業用化学物質生産性細菌と
の融合雑種を形成し； Ｃ）先行する段階又は亜段階の生成物から、そして任意
の便利な順序において、 （１）ａ業用化学物質生産性細菌の前記選択可能な性質
の少なくとも１つ、及び感染性細菌の前記選択可能な性
質の少なくとも１つの両方を有する雑種を含んで成る細
菌亜群；（２）前記感染性細菌が前記植物宿主への感染
の初期において植物組織と相互作用するのと同様な態様
において、植物組織と相互作用する能力を有する雑種を
含んで成る細菌亜群； （３）前記宿主への適用に際して病気を発生させない雑
種を含んで成る細菌亜群； 及び、 （４）　あらかじめ選択されていないとしても前記農業
用化学物質を生産する能力を有する雑種を含んで成る細
菌亜群； を順次選択し；そして、 ０）前記の段階Ｃ（１）〜Ｃ（４）の生成物から、前記
植物への前記農業用化学物質の直接適用によシ又は前記
農業用化学物質生産性細菌の適用によシ植物の性能が改
良されるはずである条件下で、植物宿主の性能を改良す
ることができる雑種を選択することにより、前記植物宿
主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質生産
性細菌を選択する。

この発明の方法により、単子葉植物及び双子葉植物のい
ずれとも内共生関係に入ることができる農業用化学物質
生産性細菌ｆ：製造することができ属の種、例えばエル
ウィニア・カロトボラ並びにキサントモナス属の種、例
えばキサントモｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）と同様に使用
することができる。

単子葉植物のためには、エルウィニア属の種、例エバエ
ルウィニア・ステワルティー（Ｅｒｗｉｎｉａ＋ｓｔｅ
ｗａｒｔｉｉ）が好ましい感染性細菌である。キサシュ
ードモナス・シリンシャーが、穀類、例えば温暖穀類及
び米に適用し得る融合生成物の形成のための感染性細菌
として特に有用であると考えられる。

好ましい農業用化学物質生産性細菌及び化学物質及び／
又は該細菌の代謝産物が有用である用途を後で第１表に
記載する。これらには肥料、例えば固定化窒素、及び燐
酸化合物を可溶化することができる化学物質、抗生物質
、例えば抗細菌性化合物、抗カビ性化合物、抗ウイルス
性化合物、殺虫性物質、殺線虫性物質、殺ダニ物質及び
除草物質、並びに植物生育制御物質を生産する能力を有
する生物が含まれる。さらに、有用な生物を選択し、又
は上記のような他の農業用化学物質、例えば香気物質、
抗フィーディング物質等を生産するために変性すること
もできよう。

この発明の方法は、１又は複数の農業用化学物質を生産
する能力、及び植物宿主と内共生関係に入る能力を有す
る新規で安定な融合雑種細菌を提供する。例えば、この
発明の窒素固定性生物は、低固定窒素条件下での非豆科
作物の収量を１０〜１８０％改良することが示されてお
シ、これは主として、植物宿主との内共生関係の過程に
おいて、窒素固定性細菌と感染性細菌との雑種により生
産される固定化窒素のためであると信じられる。

この発明の前記以外の目的及び利点は、一部は以下に記
載され、そして一部は以下の記載から明らかになり、又
はこの発明の実施によって知られルーｔ’アろう。これ
らの目的及び利点は、特許請求の範囲において特に指摘
されている手段及び組合わせによ如実現され、そして得
られるであろう。

この発明の目的を達成するために、上記の方法の雑種融
合体は好ましくは、ダラム染色に対して同じ反応を示す
細菌、好ましくはグラム陰性細菌の融合体である。しか
しながら、幾種類かのグラム陽性細菌、特にパシルス属
の構成員もまた、農業用化学物質を生産することができ
る雑種融合体の形成に特に有用である。さらに、前記の
方法による雑種融合体を自然的又は人為的遺伝的技法に
よυさらに変性することによシ、植物宿主のための農業
用化学物質の入手源としてのそれらの性能を改良するこ
とができる。このような変性は、例えば、農業用化学物
質、例えば固定化窒素を分泌する能力、例えば農業用化
学物質を特定の形で、例えば固定された窒素をアミノ酸
の形で分泌する能力；農業用化学物質を、他の源に由来
する同種の物質が適当量存在していてもなお生産を続け
る能力；低温に対する雑種の耐性の低下（すなわち、あ
る年から次の年への雑種の意図しない増殖の回避）；干
ばつ、病気又は他の生理的ストレスに抵抗する雑種の能
力；追加の農業用化学物質生産機能の導入；又は植物宿
主の外側で生育しないだめの雑種の変性をもたらす。

前記の方法の段階は任意の便利な順序で行うことができ
るが、農業用化学物質生産能力、及び感染性細菌が植物
宿主に感染する初期において植物組織と相互作用するの
と同様の態様において植物組織と相互作用する能力につ
いての選択過程を、植物宿主において病気を生じさせ彦
い雑種の選択に先立って２回以上行うのが望ましい。

感染性細菌と関連する選択可能な性質は、抗生物質耐性
、特定の栄養の補給の必要性（栄養要求性）、又はこれ
に類するものであってよい。農業用化学物質生産性細菌
と関連する選択可能な性質は、農業用化学物質を生産す
る能力のみでもよく、又は感染性細菌について前に記載
した１又は複数の性質との組合わせであってもよい。上
記の方法の段階Ｃ（２）においてスクリーニングされる
植物組織との相互作用は、例えば、植物組織に結合する
能力、植物の管系を通って拡散する能力、又はこれらに
類するものである。感染の初期と関連する相互作用が植
物細胞への結合である場合、段階Ｃからの細菌亜群を、
段階りに先立って、植物宿主全体にわたって最も容易に
拡散する雑種を上記の方法に従ってさらにスクリーニン
グして細菌亜群を選択することによシさらに限定するこ
とが望ましいＯ 融合体はプロトシラスト融合又はスフェロプラスト融合
によって得られる。雑種の感染性細菌成分を適切に選択
することによって、穀類、例えば小麦、ライ小麦、大麦
、稲及びオート；草、例えばスズメトチャヒキ属植物、
イチゴツナギ属植物、ウシノケグサ属植物及びギョウギ
シ・々；熱帯性草類、例えば砂糖キビ、トウモロコシ、
キビ及びサトウモロコシ；ナス科植物、例えば・々レイ
ショ、トマト、タバコ、ナス及びコシヨウ；アブラナ科
植物、例えばカリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、
ケール及びコールラビー；並びに他の野菜、例えばニン
ジン及び／４’セリ；他の農業植物、例えば甜菜、綿、
果樹、いちご類及びぶどう；並びに経済的に重要な木、
例えば松、えぞまつ、もみ及びポプラと内共生関係に入
ることができる融合雑種が得られる。この発明の方法及
び得られた細菌はまた、豆科植物、例えば大豆、アルフ
ァルファ−、クローバ−１野性豆、ヤエナリ、えんどう
及びその他の豆類の固定化窒素又は他の農業用化学物質
要求の幾らか又は全部を、例えば、根の結節に関連する
りゾビウムの種により与えられた固定化窒素に対する補
給物として、満たすであろう。

以下余白 ここで、この発明の現時点での好ましい具体例に、詳細
に言及する。この具体例は後記の例と共にこの発明の詳
細な説明するものである。

この発明は前記のごとく、植物宿主と内共生的関係に入
ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造方
法に関し、その方法は、植物宿主と内共生関係に入るこ
とができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造方法で
あって、農業用化学物質生産性細菌と該植物宿主に感染
する感染性細菌とを融合せしめ、そしてこの融合生成物
から、農業用化学物質を生産することができ、該植物宿
主に病気を発生せしめず、そして該植物宿主と内共生関
係に入ることができる細菌を選択することから成る。特
に、植物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化
学物質生産性雑種細菌は次の段階により製造される。

（Ａ）　任意の便利な順序において、 （１）前記植物宿主を同定し； （２）該植物宿主に感染する感染性細菌を同定し； （３）該植物宿主に感染する能力のほかに１又は複数の
選択可能な性質を有する前記感染性細菌の変異株を選択
し；そして、 （４）１又は複数の選択可能な性質を有する農業用化学
物質生産性細菌を選択し； （Ｂ）　前記感染性細菌と前記農業用化学物質生産性細
菌との融合雑種を形成し； （Ｃ）　先行する段階又は亜段階の生成物から、そして
任意の便利な順序において、 （１）農業用化学物質生産性細菌の前記選択可能な性質
の少なくとも１つ、及び感染性細菌の前記選択可能な性
質の少なくとも１つの両方を有する雑種を含んで成る細
菌亜群； （２）前記感染性細菌が前記植物宿主への感染の初期に
おいて植物組織と相互作用するのと同様な態様において
、植物組織と相互作用する能力を有する雑菌を含んで成
る細菌亜群； （３）前記宿主への適用に際して病気を発生させない雑
種を含んで成る細菌亜群；及び、（４）アらかじめ選択
されていないとしても前（３９） 記農業−化学物質を生産する能力を有する雑種を含んで
成る細菌亜群； を順次選択し；そして、 （Ｄ）　前記の段階Ｃ（１）〜Ｃ（４）の生成物から、
前記植物への前記農業用化学物質の直接適用により又は
前記農業用化学物質生産性細菌の適用により植物の性能
が改良されるはずである条件下で、植物宿主の性能を改
良することができる雑種を選択することにより、前記植
物宿主と内共生関係に入ることができる農業−化学物質
生産性細菌を選択する。

前記のごとく、この方法の段階は任意の便利な順序で行
うことができる。好ましくはこれらの段階は、段階Ｃ（
１）においてスクリーニングされる農業用化学物質の選
択可能な性質、例えば、固定化窒素生産性細菌の場合の
ように問題の農業用化学物質を生産する雑種の能力につ
いて列挙されている順序で行う。問題の農業用化学物質
を生産する能力についてのスクリーニングを第１スクリ
ーニング段階において行わない場合には、このような（
４０） スクリーニング〔段階Ｃ（４）　）を、段階Ｃ（２）及
びＣ（３）により行われる植物宿主中でのスクリーニン
グに先立って、又はこれと同時に行う。列挙された順序
において行う場合、抗生物質耐性マーカー、又は感染性
細菌と関連する選択可能な性質を構成する同様のマーカ
ーは後のスクリーニング操作に残留する必要がない。

この発明の方法により得られる安定な融合雑種細菌は、
これらが農業用化学物質を生産する能力及び植物宿主と
内共生関係に入る能力の両者を有する点において、今ま
で知られている生物から区別される。ここで言う内共生
関係とは、生物が、植物宿主中に実際に存在しそして該
植物の全部又は一部分に拡散し、病原反応を生じさせず
、エネルギー要求の一部分又は全部を植物宿主により生
産された炭水化物及びその他の物質から得、そして植物
宿主により使用されるであろう農業用化学物質を補給の
ために与える関係を言う。

この発明の微生物と内共生関係を確立する植物宿主には
、実質上すべての商業的に重要な作物が含まれる。この
発明の方法により、農業用化学物質を生産し、そして単
子葉植物宿主及び双子葉植物宿主のいずれとも内共生関
係に大能力を有する安定な融合雑種細菌を製造すること
ができることがポケれた。

この発明の生成物が内共生的農業用化学物質生産性細菌
として機能する植物宿主の特に重要な群は、穀物、例え
ば温暖穀物、例えば小麦、ライ小麦、大麦、ライ麦、米
及びオートである。この発明の方法によって得られる内
共生的農業用化学物質生産性細菌はまた、農業用化学物
質、例えば固定化窒素を、経済的に重要な芝草、及び飼
料草例えばスズメノチャヒキ草属植物、イチゴツナギ属
植物、ウシノケグサ属植物及びギョウギシパの要求に対
して補給するのに有用である。同様に、この発明の生物
は、熱帯草類、例えば砂糖キビ、トウモロコシ、キビ及
びサトウモロコシの収量を増加する証明された能力を有
する。ナス科植物、例エハバレイショ、トマト、タバコ
、ナス及ヒコショウはこの見物の生物を適用することが
できる適当々植物宿主であり、アブラナ科植物、例えば
カリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ケール及びコ
ールラビーも同様である。種々の野菜、例えばニンジン
及びパセリ；他の農業植物、例えば甜菜、綿、果樹、い
ちご類及びぶとう；及び商業的に重要な木、例えば松、
えぞ松、もみ及びポプラもまた、この発明の生物のだめ
の宿主として機能するであろう。

豆科植物が根粒中で嫌気的に空中窒素を固定する月ｌく
文り属の細菌と共生関係を有する様に、植物が農業用化
学物質を生産する微生物と共生関係を有するとしても、
これらの植物は、これに施肥その他の方法により追加の
農業的化学物質源が与えられれば、最大の収量において
収穫されるであろう。従って、追加の農業用化学物質、
例えば追加の固定化窒素が、このような植物のために、
この発明に従って得られた、農業用化学物質、例えば固
定化窒素を生産することができそしてこれらの豆科植物
と内共生関係に入ることができる微生物によって与えら
れることが予想される。

（４３） この発明において使用され、嫌気的に空中窒素を固定す
ることができ、そしてこの発明の融合法によって安定な
融合雑種を形成することができる農業用化学物質生産性
細菌は、アシドバククー属、アゾモナス属、パイゼリン
キ７　（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ）属、及びデルキシア
（Ｄｅｒｘｉａ）属から選ばれる。

特に好ましい生物群は、アゾトバクタ−属の種、炙木芝
Ｚアユ、が特に好ましい。なぜなら、この菌の窒素固定
遺伝子及びその制御について広範囲に研究されており、
そして他の細菌の属からの遺伝物質を受容しそして発現
する証明された能力を有するからである。Ｇ、Ｐ、Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ等［Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ
　ＪＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、　３５　：
　２０７−３５　（１９８１）を参照のこと。

１ツ４＝及び他の重要な好気的窒素固定（４４） 細菌は一般にグラム陰性細菌であるから、グラム陰性窒
素固定細菌がこの発明における使用のために好捷しい。

しかしながら、後に記載する融合技法はグラム陽性細菌
及びグラム陰性細菌のいずれにも適用することができる
と理解され、そしてグラム陽性窒素固定細菌もこの発明
の方法に従って使用するのに適すると予想される。

広範囲の種類の抗生物質を使用することができ、そして
この発明の融合方法によって安定な融合雑種を形成する
ことができる前記以外の農業用化学物質生産性細菌をこ
の発明において使用することができる。この発明におい
て使用することができる他の農業用化学物質生産性細菌
は、植物生育制御物質、固定化窒素以外の肥料化学物質
、香気物質、官能強化化学物質、抗フィーディング物質
及びこれらに類するものを生産することができる。

たしかに、農業用化学物質として価値があり、そしてこ
の明細書において定義する感染性細菌と安定な雑種を形
成する生物により生成される任意の化学物質又は化学的
効果、及びこの明細書において記載される方法は、この
発明に従って使用されるであろう。このような農業用化
学物質生産性細菌の選択は、この明細書の教示及び説明
に基いて当業者が容易になし得るであろう。

この発明において有用と考えられる代表的な農業用化学
物質生産性細菌、並びに農業用化学物質及びその化学的
効果を第１表に示す。

以下金白 （４７） ４１９− 特開口ＨＧＯ−７００７１（１４） １に 應 Ｓ 馴 御 堀 堀 ４２１− ｈ　／、／　ｈ　１Ｔ′Ｙ　／／／ １ＩＩＩ　λ　）　） ０　囲　［０１二 塚　型　酎　製 Ｓ　８蒙　ｇ糸　舞窄 六　珍　娘　ト屁 嬶　妥　迩 昏　士　÷ 朗　朗　朗 この発明において使用される、植物宿主に感染すること
ができる感染性細菌は、注目する植物宿主に感染し、そ
して後に記載する融合法によって安定な融合雑種を形成
することができる広範囲の細菌種の内のいずれであって
もよい。好ましくは、感染性細菌は、感染の初期におい
て公知の方法で植物宿主と相互作用するものであるべき
である。

感染性細菌は病原性、例えば潜在的病原性であってもよ
く内共生的であってもよい。代表的な病原菌にはアグロ
バクテリウム属及びエルウィニア属の種が含まれる。代
表面な内共生種にはアゾスピリルム属の種が含まれ、こ
のものは熱帯性草類、例えば砂糖きび、及び温暖草類、
例えば小麦の根に、病気を生じさせるととなく生存する
ことが知られている。病原菌の場合、この病原菌がそれ
と関連する病気の可視的症状を生じさせることが望まし
い。

最も好ましくは、感染性細菌は、注目の特定の作物宿主
に対して特異的、又はほとんど特異的であって、この発
明の融合雑種が、内共生関係に入ることを意図する植物
以外の植物に拡散する可能性が限定されるものである。

多くの植物感染性細菌、及びこの細菌が植物宿主と相互
作用する方法は科学文献に記載されている。Ｍ、Ｓ、　
Ｍｏｕｎｔ等、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｌｃ　Ｐｒ
ｏｋ［Ｌｒｙｏｔｅｓｓ　Ｖｏｌ　ｉ及びｎ（１９８２
）’ｉ特に参照のこと。これを特に引用によりこの明細
書に組み入れる。

多くの病原性生物は、それらの特定の植物宿主に対する
選択の点を除き、相互に本質上区別できない生物様を構
成することが知られている。このような宿主特異的病原
性株は、関連する植物宿主についてのバンパー（ｐａｔ
ｈｏｖａｒ）として知られている。この発明においては
、注目する特定の植物宿主のための・卆ソバ−を用いる
ことが特に有用でントモナス、特にキサントモナス書カ
ンペストリス；及び類縁細菌が含まれる。

特に好ましい非病原性向共生生物には、アゾ７る。この
発明のための使用に適する感染性細菌には第２表に列挙
するものが含まれる。

以下余白 特開口ＵＧＯ−７００７１（２１） − アグロバクテリウム・ツメファシェンスＵ、Ａ業用化学
物質を生産しそして双子葉植物宿主と内共生関係に入る
ことができる安定々融合雑種を形のよく同定された相互
作用を有し、この細菌は植物細胞組織に結合する。試験
管内で植物細胞組織と結合するアグロバクテリウム・ツ
メファシェンスの能力は証明されておシ、そして生体内
におけるアゾロバクテリウムΦツメファシェンスによる
腫瘍形成のための宿主域と並行することが示されている
。Ａ、Ｇ、　Ｍａｔｔｈｙｓｓｅ等「Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ
ｌｌＲａｎｇｅ　ｆｏｒ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ
　Ａｇｒｏｂａｏｔｅｒｌｕｍｔｕｍｅｆａａｌｅｎｓ
　ｔｏ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅ１ｌｓ　
ｊＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｏｔｈ
ｏｌｏｇｙ、　２１：３８１−３８７　（１９８２）　
；　Ａ、Ｇ、　Ｍａｔｔｈｙｓｓａ等ｒＢｉｎｄｉｎｇ
ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔ＠ｒｌｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ　ｔｏ　ＣａｒｒｏｔＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓＪ
　Ｐ１１７ｓｉｏｌｏｇ１ｃａｌ　ＰｌａｎｔＰａｔｈ
ｏｌｏｇｙ、　２０：２７−３３　（１９８２）　を参
照のこと。

これらを特に引用によシこの明細書に組み入れる。

アグロバクテリウム・ツノ１１！三ｙヱは、農業用化学
物質を生産することができそしてナス科植’ＪＩＩＪ、
例ｔハバレイショ、トマト、タバコ、ナス及びコシヨウ
；アブラナ科植物、例えばカリフラワー、ブロッコリー
、キャベツ、ケール及びコールラピー；野菜、例えばニ
ンジン及びパセリ：及び他の農業植物、例えば砂糖キビ
、綿、果樹、いちご類及びぶどうと内共生関係に入るこ
とができる安定な融合雑種を形成するために使用するの
に好ましい感染性細菌である。双子葉植物と内共生関係
に入ることができる農業用化学物質生産性細菌を得るた
めにこの発明の方法従って使用するの農業用化学物質を
生産することができ、そして単子葉穀物、例えば小麦、
大麦、ライ麦、稲及びオ（６０） 一ト；及びさらにまた草類、例えばスズメノチャヒキ草
属植物（ｂｒｏｍｅ　ｇｒａａｓ）、イチゴツナヤ属植
物（ｂｌｕｅ　ｇｒａｓｓ）、ウシノケグサ属植物（ｆ
ｅｓｃｕｅｇｒａｓｓ）及びギ目つギシパ（ｂｓｒｍｕ
ｄａ　ｇｒａｓｓ）と内共生関係に入ることができる安
定な融合雑種細菌の形成のために特に有用であると考え
られる。

エルウィニア・ステワルティーは、農業用化学物質を生
産することができ、そして単子葉植物、例えば熱帯草類
、例えば砂糖キビ、トウモロコシ、キビ及びサトウモロ
コシ、並びに小穀類、例えば稲と内共生関係に入ること
ができる安定な融合雑種細菌を形成するために有用な感
染性細菌として特に好ましい。シュードモナス・シリン
シャー及びキサントモナス・カンペストリスの菌株もま
たこれらの用途に有用であると考えられる。

”’Ｌｌ−Δイユ聞にの上記の株は、単子葉植物、例え
ば特に熱帯性及び温暖草類、例えば砂糖キビ及び小麦に
おいて有用であると考えられる。

この発明において使用する特定の植物感染性細菌及び特
定の農業用化学物質生産性細菌の選択は、（６１） この明細書の記載に従って通常の実験を行うことによシ
当業者が容易に行うことができよう。この発明の方法に
おける農業用化学物質生産性細菌又は感染性細菌として
有用であると考えられる細菌これに類するものを参照す
ることにより、又は日常的実験によシ決定することがで
きる。

この実験において使用するために、注目する植物宿主に
感染する能力に加えて１又は複数の選択可能な性質を有
する所望の感染性細菌の変異株を選択すべきである。具
体的には、試験管内で選択可能な性質を有する感染性細
菌の変異株を選択すべきである。このような性質には、
抗生物質耐性、特異的栄養補給の要求（栄養要求性）、
この組合わせ等が含まれ、これらの性質は、感染性変異
細菌からの遺伝物質を含有する融合体を同定するために
雑種融合生成物を試験管内で迅速にスクリーニングする
ことを可能にする。

抗生物質耐性は好ましい選択可能な性質で、！、そして
選択された感染性細菌変異株が少なくとも２種類の抗生
物質に対して耐性を有することが特に好ましい。２重抗
生物質耐性又は他の余分な選択可能な性質により、融合
雑種の最初のスクリーニングが、農業用化学物質生産性
細菌及び選択された感染性細菌変異株の両者からの遺伝
物質を有するもののみを同定することが保証され、そし
て農業用化学物質生産性細菌の抗生物質耐性変異株の残
存又は生成の機会が減少する。例えば、固定化窒素を生
産することができそして単子葉植物と内共生関係に入る
ことができる農業用化学物質生産性雑種の形成において
、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンの両者に対
して耐性を有するエルウィニア・ステワルティーの菌株
が好ましい。

固定化窒素を生産することができそして双子葉植物と内
共生関係に入ることができる雑種の形成においては、ス
トレプトマイシン及びカナマイシンの両者に対して耐性
を有するアグロバクテリウム・ツメファシェンスの菌株
が好ましい。植物感染性細菌のこのような変異株は、Ａ
ＴＣＣのごとき寄託機関から入手することができ、又は
よく知られている方法により野性株から作ることができ
る。

農業用化学物質生産性細菌の雑種スクリーニングを、問
題の農業用化学物質を生産する能力に関して最初に行わ
ない場合、融合段階において使用される農業用化学物質
生産性細菌は１又は複数の追加の選択可能な性質、好ま
しくは試験管内で選択可能な性質、例えば感染性細菌に
関して上記した性質を有するであろう。すなわち例りば
、目的とする農業用化学物質が殺虫性物質、殺線虫性物
質又はこれらに類するものである場合、農業用化学物質
生産性細菌は、選択可能な抗生物質耐性もしくは感受性
、又は特定の栄養補給のλ゛択可能な要求（栄養要求）
を有する変異株とする。言うまでもなく、これらの性質
は、感染性細菌の選択可能な性質と同一であってはなら
ない。なぜなら、そうでなければ最初のスクリーニング
によって非雑種生物を除去することができないからであ
る。農業用化学物質生産性細菌に由来する追加の選択可
能な性質の雑種中における存在は、最初のスクリ（６４
） −ニングの生成物中に農業用化学物質生産能力が存在す
ることを保証するものではないが、雑種生物に関して集
団を濃縮するには十分であり、次のスクリーニング段階
において、農業用化学物質生産能を有する雑種生物を同
定するのに成功することが合理的に予想できる。

以下余白 （６５） この発明の融合雑種は、従来技術において一般的に使用
されている技法に従うプロトプラスト融合又はスフェロ
プラスト融合によって形成される。

公知のプロトシラスト融合技法及びスフェロプラスト融
合技法が、Ｄ、Ａ、ＨｏｐｗｏｏｄｒＧｅｎｅｔｌｃ　
５ｔｕｄｉｅｓＷｉｔｈ　Ｂａｃｔｅｒｌａｌ　Ｐｒｏ
ｔｏｐｌａｓｔａＪＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｌｃｒｏｂｉｏ
ｌ。

３５；　２３７−７２（１９８１）：及びＲ，Ｌ、Ｗｅ
ｉｓｓ。

Ｊ、Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．、１２８　：　６６８−７０
　（１９７６）に記載されている。これらを特に引用に
ょシこの明細書に組み入れる。この発明の融合雑種全形
成するための技法の選択は、上記の科学文献の記載及び
後に記載するプロトシラストの融合の例に基いて当業者
が容易に行うことができる。

一般に、融合法には、農業用化学物質生産性細菌及び感
染性細菌の両者からの細胞壁の除去、融合媒体、例えば
ポリエチレングリコール中での感染性細菌と農業用化学
物質生産性細菌との融合、並びに感染性細菌及び農業用
化学物質生産性細菌の両者からの遺伝物質を含有する融
合雑種の細胞壁の再生が含まれる。融合及び細胞壁の再
生は低温で行うことにより、新しく形成された雑種にお
いて、発現可能な遺伝的組換速度が遺伝物質の酵素的分
解速度に比べて高く々るようにする。

融合雑種の最初の形成の後、細菌集団の遺伝的構成は２
〜３日間のあいだ比較的不安定であυ、この間に多くの
遺伝的組換が生ずるようである。

この期間において、農業用化学物質生産性細菌に関する
１又は複数の選択可能な性質及び感染性細菌に関する１
又は複数の選択可能な性質の両者を発現することができ
る安定な融合雑種を選択する。

農業用化学物質を生産する性質をもこの期間に選択する
のが特に好ましい。例えば、アシド・々クタテワルティ
の菌株との融合生成物を、テトラサイクリン及びストレ
プトマイシンを含有し窒素を含有しない培地で増殖せし
める。こうして、アシド−由来のテトラサイクリン及び
ストレプトマイシン耐性に関する遺伝物質の両者を含有
する融合生物のみが２〜３日間のインキュベーション期
間にわたって生存し続けるでおろう。

農業用化学物質生産性細菌に関する選択可能な性質及び
感染性細菌に関する選択可能な性質の両者を発現する生
存融合雑種を、次に、感染性細菌が植物宿主への感染の
初期において植物組織と相互作用するのと同様の態様で
植物組織と相互作用する能力についてスクリーニングす
ることができアシエンスに関する感染の初期は、植物組
繊細胞への結合である。植物組繊細胞と結合する雑種の
能力は、上に引用した文献に記載されている方法、又は
後で例に記載する方法によシ、試験管内で測定すること
ができる。

他の感染性細菌、例えばエルウィニア・ステワルティー
は、まず植物組織と相互作用し、次に植物の病気−反応
系に検出されることも破壊されることもなく植物の管系
を通って拡散することによｐ感染する。この性質が、感
染性細菌によって生（６８） 産されそして植物の正常な防御反応を回避するこトラ可
能にするポリサッカライドによることが文献において予
想されている。このような態様によシ植物の管系を通っ
て拡散する融合雑種の能力は、任意の便利表刃法によシ
測定することができ′る。

１つの好ましいスクリーニング方法は、植物の特定の部
位における宿主植物の実生（ｓｅ６ｄｌｉｎｇ）への感
染に関する。次に、特定の期間、例えば４日後に、植物
を、その長軸にそって多数の横断切片に切ｐきざむ。各
切片に含有されている細菌から細菌培養物を再生する。

最初の感染部位から最も離れた細菌含有切片は、植物の
管系を通って最もよく拡散することができる融合雑種を
含有するであろう。従ってこの能力を有する雑種を選択
することが可能である。

植物組織とのこの初期の相互作用についての他のスクリ
ーニング方法が、この明細書に記載された教示に基いて
当業者によシ容易に考えられるであろう。さらに、特定
の感染性細菌と特定の植物宿主との間の初期の相互作用
の他の機構が決定さく６９） れ、そしてこの明細書の記載、及び感染性細菌とその植
物宿主との間の公知の相互作用に基いて当業者にとって
自明な方法によシ、スクリーニングされるであろう。

植物の管系を通って拡散する能力は、植物細胞組織との
初期の相互作用が他の機構、例えば細胞結合によってい
る感染性細菌から形成された融合雑種についても好まし
い性質である。従って、農業用化学物質を生産する能力
、及び感染性細菌が感染の初期において植物宿主と相互
作用するのと同様の態様において植物宿主と相互作用す
る能力の両者を有することが見出された融合雑種をさら
にスクリーニングして、植物の管系を通って迅速に拡散
することができる雑種の亜群を選択するのが特に好まし
い。

さらに、この発明の実施においては、農業用化学物質を
生産する能力、及び感染性細菌が感染の初期において植
物細胞組織と相互作用するのと同様な態様で植物細胞組
織と相互作用する能力の両者を有することが見出された
融合雑種を、これらの能力について２回以上スクリーニ
ングするのが好ましい。農業用化学物質生産性細菌の選
択可能な性質、及び上記の植物細胞相互能力の両者を発
現する安定な融合雑種は、次に、個々のコロニーとして
、窒素を固定する農業用化学物質生産性細菌の場合には
好普しくは窒素不含培地上で、増殖せしめる。次に、得
られた培養物の各々を、適当な方法で、例えば注入（１
ｎｊｅｃｔｉｏｎ）により、問題の植物宿主の実生に適
用する。適当なインキュベーション期間、例えば２又は
３週間の後、宿主植物の実生中で可視的な病気の発症を
なんら示さない融合雑種を、次のスクリーニングのため
に選択する。経験によれば、問題の宿主植物においても
との感染性細菌と関連する可視的な病気の症状を生じさ
せない融合雑種５〜７個を得るには、最もよい融合雑種
２５〜３０個をスクリーニングすれば十分である。

好ましくは、植物の管系を通しての最も広い領域への拡
散、宿主植物における病気の症状からの最も明白な開放
、及び窒素を固定する農業用化学物質生産性細菌の場合
には窒素不含培地での最も旺盛な生育を発現する安定な
融合雑種を、さらにスクリーニングするために選択する
。

雑種生物の最初のスクリーニングにおいて農業用化学物
質を生産する能力についてスクリーニングを行わなかっ
た場合には、いずれかの時にこのスクリーニングを行う
。好ましくは、このスクリーニングは、この方法の最も
早い実際的な時点において行うべきであシ、この時点は
この方法のある特定の段階において生存している雑種生
物の数、及び目的とする農業用化学物質生産についての
スクリーニングのために使用する技法の能率によシ決定
し、混合接種物の中から農業用化学物質生産性雑種を同
定する。

一般に、これらのスクリーニング操作は４つの範ちゅう
の１つに属する。これらは、（１）生存スクリーニング
（生産されるべき農業用化学物質が雑種の生存のために
必須であシ、これを増殖培地に加えない）：（２）生産
されるべき農業用化学物質の存在についての分析化学的
スクリーニング；（３）生産されるべき１又は複数の農
業用化学物質に関連する生物学的活性の発現についての
生物学的スクリーニング；及び（４）イムノアッセイス
クリーニング（特定の農業用化合物質を生産する生物又
は生物群を、問題の化学物質に特異的な抗体との相互作
用により同定する）である。これらの特定のスクリーニ
ング方法又はその組合わせのいずれが適当であるかは目
的の農業用化学物質の種類によシ決定する。すなわち、
生存スクリーニングは、窒素不含培地上で自らの固定化
窒素を生産することができる雑種細菌を同定するのに特
に有用である。

生物学的スクリーニングは、抗細菌性物質又は抗カビ性
物質を生産することができる雑種細菌を同定するために
特に有用である。この種類の特に好ましいスクリーニン
グ方法においては、雑種の混合培養物の上に、雑種細菌
によシ生産される抗生物質に対して感受性の生物の培養
物全重層し、そして感受性生物が増殖できない領域から
その抗生物質を生産する雑種又は雑種群を同定しそして
取り出す。イムノアッセイ法は、目的の農業用化学物質
が大分子、例えばポリペプチドである場合に特に適当で
ある。いずれにしても、目的とする農業用化学物質の既
知の効果についての生物学的スクリーニングは、農業用
化学物質生産性細菌に関する他の選択可能な性質につい
ての予備的なスクリーニングによって培養物の数を一旦
管理可能々レベル、例えば１０２〜１０３の培養物数に
まで減少せしめた後、雑種生物の個別的な培養物を用い
て行うことができる。すなわち、例えば、殺虫性化合物
を生産する雑種は、感受性の昆虫が雑種培養物上で生存
できない仁とによシ同定することができる。このような
スクリーニングは、多数のコロニーをスクリーニングす
る必要があり、そして結果が現われるまでに長時間を要
するという欠点を有するが、それにもかかわらず注目す
る農業用化学物質を生産する能力を有する雑種を同定す
ることができる。

この発明に従って使用する特定の農業用化学物質を生産
する性質についてのスクリーニングは、この明細誉に記
載する教示に従って、日常の実験により尚業者が実施す
ることができよう。農業用化学物質を生産する能力につ
いてのスクリーニングにおいて有用であると考えられる
技法は標準的概要の記載に基いて決定することができよ
う。

融合雑種の最終群の内のいずれが、宿主植物（この宿主
植物は、雑種によって生産される農業用化学物質を、他
の方法によυ得られる農業用化学物質の補足として使用
する）と内共生関係に入ることができるかを決定するた
めに、通常、予備的な収穫量スクリーニング又はこれに
類するスクリーニングを行う必要がおる。例えば、窒素
固定細菌については、宿主植物を農業用化学物質、例え
ば固定化窒素を欠く環境で生育せしめ、そして適当な生
育期間、例えば６週間の後の乾燥重量を、前記の方法に
よって選択された安定な融合雑種を例えば注入によシ感
染せしめた点を除き同様の環境で生育せしめた同様の植
物の乾燥重量と比較することにより収穫量スクリーニン
グを行う。窒素を固定する農業用化学物質生産性細菌の
場合、経験によれば１５〜６個の融合雑種を試験すると
とによシ、窒素欠乏土壌で生育した植物において統計的
に有意な収量の増加をもたらす安定な融合雑種３〜４個
が同定される。これは、空中窒素を好気的に固定し、そ
して宿主植物と内共生関係に入る安定な融合雑種の能力
によるものであると理解される。

この発明の方法の実施においては、感染性細菌と農業用
化学物質生産性細菌とが、ダラム染色に対して同じ反応
を示すととが必須ではないが好ましい。さらに、この発
明に従って形成された内共生的農業用化学物質生産性細
菌は自然の又は人為的遺伝的方法によシさらに変性する
ことによシ、植物宿主のための農業用化学物質の入手源
としてのそれらの性能を改良することができる。特に、
細菌を、その低温に対する耐性を減少するように変性す
ることができ、これによって雑種細菌がおる年から次の
年にかけて不所望の増殖をするのを防止することができ
る。同様に、この発明に従って形成された内共生的農業
用化学物質生産性細菌は、干ばつ、病気又はその他の生
理的ストレスに（７６） 対する安定性を増すように変性することができる。

これに関し、ストレス条件下における雑種の安定性、及
び病原状態への自発的な又は強制された像部の可能性を
最小にする能力は、商業的微生物製品にとって好ましい
。確かに、この発明に従って形成された細菌は、問題の
植物宿主によシ特異的に又はほとんど特異的に提供され
る栄養補給を侠求する変異株を選択することによって該
植物宿主の外では増殖することができないように、変性
されるべきである。例えばアゾトバクタ−の菌株につい
て遺伝的４９７８作及び変異株の選択のための技法は当
業者においてよく知られておシ、そしてこれらの技法は
、この発明に従って形成された安定な融合雑種の上記の
又は同様な遺伝的操作を行うために適当であると考えら
れる。

農業用化学物質を生産する能力を有し、そして植物宿主
と内共生的関係に入ることができる。この発明に従って
形成された安定な融合雑種は、多くの方法によって農業
用化学物質を生産するのに使用することができよう。例
えば、この発明に従（７７） って形成された細菌は実生に注入することができ、又は
種子に被覆される生物的に分解され得る栄養担体と細菌
との組合わせによυ、植物宿主の被覆された種子を製造
するために使用される。同様に、この発明に従って形成
された細菌は、宿主植物の柚子に細菌を直接適用するこ
とにより、感染された種子製品を製造するために使用す
ることができる。上記の方法に代えて、この発明に従っ
て形成された細菌を、水及び、生育中の宿主植物の葉、
茎及び根に適用するだめの又は噴霧又はこれに類する方
法によって土壌を包囲するための他の適当な没とう成分
と混合することにより、農業用土壌浸とり液を製造する
ことができる。

この発明を特定の問題又は特定の環境に適用することは
当業者にとって可能であろう。この発明の範囲内にある
方法及びこれによシ得られる細菌生成物を次の例に記載
する。

以下余白 例１．　アゾトバクタ−・ビネランディーとエルウィニ
アに窒素を固定することができる公知のアＩＩＩ　１ｍ
　ｅ選択した。ストレプトマイシン及びテトラサイクリ
ンの両方に対して耐性を有することが知られているエル
ウィニア・ステワルティーの変異株の約１０　個の細菌
も選択した。これら２つのタイプの細菌の融合雑種を前
に引用したＷｅ　ｌ　ｓ　ｓ　の方法の変法によって形
成した。

対数中期において増殖中の細菌を、１ｍＭのＥＤＴＡ　
、　５　ｍＭの塩化マグネシウム、１２チのシュークロ
ースを含有するＰＨ７の媒体中１００！ＩＵ′ｆｎεの
りゾチーム及び５μｙＡｎｅのＤＮＡ−アーゼによυ処
理した。１０分間後、もとの細菌のゾロドプラスト及び
スフェロプラストが形成された。次に温度を０℃に低下
せしめ、そしてプロトプラスト形成溶液を洗浄除去した
。得られたプロトプラストを０℃の１２ｑ６シユークロ
ース溶液に入れた。次に溶液に分子量約６０００のポリ
エチレングリコールを４０％になるように加えること姉
より１０〜１５分間にわたってゾロドプラスト及びスフ
ェロプラスト融合を誘導した。融合した細菌を遠心分離
し、そして１２％のシュークロースを加えり完全増殖培
地中に０℃にて４時間再懸濁した。次に温度を３０℃に
上昇せしめそして２時間保持し、この後雑種融合生成物
を追加のシュークロースを含有する完全増殖培地に移し
２時装置いた。

次に約２５〜３０℃において最初の選択操作を行った。

雑種融合生成物を、Ｃａｒｌｓｏｎ等、［Ｆｏｒｃｅｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｈｌｇｈｅ
ｒ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄＢａｃｔｓｒｉａｌ　Ｃｅ１ｌ
　Ｉｎ　Ｖｌｔｒｏ　Ｊ　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｔ２２
＋Ａ３４８２．３９３−３９５（１９７４）に記載され
ているＢｕｒｋｅの窒素不含培地に移し、この上で増殖
せしめた。培地は窒素を含有せず、そして加えられたス
トレプトマイシン１ｏｏμｍ１／ｍε及びテトラ（８０
） サイクリン５０μｆｌ／ｍｌ：ｆ含有する。好気的に空
中窒素を固定する能力を発現し、且つストレプトマイシ
ン及びテトラサイクリンに対する耐性（あらかじめこの
耐性が導入されていたエルウィニア・ステワルティー株
と関連する）を発現する融合生成物のみが、約３日間の
増殖期間の後この培地上で生存していた。

この培養物からの融合雑種混合物のサンプルを、約３〜
４フイートの高さのトウモロコシの実生の茎組織の第１
節と第２節の間に注入にょシ感染せ（〜めた。４日後、
トウモロコシ植物を横断切片に切りきざむことにより、
植物の前部（頂部）に移行した細菌を回収した。エルウ
ィニア・ステワルティーは感染の初期において、植物の
病気−反応糸に認識されることなく又は破壊されること
なく管系を通って拡散することによシ植物細胞と相互作
用するからである。トウモロコシ植物の管系を通って最
も拡散した融合雑種は一般に第５節と第６節の間に見出
された。

トウモロコシ植物の第５節及び第６節の間に見（８１） 出された融合雑種細菌を、Ｃａｒｌｓｏｎ　等、前記、
によシ記載されたＢｕ　ｒｋｅの窒素不含培地上で３日
間培養した＠ ３日後、この窒素不含培養からの混合培養物を、約３〜
４フイートの高さのトウモロコシの実生の茎組織の第１
節と第２節の間に注入により再度感染せしめた。約３日
後、植物を前記のようにして横断的に切シきざみ、植物
の頂部に移動した細菌を回収した。この場合も、トウモ
ロコシ植物の管系を通って最も大きく拡散した融合雑種
は一般に第５節と第６節の間に見出された。

次に、トウモロコシ植物のこの部分から回収された融合
雑種細菌を、別々のコロニーとしてＢｕｒｋｅの窒素不
含培地に増殖せしめた。最も旺盛なコロニー２５個を選
択し、そしてそれぞれを２５本のトウモロコシ植物に注
入によって感染せしめた。３週間後、感染したトウモロ
コシ植物に病気の可視的症状をなんら生じさせないコロ
ニーを選択した。これらの内、窒素不含培地に最も旺盛
に増殖し、植物に最も広く拡散し、そして病気の症状を
最も明白に有しない７個のコロニーを予備的収穫試験の
ために選択し、そして融合体＋１〜融合体＋７と同定し
た。

一次収穫試験においては、１０ｃｒｎのｉｊ−ライトの
上に１５副の洗浄した無菌砂を収容したフラット（３０
ｃｒｎ×４６ｃｎ１）に、２４個のトウモロコシ種子を
一定間隔で播種した。フラッｉ温室（約２２〜２７℃）
に置き、そして１日２回脱イオン水を給水した。１０日
目（種子の窒素が消費される）から、実生に１週間に３
回栄養溶液を供給した。

１ｔの溶液を適用し、そして自然排水せしめた。

溶液として、唯一の窒素源として６μＭ濃度の硝酸イオ
ンを含有する変形Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎミックスを用
いた。Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎミックスはまた、６ｍＭ
濃度又はＯＳ度の硝酸イオンを含有するように変形し、
そしてそれぞれ下記の比較試行Ａ及びＣにおいて使用し
た。実験を６週間行い、この時点で植物の地上部分を収
穫し、そして９５℃にて１週乾燥した。こうして乾燥重
量データを収集した。

感染植物全収容するフラットについて、１０日目（同時
に施肥を開始する）に細菌株を注入によって導入した。

各分析ｔ−３連（処理当た９２４本ずつの植物全収容す
るフラット３個）により行い、そしてデータを統計的に
解析した。ウルウイニア・ステワルティーとアシドバク
ター・ビネランデイとの間の７個の異る細菌融合体（融
合体≠１〜７）を上記のようにして多段スクリーニング
によシ選択し、そしてこの研究に使用した。フラット当
たシの実際の乾燥重量（３個のフラットの平均）を次に
示す。

以下余白 （８４） （８５） 融合体＋１．３．５及び７の結果は統計的に有意である
。

接種されなかった比較試行ＡはＬｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎ
栄養培地中に最°適レベルの硝酸塩を含有し、そして十
分に窒素を施肥された土壌で生育するトウモロコシにつ
いて期待される結果金示すものである。

硝酸塩無添加の比較試行Ｃは、トウモロコシ種子中に含
せれる残留硝酸塩のみに基いて期待される収量を示す。

比較試行Ｂは、約６μＭのレベルにおいて２ｇを含有す
る対照を代表するものであり、窒素が不十分に施肥され
た土壌において期待される生育を示すものである。融合
体す６に関する乾燥重量の減少は、どの植物も病気の可
視的症状を示さなかったが、非可視的病原効果によるも
のであろう。融合体≠４の結果は統計的に有意ではない
。融合体＋１．３．５及び７の結果は、この発明の方法
によシ、好気的に空中窒素を固定することができそして
トウモロコシと内共生関係に入ることができる安定な融
合雑種が少なくとも４種製造することができ、この雑種
により、窒素ストレス条件下で生育するトウモロコシは
、この発明の融合体との組合わせにおいて、この発明に
従って形成された細菌を伴わない対照よりも２９〜１０
８％高い収量をもたらしたことを示した。

個の細菌を選択した。ストレプトマイシン及びカナマイ
シンの両者に対して耐性を有するアグロバクテリウム・
ツメファシェンスの株の約１０８個の細菌を選択した。

例１と同様にしてこれらの細菌の間でプロトプラスト融
合を行った。融合したプロトプラストを、例１の場合と
同様にして、１．００μｉ／ｍｌのストレプトマイシン
及び５０μ９７ｍｅのカナマイシンを補給したＢｕｒｋ
ｅの窒素不含培地に移した。３日後、好気的に空中窒素
を固定することができ、そして病原細菌からの、ストレ
プトマイシン耐性及びカナマイシン耐性に関する遺伝物
質を有する安定な融合雑種のみが生存した。

この培養からの混合接種物ｋ、Ａ、　Ｇ　、Ｍａｔｔｂ
ｙｇｓｅ等Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　＊　２０　＋２７−３０、及び２
１．３８１−３８７（１９８２）に記載されているのと
同様にして、ニンジン組繊細胞の浮遊培養物に導入した
。約３時間後、ニンジンの細胞、及びアグロバクテリウ
ム・ツメファシェンスが感染の初期において植物組繊細
胞と初期相互作用するのと同様の態様でニンジンの細胞
と結合することができる融合雑種を、無菌蒸留水で３回
洗浄することに工υ、結合していない細菌から分離した
。付着する雑種細菌を伴うニンジン細胞を水に浸漬し、
そして再度洗浄した。得られた懸濁液を遠心分離し、そ
して細胞壁と付着する雑種細菌とから成るベレットをＢ
ｕ　ｒｋｅの窒素不含培地上に３日間ＩＷいた。

上記の細胞細合法を反復し、そしてこうして選択された
融合雑種金、別々のコロニーとして窒素不含培地上で増
殖せしめた。３日間増殖せしめた（８８） 後、湿も旺盛なコロニーを選択した。

各コロニーを、高さ８〜１０インチの甜菜の実生の根と
植物の間の胚軸の領域に、あらかじめコロニーに浸した
ビンを挿入することにより、この植物に感染せしめた。

３週間後に甜菜にゴール又は腫瘍を形成しない雑種コロ
ニーをさらにスクリーニングするために選択した。３週
間後になんらの可視的病症も示さない甜菜植物の根を多
数の横断切片に切シきざんだ。雑種細菌が拡散した植物
の根の距離を記録した。２５の安定な融合雑種の内の５
個を、窒素不含培地上での増殖の旺盛さ、これらを植物
に注入したことと関連する可視的病症が生じないこと、
及びこれらが植物組織に拡散する容易さに基いて選択し
、そして予備的状＠量試験に供した。これら５個の融合
雑種を融合体舎１〜４−５と称し、次の予備的収穫量試
験に供した。

１０ｃｒｎのノｊ−ライトの上に１５ｃｒｎの洗浄した
無殺砂を収容したフラット（３０ｃｒｎ×４６ｃｒｎ）
に、均一な間隔で２４個の発芽した甜菜の柚子を置いた
。フラットを温室（約２２〜２７℃）に保持し、（８９
） そして１日２回ずつ脱イオン水を給水した。１０日目（
種子の窒素が消費される）から、１週間に３回、実生に
栄養溶液を供給した。１ｔの溶液を適用し、そして自然
排水せしめた。溶液として、唯一の窒素源として６μＭ
の硝酸イオンを含有する変形されたＬｏｎｇ　Ａｓｈｔ
ｏｎミックスを使用した。

さらに、Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎミックスに６ｍＭ及び
０の濃度で硝酸イオンを含有せしめて、それぞれ比較試
行Ａ及びＣにおいて使用した。

実験を６週間行い、この時点で植物を収穫し、そして９
５℃にて１週間乾燥した。そして乾燥重量データを収集
した。感染植物全収容するフラットについて、１０日目
（これと同時に施肥を開始した）に、細直株を注入によ
シ導入した。各分析は３連（処理当たり２４本の植物を
収容するフラット３個ずつを使用）で行い、そしてデー
ターをの間の５種類の異なる組直融合体を選択し、そし
てこの研究に使用した。実際のフラット当シの乾燥重量
収穫データ（３フラツトの平均）を次に示す。

以下余白 （９２） 融合体す２，３，４．及び５の結果は統計的に有意であ
る。

接種されていない比較試行Ａ、Ｂ、及びＣは例１におけ
る接種されていない比較試行Ａ、Ｂ、及びＣと同じ意味
を有する。融合体す３は、いずれの植物においても病気
の可視的症状は観察されなかったが、非可視的病原効果
を生じさせた。予備的収量データはこの発明の方法によ
シ、好気的に空中窒素を固定することができ、甜菜と内
共生関係に入ることができる少なくとも３種類の安定な
融合雑種細菌（融合体＋２，４．及び５）を製造するこ
とができ、この融合体によって、窒素ストレス条件下で
生育した甜菜が、感染を受けなかった甜菜に比べて４１
〜１８０係の収量増加金もたらしたことを確認した。

例３ 例２を反復した。但し、融合生成物ｉ、６ｍＭの濃度で
硝酸塩の形で窒素を与えられた（すなわち最適の９累施
肥を受けた）甜菜に適用した。感染を受けなかった甜菜
において、非感染対照試行（９３） Ａの収量を有意に上まわる収量は観察されなかった。こ
の結果は、例２における融合体に関連する収量の増加が
、固定化窒素が融合体によって与えられそれが植物宿主
によって使用されるという、融合体と植物との間の内共
生関係に基くものであることを確認するものである。も
し、例２において観察された収量の増加が融合体によっ
て生産された生育制御物質又はホルモンに基くものであ
れば、例３においても同様の収量増加が観察されるはず
である。

宿主との内共生関係の上記以外の証明は、ダラム染色を
用いる光学顕微鏡により、及び感染植物からの細菌の再
分離から（保持された抗生物質耐性マーカーの発現音用
いる）祷られる。さらに、雑種細菌は植物全体にわたっ
て見出される。これらの位置は感染部位に限定されない
。植物組織中の雑種紳菌の数は、低硝酸塩条件下で生育
するトウモロコシ植物中で約１０５／ｇ（乾燥重量）で
あった０ スクリーニング方法を適当に変更することによリ、リゾ
ビウム中で行われるように嫌気的に、又は微好気性（ｍ
ｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）細菌によシ行われるよ
うに非常に少量の酸素の存在下で窒素を固定することが
できる雑種を、この発明に従って製造することができよ
う。特に、窒素固定能力についてのスクリーニング中窒
素不含培地中の酸素を最少にし又は除去する必要がある
。

このような嫌気的窒素固定雑種が植物宿主と内共生関係
に入る場合には、この雑種はさらに、リゾビウムの種中
に含まれているような、宿主をして、作物中には通常存
在しないような無酸素又は低酸素環境を生じさせる遺伝
物質を含有しなければならない。この理由のため、好気
的窒素固定細菌を使用するのが好ましい。

この発明の融合体のあるものは胞子を形成することが見
出された。この発明に従って得られる、胞子を形成する
内共生的細菌を選釈することにょシ、植物宿主への細菌
の適用及び細菌の生存が容易になる。々ぜなら、一般に
胞子は増殖中の細菌細胞よりもストレスに対して耐性が
高すがらである。

この発明の方法及び融合生成物を、主として、窒素を固
定することができる細菌の融合生成物に関連させて記載
したが、スクリーニング方法を適当に変えることによっ
て、他の農業用化学物質、例えば殺虫性物質、除草性物
質、抗カビ性物質、抗細菌性物質、抗ウイルス性物質、
植物生育制御物質、可溶化燐酸化合物を生産することが
できる雑種をこの発明に従って製造することができよう
。

さらに、前記の例は、雑種中に１種類の農業用化学物質
の生産のための遺伝子を含有せしめることを例示したが
、２種以上の適合性の生成物を生産するための遺伝子を
この発明に従って形成される雑種中に含有せしめること
も考えられる。すなわち、この発明に従って形成された
雑種と他の農業用化学物質生産性細菌との融合、農業用
化学物質２種類以上を生産することが知られている生物
との最初の融合、又は農業用化学物質を生産する２種類
以上の細菌との最初の融合により、前記の多種類生産性
生物が得られるであろう。同様に、適（９６） 用し得る植物宿主の範囲を、２種類以上の感染性細菌と
の融合によって拡張することができよう。

この発明の方法及び生成物において、種々の変法又は変
形を行い得ることが当業者にとって明らかであろう。そ
して、このような変法又は変形もこの発明の範囲に属す
る。

特許出願人 クロップ　ジェネティックス　インコーホレイティド。

ナムロゼ　ペノート’ＸＪ　ＩＦ？プ 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西山雅也 （９７） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号１：０７
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化
   学物質生産性雑種細菌の製造方法であって、農業用化学
   物質生産性細菌と該植物宿主に感染する感染性細菌とを
   融合せしめ、そしてこの融合生成物から、農業用化学物
   質を生産することができ、＃植物宿主に病気を発生せし
   めず、そして該植物宿主と内共生関係に入ることができ
   る紹１菌を選択することから成る方法。 ２、植物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化
   学物質生産性雑種細菌の製造方法であって、 （４）任意の便利な順序において、 （１）前記植物宿主を特定し； （２）該植物宿主に感染する感染性細菌を特定し；（３
   ）該植物宿主に感染する能力のほかに１又は複数の選択
   可能な性質を有する前記感染性細菌の変異株を選択し；
   そして、 （４）１又は複数の選択可能な性質を有する農業用化学
   物質生産性細菌を選択し； （Ｂ）　前記感染性細菌と前記農業用化学物質生産性細
   菌との融合雑種を形成し； （Ｃ）　先行する段階又は亜段階の生成物から、そして
   任意の便利な順序において、 （１）農業用化学物質生産性細菌の前記選択可能な性質
   の少なくとも１つ、及び感染性細菌の前記選択可能な性
   質の少なくとも１つの両方を有する雑種を含んで成る細
   菌亜群； （２）前記感染性細菌が前記植物宿主への感染の初期に
   おいて植物組織と相互作用するのと同様な態様において
   、植物組織と相互作用する能力を有する雑種を含んで成
   る細菌亜群；（３）前記宿主への適用に際して病気を発
   生させない雑種を含んで成る細菌亜群； 及び、 （４）あらかじめ選択されていないとしても前記農業用
   化学物質を生産する能力を有する雑種を含んで成る細菌
   亜群； を順次選択し；そして、 ■）前記の段階Ｃ（１）〜Ｃ（４）の生成物から、前記
   植物への前記農業用化学物質の直接適用により又は前記
   農業用化学物質生産性細菌の適用により植物の性能が改
   良されるはずである条件下で、植物宿主の性能を改良す
   ることができる雑種を選択することにより、前記植物宿
   主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質生産
   性細菌を選択する； ことを含んで成る方法。 ３、農業用化学物質生産性細菌の段階（Ｃ）（］）にお
   いて選択される選択可能な性質が前記農業用化学物質を
   生産する能力である特許請求の範囲第２項記載の植物宿
   主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質生産
   性雑種細菌の製造方法。 ４、農業用化学物質生産性細菌の段階（Ｃ）（１）にお
   いて選択される選択可能な性質が前記農業用化学物質を
   生産する能力に加えて１又は複数の選択可能な性質であ
   る特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係に
   入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造
   方法。 ５、　自然の又は人工的な遺伝的技法によって前記の内
   共生的農業用化学物″霞生産性細菌をさらに変性するこ
   とにより前記植物宿主のための前記農業用化学′ｌ１Ｉ
   ｌ質の源としての前記＋Ｎｔｌｌ菌の性能を改良する段
   階を含む特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生
   関係に入ることができる農業用化学物質生産性雑種Ｈ１
   ｊ菌の製造方法。 ６、前記農業用化学・物質を生ｊ宿する能力、及び前記
   感染性細菌が植物宿主に感染する初期において植物組織
   と相互作用するのと同様の態様において植物組織と相互
   作用する能力について、細菌を２回以上スクリーニング
   する特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係
   に入ることができる農業用化学物Ｊ′ｔ′ｉ生産性韓沖
   ｎ１１菌のり々遣方法。 ７、段階（Ｃ）の生成物を、段階０）に先立って、Ａｆ
   前記植物宿主全体にわたって最も容易に拡散する雑種を
   この方法に従ってさらにスクリーニングして選択するこ
   とによりさらに限定する特許請求の範囲第２項記載の植
   物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質
   生産性雑種細菌の製造方法。 ８、前記感染性細菌が植物宿主に感染する初期の段階に
   おいて植物組織と相互作用するのと同様な態様で植物組
   織と相互作用する前記の能力が、植物細胞に結合する能
   力である特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生
   関係に入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌
   の製造方法。 ９、前記感染性細菌が植物宿主に感染する初期の段階に
   おいて植物組織と相互作用するのと同様な態様で植物組
   織と相互作用する能力が、前記植物宿主の管系を介して
   拡散する能力である特許請求の範囲第２項記載の植物宿
   主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質生産
   性雑種細菌の製造方法。 １０、前記感染性細菌が植物宿主に感染する初期の段階
   において植物組織と相互作用するのと同様の態様で植物
   組織と相互作用する能力が、病気の症状音生じさせるこ
   となく植物宿主の根の中で生存する能力である特許請求
   の範囲第２項記載の植物と内共生関係に入ることができ
   る農業用化学物質生産性雑種細菌の製造方法。 １１、段階Ｃ）の生成物を、段階（１））に先立って、
   前記植物宿主全体にわたって最も容易に拡散する雑種を
   この方法に従ってさらにスクリーニングして選択するこ
   とによりさらに限定する特許請求の範囲第８項記載の植
   物宿主と内共生関係に入ることができる農業用化学物質
   生産性雑種細菌の製造方法。 １２、前記農業用化学物質生産性細菌が窒素固定細菌で
   ある特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係
   に入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製
   造方法。 １３、前記農業用化学物質生産性細菌及び前記感染性細
   菌がいずれもグラム陰性細菌である特許請求の範囲第２
   項記載の植物宿主と内共生関係に入ることができる農業
   用化学物質生産性雑種細菌の製造方法。 １４、段階Ｃ（１）〜Ｃ（４）を記載した順序で実施す
   る特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係に
   入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造
   方法。 １５、段階Ｃ（１）〜Ｃ（３）を記載した順序で実施す
   る特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係に
   入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造
   方法。 １６、前記融合雑種をプロトゾラスト融合により形成す
   る特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係に
   入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製造
   方法。 １７、前記融合雑種をスフェロプラスト融合により形成
   する特許請求の範囲第２項記載の植物宿主と内共生関係
   に入ることができる農業用化学物質生産性雑種細菌の製
   造方法。 １８、農業用化学物質を生産する能力、及び植物宿主と
   非病原的、内共生関係に入る能力とを有する安定な融合
   雑種細菌。 １９、前記融合雑種細菌が農業用化学物質生産性細菌と
   植物宿主に感染する能力を有する感染性細菌との雑種で
   ある特許請求の範囲第１８項記載の安定な融合雑種細菌
   。 ２０、前記感染性細菌がアグロバクテリウム細菌である
   特許請求の範囲第１９項記載の安定な融合雑種細菌。 ２１、前記農業用化学物質生産性細菌が窒素固定細菌で
   ある特許請求の範囲第１９項記載の安定な融合雑種細菌
   。 ２２、前記窒素固定細菌がアゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏ
   ｂａｃｔｅｒ）属の細菌である特許請求の範囲第２１項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ２３、前記農業用化学物質生産性側＠件が抗細菌性物質
   を生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１
   ９項記載の安定な融合雑種細菌。 ２４、抗細菌性物質を生産する能力を有する前記細菌が
   ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属の
   細菌である特許請求の範囲第２３項記載の安定な融合雑
   種細菌。 ２５、前記農業用化学物質生産性細菌が抗ウイルス性物
   質を生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第
   １９項記載の安定な融合雑種細菌。 ２６、抗ウイルス性物質を生産する能力を有する前記細
   菌がストレプトミセス属の細菌である特許請求の範囲第
   ２５項記載の安定な融合雑種細菌。 ２７、前記農業用化学物質生産性細菌が殺虫性物質を生
   産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１９項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ２８、殺虫性物質を生産する能力を有する前記細菌がバ
   シルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属の細菌である特許請求
   の範囲第２７項記載の安定な融合雑種細菌。 ２９、前記農業用化学物質生産性細菌が殺線虫性物質を
   生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１９
   項記載の安定な融合雑種細菌。 ３０、殺虫性物質を生産する能力を有する前記細菌がス
   トレプトミセス属の細菌である特許請求の範囲第２９項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ３１、前記農業用化学物質生産性細菌が殺ダニ性物質を
   生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１９
   項記載の安定な融合雑種細菌。 ３２、殺ダニ性物質を生産する能力を有する前記細菌が
   ストレプトミセス属の細菌である特許請求の範囲第３１
   項記載の安定な融合雑種細菌。 ３３、前記農業用化学物質生産性細菌が除草性物質を生
   産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１９項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ３４、除草性物質を生産する能力を有する前記細菌がス
   トレプトミセス属の細菌である特許請求の範囲第３３項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ３５、前記農業用化学物質生産性細菌が結合燐酸化合物
   を可溶化する能力を有する細菌である特許請求の範囲第
   １９項記載の安定な融合雑種細菌。 ３６、結合燐酸化合物を可溶化する能力を有る細菌がパ
   シルス属の細菌である特許請求の範囲第３５項記載の安
   定な融合雑種細菌。 ３７、前記農業用化学物質生産性細菌が生育制御物質を
   生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１９
   項記載の安定な融合雑種細菌。 ３８、生育制御物質を生産する能力を有する前記細菌が
   シュードモナス属の細菌である特許請求の範囲第３７項
   記載の安定な融合雑種細菌。 ３９、前記農業用化学物質生産性細菌が、香気物質及び
   抗フィーディング物質からなる群から選ばれた化学物質
   を生産する能力を有する細菌である特許請求の範囲第１
   ９項記載の安定な融合雑種細菌。 ４０、作物種子、該作物種子上に被覆された生物的に分
   解され得る栄養担体物質、及び農業用化学物質を生産し
   そして前記担体物質と組合わされた前記作物と非病原性
   内共生関係に入る能力を有する安定な融合雑種細菌を含
   んで成る農業用種子製品。 ４１、農業用化学物質を生産しそして前記担体物質と組
   合わされた前記作物と非病原性内共生関係に入る能力を
   有する安定な融合雑種細菌によシ感染された作物種子を
   含んでなる農業用製品。 ４２、水と、農業用化学物質を生産しそして植物宿主と
   非病原性内共生関係に入る能力を有する安定な融合雑種
   細菌との混合物を含んで成る農業用土壊浸とう液。 ４３、植物宿主中に注入するのに適する園芸用として許
   容される担体中、農業用化学物質を生産しそして植物宿
   主と非病原性内共生関係に入る能力を有する安定な融合
   細菌を含んで成る農業用製品。