JPS6070074A - 微生物産生子ウシプロキモジンの回収および活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キモジン（別名レンニンＥ、Ｃ，３，２，２３，４，）
は子ウシの第４胃から分離さｎる酵素である。こｎにカ
ッパカゼインからパラカッパカゼインへの加水分解を触
媒することにより凝乳を産生する能力をもつ点で評価さ
ｎており、バラ力ツノくカゼインにカルシウムイオンの
存在下で不溶性の凝乳カルシウムパラカゼイン塩として
沈殿する。乳漿を除去後、凝乳は加工さｎて各種のチー
ズとなる。

神々の蛋白質分解酵素が乳を凝固させるが、最良のチー
ズはキモジン含量の高い試料で凝固させた乳から作らｎ
でいる。キモジンの有用性−すなわち究極的にはその価
値−に子ウシ肉に対する需要に依存している、というの
に子ウシが成長し離乳するとともにキモジン座生量は減
少しペプシンが増加してくるからである。キモジン類似
の酵素が真菌類特にＭ、ｍｅｈｅｉから抽出さ扛ている
が、凝乳そして最終的にはチーズの味に異なる。チーズ
製造におけるキモジンの優秀性におそらくその基質であ
るカッパカゼインを攻撃する際の高度に特異的な様式に
関係するものと推足さｎる。

子ウシのキモジンは２種のアイソザイム（ＡおよびＢと
表示）として存在し、こｎらに結晶酵素のＤＥＡＥセル
ロースクロマトグラフィーにより分離することができる
。アイザイムＢｆｌアイソザイムＡよりも触媒効率が劣
るが、組織抽出物にはより多量に含ま几ている。子ウシ
のキモジン１１１アミノ酸配列が完全に解明さ扛ており
キモジンＡも部分的に解明さｎているが、その結果２９
０番目のアミノ酸残基ひとつのみが異なることがわかっ
り（キモジンｌｌｊグリシン、Ａはアスパラギン酸）（
Ｂ、７オルトマｙ　（Ｆｏｌｔｍａｎｎ）　らＪ　、　
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２５４巻８４４〜８４５７頁（１９７６
）参照）。

キモジンは胃壁の細胞内でプレプロキモジンという前駆
体の形で合成さ扛る。プレプロキモジンのプレ部分にア
ミノ末端にあるアミノ酸鎖である。

こｎらのアミノ酸はシグナルペプチドであり細胞質周辺
領域に分泌するために蛋白質を細胞壁へ輸送することに
関係するものと思わｎる。シグナルペプチドは細胞壁で
切断さ几酵素にプロキモジンとして分泌さｎる。プロキ
モジンは３６５このアミノ酸を含む酵素原（分子量４０
，４７７ダルトン）である。プロキモジンはアミノ末端
の４２このアミノ酸を特異的に除去することによりキモ
ジンとなる。プロキモジンからキモジンへの転換ば胃の
ｐＨの低い環境により有利となる。

プロキモジンからキモジンへの転換に関する研究には特
別な関心が寄せらｎている。プロキモジン［１８７２年
にハマーシュタインにより初めて報告さｎｙｔｃＯ，ハ
マーシュタイン（Ｉ（ａｍｍｅｒｓｔｅｎ）Ｕｐｓａｌ
ａ　Ｌａｅｋａｒｅｆｏｅｒｅｎ、Ｆｏｅｒｈ、、　８
巻６３頁（１８７２））ｏこ扛は中性およびアルカリ性
ｐＨで安定であり、種々の方法により分離さｎている。

フォルトマンらは天然のプロキモジンをキモジンへの転
換について研究を行なつ７ｔ（Ｖ、Ｂ、−＜ｆルセン（
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）＋Ｂ、フォルトマン、　Ｅｕｒ、Ｊ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、５５巻９５頁（１９７５））：（Ｂ−
フォルトマンら、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
（Ｕ、Ｓ、）７４巻２３２１頁（１９７７））、（Ｖ、
Ｂ、ベデルセ／、に、Ａ、クリステンゼｙ（Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎ）　。

Ｂ、フォルトマン、　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９４巻
５７３頁（１９７９）：Ｂ、フォルトマン＊　Ｃ、Ｒ、
Ｔｒａｖ。

Ｌａｂ、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、　３５巻１４３頁（１９
６６））。

彼らｉｄ、ｐＨ２において分子間加水分解が起こってプ
ロキモジンのｐｈｅ−Ｌｅｕ　（第２７−２８番目間）
間が開裂し活性型の１シユードキモジン１が生じ、こｎ
がＰＨ４以上において分子内加水分解によりキモジンへ
転換すると主張した。この他に、シュードキモジンの生
成において分子内反応を仮定する者もある（アルヤナキ
（ＡＩ−Ｊａｎａｋｉ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
　２４７巻４６２８頁（１９７２））。

組換ＤＮＡ技術の出現により、プロキモジンのアミノ酸
配列を暗号化するｃＤＮＡを、形有転換した微生物内で
ブローモーターと調節配列の支配下で発現させることに
よりプロキモジンを生産することが可能となった０コペ
ンデイング（米国特許出願第５１１，７６６号１９８３
年７月７日提出）は融合蛋白質を暗号化するＤＮＡ配列
を発現させることを含むキモジンの生産方法について記
載している。融合蛋白質は通常、′活性化可能なプロキ
モジン１に結合したブローモーター配列（すなわちトリ
ブトファン合成酵素のβサブユニット）を伴った細菌蛋
白質のＮ末端断片である。活性化可能なプロキモジンは
１成熟１キモジンとそのプレ配列を十分に含む領域（最
低１５アミノ酸残基以上）のアミノ酸配列から成ってお
り、生成物が後続の自己触媒開裂により転換して活性キ
モジンを生ずることができるようになっている。プレ配
列部分に加えて、プロキモジン融合生成物はプレプロキ
モジンのシグナルペプチドの一部マタは全部および／あ
るいはアミノ酸の短いリンカ−（連結体）を含むことが
でき、リンカ−は細菌蛋白質のＮ末端断片とプロキモジ
ン（＝ｌニアｔｆｌプレプロキモジン）のアミノ酸残基
との間に位置している。

発現さｎ４ｃ蛋白質中のリンカ−の配列は、発現ベクタ
ー内で細菌蛋白質断片を暗号化するＤＮＡ配列とプロキ
モジン（ま７ｊハプレプロキモジン）のＤＮＡ配列を暗
号化するＤＮＡ配列とを結合し、こｆらの２つの暗号配
列の解読わぐをずらさないように保っている合成りＮＡ
リンカ−配列の翻訳の結果化ずる。

発現産物、すなわちプロキモジン融合蛋白質は、細胞内
で不溶性の沈殿物を形成する。細胞溶菌後、この沈殿物
は従来の蛋白質溶剤には不溶でありかつ自己触媒開裂に
より活性化して成熟キモジンを生ずるという能力にない
。発現産物が自己活性化できないのに発現蛋白質が正常
な折ったたまｎ刀をされてないことに関係すると信じろ
ｎており、こｎはすなわち蛋白質が発現される微生物宿
主内の環境の異常性とも関係してくる。したがって、微
生物により生成したプロキモジンを回収し活性化する方
法が必要となる。

本発明に以下の事から成る方法により微生物の産生じた
ウシプロキモジンを回収し活性化することができるとい
う発見に基づくものである：（ａ）発現さｆ′Ｌ７ｔグ
ロキモジ／を変性剤中で可溶化し； ６）溶媒中の変性試薬を除去もしくは希釈することによ
りプロキモジンを再生し； （ｃ）再生したプロキモジンを低ｐＨで活性化し活性シ
ュードキモジンを生成し； （ｄ）　ｐＨを上げシュードキモジンを保温して活性成
熟キモジンを生成する。

本発明の方法は微生物産生ウシプロキモジンを回収し活
性化する方法を提供する。ここで使用さ几る場合、「微
生物産生プロキモジン」という語は、キモジンのアミノ
酸配列と−ここに記述さｎる過程に後続する活性成熟キ
モジンへの自己触媒転換を可能にするための最低４２個
以上のアミノ酸プレ配列とを暗号化する外米性ＤＮＡの
、微生物宿主（すなわち大腸菌）円での発現により生じ
たウシプロキモジンを意味する。ゾロキモジンプレ配列
中少なくとも約１４この最後端アミノ酸が活性化閾値に
おいて必要であることがわかっている。

プレ配列に最低２０こばあるのが望ましり、４０こ以上
であｎば最も有利である。場合によっては、プレプロキ
モジンのシグナルペプチドの一部または全部を塀えるこ
ともできる。さらに、本発明のアン合成酵素のβサブユ
ニットのような微生物蛋白質の一部または全部と結合し
た融合蛋白質の形態をとっており、こｎらの微生物蛋白
質の発現は通常プロキモジンの発現を指令する特定のブ
ロモ−ター・オペレーター配列によって指令さｎる。

プロキモジンが融合蛋白質として発現さ几る場合、リン
カ−となるアミノ酸配列も存在する。リンカ−配列は細
菌蛋白質のアミノ酸配列とプロキモジンのアミノ酸配列
とを連結する役目をもつ。微生物産生プロキモジンの発
現に、リボゾームでメチオニンに翻訳さｎるＡＴＧとい
う配列の存在により開始さｎるので、微生物産生プロキ
モジンに通常その最初のアミノ酸残基としてメチオニン
をもつことになる。

微生物産生プロキモジンは、プロキモジンのアミノ酸配
列（その最初の２このアミノ酸を除く）に結合したトリ
プトファン合成酵素のサブユニットのＮ末端断片を暗号
化するＤＮＡ配列をｔｒｐプロモーターの支配下で形質
転換細胞内で発現させることにより産生ずることができ
る。トリプトファン合成酵素のβサブユニットの初めの
２７このアミノ酸配列の暗号配列Ｕ、ＰＲＯ−８ＥＲ−
ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−８ＥＲ−ＰＲＥ−Ａ
ＳＰ−ＧＬＮの残基を暗号化するリンカ−配列によりプ
ロキモジンの暗号配列と連結さｎている。このＤＮＡ配
列を含むプラスミドｐＧｘ２２３１で形質転換さｆした
大腸菌株（Ｇｘ１６７０）に、イリノイ州ビオリアのＮ
ＲＲＬに登録番号Ｂ−１５５７１で寄託さｎている。プ
ロキモジンの微生物による産生への使用に適したもうひ
とつのプラスミドはｐＧＸ１０４９で、こ７″Ｌはλフ
ァージの初期の左方向ト右方向のブロモ−ターの部分か
ら形成した雑種ブロモ−ターの支配下で融合させたｔｒ
ｐ　Ｂ断片／プロキモジン遺伝子を含む。雑種プロモー
ターばｃＩ８５７温度感受性抑制蛋白質により抑制さｎ
る。

微生物産生ウシプロキそジンが大腸菌のような非分泌性
宿主内で発現さｎる場合、プロキモジンに本発明の処理
法を施こす前に細胞を溶菌させてプロキモジンを放出さ
せねばならない。発現さｎたウシプロキそジンを含む細
胞にまずはじめに細胞を生育した発酵培地から通常遠心
分離により回収さｎる。次いで細胞は溶菌さｎてウシプ
ロキモジンを放出する。少量の非分泌性宿主細胞培地を
扱う場合は、フレンチプレスを用いて溶菌させるのが望
ましい。しかし、この他の従来の溶菌方法、たとえば機
械的ホモジナイザーや酵素的あるいは化学的方法なども
使用できる。プロキモジンは他の不溶性の細胞性蛋白質
や残渣とともに、熟練技術者に既知のいずｎかの手段、
たとえば１０，０００？での遠心分離などにより可溶性
分子から分離することができる。

遠心分離した沈殿物中に含まｎる微生物産生ウシプロキ
モジンに、本発明の処理法における出発材料として使用
することができる。微生物産生ウシプロキモジンは変性
剤中で可溶化さｎる。変性剤とに蛋白質を可溶化し変性
させることが知らｎている溶剤である。適当な変性剤の
例としてばＮ　ａ　ＯＨのような強塩基や尿素やグアニ
ジンのような可溶化剤がある。溶液のｐＩｌ（にＮａＯ
Ｈのような塩基を使用した場合Ｈ１２，Ｏ以上であるこ
とが望ましい。こｎに代わって８Ｍ尿素や７Ｍグアニジ
ンを使用することもできる。溶液は、微生物産生プロキ
モジンを含む沈殿物を水酸化ナトリウム希溶液中で望ま
しい蛋白質濃度となるまで再懸濁して調製することがで
きる。溶液の調整には水酸化ナトリウムを使用すること
が望ましいが他の市販の可溶化剤、たとえばグアニジン
や尿素なども使用できる。

変性さ＋！：た微生物産生ウシプロキモジンは仄に、変
性試薬を除去またに希釈することにより再生さｎるが、
こ−ｎ、は脱イオン水で溶液を希釈しｐＨを約８．５な
いし１０．５に調整してこのｐＨでグリシンのような緩
衝剤の存在下で保温することによって行なうことが望ま
しい。保温は再生を促進する温度で行なう。保温温度は
一般に約４℃ないし３７℃の範囲にある。保温は、微生
物産生ウシプロキモジンが再構成さｎて活性キモジンへ
の転換を触媒できるようになるまで行なう。保温時間は
保温温度にいくらか依存するものと考えらｎる。ゎ扛わ
れは４℃における４８時間の保温が微生物産生ウシプロ
キモジンの活性を効果的に回復することを見出した。

尿素やグアニジンを変性試薬として使用した場合、再生
は既知の透析技術を用いて溶液を透析し尿素やグアニジ
ンを除去することにより行なうことが望ましい。

わｎわｎはＮａＯＨによる変性濃度は０．０１　Ｍ以上
であり、８Ｍ尿素ま７ｔｉ６Ｍグアニジン塩酸でに２，
３分以上おくと後続のプロキモジンの活性キモジンへの
転換が可能な形態への再生を阻害することを見出した。

再生に影響を与えずにプロキモジンを変性条件下におい
ておける時間は、変性剤濃度と温度によってきまる。０
．１ＭＮａＯＨを■えて室温で変性させた場合、プロキ
モジンを再生させるためのＮａＯＨの希釈に変性条件に
達した後、ただちに行なうことが望ましい。

本発明の出願した実施例では、遠心分離後の沈殿物にエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム（約１０ｍＭ）のよう
なキレート剤の冷却溶液に蛋白質濃度が約１０η／ｌｎ
１．以上となるように再懸濁する。

生ずる懸濁液をＮａＯＨを最終濃度が約０．１Ｍとなる
まで加えることにより可溶化し変性させる。可溶化Ｗは
非常に粘性が高いが、こｎを直ちに脱イオン水で１０倍
希釈しグリシンを加えてｐＨを１０．０に調整する。グ
リシンの最終濃度は１０ｍＭないし５０ｍＭとなる。仄
いで、２４℃で２０ないし２４時間保温することにより
再生を行なう。

再生後、微生物産生ウシプロキモジンは天然のものと同
じ立体構造をもつと仮足して、成熟活性キモジンのアミ
ノ酸配列からプレ配列部分のアミノ酸を切断する技術に
より活性キモジンへ転換することができる。こｎは外米
性の蛋白質分解酵素により行なうこともできるが、プロ
キモジン含有溶液のｐＨを約２゜５以下に低下させて活
性シュードキそジンを生成させ、次いでｐＨを４．０な
いし７．０、望ましくは約６．０に調整しこｎによりシ
ュードキモジンを活性成熟キモジンへ転換させることに
よって、再生キモジンをキモジンへ転換させることが望
ましい。本発明の実施例では、塩酸のような非酸化性の
酸を添加して溶液のｐＨを約２．０以下に低下させ、溶
液を４℃に保つことにより、シュードキそジンへの転換
を行なった。

活性シュードキモジンＨｐＨ２，０で非常に溶解性が高
いので、プロキモジンが発現さＴ′Ｌ′ｆｔ：、宿主細
胞由来の余分の蛋白質は溶液を０．２〜０．３Ｍ塩化ナ
トリウムに調整した後、１０，０００９で遠心分離して
余分の蛋白質を沈殿させることにより簡便に塩析するこ
とができる。

活性シュードキモジンの最終溶液中の濃度は低い。ｐＫ
ａが２．５以下の陽イオン交換樹脂にキモジンを吸着さ
せることにより濃縮されかつより純度の高い溶液を得る
ことができる。樹脂は便宜上ｐＨ２の緩衝液で洗浄する
ことにより非吸着性の夾雑蛋白質を除去し、仄いでｐ　
Ｈ６，０の緩衝液で吸着したキそジンを離脱させて抽出
することができる。

以上の代わりに、ｐＨ２，５以下の酸性にすることによ
るプロキモジンからシュードキモジンへの転換の後、リ
ン酸ナトリウムによるｐ　Ｈ６，０ナイし６．５への簡
単な滴定によってシュードキモジンを精製しキモジンへ
成熟させることもできる。この滴定により余分な蛋白質
の沈殿が生じこｎば１．０．０００ｒ以下の遠心分離に
より除去できる。

遠心分離後の上清を含むキモジンは仄のようにして最終
形態まで濃縮できる：　ＤＥＡＥセルロース（ワットマ
ンＤＥ−５２）のような陰イオン交換樹脂に吸着させた
後、０．５ＭＮａＣｔ−５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐ　Ｈ６，０ないし６．５）で溶出する；硫安（６
０％飽和）またに飽和塩化ナトリウムで沈殿させた後、
酢酸ナトリウムまりはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，５ないし６．５）で再び可溶化する、あるいは名目分
子量ｉｏ、ｏｏ。

の粒度のフィルターで限外濾過する。

成熟キモジンはｐ　Ｅ　６．０の緩衝液中で冷蔵すｎば
安定で、安定剤や発色剤その他で明確化したり、あるい
は凍結乾燥して乾燥粉末にすることができる。以上のよ
うにして生成した酵素に、子ウシの胃から抽出した従来
のレンネットとしてチーズ製造などに使用することがで
きる。

実施例Ｉ ｐＧＸ２２３１からのキモジンの回収 プラスミドｐＧＸ２２３１　で形質転換した大腸菌を１
００μｔ／−のアンピシリンを含むＬＢ培地８を中で生
育した。プラスミドは、大腸菌のｔｒｐプロモーター−
オペレーター配列、リボゾーム結合部位の暗号配列、開
始信号、およびＰｒｏ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ　という
配列を介してプロキモジン（最初の２このアミノ酸を除
く）に結合したトリプトファン合成酵素のβサブユニッ
トのアミノ酸２７このＮ末端断片を暗号化する、プロモ
ーターに連結しｚＤＮＡ配列を含む。成長過程は５６０
　ｎｍの吸光度測定で追跡した。Ａ　５６０が２に達し
た時点で細胞を集め１０，０ＯＯＧで遠心分離した。細
胞の全湿重量に２７．３ｔであった。細胞を８０−の脱
イオン水に再懸濁し、フレンチプレス中で１　ａｏｏｏ
ｐ　ｓ　ｉ　Ｃ１士−°ンＬ毎千刀インチ）（中１．２
６５　Ｋｐｗ／ｃｒｎ２）で溶菌させた。細胞溶解産物
を直ちに約１０，０００ｆで遠心分離し上清を捨てた。

沈殿物を０．０１　Ｎ水酸化ナトリウム１６００ｄテ抽
出し、ｐＨ１２まで滴定してプロキモジン融合蛋白質を
可溶化した。仄いで溶液を脱イオン水で４ｔまで希釈し
た。グリシン（１５，２９）　全緩衝剤として加え、溶
液を０．ＩＮ塩酸でｐ　Ｈ９，５まで滴定した。溶液を
４℃に４８時間静置しプロキモジン融合蛋白質を再生さ
せた。仄いで溶液を塩酸で滴定してｐＨ２とし、４時間
静置することによりプロキモジン融合蛋白質からキモジ
ンへの転換を行なわせた。塩化ナトリウム（７０，１３
ｆ　）を添加し、溶液を１０，０ＯＯＧで遠心分離した
。キモジンを含む上清を静かに傾瀉し、脱イオン水で希
釈して６ｔとした。ｐＫａが２．０付近のイオン交換樹
脂（ワットマン５Ｅ５３）を０．０５Ｍグリシン１）Ｈ
２，５で平価化し、希釈した上清中に懸濁した。懸濁液
を３０分間撮とうし、−晩装置した後上清を捨てた。吸
着したキモジンを含む樹脂な０．０５　Ｍリン酸冷却溶
液１０〇−中に再懸濁した。

遠心分離後、上清を捨て樹脂を最少量の０．０５Ｍリン
酸−水素ナトリウムに再懸濁し、ｐＨ６，０まで滴定し
てキモジンな脱着させた。懸濁液を振とうした後、１４
，５００　Ｇで遠心分離した。上清（Ｉ）を集め、樹脂
を再び０．９Ｍ塩化ナトリウムを含む０・０５Ｍリン酸
−水素ナトリウム（ｐＨ６）に懸濁して残りのキモジン
な脱着させた。娠とう後懸濁液を遠心分離し上清（ＩＩ
）を集めた。

上清ｌと■について以下の方法によりキモジン活性を検
定した。上清ＩＵキモジン７．５単位、上清■は１．９
単位を含むと測定さｎ　７ｊ　。

キモジンの活性は酸性条件下でカッパカゼインを沈殿さ
せるというキモジンの能力を利用して測定した。５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５，５に溶
解した酵素希釈液を、全乳ま７ｔは脱水孔のいずｎかか
ら精製したカッパカゼイン２■／７！　とともに２４時
間室温で保温し＊（Ｃ。

Ａ、ライトル（Ｚｉｔｔｌｅ）　、Ｓ、　Ｈ，キャスタ
ー（Ｃａｓｔｅｒ）、Ｊ　、Ｄａｉｒｙ　８ｃｉ、　４
６巻１１８３〜１１８８頁（１９６３））。キモジン活
性は、バラカゼイン塩沈殿を生ずる最低試料希釈率（最
小限界濃度に相当するもの）と子ウシレンネット基準単
位力価の沈殿を生ずる最低希釈率との比較により定量化
する。１単位＝子ウシレンネット単位刀価１ｒｎ１０実
施例■ ｐＧＸ１０４９からのキモジンの回収 プラスミドｐＧＸ　１０４９　で形質転換し九大腸菌株
ＧＸＩ　２１４を規足さｎた培地９を中で３２℃で生育
した。キモジンの発現に温度を４２℃に１時間上昇させ
ることにより誘導した。４２℃で１時間おいた後、培地
を３９℃に冷却しこの温度に２時間保った。その終了時
点で細胞を集めた。

成長に５４０　ｎｍの吸光度測定により追跡した。

Ａ、ｌｌｏが８．０に達した時点で誘導を行なった。細
胞はべり：＋７　（Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ）ミリポア内で０
．４５μデ１ラボア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）膜により約２
１ＶＣ濃縮した後、８．００　Ｏｒｐｍ（ｘ　９，００
０　’？　）で３０分間遠心分離することにより収集し
た。得ら扛た２０９．１４に（湿重量沖細胞沈殿物を８
３６−の脱イオン水中に再懸濁した。細胞をＭａｎ　ｔ
ｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ細胞破壊機に操作圧力９ＴＯＯＯｐ
ｓｉ（中６３３　Ｋｒｗ／ｃｒｎ２）で２回通過させる
ことにより溶菌させた。細胞溶解産物を約９．００　Ｏ
ｒで２０分間遠心分離し上清を捨てた。沈殿を再び約１
ｔの脱イオン水に懸濁した後、約９，０００　ｆで２０
分間遠心分離し上清を捨てた。

沈殿を１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩の
冷却溶液１２６−に再懸濁した。この試料をｌＮＮａＯ
Ｈ１４−をかくはんしつつ添加することにより可溶化し
た。可溶化物を直ちに脱イオン水１１２０ｔ／（室温）
で希釈し、０．１Ｍグリシン１４０ｆｎｔを添加してｐ
Ｈ約１０．０まで中和した。

本試料を約１０，０ＯＯｒで３０分間遠心分離して細胞
残渣を除去した。次いで室温で約６７時間静置し、１．
ＯＮ　Ｈｃｔを加えてｐ）１２．０まで滴足した。

３日間冷蔵してプロキモジンを活性シュードキモジンへ
転換させ友後、ｐＨ２，０の溶液９５５−を０．５Ｍ　
Ｎａ２ＨＰＯ，約８５．５ｍ／！を迅速に添加すること
によりｐＨ６，５とした。試料を３０分間かく（２す はんした後、約１０，０ＯＯｆで２０分間遠心分離した
。上清を集め冷蔵保存した。収量を増やすため、遠心分
離後の沈殿を０．０５　Ｍグリシンｐ　Ｈ２，０，５０
０づに再び溶解し一晩冷蔵した。この溶液を約９．００
　Ｏｆで１０分間遠心分離した。上清を０．５Ｍ　Ｎａ
　ＨＰＯｑを迅速に添加することによりｐ　Ｈ６，５に
調整し、３０分間かくはんした後、遠心分離した。上清
を前述のｐＨ６，５の上清とひとまとめにした結果、最
終容量は１７６０ＷＬｅとなった。ｐＩ（６，５の上清
（１７５５ｍＪ）を冷蔵下で硫酸アンモニウム６４７．
６９″で６０％飽和にし活性キモジンを沈殿させた。ｐ
Ｈ２，０溶液（ブレキモジン）、ｐＨ６，５溶液（キモ
ジン）、および（ＮＨ，）２ＳＯ１沈殿物のキモジン活
性を、単位力価のレンネット１−の活性を１単位として
乳凝固活性により測定した。結果に下記のようになった
。

（２す ｐＨ２，０９５５７８，２７４，５ （シュードキモジン） ｐＨ６，０１，７６０３６，２６３゜７（キモジン） 代理人　弁理士　１）　澤　博　昭 （外２名） 手続補正書（自発） 、　特許庁長官殿 １、事件の表示　特願昭５９−１８０８１９号２、発明
の名称 微生物産生子ウシプロキモジンの回収および活性化法３
、補正をする者 名称　ジエネツクス優コーポレイション６、補正の内容 （１）別紙のとおり願書の特許出願人の代表者の欄を補
正する。

（２）別紙のとおり委任状およびその訳文を補充する。

（３）明細書の浄書（内容に変更なし）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　（ａ）微生物産生ウシプロキモジンを変性剤中で
   可溶化することと、（ｂ）プロキモジンを溶媒中の変性
   試薬を希釈あるいに除去することにより再生することか
   ら成る、微生物により産生さｎｙ’ｃウシグロキゾロン
   を活性キモジンへの転換可能な形で回収する方法。 ２）変性剤がＮａＯＨ，尿素、およびグアニジンの各溶
   液の中から選択さｎる、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３）微生物産生ウシプロキモジンをＮａ０Ｉ（溶液中で
   ｐＨ１２，０以上において可溶化する、特ｒｌｆ謂京の
   範囲第１項記載の方法。 ４）ゾロキモジン含頁Ｎ　ａ　ＯＨ溶液を希釈し、希釈
   溶液をｐＨ８，５ないし１０．５で保温することにより
   プロキモジンを再生させる、特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５）変性剤を尿素とグアニジンの中から選択し、プロキ
   モジン含有溶液を透析して尿素あるいはグアニジンを除
   去することによりプロキモジンを再生させる、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ６）　（ａ）微生物産生ウシブロキモジｙを変性剤中で
   可溶化することと、（ｂ）溶媒中の変性試薬を希釈まタ
   ニ除去することによりプロキモジンを再生させることと
   、（Ｃ）再生プロキモジン含有溶液のｐＨを低下させる
   ことにより再生プロキモジンを活性化し活性シュードキ
   モジンを生成させることと、（ｄ）　活性シュードキモ
   ジン含有溶液のｐＨを上昇させて活性成熟キモジンを生
   成させることから成る、微生物産生ウシプロキモジンか
   ら活性成熟キモジンを産生ずる方法。 ７）微生物産生プロキモジンが、キモジンである蛋白質
   に結合した微生物蛋白質のＮ末端断片と少なくとも活性
   キモジンへの自己触媒開裂を行なうことを可能にするの
   に十分なだけのプレ配列とから成る融合蛋白質であるよ
   うな、特許請求の範囲囲第６項記載の方法。 ８）蛋白質がキモジンのプレ配列のアミノ酸残基をキモ
   ジン側から数えて少なくとも約１４０含むような、特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 ９）蛋白質がキモジンのプレ配列のアミノ酸残基をキモ
   ジン側から数えて少なくとも約２０こ含むような、特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 １０）蛋白質がキモジンのプレ配列のアミノ酸残基をキ
   モジン側から数えて少なくとも約４０こ含むような、特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 １１）変性剤をＮａＯＨ，尿累、グアニジンの各溶液の
   中から選択した、特許請求の範囲第６項および第７項記
   載の方法。 １２）微生物産生ウシプロキモジンをＮａＯＨ溶ｉ中で
   ｐＨ１，２，０以上において可溶化する、特許請求の範
   囲第６項および第７項記載の方法。 １３）プロキモジン含［ＮａＯＨ溶液を希釈し、希釈液
   をｐ　Ｈ８，５ないし１０．５で保温することによりプ
   ロキモジンを再生させる、特ｌｆｆ−謂釆の範囲第１２
   項記載の方法。 １４）変性剤を尿素とグアニジンの中から選択し、溶液
   を透析して尿素またはグアニジンを除去することにより
   プロキモジンを再生させる、特許請求の範囲第６項お・
   よび第７項記載の方法。 １５）再生プロキモジンの活性化をｐＨ約１．０ないし
   ２．５で行ない活性シュードキモジンをｐＨを約４．０
   ないし７．０に上昇させることにより活性成熟キモジン
   へ転換する、特許請求の範囲第６項および第７項記載の
   方法。 １６）再生プロキモジンの活性化をｐＨ約２．０で行な
   い活性シュードキモジンをＰＨを約６．０に上昇させる
   ことにより活性成熟キモジンへ転換する、特許請求の範
   囲第６項および第７項記載の方法。 １７）（ａ）微生物産生プロキモジンをエチレンジアミ
   ン四酢酸ナトリウムのようなキレート剤中に蛋白質濃度
   が１０１ｎ９／−以上となるように懸濁することと、（
   ｂ）　Ｎ　ａ　ＯＨを最終濃度が約０．１Ｍとなるよう
   に添塀することにより懸濁液中の微生物産生プロキモジ
   ンを可溶化することと、（Ｃ）［ちにＮａＯＨ溶液ｆｆ
   ：８釈し、ｐＨを約１０．０に調整して溶液を保温しプ
   ロキモジンを再生させることから成る、微生物産生ウシ
   プロキモジンを活性キモジンへの転換が可能な形で回収
   する方法。