JPS6070360A - 抗特異タイプの標識付モノクロ−ナル抗体を用いる受容体測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は末梢血液細胞上の細胞受容体の定量化のための
測定方法、およびより詳細には受容体の定量化のための
配位子擬似物としての標識付抗特異タイプのモノクロー
ナル抗体の使用に関する。

〔背景技術〕

ホルモン、薬剤、神経ペプチド、神経伝達物質および生
長促進因子のような多くの生物学的作用物質の生物学的
効果は、それらの標的細胞上にある生１Ｚ　４＃異的受
容体との相互作用によって媒介される。これらの受容体
は、広義には二つの範噴にさらに分けられる。すなわち
（１）細胞の細胞質または核中に存在するｍ川内受容体
、および（２）細胞膜に存在する表面受容体である。２
種類の受容体は化学的に異なっているが、選択的でかつ
特異的な配位子結合の原理は両者にひとしく該当する。

ヒトにおいては多くの病的状態が生物特異的な受容体の
性状の変更により特徴づけられ、これらの変更の最も広
範にわたるのは見かけ上の受容体レベルの変化である。

見かけ上の受容体レベルの変化は、出現または喪失、数
の変化、結合定数、利用可能度などである。従って所与
の組織内で所与の配位子に対する受容体の見かけ上の数
の定量化を可能にすることは、しばしば利益あることで
ある。ある場合には、受容体は末梢血液細胞（リンパ球
、赤血球、血小板など）に現われるので、そこで生体組
織検査を要することなく測定され得る。第１表は、多く
のこのような受容体、それらが見出されるｉｌ＋胞のタ
イプおよびそれらの見かけ上のレベルが変更される病状
を示す。

ｅＢ　１表　末梢血液細胞における受容体の存在および
病状との関連 インシュリン　単球　筋ジストロフィー　減インシュリ
ン　単球　糖尿病　減 インシュリン　赤血球　慢性肝臓病　増糖質コルチコイ
ド　リンパ球　白血病　減β−アドレナリン作動性　リ
ンパ球　白血病　減β−アドレナリン作動性　リンパ球
　ぜん息　減β２−アドレナリン作動性　血小板　うつ
病　増トーハミン作動性　リンパ球　パーキンソン氏病
　減トリョードチロニン　リンパ球　甲状腺病　減アセ
チルコリン　リンパ球　白血病　減生長ポルモン　リン
パ球ノ←キット氏リンパ腫　減カルシトニン　リンパ球
　パーキット氏リンパ腫　減ヒヌタミン　リンパ球　ア
レルギー病　出現ヒスタミンーアドレ　血小板　血栓嚢
腫　増ナリン作動性 グルカゴン　単球　なし　なし ソマトスタチン　単球　なし　なし プロラクチン　リンパ球　なし　なし ムスカリン、コリン作動性　リンパ球　なし　なし血管
作動仙腸ペグチド　リン・９球　なし　なしグロスタグ
ランジン　リンパ球　なし　なし副甲状腺ホルモン　リ
ッツ９球　なし　なしエンドルフィン　リンパ球　なし
　なしＡＣＴＨリンノぞ球　なし　なし パンブレラシン　血小板　なし　なし 現在利用可能な受容体定量化の方法は、時間がかかシま
た徹底して労働力を要する。典型的には、関心対象の組
織は最初に生検され、ホモジエネート化され、ついで適
宜の放射能標識付配位子と共に平衡に達するまで保温さ
れる。ホモジエネートはついで結合されなかった標識を
すべて除去するために徹底的に洗浄され、結合された標
識の量がシンチレーションまたは〃ンマ計数にょシ定量
測定される。この操作手順は繁雑なばがシでなく、小さ
な配位子に活性喪失をもたらさないで放射能標識を付す
ることはしばしば困難である。さらにまた、放射能標識
の使用は、その貯蔵、取扱、および廃棄の面で数多くの
難点を生ずる。′Ｉおよび１３１１のように広く用いら
れる放射性同位元素の短い半減期のために、それらは臨
床検査室の日常使用には魅力に乏しい。結局、小さい疎
水性の配位子が細１１ｉｊｌ　ｆ、％上の部位すなわち
非受容体部位に非特異的に結合する傾向は、受容体を測
定するために放射能作識付配位子が用いらＩする場合に
しばしは（Ｘ！ｌ↓つた飴に至らしめる〔■〕ｆＩＸ氏
等、Ｉ−ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
　Ｊ　第２２巻第５号、（１９８２年）〕。

特５心的な抗受容体抗体を用いる受容体免役測定は、上
記の伝統的方法に対して魅力ある代替法を提供する。抗
受容体抗体は同位体標識によシ、または酵素および螢光
発色原子団のように非同位体標識により便宜に標識され
る。しかしながら所望の性状（％、異性、高度の親和性
等）を有する抗体の生産社、受容体を免疫原として有用
にするような十分に純粋な形で取得することが困難なた
めに制約される。受容体は典型的には極度の低濃度、す
なわち典型的には膜の全蛋白質の０．０１％以下にしか
現われず精製が困難である。現在入手可能な抗受容体抗
体の大部分はヒト以外の取得源から単離された受容体に
対して生成せしめられたものである。典型的にこれらの
抗体は配位子結合部位よシもむしろ枠組決定因子を認識
し、またヒトの組織より得られた同等の受容体と又差反
応しないことが多い（ＳｔｒｏＦＩｂｅｒｇ氏等、ｒ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、　Ｊ第４巻第７５頁、
（１９８１年）〕。これらの実用上の困離さのたｋ）に
、受容体の免疫測定法は広い範囲の臨床的利用に至って
いない。

結合の挙動において配位子を模擬する抗受容体抗体ｆ、
調製する仁とおよび反対に抗配位子抗体上の特異タイプ
決定因子に対する抗体を調製することにより受容体を模
擬することは可能である。特異タイプまたは特異タイプ
決定因子という用語は、Ｆｖ区域と連結している免疫グ
ロブリン（抗体）分子の抗原性決定因子を云う。抗体は
、１個またはそれ以上のＳ−Ｓ結合を通じて連結してい
る２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）よりなる。

各鎖はさらにＣ末端の定常区域とＮ末端の可変区域（ト
）とに分けられる。Ｖｌに区域とｖＬ区域との合併され
たものは免疫グロブリンのＦｖ区域を形成する。Ｆｖ区
域内の決定内子と反応する抗体全抗特異タイプ抗体と云
う。

多くの特異タイプ決定因子は、配位子結合部位内または
ごく近辺に局在する。このような場合には、配位子は抗
特異タイプ抗体の特異タイプ抗体（抗配位子抗体）への
結合を競合的に阻害する。

そのような抗特異タイグ抗体は、「配位子阻害可能」と
云われ、それらは配位子模擬物として挙動する。

Ｓｅｇｅ氏等［［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ　）　Ｊ第７５巻第２４４３頁、
（１９７８年）〕は、インシュリン受容体にインシュリ
ン様の方式で結合する抗インシュリンに対する抗特異タ
イプのポリクローナル抗体の生産を記述している。

５ｃｈｒｅｉｂｅ１氏等はｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、（ＵＳＡ）Ｊ第７７巻第７３８
５貝、（１９８０年）によると、抗アルプレノロール（
タタシアルプレノロールはβ−アドレナリン作動性受容
体の拮抗物）に対する抗特異タイプのポリクローナル抗
体を産生せしめた。

これらの抗特異タイプ抗体は、β−アドレナリン作動性
受容体に結合し、カテコールアミン感受性の酵素である
アデニル酸シクラーゼを変調させた。

他ノ研究者は、ホルミルペゾチド受容体と反応する抗配
位子抗体に対する抗特異タイプ抗体〔λＩａｒｅｓｃｏ
氏等、［：　Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ第１２８巻第
９６３頁（１９８２年）］およびアセチルコリン受容体
（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ氏等、ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　（ＵＳＡ）　Ｊ第７９巻第
４８１０頁（１９８２年）〕を生成した。

上記の抗体はすべてポリクローナルであり、それぞれの
受容体との親和性がすべて低すぎるので、診断的免疫測
定法に何ら実用的に役立たない。

ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの両氏〔ｒＮａ、
ｔｕｒｅ　ｊ第２５６巻第４９５頁（１９７５年）〕は
、免疫化されたマウス力）らの肺臓ａｌｔ＋胞をプラズ
マ卸ｊ胞腫の薬剤耐性細胞株に融合せしめ、父雑クロー
ンを選択培地上で生ｆｒ　Ｊ！シめて単離することによ
りモノクローナル抗体を作る方法をＭ初に記述した研究
者である。

その後に各種の抗原および不完全抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の７亀生に関する多数の特許および非特許文
献がある。こｔについては例えばＦ。

Ｍｅｌａｈｅｒｉ氏等編、［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉ
ｃｓ　Ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｒｎ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ　：　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ　Ｊ　（スプリンガー社発行（１９７８
年）〕　および該誓書の文献を参照されたい。

抗％異タイプのモノクローナル抗体は、Ｅｓｔｅｓｓ氏
等の文献ＣＭ、　Ｆｏｕｇｅｒｅａｕ氏編、ｊ　Ｐｒｏ
ｇｒｅｓｓ　ＩｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　７１／　Ｊ所
収、アカデミツクブレス社発行、（１９８０年）〕にも
記述されている。しがし抗配位子抗体に対して産生せし
められた抗特異タイプのモノクローナル抗体に関する報
告はない。受容体、測定の実験的有用性は、その不利さ
が自明である生検試料を必要としない迅速かつ高感度の
測定法が利用可能になると共に増加するであろう。

より多くの受容体測定が実施されるにつれて、末梢血液
細胞の見かけ上の受容体レベルと各種の病状との間の相
関関係がよシ多く出現するであろう。

放射能標識付配位子を要せず、精製された受容体を要ぜ
す、生検試料を要せず、迅速、高感度でまたオートノー
ジョン化に潜在的順能性を有する受容体測定法が必要と
されている。

〔発明の開示〕

本発明は、正常生検組織上の受容体測定のだめの現イＩ
の諸方法の改良を提供するものである。現存の諸方法に
１、組織を放射能標識付生物特異的受容体配位子と共に
保盃１することよりなる。その改良は、（１）特定の病
状、（１１）治療性の選択および有効性、（１１）受容
体と反応性で、直接的または間接的にｕＡ　：、：’ｙ
、　烙れている抗特異タイフ０のモノクローナル抗体を
有する細胞の生理学的状態と関連づけられ１１する見か
け上のレベルにある生物特異的受容体を少なくとも１種
類有する末梢血液細胞を保温すること、訃よび上記の、
ｔｉｌｌ胞に生物４°Ｓ異的に吸着された標識の１１１
食仰１定すること、ならびに測定された標識の量を対照
値と関係づけることよシなる。

細胞に結合された標識の月は、細胞上における受容体の
見かけ上のレベルに比例する。標識は、酵素、螢光発生
原子団、化学発光物質、生物発光物質、酵素阻害剤、補
助因子のいずれでも、また放射性同位元素でもよい。そ
の他多数の標識物質が特許および非特許文献中で知られ
ている。抗体は直接的に標識されてもよく、また抗特異
タイン０抗体のＦＣ区域と反応する直接的に標識された
異種の抗体を用いて間接的に標識されてもよい。さらに
抗％異タイプ抗体はビオチンおよびアビジンのような２
個の相補性分子のうちの１個にカップルしてもよく、ま
た在来の標識（放射性同位元素、酵素、螢光発色原子団
等）は他の分子（それぞれアビジンｔｉはビオチン）に
カップルしてもよい。

２個の相補性分子の間の相互作用は、在来の標識を抗特
異タイプ抗体に結びつけるであろう。

〔発明の記述〕

配位子に対する抗体の産生け、当業界によく知られてい
る。抗体は在来の免疫処置オたは細胞融合の技術のいず
れかにより開裂され、後者の方法はモノクローナルまた
はノ・イブリドーマ抗体を生ずる。典型的には、動物が
アジュバント中で乳濁化され、一定期間ごとに増重され
る関心対象の配位子により免疫化される。血清は便宜の
方法（多くの場合ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ　）により抗
配位子抗体の存在について測定される。一旦受容可能な
力価を有する抗体が見出されたときには、動物は採血さ
れ、抗体は血清から精製されるか、または動物（通常は
マウス）をま殺されその肪酸が融合のために無菌的に取
り出される。後者の場合には単一細胞の懸濁液が調製さ
れ、免疫性の牌臓細胞はポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）　ｆｆ用いてヒボキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル・転移酵素（■１１ＧＰＲＴ）欠損のプラズマ細
胞腫の培養株と融合せしめられる。このような数種の培
養細胞株が知られているが（上記に引用のｒ　Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｔｏｐｌｃｓ　ｉｎ　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ参照）、そのうち
最も好適ナノハ、自身の免疫グロブリンを全く分泌しな
い株である。

そのような株の１例は、Ｆａｚｅｋａｓ　ｄｅ　Ｓｔ、
　Ｇｒｏｔｈ氏等ｒ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｏｔ
ｈ、　Ｊ第３５巻第１頁（１９８０年）によｐ記述され
たＦ１０プラズマ細胞腫株である。

融合用混合液はついでヒポキサンチン、アミノプテリン
およびチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ）上に平板
に接種される。十分な細胞生育が起った時に、培養土消
液は試料採取され、便利な方法（多くの場合ＲＩＡまた
はＥＬＩＳＡ　）により抗体についてテストされる。関
心対象となる抗体を含有するこれらの培養はついで限定
希釈または軟寒天によりクローニングされ、再試験され
、拡大された。

関心対象となるクローンはついで同系または先天的（ｃ
ｏｎｇｅｎｌｃ　）　マウスに注射される。もし静脈内
または皮下に注射された場合には、抗体は血清から収得
される。もしシリスタンで前処理された動物に腹腔内注
射された場合には、抗体は腹水から収得される。

抗配位子抗体（以下Ａｂ、と記す）が在来法とモノクロ
ーナル法のいずれによシ産生されたかにかかわらず、そ
れを抗特異タイツの抗体（以下Ａｂ２と記す）を産生せ
しめる前に少なくとも部分的に鞘摂することが望ましい
。抗体精製技術は、当業界によく知られている。一般的
に、血清または腹水は免疫グロブリン（Ｉｇ　）分画を
生ぜしめるために硫ＩＮアンモニウムを用いて沈殿ぜし
められ、生じた沈殿は関ノし対象類別の抗体の単離のだ
めのイオン父換またはゲル漣過クロマトグラフィーのた
めに水性媒液中に４’＋　ｒ＆ｆｉ濁される。もし抗体
活性がＩｇＧの蛋白質Ａ結合性小分画（５ｕｂｃｌａｓ
ｓ　）中に所在する場合には、ぶどう状球菌の蛋白質Ａ
に関するクロマトグラフィーも用いられる。それ以上の
精製は、配位子親和性カラム上でのクロマトグラフィー
によシ達成される。

精製の後にＡｂｌはＡｂ２を産生せしめるために動物に
注射される。Ａｂ２は少なくとも１０１モルの親和性を
有しまた配位子阻害性であることが望ましいので、Ａｂ
２はモノクローナル抗体であることが好適である。理論
的にはＡｂ２はいずれの種においても派生できるが、Ａ
ｂ２意生の実際的見地からはＡｂｌの産生に用いられた
のと同じ種においてＡｂ２を産生せしめるほうが容易で
ある。ノ・イブリドーマにはラットスラット、ラット×
マウス、ヒト×ヒト、およびマウス×ヒ）９雑体が知ら
れているが、それらは一般にマウス×マウヌ交雑体に比
べて作ることが困難でまた女定性が低い。従って一般に
Ａｂ２をマウスにおいて産生せしめるのが好適であり、
さらに非特異タイプの決定因子に対する抗体の産生を最
少限にするために同系の々ウスにおいて産生せしめるの
が一層好適である。

Ａｂ　は、受答体に配位子阻害方式で結合する能力につ
いてスクリーニングされる。一旦適当な抗体が同定され
るとその抗体は上記の通シに精製され、標識される。

Ａｂ２１ｒ、Ｉ−さらにスカチャード分析法による結合
定数少なくとも約１０９１モルをもって受容体に結合す
る能力についてスクリーニングされ得る。

多くの標識が当業界に知られている。最も広く用いらｈ
るもののうちに、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさび・
♀−オキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼが
ある。標識が酵素である場合には、その酵素は高い代謝
回転回数、容易に利用可能な発色性才たけ螢光発色性基
質、およびＡｂ２と共役するだめの適当な官能基を有す
ることが望ましい。さらにまた、酵素が安定であシ、そ
してヒト血清中に存在しなければ好都合である。酵素上
の共役のための官能基には、アミン基、カルビキシル基
およびＳ　Ｈ基ならびに炭水化物部分がある。

同じ官能基はＡｂ２上にも利用され得る。

一般に、Ａｂｚを抗体結合能力または酵素活性を喪失す
ることなしに可及的広範囲に標識することが望ましい。

抗体１個につき４分子もの西洋わさびノｅ−オキシダー
ゼ分子を付着せしめることが可能であるが、β−ガラク
トシダーゼは数倍も分子倉が太きいために多分１分子の
みであろう。

多くのカッブリング技法が当業界に知られている。選択
される物足の技法は、酵素および抗体上で利用可能な官
能基に依存する。例えばカップリングに用いられ得る部
分としてβ−ガラクトシダーゼは遊離のＳＨ基、西洋わ
さびパーオキシダーゼは炭水化物を有する。

付υ１を識に続いて接合されていない酵素と抗体、なら
びに非免疫反応性の抗体を除去するために、接合体を精
製することが望咬しい。このことはゲル濾過と親和性ク
ロマトグラフィーとの組合せによって達成される。

付標識の目的のためには、Ａｂ２は１価でも２価でもよ
い。１価の抗体断片を産生せしめる技法は当業界によく
知られている。例えばＦａｂ断片は、ＩｇＧを・ぐノぐ
インで分解することにより、またＦａｂ　’断片はＩｇ
Ｇのペプシン分解により得られるＦ（ａｂ　’＋２断片
の還元およびアルキル化によって作られる。

また無標識Ａｂ２を用い、つぎにマウス免疫グロブリン
と反応する杼識伺抗体を用いることも可能である。その
ようなザンドイツチ状構造は、どのような受容体を測定
しようとするにせよ、ただ１種類の標識付抗体のみを調
製すれば足るという有利性をもたらす。ｒ１４言すれば
、抗マウスＩｇ抗体は上記のいずれの標識物質ならびに
いずれの方法によシ標識されてもよい。それは２側坑体
または１側坑体として用いられ得る。

末梢血液細胞は既知方法により単離され得る。

最も普通に用いられる方法は、密度勾配遠心分離法であ
る。例えば赤血球はリン・千球および血小板からフィコ
ール／ハイノＲ−り勾配によシ分離される。牛血清およ
びコロイド状シリカ勾配も用いられ得る。血小板は低速
遠心によりリン・９球から分離される。リンパ球はパー
コール勾配によりＢ細胞とＴ細胞とに分別される。

本発明による泪１ｊ定は、細胞表面あるいは細胞質内に
出現する細胞受容体の定量化に用いられる。

細胞質性受容体を測定するためにｅま、最初に細胞を溶
解せしめることが必要である。トリトンＸ−１００また
はノニデットＰ−４０のような非イオン性界面活性剤に
よる溶解が通常好適であるが、浸透圧的溶解も可能であ
る。

本発明による細胞結合性受容体測定は、末梢血液細胞を
抗特異タイプの標識付モノクローナル抗体と共に保温し
、結合されなかった標識付抗体を除去するために細胞を
洗浄し、細胞表面と結合された標識の量を迎１定するこ
とにより実施される・末梢血液細胞は赤血球でもリンパ
球でも顆粒球でも血小板でもよく、適当な方法、最も普
通には密度勾配遠心法によシ単離される。細胞は、等張
の緩衝ＴＭＲ溶液または媒液で洗浄される。細胞は血球
計算盤の手作業によるかまたは例えはコールタ−を用い
て自動ｎに引数され、所望の濃度に調整される。もし必
要ならば細胞の生存率もこの段階において、通常生体染
色色素で染色して測定される。細胞はつぎに異なる長さ
の時間酵素標識付抗特異タイプのモノクローナル抗体と
共に保温される。保温時間は典型的には５分〜３時間の
範囲であるが、３０分〜１時間が最も多い。保温の温度
は００〜４５℃の範囲であるが、最も多くは３７℃であ
る。細胞は通常ｐＨ４〜１０、多くは６〜８に緩衝調整
された等張液中で保温される。緩衝液は、例えば０．１
〜１．０％（重量）のＢＳＡのような他の物質を含有し
てもよい。若干の場合には、微生物汚染を防ぐことと受
容体の変調を防ぐこととの二重の目的のために保存料ま
たは代謝阻害剤を加える。

細胞を栄養培地中で保温することも可能であシ、これは
保温時間が長きにわたシ、また測定の時点で細胞の生存
を要する場合に特に望ましい。用いられる培地のタイプ
は測定される細胞の種類によって異なる。典型的には、
ＲＰＭＩ−１６４０培地およびダルベツコ氏の改変必須
培地（ＤＭＥＭ　）が用いられる。保温の後に細胞は緩
衝液または培地（通常保温に用いられたのと同じ緩衝液
または培地）で洗浄される。洗浄は通常洗浄媒液中に懸
濁し、遠心し、上消液を吸引除去することによシ達成さ
れる。代替法も可能である。例えば細胞を濾過に上り洗
浄してもよい。洗浄された細胞は、標識の検出に必要な
試薬のいずれかを含有する適当な緩衝液中に１１懸濁さ
れる。もし標識が酵素であれば、結合された酵素標識の
抑１定に必要な補助因子および陽イオンがいずれも緩衝
液に加えられるであろう。酵素活性は、適当な波長にお
ける吸光度（または透過率）の変化速度、または一定時
間後における反応終末点として分光光度計また（・は螢
光光度計により　ｇｉ１足される。活性度が側足さｉす
る温度はＯＬ゛〜４５℃、多くは２５°〜３７℃の範囲
である。

酵素活性の月（もし標ｉ１“＆が酵素ならは゛）は標準
曲想との比較もしくはスカチャード分析法により見かけ
上の受答体レベルと関連づけられる。

他の標識物質が用いられる場合には、見かけ上の受容体
レベルに関する他の６川定法かり能である。

例えばもし標識が螢光発色原子団であれば、受容体密度
は螢光活性化細胞類別化分析（ＦＡＣ８）によシ測定さ
れ得る。このタイプの分析は、完全自動化の有利性をも
たらす。

測定された受容体のレベルが病状の診断指標として用い
られる場合には、患者からの細胞上の受容体レベルは正
常個体からの細胞上の受容体レベルを対照として比較さ
れる。患者の細胞上の受容体レベルの対照に比べての変
動は、しばしば第１表に掲げられた諸病の若干を含むあ
る種の病状を指示するであろう。例えば糖尿病患者の循
環単核細胞に対するグルカゴンの結合が対照の非糖尿病
患者に比べて６６−減少したことが報告されているＣ　
Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ氏等ｒ　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ−ｃａｔｌｏｎ　ｊ第２
巻第３６７頁（１９８０年）〕。

測定された受容体レベルが臨床医によって特定の患者に
対する治療処置法を計画するために、またはそのような
処置の有効性を監視するために用いられる場合には、受
容体レベルは同じ個体の細胞上の治療開始前の受容体レ
ベルまたは正常な無処置の個体の細胞上の受容体レベル
を対照として比較されるであろう。例えば非ホジキン氏
リンパ腫および急性リンパ芽球白血病におけるリンパ球
糖質コルチコイド受容体数の測定は、糖質コルチコイド
治療法によシ利益を受けると思われる患者を選ぶ上に有
用である［　Ｓｈｉｐｍａｎ氏等［Ｂｌｏｏｄ　Ｊ　第
５８老第１１９８頁（１９８１年）〕。

測定された受容体レベルが有糸分裂促進剤、ウィルス、
または腫瘍によシ誘発された変性によシ起さｉした活性
化のような細胞の生理学的状態を監視するために用いら
れる場合には、受容体レベルは正常な個体から得られた
活性化されていない細胞を対Ｉｌｌとして比較されるで
あろう。例えば休止状態のＴ−リンフ９球は少数しかグ
ルカゴン受容体を有しない。しかしながらそのような細
胞のＴ−細胞特異性有糸分裂促進剤による活性化の後に
は、そのような受容体の数が劇的に増加し、グルカゴン
受容体は活性化されたＴ−細胞の指標であることを示す
［Ｂｈａｔｅｎａ氏等ｒ　Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏｌｏｇｙ
　Ｊ第１１１巻第６８４頁（１９８２年）〕。

下記の実施例は、本発明を明示する。

〔実施例〕

抗特異タイプのモノクローナル抗体のｐｌ！！！および
血液細胞上の受容体測定のための使用は、例としてグル
カゴン受容体と反応する抗特異タイプ抗体を用いて下記
に記述される。その他の受容体と反応する抗特異タイプ
抗体の調製および利用には在来の方法が適用可能である
。

第１部 細胞の受容体と反応する抗特異タイプ 抗体の調製 Ａ、抗グルカコ゛ン抗体（％異タイプ）の調製グルカゴ
ンは、カルボジイミドを用いて担体である陣笠貝ヘモシ
アニン（ＫＬ）Ｉ）に共有結合的に結合された。グルカ
ゴン０．５　ｍＶおよびＫＬＨ２，５ＭＶは蒸留水１．
５ｍ７中に溶解され、１規定Ｎａ０Ｉｌ液で完全溶解が
達成される１で滴定された。１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノ−プロピル）−力ルぎジイミド（ＥＤＡＣ
。

３、５　＋ｎｙ／讐）の水溶液０．５鉱が加えられ、溶
液は室温において１８８時間保れた。００５モル濃度の
ヒドロキシアミン塩酸塩溶液２　ｍＩ！、が加えられ、
溶液はさらに５時間室温に保たれた。ＫＬＨに対するグ
ルカコ゛ンの比約Ｂ〜１０：１を有する生成接合体は、
等量の完全フロイント氏アソユバンｌ−ｉｌｌ　（ＣＦ
Ａ）中に乳濁化され、その２５μｍがｌ３ａｌｂ／ｃ系
マウスの足の裏に注射された。２週間後にマウスは不完
全フロイント氏アジュバント（ＩＦＡ）中に乳濁された
接合体１２．５μｍを腹腔内に追加膜力された。マウス
はその後毎月追加投与され、毎回投与の７日後に下記の
通りに抗体の存在が測定された。

グルカゴンに対する抗体は、酵素連結免疫吸着測定法（
ＥＬＩＳＡ）を用いて検出された。グルカゴンは上記の
通りにカルビジィミドを用いて牛血清アルゾミン（ＢＳ
Ａ）に共有結合的にカップリングせしめられた。ｐＨ７
，４の燐酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ）　１００μを中のグ
ルカゴン／　ＢＳＡ接合体（ＢＳＡに対するグルカゴン
の比は約８〜１０：１）１０μｍが９６孔の塩化ポリビ
ニル性微量力価創定用グレートの名札に加えられ、室温
に１時間保たれた。プレートは余剰の接合体溶液を除去
するために軽く振られ、ＰＢＳｌｏ、１％ＢＳＡで１０
〜１０−６に希釈されたテスト用血清５０μｔずつが名
札に加えられた。室温に２時間保った後にプレートはＰ
ＢＳで３回洗浄された。β−ガラクトシダーゼに結合さ
れた羊抗マウスＩｇＧ　抗体（ベセスダ　リサーチ　ラ
ボラトリーズ社製）５０μｔが名札に加えられ、プレー
トは式らに２時間常に振盪しつつ室温に保たれた。つき
゛にプレートはＰＢＳで４回洗浄され、２−メルカゾト
エタノール１（）０ミリモルを含有するｐ−ニトロンエ
ニルーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＰＮＰＧ　）の１”ｆ　
／ｍｅ溶′＃、５０μｔが名札に加えられた。プレート
は１時間常に振盪しつつ室温に保たれ、つぎに名札の内
容物の吸光度が抗グルカゴン活性の高い力価を有する血
清を同定するために４１４　ｎｍにおいて測定された。

Ｉｇ分画が全血清から４５係飽和の硫酸アンモニウムを
用いる沈殿法によシ調製さノ′シた。得られた沈殿は水
に溶解され、限外濾過により濃縮され、つぎにｐｌ（７
，４のＰＢＳに対して透枦された。グルカゴン親和性カ
ラムは、ホルモンをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに
カップリングさせ、製造業者（ファルマシア　ファイン
　ケミカルズ社）が推奨する手順に従って調製された。

セファロース４Ｂに対するグルカゴンの比は５■／Ｖ湿
重量であった。

上記によシ得られたＩｇ分画はカラムを通され、…３．
４の０．２３モル濃度グリシン緩衝液で溶離された。

ｐｌ（７，６の２モル濃度トリスがＰｌｌを中和するた
めに直ちに溶出分画に加えられ、分画は５０％飽和の硫
酸アンモニウムで沈殿せしめられｐＨ７、４のＰＢＳに
対して透析された。各種の分画における抗グルカゴン活
性は、上記（Ｂ）に記述した通ｐ　ＥＬＩＳＡによシ測
定された。

Ｄ６　抗特異タイプ抗体の調製 上記の通シに調製されたＩｇ分画１００μ７または親和
性Ｎ製された物質２５μｍはＣＦＡ中に乳濁化芒れ、Ｂ
ａ１ｂ／ｃ　マウスの足の塁に注射された。マウスは、
ＩＦＡ中に乳濁化された抗体を用いて１か月間隔で追加
投与された。３か力抜にマウスは採血され、血清は下記
（匂に記述する通シにグルカゴン受容体と反応する抗特
異タイプ抗体の存在についてテストされた。

Ｅ、グルカゴン受容体と反応する抗特異タイプ抗体の検
出 グルカゴン受容体に富むラット肝臓細胞膜が、スプラー
グ／トウリー系ラットの肝臓を挽き砕いてＮ１製された
。肝臓懸濁液はスクロース濃度４３３チに調整され、そ
の懸濁液２５ゴが遠沈管に入れられ、スクロース４２３
％液で重層され、ＳＷ　２８型ローター（ベックマン　
インストルメンツ社スビンコ事業部製）中で２時間２７
．０　（＋　Ｏｒ、ｐ、ｒｎ、で遠心された。精製され
たｊ換は遠心管の最上層に浮かび、そこで回収された。

膜のｉ１４　ｆｆ、はロウリー氏法により測定された。

１ミリモル濃度の炭酸水素ナトリウム液中の膜蛋白質２
５μ２は、ｐＨ７，６の１００ミリモル濃度トリス、１
０ミリモル濃度エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウ
ム、Ｉ　Ｗ／ｄＢｓＡ、および０．０５　ｍｙ／ｍｔの
バシトラシンを含有する最終量１００−中にＰＢＳｌｏ
、　１チＢＳＡ液に１０〜１０　に希釈されたテスト用
血清５０μｔと共に室温に保たれた。１時間後に〔１２
５Ｉ〕−グルカゴンにューイングランドニュクレアー社
製、２１８μＣ１／μｍ）が５　Ｘ　１０　’　モル濃
度になるように各試料に加えられた。保温は３０分間継
続され、しかる後試料はミクロ遠沈管中の１ミリモル濃
度炭酸水素ナトリウム液２５μｔの上ヘビベットで圧加
され、ミクロ遠沈管中で１０，０００Ｘｇにおいて５分
間遠心された。

上消液は吸引除去され、沈降物はガンマカウンターで計
数された。免疫化されていないマウスの血清が対照に用
いられた。標識付グルカゴンの肝臓膜調製物への結合を
著しく減少せしめる血清は、グルカゴン受容体と反応す
る抗特異タイプ抗体を含有すると判定された。

上記の（匂において記述された４１１１定に陽性の反応
を示した血清を産生中のマウスは、最終の追加投与を受
け、その３日後に殺された。それらの肺臓は無菌的に取
シ出され、Ｆ１０糸ネズミのプラズマ細胞腫培養株と融
合せしめられた。ネズミのプラズマ細胞腫培養株の、ア
メリカンタイプカルチャーコレクションに保存され、そ
れぞれＣＲＬ−１５８１およびＣＲＬ−１５８０株と同
定されているＳＰ２／′０−Ａｇ１４おＪ：ぴＰ　３　
ｘ６’３−　Ａｇ　８．６５３株を含むいずれの株を用
いてもよい。融合に用いられた肺臓細胞に対するゾラズ
１細胞腫細胞の比ば２：１であった。融合促進剤はポリ
エチレングリコ−・ル４０００でｌ　Ｏｆｃ。

ＨＡＴ　（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
）選択培地を含有する９６孔の微量力価検定用グレート
の名札に肺臓細胞２×１０５個ずつが入れられた。細胞
は１週間ごとに新鮮なＨＡＴ培地を最初の２週間与えら
れ、その後はＨＴ（アミノプテリンなし）培地を与えら
れた。２〜４週間後に細胞の生育を示した孔の上清液は
上記（ト）に記述の通りの測定法を用いてグルカゴン受
容体と反応する抗体の存在についてテストされた。抗体
を産生中の細胞は限定希釈法によシクローニングされ、
培養において拡大された。抗体は硫酸アンモニウムを用
いる沈殿法およびそれに続（ＤＥＡＥ−セルロースクロ
マトグラフィーによシ培養上清から単離される。特異性
は、（Ｑによる親和性精製特異タイプ全抗原として用い
、上記（Ｂ）の通りのＥＬＩＳＡにより確かめられる。

分類群、亜分類群、等電点および親和性は各抗体ごとに
決定される。分類群および亜分類群は、市販の分仙群お
よＯ：亜分顛群特異的血清を用いる寒天ゲル中の免疫拡
散法によシ判定される。等電点は、ポリアクリルアミド
ゲル中の等電点フォーカシングにより測定される。親和
性はスカチャード分析法により測定される。

第２部 抗特異タイプのモノクローナル抗体の付標識西洋わさひ
・ぐ−オキシダーゼ（ＨＲＰ）　４　ｍｇが、−■８．
１の０３３モル濃炭酸水素す）　ＩＪウム緩衝液１−中
にｆ８Ｍされる。蒸留水中０．０６６モル濃のＮａ　ｌ
０４１　ｍｌが加えられ、生じた混合液は３０分間室温
に保たれる。余剰のＮａ　Ｉ　Ｏ４は０．１６６モル濃
エチレングリコールを加えることによシ中和される。１
時間後に混合液はＰ１１９．５の０．１モル濃度炭酸水
素ナトリウム液に対して徹底的に透析される。透析され
たＨｒｔＰを含有する溶液は抗（抗グルカゴン）抗体２
ｍ？に加えられる。３時間室温に保った後に水素化硼素
す）　ＩＪウム５■が加えられ、続けて４℃に３時間保
たれる。混合液はついで４℃においてＰＢＳに対して徹
底的に透析される。接合体溶液はつぎにウルトロゲルＡ
ｃＡ　４４　（ＬＫＢ社製、１．６　Ｘ　９５αのカラ
ム、４チポリアクリルアミド／１４％アガロースゲルで
２０万ダルトンの排除限界を有する）上で標識付抗体を
無標識抗体から分別するために分画され、前者は無効容
積中に溶離する。最大の酵素活性を含有するカラム分画
はプールされ加圧済過（アミコンＰＭ−３０濾過膜）に
よシ２ｍ／！に濃縮され、ついで下記の通りに抗グルカ
ゴンカラム上において親和性クロマトグラフィーに：り
精製される。

接合体溶液は抗グルカゴンＩｇＧ親和性カラム（ＩＸ７
ｃｍ）を通され、続いてＰＢＳ　１００　ｍｌが通され
る。親和性カラムは、上記（Ｃ）による親和性精製され
た抗体をＣＮＢｒ活性化されたセファロース４Ｂに湿潤
ゲルｌｒｄに対しＩｇＧ１■の比にカップリングせしめ
ることによシ調製される。結合された接合体は続いでＰ
ＢＳ中１０ミリモル濃度グルカゴン液５０−で溶離され
る。この溶！’＋ｔｆ　＃は最終的試薬に和尚し、４！
のＰＢＳに対し４℃において順次に６回透析される。

Ｆａｂ’断片は、ペグシン分解を経て親和性精製された
抗体より調製される。親和性精製された抗（抗グルカコ
゛ン）抗体２０　ｍｌはアミコン攪拌容器装置（ＰＭ−
３０膜）上で２−に濃縮される。最終蛋白質儂度は１０
　’８９７ｍ１に調製逼れる。試料はｐ！−１４，５の
０．１モル濃度酢酸ナトリウム液１，０００−に対し４
℃において４時間透析芒れる。透析の後に、同じ酢酸ナ
トリウム緩衝液に溶カイされた１　０　Ｗ／ｎｔのベズ
シン溶液２０μｔが加えられ、温度は３７℃に上けて２
０時間保たれる。この分解期間の後に、試料は短時間の
遠心により澄明化され、ついで０．０１５モル濃度燐酸
ナトリウム（ｐ）１７．４）中の０．１５モル濃度Ｎａ
Ｃｔ（燐酸塩緩衝食塩液）中で平衡化されたセファデッ
クスＧ−１５０（交差結合されたビーズ状デキストラン
で、排除限界１５万ダルトンを有する）のカラム（ｉ、
５ｘ９ｏｃ、ｍ）上でクロマトグラフに付された。ゲル
電気泳動によシ同定された（Ｆａｂ　′）２断片を含有
するカラム分画はプールされ（ｘ９．ｚｒｎｌ）、つい
で加圧濾過（アミコンＰＭ−３０膜）により２．０１ｎ
ｌに濃縮される。濃縮の後に（Ｆａ　ｂ　’　）２断片
は１モル濃度・ジチオスレイトール溶液４０μｔを加え
ることにより対応するＦｅｂ’断片に還元される。還元
はアルゴン気相下で２５℃において９０分間行われる。

Ｆａｂ’断片はつぎにヨードアセタミド１４．８■と２
５℃において２時間アルゴン気相下にて反応せしめられ
る。反応生成物は、燐酸塩緩衝食塩液４！に対し４℃に
おいて順次３回の透析によシ除去される。

こうして生成したＦａｂ’断片は、ついで２０倍モル濃
度余剰のＭＢＳ（ｍ−マレイミド安息香酸　Ｎ−ヒドロ
キシーサクシニミドエステル）と反応せしめられる。テ
トラヒドロフラン中７９ミリモル濃度Δ１ＢＳ溶ｆｉ８
５μｔがＦａｂ’断片の溶液２１艷に加えられ、１時間
２５℃、アルゴン気相下で反応せしめられる。混合液は
燐酸′塩緩衝食坦液中セファデックＧ−２５（交差結合
したビーズ状デキストランで、排除限界５０００ダルト
ンを有する）カラム（１，５Ｘ４０　ｃｍ　）上で脱塩
される。無効容積中に溶離した銹導体化Ｆｒ１ｂ’はプ
ールされ、燐酸塩緩衝食塩液中１２ｑ／−のβ−がラク
トシダーゼ液２−と４℃において合併される。１６時間
後に、この溶液はアミコンＰＭ−３０加圧濾過攪拌容器
にょシ、ついでセファロース４Ｂ−ＣＬ（３Ｚ差結合し
た大孔径アガロースのビーズで、１．５Ｘ９０ｃｍＯカ
ラム中で排除限界１〜５Ｘ１（１’ダルトンを有する）
上のカラムクロマトグラフィーによシ２−に濃縮される
。

Ｆａｂ’　／β−ガ゛ラクトシダーゼ接合体は、遊離の
β−ガラクトシグーゼで溶離される。酵素活性最大の部
分全部はプールされ、しかる後抗グルカゴン親和性カラ
ム上で免疫精製される。免疫精製の手順は下記の通シで
ある。すなわちセファロース４Ｂ−ＣＬ　Ｌ　！、ｌの
プールされたカラム分画は抗グルカゴン親和性カラム（
ＩＸ７ｃｍ）を通し、続いて燐酸塩緩衝食塩ｇ１００−
で溶離される。Ｆａｂ７β−ガラクトシダーゼ接合体は
、つぎに燐酸塩緩衝食塩液中１０ミリモル濃度グルカゴ
ン液５０　ｍｌで溶離される。この溶離液は最終的試薬
に相当し、燐酸塩緩衝食塩液４！に対し順次に６回４℃
において透析される。

第３部 患者または自発的協力者から静脈穿刺により得られた血
液は、ヘノンリンを含有する試験管中に集められる。全
血中の細胞成分の分離は、等量のバランスされた塩溶液
（ｎｓｓ）中に希釈し、フィコール−パーク（ファルマ
シアファインケミカルズ社製、平均分子量３０万〜５０
万を有するスクロースとエピクロルヒドリンとの共重合
体）上に重層し、４００Ｘｆ’で３０分間１８〜２０℃
において遠心することによシ達成される。赤血球は沈降
した管の底から集められるのに対し、リンパ球、単球お
よび血小板は試料／フィコール−・や−クの界面にとど
まる。界面から回収された細胞はＢＳＳ中に再懸濁され
、２９００Ｘ　ｆで３分間遠心される。血小板（よ最上
層から集められるのに対し、それよりも重い単球および
リンパ球は底に沈降する。沈降物はＢＳＳ中に再懸濁さ
れ、単球は）０ラスチック製ペトリ皿に３０分間２５℃
において刺着せしめて分離される。リン・ぐ球がプラス
チックに付着せず、ピペットで吸い取られるのに対し、
付着する細胞（単球）はプレートを強く叩きＢＳＳで洗
うことによりペトリ皿から回収される。９７７９球中の
Ｔ細胞とＢ細胞との分離は、リンフ９球分画を７９−コ
ール（ファルマシア　ファイン　ケミカルズ社製、透析
不可能なポリビニルピロリドンのコーティングを有する
コロイド状シリカで、密度は１．１３０り／７）の非連
続勾配上に１層し、１０分間３０００ｒ　、ｐ　、ｍ、
で１０分間遠心することによ）達成される。

Ｂ細胞はＴ細胞よυも軽い密度域にノ々ンドを生じ密度
１．０５２ｆ／−と１．０６３　ｒ／７との界面で収集
される。

第４部 上記の通９に単離されたリンパ球Ｔ細胞５Ｘ１０６個が
Ｂ５５７５μを中に懸濁される。上記の通りに調製され
たグルカゴン受容体と反応する抗特異タイプのモノクロ
ーナル抗体のβ−ガラクトシダーゼ標識付Ｆａｂ’断片
（以下Ａｂ２と記す）のＩ　Ｔｎ？／７ｎｔ　溶液２５
μｔが加えられ、混合液は１時間３７℃に保たれる。細
胞は遠心によシ沈降せしめられ、ＢＳＳで３回洗浄され
る。最終回洗浄の後に細胞は１００ミリモル濃度２−メ
ルカゾトエタノールおよび３ミリモル濃度ＰＮＰＧを含
有するｐ！（７，４のＰＢＳ中に再懸濁される。１時間
３７℃に保温の後に１．ｔｉｎ胞は再び遠心によシ沈降
せしめられる。上清が採取され上清液の吸光度が４１４
　ｎｍにおいて測定される。吸光度は、細胞に結合され
た標識付Ａｂ２の量に１自接比例する。この値は吸光度
と見かけ上の受容体密度とを関係づける標準曲線に比定
される。

上記の測定は、抗体の１種類の希釈のみが用いられる単
一点？１１１定である。単一点測定は、患者の細胞上の
受容体レベルを対照値と比較する場合、特に両方の値が
大幅に異なる場合に有用である。

若干の場合には、標識付人ｂ２の希釈を用いて見かけ上
の受容体密度を滴定するととが望ましい。このようす多
点測定であれば、データのスカチャード分析を行えるよ
うになる。リンパ球Ｔ細胞上におけるグルカゴン受容体
のスカチャード分析は、それぞれ標識（＝ｊ’Ａｂ２の
標準量およびＴ細胞５Ｘ１０６個を含有する一系列の試
験管を異なる濃度の無標識Ａｂ２と共に保温することに
より実施される。遊離Ａｂ２の結合Ａｂ２よシの分離お
よび細胞に結合された抗体の定量化は、第４部中上記の
通υに実施される。無標識Ａｂ２の各濃度について標識
付Ａｂ２の結合／遊離比が結合Ａｂ２の函数としてプロ
ットされる。受容体に対するＡｂ２の親和性は、プロッ
トの傾斜度から計算され得る。プロットのＸ軸交点は値
［Ｒｏｌを与える。この値（Ｒｏ　〕から細胞１個当シ
の受容体部位の数が下記の式によ請求められる。すなわ
ち 第５部 患者の単−測・定点呼たけ単一測定点ｌにより得られた
患者の細胞上の受容体レベル、またはスカチャード分析
により得られた親和性および受容体数は、正常な個体に
ついて同様な測定を行って得られた対照値と比較される
。それらの値の統計的に有意な差は、特定の病気を指示
する。グルカゴンに関しては、患者の単核′ＩｔＩＩＩ
胞上のグルカゴン受容体レベルが対照値に比べて著しく
減少していれば、それは糖尿病を示唆する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）末梢血液細胞を受容体と反応する標識付抗特異タイ
   プのモノクローナル抗体と共に保温し、前記の細胞に生
   物特異的に吸着された標識のルをｌＴｌ１１定し、測定
   された標識の量を対照値と関連づけることよりなる、中
   病状、（１１）治療の選定および有効性、または（１１
   し前記細胞の生理学的状態と関連づけられ得る末梢血液
   細胞上の生物特異的受容体の見かけ上のレベルｉ　１ｉ
   １１１１定するための方法。 ２）末梢血液細胞がＴ　ＩＪン・ぞ球である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３）受容体がグルカゴン受容体である、特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ４）抗特異タイプの標識付モノクローナル抗体が、β−
   ガラクトシダーゼおよび西洋わさびノぐ−オキシダーゼ
   よシなるグループよシなる群から選ばれた酵素で標識付
   されている、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）抗特異タイプの標識付モノクローナル抗体が少なく
   とも１０１モルの親和性定数を有する、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ６）抗体が間接的に標識付されている、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ７）抗原がマウス由来のものである、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。