JPS6091987A - 特定の蛋白質の過剰生産を指示する発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターロイキン−２、β−インターフェロン
およびβ−２クタマーゼのような蛋白質を大腸菌（ｇ、
　ｃｏｌｉ）において過剰生産させるための誘導しうる
発現シラスミドに関する。

ＤＮＡ組換え技術における発達が人間および他の哺乳動
物のような高等有機体からの特定の遺伝子またはその一
部分の単離、およびそれら遺伝子または断片の細菌また
は酵母のような微生物種への転移を可能にした。転移さ
れた遺伝子はその形質転換された微生物が自己複製する
に伴い複製および繁殖される。その結果、形質転換され
た微生物は、それが酵素、ホルモン、抗原、抗体または
いずれの他の蛋白質であろうとその遺伝子または断片が
コーティングしているどの蛋白質でも作９出す能力を有
しうる。

かかる科学技術は既にンマトスタチン（Ｉｔａｋｕｒａ
氏他、５ｃｉｅｎｃｅ第１９８巻第１０５６〜１０６６
頁（１９７７年）参照）、ヒトインシュリンの成分Ａお
よびＢ鎖（Ｇｏｅａｄｅ１氏他Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Δｃ＋ａｄ。

Ｓｏｉ、　ＵＳＡ第７６巻第１０６〜１１０頁（１９７
９年）参照）、ヒト生長ホルモン（、Ｇｏｅｄｄｅ１氏
他、Ｎａｔｕｒｅ第２８１巻第５４４〜５４８頁（１９
７９年）参照）およびヒトインターフェロン（英国特許
第２，０６８，９７０号Ａ参照）のような有用なポリは
プチド生成物を製造するために細菌の修飾に使用されて
いる。米国特許第４，３２２，４９９号明細書第２〜７
欄にはＤＮＡ組換え技術に使用された技法のいくつかが
まとめられている。

分子量約１５，０００ダルトンを有する糖蛋白質である
ヒトのインターロイキン−２（工Ｌ−２）はＤＮＡ組換
え技術によっても製造された。ＴａｎＪｇｕｃｈＬ氏他
のＮａｔｕｒｅ第６０２巻第３０５〜３１０頁（１９８
３年）においては工Ｌ−２をコーディングするｃＤＮＡ
のクローニングおよび培養されたモンキー細胞中におい
てそれを発現させて生物学的に活性なはプチドを製造す
ることが記載されている。Ｆ’ｕ、ｊｉｔａ氏他はＰｒ
０ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｔ５．、　Ｅｌｃｉ、　ｌ
ｌ５Ａ第８０巻第７４３７〜７４４１頁（１９８３年）
において工Ｌ−２遺伝子の配列について記載している。

Ｄθｖｏθ氏他はＮｕａｌｓｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ０７〜４６２３頁（１９８
３年）において、そしてＲｏθｅｎｂｅｒｇ氏他け５ｃ
ｉｅｎｃｅ第２２３巻第１４１２〜１４１５頁（１９８
４年）において大腸菌中ｔｒｐプロモーターの制御の下
にＩＬ−２遺伝子を発現させて生物学的に活性なＩＬ−
２生成物を総蛋白質の約５〜１０チの濃度で得ることを
記載している。

多くのＤＮＡ組換え技術では２種類の化合物すなわちト
ランスファー（フタ−および制限酵素を使用している。

トランスファーベクターはなかんずく宿主微生物菌株に
転移された場合にそれ自身の複製を保証する遺伝情報を
含有するＤＮＡ分子である。細菌遺伝学に共通して使用
されるトランスファーベクターの例はプラスミドおよび
ある種のバクテリオファージのＤＮＡである。「プラス
ミド」は宿主細胞自身のゲノム以外の微生物細胞中に見
出され・るよう自律的に複製するＤＮＡユニツ）Ｋ用い
られる用語である。

「制限酵素」はＤＮＡ分子の解裂を触媒しうる加水分解
酵素に用いられる用語である。これら酵素の多くはＤＮ
Ａ中の特定の短い配列を認識しそして個々の酵素および
それが認識するＤＮＡの配列の如何に応じＤＮＡを精密
な、程よい短い断片に解裂させるかまたは解裂を触媒し
よう。解裂後異種構造（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）
の遺伝子または遺伝子断片が解裂点でまたは解裂点に隣
接した再構成された末端で末端接合法にょシブラスミド
中に挿入されうる。「異種構造の」なる用語は大腸菌の
ような特定微生物中に普通は見出されない遺伝子、また
は普通はその微生物により産生されないポリペプチド配
列を指す。［相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）　Ｊなる
用語は特定の微生物中に普通に見出されるかまたは特定
の微生物によって産生される遺伝子またはポリペプチド
配列を指す。

コーディングされたＤＮＡメツセージの転写および翻訳
を支配するプラスミドの部分に関して遺伝子が適正に挿
入された場合、得られるビヒクルは挿入された遺伝子が
コーディングする蛋白質の発現に使用されうる。ＤＮＡ
組換え技術における「発現」なる用語は転移された遺伝
子によりコーディングされる蛋白質が形質転換された細
菌により実際に合成される操作を指す。

遺伝子の発現が大腸菌において制御される様式は充分に
理解されている。細胞中の関連する機能を実施する蛋白
質をコーディングする遺伝子は連続的な配列で一個所に
群れをなしてまとまる傾向がある。この群れを「オはロ
ン」と呼ぶ。オペロン中のすべての遺伝子はその配列中
の第１番目の蛋白質のＮ−末端アミノ酸をコーディング
するコドンから開始しそしてオはロン中の最後の蛋白質
の〇−末端まで継続して同じ方向へ転写される。

Ｎ−末端アミノ酸コドンに最も近いオペロンの始めには
、プロモーター−オペレーターおよびリポソーム結合部
位のための配列（５ｈｉｎθ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列）
を包含する種々の制御エレメントを含む制御領域と呼ば
れるＤＮＡの領域が存在する。これら部位の機能はそれ
らの制御の下にこれら遺伝子を細菌の要求に感応するよ
うに発現せしめることである。発現が生ずるように存在
すべき制御領域機能はＤＮＡ鋳型に対して相補的なメツ
センジャーＲＮＡへの転写およびそのメツセンジャーＲ
ＮＡのリポソームと呼ばれる細胞小器官上の蛋白質への
翻訳である。

配列の第１番目の遺伝子の発現はオペロンの第１番目の
蛋白質のＮ−末端アミノ酸をコーディングする位置にお
ける転写および翻訳により開始される。そのポイントか
ら流れに沿った各遺伝子の発現も、少くとも異なる一組
の周囲合図に感応するように信号が組まれｌζそれ自身
の制御領域と停止シグナルまたは他のオはロンが出合う
′まで順に開始される。この一般的図式には詳細には多
くのバリエーションがおるが、重要な事実は、大腸菌の
ような原核生物中にて発現されるためには遺伝子ｔユ転
写および翻訳機能を有する制御領域に関し−Ｃ適正に位
置しでいなければならないということでめる。プロモー
ター配列にわずかな変更があってもＲＮＡポリメラーゼ
がプロモーターに結合して転写の速度を高めるであろう
確率を増大させうる。オはレータ−領域または調節遺伝
子における突然変異はリプレッサーの結合を阻止しそし
てそれにより転写を大いに増大させうる。

もしＤＮＡ組換え技術がその約束を完全に維持すべきな
らば、遺伝子挿入物の発現を最適にし、従って意図され
る蛋白質が高収率で入手しうるようにされうるシステム
が工夫されるべきである。普通に使用されるＩ−２クタ
マーゼおよび乳糖プロモーター−オペレーターシステム
は収率の見地からはこの科学技術の能力を充分には利用
していなかった。より効率的なプロモーター−オはレー
タ−システムであるトリシト７アン（ｔｒｐ）プロモー
ター−オはレータ−が細菌中における外来遺伝子の発現
を高めるために用いられた。例えば、ヨーロツノξ特許
出願第３６７７６号明細書には減衰体（ａｔｔｅｎｕａ
ｔｏｒ　）領域が欠失したｔｒｐプロモーター−オはレ
ータ−システムを用いるヒト生長ホルモンのプラスミド
発現が記載されている。

ＨａｌｌｅＷｅ１１氏他のＧｅｎｅ第９巻第２７〜４７
頁（１９８０年）には大腸菌ｔｒｐプロモーター、〜ｔ
ｒｐＥ遺伝子および約１５−のｔｒｐ　Ｄ遺伝子を含有
する外来遺伝子の発現に適当なプラスミドｐＢＲ３２２
の誘導体について記載されている。Ｆｉｄｍａｎ氏他の
Ｎａｔｕｒｅ第２９１巻第５０３〜５０６頁（１９８１
年）にはｔｒｐオペロン調節領域の制御の下にＢ型肝炎
核抗原およびβ−ラクタマーゼ／Ｂ型肝炎表面抗原融合
ホＩＪペプチドの合成を指示する組換えプラスミドの調
製が記載されている。

Ｒｕ５ｓｅｔ氏他のＧｅｎｅ第１７巻第９〜１８頁（１
９８２年）にはｔｒｐプロ単一ター−オはレータ−領域
からの４ｌ−ｔｐ　（塩基対）　Ａｌｕｌ制限断片をｐ
ＢＲ３２２のＰｖｕｌｌ切断点にクローニングし、Ｐｖ
ｕｌｌ切断点を再生させることＫよるいくつかの新規な
ｔｒｐ−プロモーター−オ／Ｖ−ターを担持するプラス
ミドの調製について記載されている。

０ｈｒｉｓｔｉｅ氏他のＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、第
１４３巻第３３５〜３４１頁（１９８０年）にはプラス
ミドｐＬＤ１０２が記載されている。Ｇｕａｒｅｎｔｅ
氏他の０ｅｌｅ第２０巻第５４３〜５５３頁（１９８０
年）にはプラスミドｐＬＧ４００が記載されている。

ヨーロッパ特許出願第５２００２号明細書にはその減衰
体が除去されたｔｒｐプロモーターに隣接したＤＮＡ断
片に対する挿入部位を有するプラスミドが記載されてい
る。ヨーロツ７ミ特許出願第４８９７０号明細書にはｔ
ｒｐプロモーターシステムを含有するプラスミドを用い
る成熟したヒトの繊維芽細胞インターフェロンの調製が
記載されている。ヨーロッパ特許出願第６７５４０号明
細書には化学的に誘導されうるプロモーター−オペレー
ター断片、例えばｌａｃ、およびょシ大きなシグナル強
さを有する第２のプロモーターの断片、例えばｔｒｐ　
、を含有するハイブリッドプロモーター−オはレータ−
が記載されている。

英国特許出願第２，１０４，９０１号Ａ明細書には外来
遺伝子を大腸菌中で発現させるための持ち運びできるプ
ロモーター、例えばｌａｃおよびｔｒｐ　。

の使用が記載されている。ｌａｃオはロンの使用が例示
されている。

本発明は細菌中における多数の相同のおよび異種構造の
蛋白質の過剰生産に有用な新規な誘導しうるプラスミド
に関する。シラスミドが使用されうる代表的な細菌は大
腸菌であシそして過剰に生産されうる代表的な蛋白質に
はインターロイキン−２、β−インターフェロン（工Ｆ
Ｎ喝およびβ−ラクタマーゼが包含される。本発明はま
た新規なプロモーター−オペレーター断片、本発明のプ
ラスミドにより形質転換された微生物、それらプラスミ
ドの製法、それらを微生物に組み込む方法、およびコー
ディングされた蛋白質の過剰生産法にも関する。本発明
の微生物を記載するのに使用される［生物学的に純粋な
培養物」とは遺伝的に同質な培養物を意味する。

本発明の新規なプロモーター−オペレーター断片は （＋）　断片（５′→３′）の−３５領域におけるＧＯ
ＯＧＡ ＵＧＧＯＴ なる６個の塩基対配列、および （１１）最初の８個の塩基対（５′→３′）の配列がＯ
ＧＣ！ＧＣ！ＡＴＣ （正ＯＧ（！ＧＴＡＧ である前記断片の−３５と一１ｏ領域の間の約１７個の
塩基対配列、 を肩することを特徴とする。

本発明のプラスミドには配列（１）および（１１）を有
するここに記載されるプロモーター−オはレータ−断片
を含有するものが包含される。これらにはまたｐＫ（）
Ｐ４３　、ｐＢＲＷＩＬ−２、ｐＫ（）ＰＩ３−１９Ｒ
−１；ｒ’ｐ６、ｐＫＧＰ３６・ｔｒｐおよびｐＴｒｐ
ＨＦ：工Ｌ−２が包含される。

本発明の代表的なプラスミドをあげれば次のとおシであ
る。

ｐＫＧＰ３６　第４Ａ図参照 ｐＫ、ＧＰ４３　第３図参照 ｐＡＰ１６　第５図参照 ｐＡＰＦ工Ｆ９　第６図参照 ｐＫＧＰ１２−２　第７図参照 ｐＫＧＰ１３−１９第７図参照 ｐＫＧＰ９−２５　第８図参照 ｐＫＧＰ１３−１９Ｒ−ｔｒｐ６　第３０図参照ｐＫＧ
Ｐ１３−１９Ｒ第９図参照 ｐＫＧＰ９−２５Ｒ第８図参照 ｐＫＧＰ１２−２Ｒ第７図参照 ｐＢＲＫ工Ｌ−２第１４図参照 ｐＫＧＰ３６−ｔｒｐ　第１５図参照 ｐＴｒ　ｐｌ）！！工Ｌ−２　第１５図参照本発明はま
た時間の経過と共に幾分突然変異した前記プラスミドを
も包含するものである。

プラスミドｐＫＧＰ３６およびｐＫＧＰ　４３の調製法
はｐＬＤＩＱ２およびｐＢＲ３２２型の既知プラスミド
の断片を下記の方法により組換えることからなる、すな
わち、 （１）　］；１ＬＤ１０２型のプラスミドをＨｐａ　■
およびＢａ１ｌを用いて制限し、 （Ｉｆ）　ｔｒｐ−プロモーター−オペレーター含有Ｈ
ｐａｌ／Ｂａ１ｌ断片を単離および精製し。

（Ｉｌｌ）　Ｉ（ｐａｌ／Ｂａ１１断片をＴａｑ　ｌで
限定消化することによシ修飾し、そして （Ｖ）　前記の修飾された断片をｐＢＲろ２２のｃ１ａ
ｌ切断点に挿入する。

反応混合物から本発明の新規プロモーターーオはレータ
−断片を包含するｔｒｐ　Ｐ、Ｏ，含有ｐＰ４３ならび
にｐＫＧＰ３６が分離された。

本発明のプラスミドｐＡＰ１６の調製法は以下の工程か
らなる、すなわち、 （１）　ｐＬＧ４００型のプラスミドをＰｅｔｌおよび
阻ｎｄ［ｌを用いて制限してＰ　、ｑ　ｔ　ｌ／Ｈｉ　
ｎｄＩＩＩ断片を得、（ｔｌ）　ｐＫＧＰ３６型のプラ
スミドをＰｓｔｉおよびＨｌ　ｎｄｌｌｌで制限しそし
てプロモーター−オペレーターを含有する断片を単離お
よび精製しそして（ｌｉｉ）　ｐＫＧＰ３６のプロモー
ター−オはレータ−を含有する断片をｐＬＧ４００のＰ
Ｂｔ　）／Ｈ１ｎａｌｌｌ断片ニ漣結させる。

本発明のプラスミドｐＡｐｎ工Ｆ９の調製法は以下（１
）　工ＦトβｃＤＮＡ断片をＨａ　ｅ　ＩＬ／’Ｈｉ　
ｎｃ　ｌｌで制限してＨａθＪｌ／Ｈ１ｎａｌｌ断片を
得、そしてこの断片を単離および精製し、 （１１）工程（１）のＨａｅｌ［／Ｈ１ｎｃｌ断片の両
端にＨ１ｎｄｌｌｌリンカ−を連結させてＨｌ、ｎｄｌ
ｌｌ／Ｈ１ｎａｌｌｌ断片を得、そしてこの断片を単離
および精製し、 （ｔｉｉ）　ｐＡＰ１６型のプラスミドをＨｌｎｃｌｌ
ｌｌを用いて制限し、そして （Ｉφ　工程（１０の断片を工程（ｌｉｉ）の断片と連
結させる。

本発明のプラスミドｐＫＧＰ　１２−２およびｐＫＩｌ
）Ｐ　１３−１９の調製法は以下の工程からなる、すな
わち、（１）　ｐＡＰ１６型のプラスミドをＨｌｎｄｌ
ｌｌを用いて制限しセしてＨｌｎｄｌ［切断点に大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を充填して鈍い
切れ端の断片を得、 （１１）　工程（＋）の断片をＰｅｔｌで制限してβ−
ラクタマーゼ遺伝子（ＡＭＰ）のアミン末端およびｐＫ
σＰ３６トリプトフアンプロモーターーオはレータ−８
ｈｉｎｅ−Ｄａ’１ｇａｒｎｏ　（Ｐ、Ｏ，−８，Ｄ、
）　：ｓ−ニットを含有するＰｓｔｌ断片を得、そして
この断片を精製し、（ｉｉｉｌ　ｐＡＰＦ工Ｆ９型のプ
ラスミドをＰｅｔｌを用いて制限し、そしてβ−ラクタ
マーゼ遺伝子のカルボキシル末端およびＩＦＮ−βｃＤ
ＮＡのカルボキシル末端を含有する断片を精製し、 （ｌφ　工ｙトβＱＤＮＡ断片を編集して塩基対１４０
個を有する鈍い切れ端のＡＴＧ、／ｉ）ｓ　ｔ　ｌ断片
となし、そして （ｖ）工程（ｔｌ）　、θ１１）および４ｖ）の断片を
連結させる。

本発明のプラスミドｐＫＧＰ９−２５の調製法は以下の
工程からなる、すなわち、 （１）ｐＡＰ１６型のプラスミドをａｌｎａＢｌ　′ｆ
ｃ用いて制限し、そしてＨ１ｎｄｌｌ切断点に大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を充填して鈍い切
れ端の断片を得、 （１１）工程（１）の断片をＢａｍＨで消化し。

（ｉｉＤ　ｐＡＰＦ工Ｆ９型のプラスミドをＨｐａｌで
制限して３個の断片を得、 り■）工程（ｉｉｔ）の断片をＢａ１３１エキソヌクレ
アーゼおよびＢａｍＨ７で処理してｘＦＮ−７１遺伝子
の５′−末端でランダムに崩壊されそしてＢａｍＨｌ切
断点を末端とする断片を得。

（ｖ）　工程Ｏφの工ＦＮ−βｉ’ｉ９’ｒ片を工程（
１１）のｐＡＰ１６断片に連結する。

本発明のプラスミドｐＫＧＰ　１２−２Ｒ％　ｐＫＧＰ
１３−１９ＲおよびＩ）ＫＧＰ９−２５Ｈの調製法は以
下の工程からなる、すなわち、 （１）　ｐＢＲ３２２型プラスミ型金ラスミドｌおよび
ＢａｍＨｉを用いて制限してＰｅｔｌ／Ｂａｍ旧断片を
得そしでこの断片を硝製し、 （ｉｔ）　１ｐ）ｐｘＧｐｉｚ−ｚ型、（ｂ）　ｐＫＧ
Ｐ１３１９型または（ｃ）ｐＫＧＰ９−２５型のプラス
ミドをＰｓｔｌを用いて制限しそしてβ−ラクタマーゼ
のアミン末端、　ｐＫＧＰ３６　Ｐ、Ｏ，−８，Ｄ、ユ
ニットおよび編集された工ＦＮ−β遺伝子のアミノ末端
を含有する断片を精製し。

ＯｉＤ　Ｐ３８４７型のプラスミドをＰｓｔｌおよびＢ
ｇｌＩ［を用いて制限しそして工ＦＮ−β遺伝子のカル
ボキシル末端断片を含有する断片を精製し、そしてＧＶ
　工程（１）、（ｉｉＤおよび工程（ＩＩ）　（７）　
（ａ）、（ｂ）　ｉ　ｆｃ　ハ（ａ）の断片を連結する
。

本発明のシラスミドｐＫＧＰ１３−１９Ｒ−ｔｒＩ）６
の調製法は以下の工程からなる。すなわち、 （１）　ｐＫＧＰ４３型のプラスミドをＨｐａｉおよび
ｌ１ｌｉｎｄ■を用いて制限しそしてＨ１ｎｄｌｌ切断
点を充填して充填されたＨｌｎａｌ［ｌ末端およびＨｐ
ａ　ｌ末端を有する断片を得、 （ＩＩ）　ｐＫＧＰｌ　ｓ−１９Ｒ型のプラスミドをＨ
ｐａ　ｌを用いて制限してＨｐａ　ｌ断片を得、そして （Ｉｊｌ）　工程（１〉の断片と工程（１１）の断片と
を連結させる。

本発明のプラスミドｐＢＲＥ工Ｌ−２の調製法は以下の
工程からなる、すなわち、 （＋）　ｐｌＨ４０型のプラスミドをＰｓｔｌで制限し
て工Ｌ−２に対する遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片を得
、（１１）　工程（１）の断片を処理してＯＯＴコドン
で始まる鈍い３′−末端を形成させ、 （１１０工程（１１）の断片の鈍い３′−末端に、連続
して配置されたＡＴＧおよびａａ’ｒコドンを包含しそ
してＨ１ｎｄＶ切断点を含有するアダプター分子全連結
させ、 （Ｉｖ）　工程ＯｉＤの断片をＨ１ｎ４１１およびＢｔ
ｕ　ｌを用いて制限し、 （■）ｐＢＲ３２２型のプラスミドをＨｌｎｄｌ［およ
びＰｖｕｌを用いて制限し、そして大きいＤＮＡ断片を
単胎し、 ＱＯ工程（Ｉｔの工Ｌ−２遺伝子を含有する断片を工程
（ψのＨｌｎｄＶＰｖｕｌ［＠片に連結させる。

本発明のシラスミドｐＫＧＰ３６・ｔｒｐの調製法は以
下の工程からなる、すなわち、 （１）　ｐＫＧ、Ｐ３６型のシラスミドをＨｐａｌおよ
びＰｓｔｌで制限しそしてｔｅｔＲ遺伝子を含有する断
片を精製し、 （Ｉｉ）　ｐＫＧＰｌ３−１９Ｒ−ｔｒｐ−６型のシラ
スミドをＨｐａ　１およびＰｏｔｌで制限し、そしてｔ
ｒｐ　Ｐ、Ｏ，を含有する断片を精製し、 （ｉｌＤ　工程（１）および（１１）の断片を連結する
。

本発明のプラスミドｐＴｒｐＫ工Ｌ−２の調製法は以下
の工程からなる、すなわち （１）　ｐＢＲＥ工、Ｌ−２型のプラスミドをＨｌｎａ
ｌｌ　およびＰｅｔｌを用いて制限しそして工Ｌ−２遺
伝子を含有する断片を精製し、 （ＩＩ）　ｐＫＧＰ３６＋”ｔｒｐ　Ｗのプラス゛ミド
をＨｌｎｄｌｌおよびＰｓｔｌを用いて制限しそしてｔ
ｒｐ　Ｐ、Ｏ，ｆ含有する断片を精製し、そして 佃）工程（１）と工程（１１）の断片を連結させる。

本発明の新規プラスミドをとり込ませるだめの微生物の
修飾方法は以下の工程から、ケる、すなわち （１）細菌細胞を指定される光学濃度まで生育させ、 （Ｉｔ）　ｔｍ化カルシウム溶液で処理することにょシ
細胞壁を修正し、 （１１Ｄ　コンピテントな細胞を新規なシラスミドを含
有する連結されたＤＮＡ混合物と混合し、そして ＯＶ）　この混合物を培養してプラスミドの挿入を行わ
しめる。

今やクローニングされたシラスミドを含有する修飾され
た微生物の分析は工程０ψの培養された細胞を選択され
た培地上で培養しそして次に検定することによシなされ
る。

本発明の修飾された細菌細胞から蛋白質を過剰に生産さ
せる方法は以下の工程からなる、すなわち、 （１）修飾された細菌細胞を光学濃度が６ＤＯｎｍで少
くとも２となるまで富化された培□地中で生育させ、 （１１）生育した細胞をミニマル培地中１：１０に希釈
しそして ０１１）希釈された細胞をβ−インドールアクリル酸（
β−工ＡＡ　）で処理する。

希釈された細胞およびβ−工ＡＡを包含する培地はイン
ターロイキン−２および／１７＋２１．はβ−２クタマ
ーゼおよび／ｌたは工ＦＮ−β活性のような関心ある蛋
白質に関連する活性について検定することにより過剰に
生産さ−れた蛋白質について分析されうる。あるいはま
た、生産された蛋白質は放射性アミノ酸で標識されそし
て放射性標識された蛋白質を分離および分析することが
できる。

図面中に示されるプラスミドは寸法通シではない。塩基
対距離は右まわりに測定された。

第１図はベクターｐＡＯＹｏ　１７７　ｓおよびトリプ
ト７アンオはロンのＣ遺伝子をトリプト７アンリーダー
リポソーム結合部位に融合させるトリプトファン欠失ｔ
ｒｐΔＬＤ１０２配列を包含する従来法のプラスミドｐ
ＬＤ１０２を示す。

第２図は従来法のプラスミドｐＢＲ３２２を示す。

第３図はＰ、０．方向がβ−ラクタマーゼ遺伝子の方向
であるβ−２クタマーゼ遺伝子を包含する新規なプラス
ミドｐＫＧＰ４３の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す
。

第４Ａ図はＰ、０．がナト２サイクリン抵抗性（ｔθｔ
Ｒ）遺伝子の方向を向いているβ−２クタマーゼ遺伝子
を包含する新規なプラスミドｐＫＧＰ３６の制限エンド
ヌクレアーゼ地図を示す。

第４Ｂ図はｐＫＧＰ３６からの新規なＰ、０．断片対ｔ
ｒｐ　Ｐ、Ｏ，断片の比較を示す。

第５図はβ−ガラクトンダーゼ遺伝子に融合したｐＫＧ
Ｐ３６からのｐ、ｏ、を包含する新規なプラスミドｐＡ
Ｐ１６の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。

第６図は新規なプラスミドｐＡＰＦ工Ｆ９およびその消
化配合表を示す。

第７図は新規なプラスミドｐＫＧＦ１２−２およびｐＫ
ＧＰ１３−１９の制限エンドヌクレアーゼ地図、および
ｐＡＰ１６　Ｐｅｔｌ鈍い切れ端の断片、ｐＡＰＦＩＦ
９Ｐｓｔ　ｌ断ハおよび編集されたＩ’ｅｔ　ｌ鈍い切
れ端の１ＦＮ−β断片の三者間連結を用いるそれらの調
製を示す。

第８図はｐＡＰＦ工Ｆ９およびＢａ１３ｉエキソヌクレ
アーゼを用いそしてｐＡＰ１６中に連結するプラスミド
ｐＫ（）Ｐ９−２５調製のための代替ｍ４Ｊ法を示す。

第９図はｐＢＲ３２２からのＰｓｔｌ／Ｂａｎ旧断片、
ＩＩＫＧＰ１３−１９からのｐｓｔｌ断片およびｐｓｔ
ｌ／Ｂｇ１［カルボキシル末端工ＦＮ−β断片を三者間
を連結させる新規プラスミドｐ’ＫＧＰ１３−１９Ｒの
調製を示す。

第１０図は新規シラスミドｐＫ（）ＰＩ３−１９Ｒ−ｔ
ｒｐ６を形成させるだめの消化、連結および形質転換工
程を示す。

第１１図はプラスミドｐ３８４７からのＩＦＮ−β遺伝
子のｃＤＮＡ配列を示す。

第１２図は本発明のプラスミドｐＫＧＰ１２−２Ｒ。

ｐＫＧＰ　１３−１９ＲおよびｐＫＧＰ９−２５Ｒを特
徴づけるＰ、０゜−Ｂ、Ｄ、断片を包含する転写ユニッ
トのＤＮＡ配列を示す。

第１３図はｐＬＤ１０２からのＨｐａｌ切断点を含有す
るおよそ４００個の塩基対を有する断片を示す。

第１４図はｐｌＨ４０からの編集された工Ｌ−２遺伝子
断片をｐＢＲ３２２の制限により得られる大きい方のｌ
ｌｌ１　ｎ　ｄＩｌＬ／′Ｐｖｕ　ｌ断片に連結するこ
とによる一Ｗｌ。

−２ベクターの調製を示す。

第１５図はｐＫＧＰ３６−ｔｒｐおよびｐＴｒｐＨｉ工
Ｌ−２を示しおよびｐＫＧＰ３６　・ｔｒｐがらのＰｇ
ｔＩ／Ｈ１ｎｄｎｌ　ｔｒｐ　ｐ、ｏ。

断片を工Ｌ−２遺伝子およびアンピシリン遺伝子の一部
分を包含するｐＢＲＩ！！工Ｌ−２からの断片に連結さ
せることによる後者ｐＴｒｐＭ！■Ｌ−２の調製を示す
。

大腸菌中における外来遺伝子の発現はトリプトファンフ
ロモーターのような効果的なｉｏモモ−−の存在により
一般に高められるが、このプロモーターの制御の下に遺
伝子を発現するプラスミドは不安定でありうる。外来遺
伝子ノクローニング、編集、および操作は欠失および配
列換えゆえに困難でありうる。本発明の特徴の一つは外
来遺伝子を非常に安定してクローニングおよび編集する
のに使用できそして次に遺伝子操作が完了後に効果的な
プロモーターに変換されうる「不充分な」プロモーター
−オイレーターを提供することにある。かかるシステム
の利点は外来遺伝子の発現に必要とされる配列の長期保
持である。

プラスミドおよび微生物 本発明の多数の新規なプラスミドは図面に示されるそれ
らの制限エンドヌクレアーゼ地図およびＤＮＡ配列に関
して記載される。ある種のこれらプラスミドの最も特徴
的な領域の一つは独特の源から発しそして画業上未知の
配列を含有するプロモーター−オＲレータ−およびＳｈ
ｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列を包含する断片である。

本発明の好ましい態様は第３図に示されるプラスミドｐ
ＫＧＰ４３である。Ｏｌａ　ｌおよびＨ１ｎａｌｌ切断
点の間に位置するＨｐａ　ｌ切断点はＰ、Ｏ，−８，Ｄ
、断片の存在および方向（矢印で示される）を記載して
いる。この新規なプラスミドにおいてはβ−２クタマー
ゼ遺伝子はトリプトファンｐ、ｏ。−８，Ｄ。

断片から下方へ向っている。５ｈｉｎθ−Ｌｌａ１ｇａ
ｒｎＯ配列は５ｈｉｎθ氏他によｐ　Ｈａｔｕｒｅ第２
５４巻第３４〜３８頁（１９７５）に記載されている。

この地図はｐＢＲ３２２（第２図参照）の既知寸法およ
び制限地図、ｐＬＤ１０’２　（第１図参照）からのト
リプトファンＰ・０．−８．Ｄ。断片の既知寸法および
制限地図、ならびに混成プラスミドｐＫＧＰ４３の独立
した制限地図作成およびＤＮＡ配列分析に基き作成され
る。

ｐＫＧＰ４３の分子量は２．８Ｘ１０’ダルトン（約４
７００ｂｐ）である。ＨｐａｌＬ／’ｒａｑ　ｌ断片（
トリプトファンＰ、Ｏ，−Ｅ１．Ｄ、含有断片）の存在
はそのプラスミドにトリプトファンの非存在量またはβ
−工ＡＡの存在下またはその両方の下におけるβ−ラク
タマーゼの過剰生産をコーディングする能力を与える。

前記Ｐ、００−８．Ｄ、含有断片中における塩基配列は
混成プラスミドの安定性を変えるものではない。

下記の塩基対距離がプラスミドｐＫＧＰ４３をさらに特
徴づける、すなわちＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ　、　７５０
ｂｐ：Ｆ！ｃｏＲＩ−Ｈｐａｌ、１００ｂｐ：　Ｈｐａ
ｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、３００ｂｐ；　Ｈｌｎｄｌｌ−Ｂ
ａｍＨ７，３４５ｂｐである。この距離はアガロースお
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定されそ
して近似値である。ｇｃｏＲｌおよびＰｓｔｌ単一制限
部位は外来遺伝子の挿入および発現に使用されうる。

本発明のもう一つの好ましい態様は第４Ａ図に示される
プラスミドｐＫＧＰ３６である。Ｈｐａｌ切断点ｉ　Ｐ
、Ｏ，−８，Ｄ、配列に位置しそして方向を向いている
。この新規なプラスミドでは、分子量約五０Ｘ１１）’
ダルトンであり、ｔｅｔＲ遺伝子はア、０８−８．Ｄ、
断片から下方に向っている。制限断片の寸法および配置
はｐＫ（）Ｐ４３に記載されたようにして決定される。

ｐ、ｏ・、−８，Ｄ、断片の存在はそのプラスミドにＨ
ｌ　ｎ’ｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩ制限部位中にクロー
ニングされた外来遺伝子を低レベルで発現する能力を与
える。クローニングおよび遺伝子操作後、ｐＫＧＰ　３
６のＰ。０．は単一の一工程クローニングで再構成され
て有効なｔｒｐ　Ｐ、Ｏ，を形成する。

得られるプラスミドが次にクローニングされた蛋白質の
高収率な合成を指示しうる。下記の塩基対距離によりこ
のプラスミドについて述べる、すなわちｒｅｔｌ−ｖｃ
ｏＲｌ、、７５０ｂｐ；　ｚｃｏＲｌ−ｃｌａｌ、２３
ｂｐ：　（’１ａＩ−Ｈｐａｌ、５６５’ｂｐ’、　０
１ａｌ−０１ａｌ＋６０Ｄｂｐ：　Ｈｐａｌ−０１ａｉ
、３５ｂｐ；　Ｈｐａｌ−Ｈｌｎａｌｌｌ、５９ｂｐＳ
阻ｎａｉｌ−ＢａｍＨｌ　。

３４５ｂｐである。ｐＫＧＰ３６のプロモーター領域が
配列分析によりさらに特徴づけられた。

プラスミドｐＫＧＰｓｂはｐＢＲ３２２のｔｅｔＲ遺伝
子の方向に向いている新規なＰ、０．配列を含有する。

この新規なＰ、０．はｔｒｐ　Ｐ、Ｏ，の−１０領域お
よびクローニングの間にＴａｑ　ｌ切断点を介してｔｒ
ｐ　−１０配列に融合した新規な一３５領域からなる。

第４Ｂ図参照。この新規な配列はＴ二Ａ塩基対で始まシ
ぞしてＡ：Ｔ塩基対で終る６個の塩基対の新規な一３５
領域を含有する（５′→３′）。これら２個の塩基対が
ｔｒｐ　７ｐ口モーターのまとまった一３５領域の縁ど
りをしている。しかしながらｐＫＧＰ３６中のこれら２
個の塩基対の間の４個の塩基対はｔｒｐプロモーター中
のそれらと相異する。ｐＫＧＰ３６の−３５と一１０領
域の間の距離（スは−サー）はｔｒｐ　ｉロモーター中
におけると同じ距離である１７塩基対である。この新規
なプロモーターはプロモーターとして機能するための基
本的構造を有するが、しかしｔｒｐプロモーターより効
率が劣る。このことは究極の目的が工Ｆ’Ｎ−βのよう
な外来遺伝子をｔｒｐまたは１ａＯプロモーターのよう
な有効なプロモーターに融合させることにある場合は好
都合でありうる。

本発明のもう一つの好ましい態様は第５図に示されるプ
ラスミドであるｐＡＰ１６である。分子量約４．８ｘ１
０６ダルトンであるプラスミドベクターｐＡＰ１６はｐ
ＫＧＰ　３６からのＰ、Ｏｏ−〇、Ｄ、配列に外来遺伝
子を融合させるのに有用な一般目的用ベクターである。

用いられるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子１ｄ、　ＡＴＧ
開始コドンを有せずそしてβ−カラクトクターゼ単独の
発現を指示できない。ｐＬ（）４００からのβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子は述ＧＰ３６からのＰ。０．−８．Ｄ
、制御エレメントに融合されてｐＡＰ１６を形成する。

このばフタ−は検出できないレベルのβ−ガラクト・シ
ダーゼしか生じない。しかしながら、官能性アミン末端
遺伝子断片がＰ、Ｏ，−８，Ｄ、制御エレメントとβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子との間の枠に挿入される場合は
、β−ガラクトシダーゼ活性を示す融合蛋白質が生産さ
れうる。このことがｐＫＧＰ３６のＰ、０．への外来遺
伝子融合物の選択を大いに促進させる。

プラスミドｐＡＰ１６はｐＫＧＰ３６のＰｓｔ　ｌ／Ｈ
１ｎｄｌ［ｌ　Ｐ、Ｏ。

含有断片とプラスミドｐＬＧ４００のＰｓｔ　Ｉ／Ｈ１
ｎｄｎｌΔ’ｌａａ工２含有断片との間の融合主２含有
断片。下記の制限地図によりこのプラスミドがさらに特
徴づけられうる、すなわち、Ｐｅｔ（−Ｈｌｎｄｌｆｆ
、１３００ｂｐ；　Ｏ：Ｌａｌ−０１ａ！、６００ｂｐ
：　Ｈｐａｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、３９ｂｐ；　Ｈ牌１−
ＢａｍＨｌ　、４５ｂｐである。プラスミドｐＡＰ１６
け△１ａＯ工２配列をプラスミドｐＫＧＰ３６のプロモ
ーター−オズレーター配列に融合されて包含して、外来
遺伝子をｐ、ｏ、およびリーダー〇、Ｄ、配列中および
Δｌａｃ　工Ｚ遺伝子との枠内に融合させるための独特
のベクターを創出する。プロモーター−オペレーターか
らの発現は代表的なβ−ガラクトシダーゼ検定により検
出されうる融合された遺伝子生成物、例えばｐＡＰ？１
Ｆ’９　（第６図参照）を生ずる。結果として得られる
プラスミドは次にトリプトファンリーダーＳ、Ｄ、およ
び関心のある外来遺伝子の間の配列を操作するのに使用
される。

このプラスミドけまプこ大腸菌中における異種構造遺伝
子の発現を研究するのにも使用されうる。

このプラスミドのもう一つの用途は抗原決定基の△ｌａ
ｃ工２遺伝子への融合である。このことが診断法または
ワクチン用の融合抗原の合成を許すことになる。

プラスミドｐＡＰ　１６はΔ１ｈｃＩＺ遺伝子の枠内に
融合された場合にそれ自身のＡＴＧ開始コドン全担持す
る任意の外来遺伝子配列のクローニングおよび操作に使
用されうる。プラスミドｐＡＰｉ６は大腸菌のｔａｃ　
Ｐ、０．およびａａＣ菌株會用いるための代替法を提供
するものである。ｐＡＰＦ工Ｆ９のような融合蛋白質を
担持するｐＡＰ１６　＃導体からのβ−ガラクトシダー
ゼ活性発現はトリプトファンオペレーターの制御下にあ
るので、プラスミドに指示されるβ−ガラクトシダーゼ
活性はいずれの大腸菌宿主においても背景上で測定され
うる。

ｔａｃ　Ｐ、Ｏ，融合システムは染色体β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の欠失全含有する特定の菌株を必要とする
。これは同じ誘導物質（１ｎｄｕｃｅｒ）　（乳糖およ
び■ＰＴＧ）がプラスミドβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
および染色体β−ガラクトシダーゼ遺伝子両方の発現を
誘導するので必要である。

それゆえプラスミド活性は染色体活性から区別できない
。ｐＡＰ１６では、プラスミドに指示されたβ−ガラク
トシダーゼ活性の発現は培地からトリプトファン金なく
するかまたはβ−工ＡＡの添加によｌ）誘導されうる。

これら誘導条件は染色体β−ガラクトシダーゼ発現を起
させることなくプラスミドに指示されたβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を発現さ廿る。ＬＧ９０のようなβ−ガラク
トシダーゼが欠失する菌株は正しく岨み立てられた分子
に非常に低い効率しか（５〜１０％）与えない。代ｆ）
　ｌ／ｌ：　ｔａｃ　Ｚ遺伝子を含イ１する菌株すなわ
ちＭＭ　２９４およびＨＢ　１０１は同じ連結混合物で
形質転換された場合それぞれ９０および９５％の効率を
有する正しく組立てられた分子を生じた。

本発明のもう一つの態憔は第６図に示されるプラスミド
ｐＡＰＦＩＦ９である。分子量約５．１Ｘ１０”ダルト
ンを有するこのプラスミドはＰｓ　ｔ　Ｉ　−Ｈｐａ　
Ｉ　。

１３２０　ｂｐ；Ｈｐａｌ−Ｈｉｎｄｌｌ［，３９ｂｐ
；Ｈｌｎｄｌｌｌ−Ｐｓｔｌ、２０７ｂｐ；Ｐｅｔｌ−
Ｈｌｎｄｌｌｌ、２７０　ｂｐ；およびＨ１ｎｄ用−Ｂ
ａｍＴ−１１，６ｂｐなる制限地図を有する。このプラ
スミドにおいては、ＩＰ”Ｎ−βアミノ末端がｐＫＧＰ
　３６　Ｐ、Ｏ，−８，Ｄ。

制御エレメントおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の間
に融合される。

制限地図作成、ＤＮＡ配列分析および生物学的検定法は
β−ガラクトシダーゼ活性を有する融合蛋白質がＩＦＮ
−β開始コドンであるＡＴＧ　Ｋよって指示されている
ことを示すために用いられた。

Ｐ、　Ｏ，−Ｂ、Ｄ、制御エレメントと工ＦＮ−βＡＴ
Ｇコドンとの間のＤＮＡの操作はβ−ガラクトシダーゼ
検定によシ監視される融合蛋白質の産生を最小限に抑え
るために実施されうる。−ば融合蛋白質のＲ適なる発現
がｐＫＧＰ　３６　Ｐ、Ｏ，−Ｓ、Ｄ、配列から得られ
ると、真正の工ＦＮ−β遺伝子の再構成はａａｃ工２配
列全工ＦＮ−βカルボキシル末端遺伝子断片で置換する
ことによ勺得られうる（第７図参照）。トリプトファン
Ｐ、０．は工ＦＮ−βまたは他の外来遺伝子を効率的に
発現させるためにｐＫＧＰ３６　ｐ、ｏ、から再構成さ
れうる。他の好ましい態様にはｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ
およびｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ−ｔｒｐ　６が包含され
る。

プラスミドｐＫＧＰ　１２−２．１３−１９および９−
２５は約５．ｌＸ１（１６ダルトンなる分子遍）・よび
Ｐｓｔ　１−Ｈｐａｌ　１１３２０　ｂｐ　；Ｈｐ’ａ
ｌ　−０６ａｌ　、　２７　ｂｐ；Ｏ６ａ’ｌ　−’Ｐ
ｓｔｌ　、　１４５　ｂｐ；Ｐｓｔｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ
、２７０ｂｐおよびＨｌｎｄｌｌｌ−ＥＦＬｍｌｌｌ、
６　ｂｐ、ｅる制限地図によｆ）’Ｆ！ｊ徴づけられる
。

プラスミドｐＫＧＰ　１２−２Ｒ、１６−１９Ｒ：Ｉ？
よび９−２５Ｒは約３．４Ｘ１０６ダルトンなる分子鎖
およびＰｓｔｌ−Ｈｐａｌ、１３３０１）ｐ；Ｈｐａｌ
−Ｏｔａｌ、２７　ｂｐおよび０４ａｌ−Ｐｓｔｌ、　
１４５ｂｐなる制限地図を有する。プラスミドｐＫＧＰ
　１３−１９Ｒ−ｔｒｐ　６は分子量約３．７Ｘ１０’
ダルドアｊｉｐよび、Ｐｅｔ−Ｈｐａｌ、　１５３０　
ｂｐ；Ｈｐａｌ　−Ｃ１ａｌ　ｅ２７ｂｐ＞よび０４ａ
ｌ−Ｐｓｔｌ、１４５　ｂｐなる制限地図を有する。

プラスミドｐＢ、ＲＥＩＬ−’２はＦ記の特徴を有する
１すなわち分子量約１．７Ｘ１０６ダルトンおよび、几
−２遺伝子を包含するＨｌＭｌｉｌ−ＩＬ−２，５ｔｕ
ｌ切断点、４５０　ｂｐ％ＩＬ　−２遺伝子を含まない
ｘＬ−２ｓｔｕ１切断点−Ｈ１ｎｄｌｌｌ　２３２５　
ｂｐなる制限地図を有する。

プラスミドｐＫＧ、Ｐ　３６・ｔｒｐは分子量約３．０
Ｘ１０’ダルトンおよびＨｌｎｄｌｌｌ−ＰｓｔＪ　３
５８６　ｂｐ％Ｐｓｔｌ−ｃム１゜７７５　ｂｐ；Ｔｒ
ｐ　Ｐ、Ｏ，ｆ包含Ｔ　ル（Ｊｌａｌ　−Ｃ４ａ　Ｉ　
、　７９０ｂｐ；Ｃ’ｔａｌ　−Ｈｌｎｄｌｌｌ　４　
ｂｐなる制限地図を有する。

プラスミドｐＴｒｐ＋ＥＩＬ−２ｆｉ分子薙約２．ｌＸ
１０６ダルトンおよびＩＬ　−２遺云子を包含するＨｌ
ｎｄｌｌｌ　−ｐｓｔｌ、２υ００　ｂｐおよび’ｒｒ
ｐ　ｌ’、Ｕ、　ｉ包含するＰｓｔｌ−）（１ｎｄｌｌ
ｌ　１５６９わｐなる制限地図を有する。

形質転換に適する微生物には大腸菌（Ｋｓｃｈｅｒｉ−
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ｈｆのＲ１菌が包含される。適当
な菌株の例にＦｉ、に−１２株、ＨＢ　１０１株、ＭＭ
２９４株およびＲ１（１株が包含され％　Ｋ−１２株が
好ましい。

方　法 当業者に認識されるように、ここに記載される編集、再
構成および他の操作は制御エレメントと所望の蛋白質の
翻訳を開始する第１番目のＡＴＧコドンとの間で実施さ
れる。これら操作は遺伝子のアミン末端（フロント部分
）で実施される。容易に検定しうる蛋白負全コーティン
グ−Ｔる遺伝子が外米遺伝子のアミン末端に融合される
場合は関心ある再構成事象は容易に検定されうる。本発
明の目的のためには大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子およびトリプトファン第４ロン制帥エレメントが
選択される。酵素活性のレベルは存在するβ−ガラクト
シダーゼ分子の数に直接比例する。従って、β−ガラク
トシダーゼ遺遺伝子例えば工ＦＮ−β遺伝子のアミン末
端に融合させることにょυ、大腸菌中に）Ａ現されるハ
イブリッド分子のレベルがｍｊＦＬｌ比色定量分析によ
シ測定されうる。

プラスミドｐＫＧＰ　４３およびｐＫＧＰ　３６は下記
の操作により得られた。すなわち、制限酵素Ｈｐａ■お
よびＪＪａｔＩで消化′ｊ−ることにｊＪ）ブラスミＦ
’　ｐＬＤ　１０２から大ｙＪ菌トリブトファンプロモ
ーター−オ投レータ−、Ｓｈｉｎｅ−ｆ）ａｌｇａｒｎ
ｏ　ＤＮＡＪピ列金とり出した。ノ９？望のＤＮＡ金含
有する〃「片會梢製しそして制限酵素Ｔａｑ　ｌで修飾
した。得られた修飾された１析片をプラスミドｐＢｆ？
　３２２の０１ａ１制限部位中Ｖ（サブクローニングし
た。上記構成措置によシｔｒｐオペロンからの配列を反
対方向に含有する２独の発現プラスミドが生じた。

プラスミドｐＫＧＰ　４３１’ｔ　ＥｌｃｏＲｌおよび
Ｐｓｔ　ｌの制限部位中にまたはβ−ラクタマー七遺伝
子内の任意の部位中にサブクローニングされた遺伝子の
発現を指示しうる。シラスミドｐＫＧＰ３６は新規なハ
イブリッドトリヲトファンＰ、０．を貧有しそして）］
ｉｎ４川制限部用中にまｆｃはｔｅｔＲｆｆｌｆ＝子内
の任思の部位中にサブクローニングされた遺伝子の低レ
ベルｉｃ　＊−ける発現を指示しうる。

本発明の新規なプラスミドは適切な遺伝子がプラスミド
中に挿入された場合にイ■（々の異柚構造性および相同
性ポリペプチドを過剰生産させるのに使用烙れうる。イ
ンターロイキン−２、β−ラクタマーセおよびヒトの繊
維芽細胞インターフェロンの過剰生産にこれらプラスミ
ドを使用するのが好ましい。プラスミドｐＫＧＰ　４３
のβ−ラクタマーセの生産への使用、プラスミドｐＫＧ
Ｐ　１３−１９Ｒ−ｔｒｐ　６の工ＦＮ−βの生産への
使用、およびプラメミドｐＴｒｐＢ工Ｌ−２のインター
ロイキン−２の生産への使用が特に好ましい。β−ラク
タマーセは薬物調査用のスクリーニング剤としておよび
分析用製剤においてｎＩｌ液試料から残留はニジリン葡
除去するための薬剤としてのＭ相性？有する。インター
フェロンはウィルス感染に感応して卸１胞によシ産生さ
れる天然の分子である。この分子は＃４＋１廁にさらさ
れるとそれらをウィルス感染に対して抵抗性となす。イ
ンターロイキン−２ば１１甫乳動物にふ・ける細胞によ
シ仲介される免疫感応に影響會及はしうる。リンフ才力
インである。例えば、これはＴ−リンパ球の調節剤（レ
ギュレーター）として機能する。

本発明の寄託されたプラスミドの受理番号を示せば次の
とおりである。

プラスミド　ＡＴＣＯ寄託番号 ｐ、ＫＧＰ　３６　３９４１３ ｐＫＧＰ　４３　３９４１４ ｐＡＰ　１６　３９４１５ ｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ５９４１６ ｐＫＧＰ　１３−１９ｆｌｔｒｐ６　３９４１２ｐＴｒ
ｐＥＩＬ−２，３９７５０ 本発明を説明するために以Ｆに実施例を掲げる。別に断
わｐなければ部および６分率はすべて重賞によるものと
しそして温度はすべて摂氏によるものとする。

実施例　１ プラスミドｐＬＤ　１０２　ｋ宿主大腸菌Ｗ６１１０ｔ
ｒｐ０５５菌株の培養物１を中で増殖させそして標準的
な清澄化さノｔ７’（浴屏物％　０ｓＯ６−エチジウム
ブロマイドと一衡遠心分離操作にｕｎ！１１梢製した。

このプラスミドの２μｇを１０す限酵素Ｈｐａ　ｌふ・
工びＢａｔｌで消化しそして５％アクリルアミドゲル上
分離した。４００塩基対（ｂｐ）範囲付近を移動する幾
つかの断片が観察された。Ｈｐａｌｌ／Ｂａｔ］断片を
さらにＨｐａ　ｌで消化−ｒると断片１神が消失し、こ
のことはＨｐａｎ／Ｂａ／！、１断片中におけるｔｒｐ
Ｐ。Ｏ，−Ｅｌ、Ｄ、配列の存在全示す。次にこの断片
を精製しそしてＴａｑ　ｌでの限定消化にかけて予想さ
れるＴａｑ　ｌ制限部位が存在するか否か判定した。Ｔ
ａｑ　］消化ｌ吻勿ポリアクリルアミドゲル分析すると
予想される切断点が存在することが示された。

Ｈｐａ　ｌ切断点（第１６図容態）を官有する４００ｂ
ｐ断片會以下のようにしてＴａｑ　ｌ　ｆ用いて部分消
化した。すなわち、断片２５０．０μｇ’ｉ最終容量１
０μを中で１ユニツトのＴａｑ　Ｉ　ｋ用い６５℃で１
２分間消化した。プラスミドｐＢＲ６２２をＯｔａ　ｌ
を用いて死金に消化した。訃よそ１１００ｎのベクター
ＤＮＡ　ｉ最終８Ｒ１０１ｔｔＫてリガーゼ緩衝液、ア
デノシン三燐酸（ＡＴＰ）　５００ＭおよびＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼ２ユニツト中４　Ｃｌ　Ｏ’ｂｐの部分的Ｔ
ａｑ　ｌ消化物４μｔと結合させた。上記混合物音１２
℃で４８時間培養した。

形質転換に使用された大腸菌に一１２株は２９４（ｅｎ
ｄ　Ａ−，１１θｄＲ−、ｔＪｌｌ−、ｐｒｏ’″）お
よびＨＥｉυ１（ｐｒＯ−４ｅｕ−ｔｈｌ−１ｔａＣｙ
−１ｈ６ｄＲ１ｅｎｄＡ−２ｒθＣＡ−１ｒｐｅ　Ｌ２
Ｌ）、ａｒａ　１４１ｇａｔＫ２．ｘｙｊ−５，ｍｔｔ
−１＋θｕｐＥ４４）である。形質転換されるｔＩＩＩ
胞はＬＢ培地中で培養液２０ｄ中光学濃度（ｏ、Ｄ、）
５５０で０．５となるまで生育させた。この細胞を遠ノ
し分離器（Ｓｏｒｖａｌｌｓｓ−５４）ローター中５Ｕ
ＯＯｒｐｍで６分間遠心分離してベレット状となし、こ
れｋ　５１Ｊ　ｍＭ　Ｇ１１ＬＯｊ２１０ゴ中に再懸濁
させそして氷上１時間培養した。次にガイ！１胞を再び
はレット状となしそして５０　ｍＭ　０ａＯ４２２ｍｌ
Ｖ中に再’ａ　ＩＢさせた。次にコンピテントな細Ｍ８
！、全氷上さらに３０分間培養した。

これらは直接形質転換に使用されるか、または０ａＯ６
２ｉ＠液液中夜保存しそ１−て２４時ｒｉ−ｉ］　後に
使用した。前記した連結混合物１０μｔ？コンビテン）
　７ｋ　１（ＩＬＩｔｌ　２００μを中に添加し、そし
てこの混合物を６７℃で５分１’、ｌＪ暗培養た。ホ１
１１胞ＤＮＡ混合り勿Ｖ（ＬＢ培Ｊ也（０，８ｍｌ　）
　ｆ加え、これを次に３７℃で１１時間培養した。その
一部分（１００μｔ）をアンピシリン２５μｇ、／ｍｔ
を含有するＬＪ３プレート上に塗布した。プラスｉ１−
″ＤＮＡ　ｔｒｉ　ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏ　１７
氏のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｏｓ、　第７巻第
１５１６〜１５２６頁（１９７９年）記載の方法によジ
調鯛した。トリプトフアンプロモーターオはレータ−お
よびＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列を含有するプラ
スミド’ｉ　ｐＫ（）Ｐと称する。

プラスミドＤＮＡを伸率的方法（Ｃ！ｌｅｗｅｌｌ）に
よシ精製しそして４４００　ｂｐ〜４９５　Ｃｌ　ｂｐ
の範囲の寸法であった。１個のＨｐａ　Ｉ制限部位」？
よび１００ｂｐま７’（はそれ以上の挿入を有するプラ
スミドを制限酵素分析にかけてトリプトファンプロモー
ター断片の方向〉よびｐＢＲ３２２円の独特の制限部位
に関するその位置について判定した。制限部位、制限部
位間の距１”１および断片の方向は制限酵素消化物のア
ガロースお、にびポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定された。ベクター　ｐＫＧＰ　４３．４４．４５
およびｐＫｃ＋Ｐ　６６が以グの研究用に選択された。

発現ベクターｐＫＧＰ　４３はβ−ラクタマーゼ遺伝子
がその制御１ｃあるような方向をしたトリプトファンＰ
、Ｏ，−Ｓ、Ｄ、断片を有する。これは第３図の制限地
図から推論された。β−ラクタマー七の発現を分析する
ことによクシ６現ベクターの効力が示された。第ｉ　４
に目の実ｊ険においては３植のクローンであるｐ］（Ｇ
Ｐ　４３．４４および４５（ｐＫＧＰ　４４および４５
はｐＫＧＰ　４３と同じ構造物の独立した単離物である
）をＬＢ培地中糾胞約５Ｘ１０８個／−となるまで振盪
しながら生育させた。β−インドールアクリル龍を最終
濃度２０μｇ、／ｍｔとなるまで添加し、そしてＡ４１
１胞全６７℃で２時間振盪した。対照培養′吻は同じ条
件下にβ−工ＡＡの非存在ドに生育させた。培養ｑＩ／
）ｉゴを遠心分離し、ぞして刺ｊ胞奮カザミノ１該０．
５％およびアンピシリン２５μｇ／ｍｌが重加されたＭ
９培地中にＭＭＪ濁した。５０μＬ！１３５ｓメチオニ
ン全培養物に加えそして細胞１ｃ　３０分１ｉＪＪ像識
づけ全した。標識つけしたのち、細胞をベレット状とな
しそしてグリセリンＺ５％およびドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）　１％を含有するｐＨ６，８の１００ｍＭ
）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）５
０μを中に再懸濁させた。

このａｔ胞懸濁液を６分間沸騰さゼ−１はレット状とな
し、そして試料全１０％分離用、３係試料添加用ポリア
クリルアミドゲルに負荷しそして一２５ｍａの定電流で
電気泳動した。クマシーブリリアントブルー染色によれ
ば、β−工ＡＡの非存在下に生育した同じクローンの蛋
白質プロフィルと比較してβ−工ＡＡと培養した培養物
中には約２９．０００ダルトンの軛四倉移動する１個の
バンドが過剰生産されていることが明白で必°りだ。最
高の過剰生産レベルはクローンｐＫＧＰ　４４で生じた
。このゲルを乾燥しそして放射能写真ヶとった。β−Ｉ
ＡＡで誘導されなかったｐＫＧＰ４４のｆ＠養物におい
ては標識づけパターンはｐＢＲ３２２と同様であった。

誘導されたＪ＠養物においては２９．０００ダルトンの
蛋白質バンドにおいて不釣合いな量の標識づけが起った
ことが明白であった。β−ラクタマーゼ酵素検定（１誘
導の前および・陵に遂行された。β−ラクタマーゼの酵
素活性は２９．０００ダルトンの蛋白質の誘導と直接半
行しでいた。これらの結果は調製物中に含有されるトリ
プトファンｐ、ｏ、が大腸菌中において蛋白質の過剰生
産を指示できるという面接の証拠である。

続く笑験ｔまβ−ラクタマーセを過剰生産するための最
良のありうる条件ケ決定するためにプラスミドｐＫ（Ｊ
Ｐ　４３．４４および４５を言上する大腸菌に対して実
施された。ｐＫＧＰ　４５を含有する細ｂ１を０．５％
のカザミノ酸および２５μｇ／ｍｌのアンピッリンを才
有するＭ　９中にて一夜生付させた。ｉ４ｄ　Ｗ　ｘβ
−工ＡΔのイ１．在ドｔこ４１１，７間誘導した。誘導
された培養物の蛋白分析では２９．０００ダルトンで移
動する王なるバンドが示きｔした。

このバンドはｐＢＲ３２２対照中には存在しなかった。

濃度計の記録では新蛋白台成り８０％以上がβ−ラクタ
マーゼ（推定前駆物賀訃↓び成熟蛋白質）であることが
示された。誘導された細胞からの蛋白質のクマシーブル
−染色では総細胞蛋白質の２５％以上がβ−ラクタマー
ゼであることが示された。ｐＫＧＰ　４５のＤＩＩＡ配
列分析ではＰ、Ｏ６配列が予測された出版されたｔｒｐ
　Ｐ、Ｏ１配列と一致することが示された。？Ｊ４４　
Ａ図および５ｉｅｂｅｎｌｉｅｔ氏他のＣｅ１ｌ　ｄ”
ｒ　２０巻第２６９〜２８１頁（１９８０年）’ｉｆ照
されたい。

実施例　２ プラスミド精製、制限酵素消化、連＾ハ形質転換および
スクリーニングは実施例１記幀の操作金相いて実施され
た。

プラスミドｐＬＧ　４００　ｋ　Ｐ８°ｔｌおよびＨｌ
ｎｄｌｆｌで消化した。プラスミドｐＫＧＰ　３６　ｋ
　ｐｓｔ；　ＩおよびＨｌｎｄＪＩＩで消化しそしてプ
ロモーター−オはレータ−全含有する断片を精製した。

次にｐＫＧＰ　３６断片ｋ　ｐＬσ４００消化生成物に
連結させそして大腸菌に一１２株、ＬＧ９９をこの連結
されたＤＮＡ　’ｉ用いて形質転換した。選択された形
質転換体からのＤＮＡ　ｆ　ＡｆＪ記引用したＢｉｒｎ
ｂｏｉｍ　ｂよびＤｏｌｙ氏の方法によシ調製し、そし
てＰＦ３ｔ　Ｊ／Ｈ１ｎｄｌ■を用いる制限消化に刀＼
けた。消化物を０．８％アガロースゲル十′を電気泳動
により分Ｉ帷しそして正しく融合したプラスミドｋ＜イ
認し／ζ。これらの１つであるｐＡＰ１６に以ｆ麦の研
究用に選択した。分析では予測どおり１（ｐａ　Ｉ／Ｈ
１ｎｄｌｌｌ切断点は３９　ｂｐ離れておりそしてＨｐ
ａ　］／ＢａｍＨ］切断点（ｒｉ　４５　ｂｐ　離れて
いることが確認されｆｃ、第５図全参照されたい。

実施例　３ ｐＡＰＰＩＦ９の調製 インターフェロンｃＤＮＡｉ含有するプラスミドである
プラスミド３８４７を標準方法により調製し／辷。ｃＤ
ＮＡはＷｉｃｋｅｎ日氏他にょ９　Ｊ、Ｊ３１ｏ１．Ｏ
ｈｅｍ。

第２５３巻第２４８３〜２４９５頁（１９７８年）％に
第４７１留目戦の一般的方法にょｐ合成された。ｃＤＮ
Ａ配列は第１１図に示される。クローニングはＶｉｌｉ
ａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ氏他によ、ｊｌ）　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　第７５巻第３７２７〜３７
３１貞（１９７８年）、特に第６７２７および６７２８
貞記載の標準的方法にょ夛実施された。プラスミド３８
４７をｎ１ｎｃｌｌおよびＢｇｔ　ｌで消化しそして工
ＦトβｃＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル上の電気
泳動によシ分離したのち精製した。Ｈ１ｎＣＩｌ／Ｂｇ
ｔＩｆ断片（第６図Ａ）をＨａｅ　ＩＩＩによりさらに
消化するとこれは成熟したコーディング配列（絹６図Ｂ
〕の第４７１留目の塩基で１Ｆ−Ｎ−ｐｃＤＮＡ全ＤＮ
Ａる。

′Ｈ１ｎ　Ｃｆｉ、／Ｈａｇｍ１ＦＮ−βｃＤＮＡ断片
をポリアクリルアミドゲル上の電気泳動にょシ分離した
のち精製した。Ｈ１ｎｄｌｌｌリンカ−（ＯＡＡＧＯＴ
ＴＧ）ｒ　Ｈ１ｎｃｌｌ／Ｈａｅｉｌ工ＦＮ−βｃＤＮ
Ａ断片の両端に連結した。

連結生成物（第６図Ｃ）全Ｈｉｎｄｌｌ［で消化しそし
て今やそれぞれの末端ＫｇｊｎｄｌｌＩ　ｆｌｔＵ　Ｉ
興ｇ＋＋址全官有する所望の工ＦＮ−βｃＤＮＡ断片を
電気泳動により分離したのちポリアクリルアミドゲルか
ら＃製した。プラスミドｐＡＰ　１６　（［−）１１ｎ
ｄ　ＩＩＩで消化した。

■Ｐ″Ｎ−βｃＤＮＡ断片紮ベクター中に連結しそして
連ｉ６　したＤＮＡ−ｔ？大１）％　ｍ　Ｉｃ　−１２
株、Ｌ（Ｊ−９０ｋ形質転換した。プラスミドＤＮＡは
ｐＡＰ　１６の６１．５製について前記された選択され
た形質転換体から調製し、そしてこれ４ｐｅｔｌで消化
した。このベクターは１個所のＰ６シ１切断点しか有せ
ずそしてＩＦＮ−βｃＤＮＡは１個のＰｓｔ　１ｗ断点
をぼ府するので、２個のＰｓｔ　ｌ切断点（ｉ−有する
プラスミドを選択してさらに分析した。

制限地図作成では断片が両方のめりうる方向に挿入され
たことが示された。１方の組換えプラスミドであるｐＡ
ＰＦ工Ｆ９はｐＡＰ１６のＰ、Ｏ，ｉ断片に対し適正な
方向に融合した工ＦＮ−βＣＤＮＡの開始コドンを含有
した。ＩＦＮ−βＣＤＪＪＡはｍａｃｘｚ遺伝子の枠内
に融合されて工ＦＮ−ββ−ガラクトソダーゼ融合遺伝
子を構成する。反対方向はｐＡＰＦ１Ｆ８と呼ばれた。

さらに分析するとｐＡＰＦＩＦ９はβ−ガラクトシダー
ゼ活性を生ずるがｐＡＰＦ’ｌＦ８は生じないことが示
さ〕′した。またｐＡＰＦ’ｌ：ｊ、ｉ’９は予想され
る融合蛋白質をコーディングしていたがｐＡＰＦ工Ｆ８
＋１ましていなかった。

実施例　４ プラスミドｐＡＰＦＩＦ９およびｐＡＰ　１６が工ＦＮ
−β紮大腸菌中においてクローニングし、編集しそして
発現させるのに使用さｉ７．た。活性な工ＦＮ−β金大
腸菌中で発現させるために、１：ＦＮ−βシグナル配列
をコーディングするＤＮＡ配列金２１ｉｉ＋類の方法で
除去した。ＧｏｅｃＬｄｅ］氏他のＮｕｃｔｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄＲｅｅ−’ＭＡ　８巻ｍ４０５７〜４０７４．Ｒ
（１９８０年）記載の方法を用いる修飾にょシ、　ＩＦ
Ｎ−βｃ１）ＮＡｖ変性されたＨ１ｎｃｎ／ＢｇｌＨ断
片の一方の鎖に船足のオリゴヌクレオチドＡＴＧＡＧＣ
ＴＡＯＡＡＣ！　ｆ交雑させた。

ＤＮＡポリメラーゼのＫ］、ｔ３　ｎ　ＯＷ断片のポリ
メライジング活性を利用してプライマーとしてオリゴヌ
クレオチドを用いＩＦＮ−βＰθｔ１４カｉ＃ｒ　点ｋ
　）ｌｕっで新しい鎖が構成された。続いて別の展応に
おいて、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性がオリゴヌ
クレオチドおよび１ＦＮ−βｃＬ）ＮＡにょシ形成され
た二本鎖で停止する一本偵のシグナル領域を崩壊させた
。Ｇｏｅｄｄａ１氏他の方法のこの修飾はクローニング
のためのｍ集された断片を充分な収率で得るために必要
である。反応生成物の消化およびポリアクリルアミドゲ
ル上分離した後、子側される１４［１ｂｐの鈍い切れ端
のＰｓｔ　Ｉバンドを精製しそして以下のようにして発
現ベクター中に＋Ｆ１１み込んだ。

プラスミドｐＡＰ１６　ｋ初めにＨｌｎｄｌｌｌで消化
しそしてＨｉｎｄ朋切断煮切断点して鈍い切れ端となし
た。この反応に＠きＰ８ｔ　ｌで消化した。β−ラクタ
マーセａｔ子のアミノ末端およＵ’　Ｉ）ＫＧＰ　３６
Ｐ、Ｏ，−８，Ｄ、断片全含有する鈍い切れ端のＰｓｔ
　１断片をポリアクリルアミドダルから精製した。

プラスミドｐＡＰＦＩＦ９　ｆ　Ｐｓｔ　ｌで消化しそ
してβ−ラクタマーセ遺伝子のカルボキシル末端卦よび
ａａｃ工２遺伝子に融合した工ＦＮ−β０ＤＮＡのカル
ボキシル末端を含有するＰＢｔ　Ｉ断片金梢製した。

ｐＡＰ１６　Ｐθｔｌ鈍い切れ端の断片、ｐＡＰＦＩＦ
９　Ｐｓｔｌ断片および編集されたＰｓ’ｔｌ−鈍い切
れ端の■ＦＮ−β断片全第７図に図示される王者連結に
ょシ組み立て／ｃ０ 大腸菌に一１２ａＬＧ９Ｑ全連結された分子音用いて形
須転換した。適正に組み立てられた分子ｆｆ、　ｐＡＰ
Ｆ工Ｆ９がら得られるＩＦＮ−β／ａａｃ工Ｚ融合物か
らの酊与ゆえＫ　Ｍ９　ＸｇａＡプレー１・上を色に現
われた。虐ｉＥを構造ばｔｌｊ（Ｊ訳地図作成およびＤ
ＮＡ配列分析によシ確認された。２棟類のクローンであ
るｐＫ、ＧＰ　１２−２およびｐＫＧＰ１３−１９はこ
の方法で同定された。ｐＡＰＦＩＦ９がらのＰｓｔ　Ｊ
断片はＩＦＮ−β編集ｃ　Ｄ　ＮＡがｐＫＧＰ　５６プ
ｒｆｆモーターに？＋正に融合するグこめの所望の選択
？与えた。すべての青色コロニーリ−１）ＡＰＩ６プラ
スミドのイリ用全証明する適正に構成された分子を言上
した。

実施例　５ ｐＡＰＦＩＦ９および９ａｔ３１エキンヌクレアーゼを
用い実施例４記載の方法の代替編集法が用いられた。シ
ラスミドｐＡＰＦＩＦ９　ｆ　Ｈｐａ　Ｉ制限酵素で消
化した。それにより５種類のＷ「片が得られ、その１種
は融合遺伝子の工ＦＮ−β部分１ｒ：＠’１ｇしていた
。これらの断片を標準的方法によ、！７Ｂａｔ３ｉエキ
ソヌクレアーゼでランダムに崩壊させそしてＢａｍＨＩ
で消化した。この操作にＪｕｌ）工ＦＮ−β遺云子の５
′末端でランダムに崩壊されそして独特のＢａｍＨｆ　
ｖＪ断点を木端とする一遅の断片が得られた。５′−末
端が欠失したＩＦＮ−β〃Ｔ片のみが翻訳を開始する／
こめの枠内ＡＴＧを有しそしてＥａｍＦ［切断点を末端
としており、これが枠Ｐｅの工ＦＮ−β断片ｔ：ｐＡＰ
１６のβ−ガラクトシダーゼ遺伝す七融合させよう。ベ
クターｐＡＰ　１６をＨｉｎｄｌｌｌで消化し、そして
ジグザグした末端？デオキシヌクレオチド三燐ばの存在
ドにＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ助片で充填して
純い切れ端となした。次にこの鈍い切れ端をＭする分子
ｆ　ＢａｍＨＩで消化した。ランダムに崩壊された工Ｆ
Ｎ−β断片を修飾されたｐＡＰ１６ベクター中に連結さ
せ、そしてそのＤＮＡを第８図に概説されるようＶこ大
腸菌に一１２株ＬＧ　９０および大腸菌ＨＢＩＯＩの形
質転換に使用した。

得られるクローン（］−ｐＫＧＰ　１２−２およびｐＫ
ＧＰ１３−１９１／ζついてｄ己１火されたようにスク
リーニングした。クローンｐＫＧＰ　９−２５　Ｂ予測
されるようにプレＩＦＮ−β配列が欠失しそしてｐＡＰ
１６のプロモーター−オ・ぐレータ−げ１片に融合した
成熟しノζ活性蛋白跡勿１別始り−るＡＴＧを有するプ
ラスミド伊言イ１していた。全ての構ｔＪｙ、はＤＮＡ
配列分析により確認された。

実廁例　６ ｉ９Ｒおよび９−２５Ｒｌ／）調製 ＩＦＮ−β発掬、プラスミドを得るためＫはａａ　ｃ　
ｌ　Ｚ遺伝子に融合されたプラスミドｐＫＧＰ　１３１
９．１２−２および９−２５からの編集されたＩＦＮ−
β遺伝子のカルボキシル末端金工ＦＮ−β遺伝子の機能
性カルボキシル末端配列と置換せねばならない。標記し
た３袖の融合プラスミドすべてを同一の方法で工ＦＮ−
β発現プラスミドに変換した。ｐＫＧＰ　１３−１９の
変換のみが以トに記載されよう。

ｐＢＲ３２２からのＰｓｔＪ／ＥａｍＨ工断片を精製し
た。

この断片はβ−ラクタマーセのカルボキシル末端および
ｐＢＲ３２２の複製開始点全含有していた。

β−ラクタマーゼの７ミノ末端および工ＦＮ−βの編集
されたアミン末端に融合したｐＫＧＰ　’３６のＰ、　
０．（Ｈ含有するｐＫＧＰ１３−１９からのＰｓｔｌＫ
ｆｒ片を精製した。終シに、Ｐｓｔｌ／Ｅｇｔ…カルポ
ギシル末端ＩＦＮ−β断片金梢裂した＝これら６槽の断
片全三者連結により組み立て（第９図参照）、そしてそ
のＤＮＡ全大腸劇ＭＭ２９４の形質転換に使用した。プ
ラスミドＤＮＡ　ｆ　？Ｊａ製しそしでＰｅｔ　１で消
化し続いてアガロースゲル上分析した。約１０００個の
塩基対で分離された２個のＰθｔｌ切断点を有するプラ
スミド？！−＠ｌｔｑするクローンを整理配列させそし
て、ＴＦＮ−β活性について検定し７た。ＤＮＡの整理
配列は選択され′ｆＣ，断片をＭ１５ファージＤＮＡ中
にクローニングすることによシ実施されそしてＤＮＡ配
列ｆ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

により供給きれる試桑を用いるジデオキシ法により決定
した。

工ＦＮ−β活性について検定するためには％Ｘ１１１菌
を光学濃度的１となるまで生育させそして２０μｇ／ｍ
ｌのβ−■ＡＡの存在下に約２時ｆ’ＪＪ振導すること
によ、！ｌｌｌ誘導した。細）＠（＋−１００倍に濃縮
しそして超音波処理により溶解させた。細胞ぐずをベレ
ット状となしそして上澄み液ｋ　Ｋｎｉｇｈｔ氏他のＪ
、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、　第２巻第４２１−
４２９頁（１９８２年）記載の卸１胞変性効果抑１０１
」検定を用い抗ウィルス活性について検定した。プラス
ミドｐＫＧＰ１２−２Ｒｓ　１３−１９Ｒおよび９−２
５Ｒｋ：Ｌ予測爆れたＤＮＡ配列（第１０図参照）ｒ有
しそして抗ウィルス活性を発現した。抗ウィルス活性は
ｐＨ２に抵抗性であジ、５６ｃでの加熱に対し感受性で
ありそし℃工Ｆ’Ｎ−βに！特異的な抗血清により中和
された。従って、この実施例は記載されたクローニング
ぶ・よび発現ベクターを用いる大腸菌中における工ＦＮ
−βのクローニング卦よび発現を論証している。

実施例　７ プラスミドｐＫＧＰ　１２−２Ｒｓ　９−２５Ｒおよび
１６−ｉ９Ｒ上の工ＦＮ−β遺伝子の転４はプラスミド
ｐＫＧＰ５６からのノ（１（能なハイブリッドプロモー
ターにより指示される。ＩＦＮ−β遺伝子の効果的な転
写を行うために、トリットファンプロモーターを１］二
稈クローニング実験で再イ１４成した。プラスミドｐＫ
ＧＰ　４３は実施例１に記載されるように完全１ｔｒｐ
　Ｐ、、Ｏ，を含有する。制限エンドヌクレアーゼＨｐ
ａ、　ｌはｔｒｐ　ｂよびｐＫＧＰ　３６プロモーター
の一１０領域内全切断する。プラスミドｐＫＧＰ　４３
を初めに制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌｌｌを用い
て消化した。Ｈｌｎｄｌｌｌのジグザグの末端全実施例
４記載のようＶこして充填して２個の鈍い末端金石する
断片をイｉＪた。次にこのＬ［片をＨｐａ　ｌで消化し
、そしてｔｒｐプロモーターの一６５領域？含有するＨ
ｐａｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌ充填断片を単離した。プラスば
ドｐＫＧＰ　１３−１９Ｒｔ　Ｉ（ｐａ　Ｉで？白化し
た。ｔｒｐプロモーターの一３５領域盆含イ１するｐＫ
ＧＰ　４５からの”Ｉ）ａＪ／Ｈ１ｎｄｌｌｌ充填断片
ｋ　ｐＫＧＰ　１３−１９ＲのＨｐａ　ｌ切断点に連結
させ、そしてこのＤＮＡ　ｉ大腸菌ＨＪ３１０１の形質
転換に使用した。

選択されたクローンからミニ溶Ｍ物を調製しそして挿入
された断片の方向を判定した。正しい方向を有するクロ
ーンからのＤＮＡ’　ｉ整理配列した。配列分析では１
棟類のクローンｐＫＧＰ　１５−１９Ｒ−ｔｒｐ６が所
望の工ＦＮ−β遺伝子に融合した再構成されたｔｒｐプ
ロモーターを含泡することが確認された（第１０図参照
）。π（１１胞変性効果抑制検定はＫｎｉｇｈｔ氏他の
前出文献に記載された方法により　ｐＫＧＰ　１６−１
９Ｒおよびｐｉ’、ＯＰ　１５−１９Ｒ−ｔｒｐ６につ
いて実施された。プラスだドｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ培
養物は約５　Ｘ　１０４１ｔ／ｌの抗ウィルス活性を含
有していた。ｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ・しｒｐ　６の培
養物は約１０７μ／ｌの抗ウィルス活性を有した。この
ことハ遺伝子のクローニングおよびう６現実験にとって
のｐＫＧＰ　３６プロモーターの４ｊ用性を明らかに証
明している。発現された場合に培養物において組換えプ
ラスミドの不安定性をひき起す外米遺伝子配列のクロー
ニングおよび操作にとってこのシステムが廟用であるこ
との証明となる筈である。

実施例　８ 工Ｌ−２ＣＤＮＡを＠有するプラスミドであるｐｔＨ４
０會実施例６のインターフェロンｃＤＮＡ言ｐプラスミ
ドであるプラスミド５８４７について記載された標準的
方法により調製した。

大腸菌中に赴いて活性な成熟工Ｌ−２を、ロルベルで発
現させるためには、工Ｌ　−２ｃＤＮＡ　ｉｄ編集され
てシグナル配列のための５’ＤＮＡコーデイング領域が
除去されそして編集された１、Ｌ−２ａＤＮＡが発現ベ
クター中に挿入されねばならない。プラスミドｐｔＨ４
０全Ｐｓｔｌで消化しそしてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物を精
製した。Ｈｇ１Ａ１制限部位がシグナル配列の最後のア
ミノ酸（Ｓｅｒ）および成熟した工Ｌ−２の最初のアミ
ノ酸（Ａｔａ　）との間の接合点に残存する。工Ｌ−２
ｃＤＮＡ全詮有するＰｓｔ　ｌ断片をＨｇ１Ａ１で解裂
させた。Ｈｇ１Ａ１１”ｉ　４　ｂｐの６′張出しを生
ずるので、４個の塩基を除去しそして鈍い末端を得るた
めにＤＮＡポリメラー七〇に１ｅｎＯＷ断片が使用され
た。この操作により　Ａｌｅ、コドンが除去されそして
成熟工Ｌ−２の第２番目のアミノ酸（Ｐｒｏ）のコドン
であるｃａ’ｒで始葦る鈍い末端金銭した。

開始コドン（ＡＴＧ）ならひＫ　Ａｔａについてのコド
ンを供帽するために、特殊なアダプター分子（ＡＪが案
出されそして合成された。断片（ＡＪ　ＴＡＴＴＯ（）
ＡＡＴＡＯｃＧＡは幾つかの価値ある特徴全Ｍする。こ
れはＡＵＧ開始コドンのみならず成熟した工Ｌ−２の第
１番目のコドンｆ！：与える。Ｃ１ｔｈ　ｌ切断点およ
びＨｉｎａ１１１切断点を再構成するＣＧ張出しが以ト
のようにベクター中への挿入ケ許芥した。このアダプタ
ー分子を前記の鈍い末端／　Ｐｓｔｌ　ｃＤＮＡ断片に
連結させ、そして連、萌された１）ＮＡをＨｉ　ｎ　ａ
　ＩＩＩ訃よびＳｔｕ　１で消化した。Ｈ１ｎｄｌｌｌ
／５ｔｕｌ　４５０　ｂｐ　ｌｆＩ片全ポリアクリルア
ミドゲル上精製し、そして精製された断片をｐ［３Ｒ３
２２の２６２５　ｂｐ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ／ＰＶＪ断片に
連結させた。５ｔｕｌ訃よびＰｖｕｌでの制限が鈍い末
端を与えるのでこのＩ−勾製が可能であった。次にＤＮ
Ａ紮犬腸大腸Ｍ２９４の形に転換に使用した。プラスε
ＦＤＮＡヲ迫択され／Ｃクローンから精製しそ［−てＸ
ｂａ　］での制限分析にかけた（１個のＸｂａ　ｌ切断
点が工Ｌ−２ｃＤＮＡ配列内に残存する）。１個のベク
ターｐＢＲＢＩＬ−２が予測された位置にＸｂａ　１１
）Ｊ断点４言イーａ−Ｌぞしてさらに構成させるために
選択さｉした。倚られるベクク−ｐＢＲＥ工Ｌ−２は几
−２遺伝子が上動なプロモーターを欠くので安定性が増
大した。前記の真裏は第１４図に概略して示される。

ベクターｐＫＧＰ　５６　（実施例１）の紡導体ｐＫＧ
Ｐ３６・ｔｒｐ　ｕ　ＩＬ−２遺伝子のｔｒｐプロモー
ターへの融合を促進するために、以下のようにして調製
された。ｐＫＧＰ　３６　ｋ　Ｈｐａｌ／Ｐｓｔｌで消
化しそしてｔθｔＲ遺伝子、複製開始点およびβ−ラク
タマーゼ遺伝子のカルボキシル末端全含肩する大きい断
片（３６４０ｂｐ）ｋ精製した。ベクターｐＫＧＰ　１
３−１９Ｒ−ｔｒｐ　６　（実施例７　）　ｋ　Ｈｐａ
ｌ／Ｐｓｔｌで消化しそしてβ−ラクタマーゼ遺伝子の
アミン末端を含有する／ＪＳさな断片（１５３１］ｂｐ
）を精製した。これら２　ｍの断片全連結させそしてそ
のＤＮＡを大ＩＩ菌ＭＭ　２９４の形質転換に使用した
。

１個のＨｐａ　Ｉ　９Ｊ　１９ｒ点全有するプラスミド
金言有するクローンと選択してさらに研究に用いた。

プラスミドＤＮＡを１つのクローンから精製しそしてｔ
ｒｐプロモーターの領域中のＤＮＡ　’ｉ整理配列して
完全なｔｒｐプロモーターの融合を確認した。このベク
ターはｐＫＧＰ　５６　ｔｒｐと呼ばれた５１’６０ｂ
ｐ（約６．０Ｘ１０６ダルトン）。

ｔｒｐプロモーター全以下のようにしてプラスミドｐＫ
ＧＰ３６・ｔｒｐおよびｐＢＲＥＪＬ−２を用いて編集
された工Ｌ−２遺伝子に融合させた。ベクターｐＢＲＩ
ｎＩＬ−２ｉ　Ｈ１ｒｏｌｌｌＬ／Ｐｓｔｌで消化しそ
して工ＩＪ−２遺伝子を含有する大きい（２０００ｂ′
ｐ）ＩｌｉＱ片を精製した。プラスミドｐＫＧＰ３６・
ｔｒｐ　ｆ　）（ｉｎｄｌｌｌ／、Ｐｓｔｌで消化しそ
してｔｒｐプロモーターを含有する小さな断片（１５３
０ｂｐ）′ｔ−精製した。２柚類の断片を連結させそし
てそのＤＮＡを大腸菌ＭＭ　２９４の形質転換に使用し
た。１個のＨｐａ　ｌおよびＸｂａ　Ｉ　ｆｆＴＩＩ限
部位會Ｍする予測された寸法のプラスミドを含涌するク
ローフッ選択してさらに分析した。１個のクローンのＤ
ＮＡ配列分析によシｔｒｐプロモーターと工Ｌ−２遺伝
子の予ｄ１１］された融合が起っていることが確認され
た。ｐＴｒｐＥｉｘＬ＝２、第１５図径照。ＩＩ、−２
発現ベクターを有するものおよび有しない大腸菌からの
総蛋白質をポリアクリルアミドゲル′電気泳動により分
離した。１５にダルトンの明白な分子′Ｍを以って移動
する新規な蛋白質が発現ベクターを含有する＃Ｉ胞中に
存在したがしかし対照細胞中には存在しなかった。この
蛋白質は非グリコジル化工Ｌ−２について予測された通
りＶＣ移動した。ｐＴｒｐ［ＩＬ−２を含有する細胞の
溶解物は天然のＩＬ−２に対する抗体を用いる放射線免
疫検定において陽性でありそして対照細胞の溶解物は陰
性であった。

工Ｌ−２活性はクローニングされたネズミの細胞毒性Ｔ
−リン／ぞ球系統（ＯＴＬＬ−２、サブクローン１５Ｈ
）の工Ｌ−２濃度依存性増殖刺激（５Ｈ−チミジンとシ
込みによう測定）Ｋよ、Ｄ　３＋１１定された。

ｐＴｒｐＫ工Ｌ−２を含有する細胞の抽出物は培養物１
ば当シロ０ＵＯ〜５０００の相対関連単位を生じたが一
方ｐＫＧＰ３６・ｔｒｐ　ｆ含有する対照抽出物は例の
活性も生じなかった。天然のＩＬ−２に対する抗体は組
換え抽出物中の活性を中和した。このことは発現ベクタ
ー中に挿入されたより一２遺伝子がヒトの工Ｌ−２の性
寅ｋ　１４　ｊる高レベルの絹換え蛋白質の合りにを指
示したことを証明している。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターｐＡＯＹｃ！　１７７、ツタよびトリ
プトファンオペロンのＯ遺伝子をトリプトファンリーダ
ーリボンーム帖合部位に融合させるトリプトファン欠失
ｔｒｐ　乙Ｄ　１０２配列金包含する従来法のプラスミ
ドｐＬＤ　１０２　’ｌ：示す。 第２図は従来法のプラスばドｐＢＲ３２２會示−ｒ０第
３図はＰ、０．方向がβ−２クタマーセ遺伝子の方向で
あるβ−ラクタマーゼ遺伝子全包含する新規なプラスミ
ドｐＫＧＰ　４３の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す
。 ｉＪＡ図はＰ、０．がテトラサイクリン抵抗性（ｔθｔ
Ｒ）遺伝子の方向金向いているβ−ラクタマーゼ遺伝子
ヲ旭含する新規なプラスミドｐＫＧＰ６６の制限エンド
ヌクレアーゼ地図を示す。 第４Ｂメ１はｐＫＧＰ　３６からの新規なＰ、０．断片
対ｔｒｐ　Ｐ、ＯＪｆ＋片の比較ｆｃ　示Ｔ。 第５図はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合したｐＫＧ
Ｐ　３６からのＰ、０．をｎ＠する新規なプラスミドｐ
ＡＰ　ｌ　（、の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。 第６図は新規なプラスミドｐＡＰＦ工Ｆ９およびその消
化配合表ケ示す。 第７図はｌ「親なプラスミドｐＫＧＰ　１２−２　ｊ？
よびｐＫＧＰ　１５−１９の制限エンドヌンレアーゼ地
図、およびｐＡＰ１６　Ｐｓｔ　Ｉ鈍い切れ端の断片、
ｐＡＰＦ工Ｆ９Ｐｓｔ　ｌ断片および編集されたＰｅｔ
　Ｉ鈍い切れ端の１ＦＮ−β断片の三者間連結を用いる
それらの調製を示す。 第８図はｐＡＰＦＩＦ９ふ−よびＢａＡ３１エキソヌク
レアーゼを用いそしてｐＡＰ　１６中に連結するプラス
ミドｐＫＧＰ　９−２５調製のための代替編集法を示す
。 第９図ｕ　１）ＢＲ３２２からのＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ
　断片−ｐＫＧＰ１３−１９からのＰｅｔ　１断片およ
びＰ日ｔｌ／Ｅｇｔ…カルボキシル末端ｉＦｌ＋−β断
片を王者間？：連結させる新規プラスミドＩ）ＫＧＰｌ
　６−１９Ｈの調製會乃く丁。 第１０図はヤ「規プラスミドｐＫｕＰ　１３−１９Ｒ・
ｔｒｐ６を形成させるための消化、連結および形賀転換
工程を示す。 第１１図はプラスミドｐ　５８４７からの工ＦＮ−β遺
伝士のｃＤＮＡ配列を示す。 第１２図は本発明のプラスミドｐＫＧＰ　１２−２．Ｒ
−ｐＫＧＰ　１３−１９ＲおよびｐＫＧＰ　９−２５Ｒ
を特徴づけるＰ、Ｏ，−Ｓ、Ｄ、断片を包含１′る転写
ユニットのＤＮＡ配列を示す。 第１３図はｐＬＤ　１０２からのＨｐａ１切断点を含有
する訃よそ４００個の塩基対を有する断片を示す。 第１４図はｐＩＨ４０からの編集された工Ｌ−２遺伝子
断片全ｐＢＲ３２２の制限によシ得られる大きい方のｋ
ｌ　ｉｎ　ｄＩＩＬ’Ｐｖ　ｕＩＩ断片に連結すること
によるｐＢＲＥＩＬ　−２ベクターの調製を示す。 第１５図はｐＫＧＰ３６　・ｔｒｐおよびｐＴｒｐＨ：
工Ｌ−２ｋ示しおよび１；１ＫＧＰ３６　・ｔｒｐから
のＰｅｔｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌ　ｔｒｐｐ、ｏ、Ｕｒ片金
工Ｌ−２遺伝士およびアンピシリン遺伝子の一部分を包
含するｐＢＲＥＩＬ　−２からの断片に連結させること
による後者ｐＴｒｐｇＩＬ−２の調製を示す。 ＦＩＧ、１ ＰＯ妄現ベクタ一方向 ＦＩＧ、６ ＩＦＮ−βｃＤＮＡ／ＨｉｎｃＴｒ　ＡＴＧＡＴＧＢｇ
ｌＩＩ　ＡＨｉｎｄｒＩＩリカー２５力ロ／１ｌｉｎｄ
＋４１　”Ｇ　ＡＴＧ　１（ｉｎｄＨＩ　Ｃ＋ ＦＩ６．９ ＮＩＰ２ＮＨ２ ｐＫＧＰ１３−１９　ＰｓｔＴ　ＰｓｔＩＡＭＰ　Ｉ　
ＦＮ　−８ ＋ ０ＯＨ ｐ３８４７　Ｐｓｔｌ　Ｂｇｌｌｌ ＴＦＮ−１＋ ＋ 理祐、１φ買転換 ｐ１８４０　Ｆ　／　Ｇ、／４ ↓ ＰｓｔＩ　入５ｎｓｅｒＡｌａＰｒｏＴｈｒ　５ｔｕｆ
ｆ　Ｐｓｔｆｆ３’＋５’ＥＸＯ↓ ＭｅｔＡｌａ　ＰｒｏＴｈｒ　５ｔｕｆｆ　Ｐｓｔｌオ
リコヌクレ＾ヂト　アタフ９ター ＦＩＧ、１５ 第１頁の続き ■ＩｎＪＣ１，４識別記号　庁内整理番辷優先権主張　
０１９８４７月５日［相］米国（ＵＳ）０６２８０発　
明　者　ステイーブン・Ｏｔ＜−アメリカ合衆Ｉト・ペ
テウエイ・シュ　デンホール・フニア １プラウエア州（１９７０７）ホッケシン・メンインデ
ィングビルドライブ４２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）約６００個の塩基対からなりそして一１０領域およ
   びｔｒｐｉロモーターーオズレーターＳｈｉｎｅ−Ｄａ
   １ｇａｒｎｏ断片の特性を示すＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａ
   ｒｎｏ配列を有するプロモーター−オはレータ−８ｈｉ
   ｎｅ　−ＤａｌｇａｒｎＯ０１ａｉ含有断片であって、 （１）断片（５′→６′）の−６５領域におけるＴＧＣ
   ！ＯＧＡ ０ＧＧＯＴ なる６個の塩基対配列、および （ＩＩ）最初の８個の塩基対（５′→３′）の配列が０
   ＧＣＧＯＡＴＯ ＧＯＧＯＧＴＡＧ である前記断片の−６５と一１０領域の間の約１７個の
   塩基対の配列、 からなる改良を有する断片。 ２）前記特許請求の範囲第１項記載の断片を包含するプ
   ラスミド。 ３）　１（ｉ）β−ラクタマーゼをコーディングする遺
   伝子、または（ＩＩ）工ＦＮ−β（β−インターフェロ
   ン）およびβ−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子
   、の−力を付加的に包含する前記特許請求の範囲第２項
   記載のプラスミド。 ４）β−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子および
   テトラサイクリン抵抗性をコーディングする遺伝子を包
   含し、プロモーター−オはレータ−がｔｅｔＲ遺伝子の
   方向を向き、そのシラスミドの分子量が約３．０ｘ１０
   ６ダルトンでおり、そのプラスミドが下記の部分制限地
   図、すなわちＰｓｔｌ−１ｃｏＲＩ、７５０’ｂｐ；　
   ＫｃｏＲｌ−０１ａｌ、２３ｂｐ；　Ｃ！ｍａｌ−Ｈｐ
   ａｌ、５６５ｂｐ；　Ｃ１ａｌ−ｃｌａｌ、６ｏｏｂｐ
   ：Ｈｐａｌ−０１ａｌ、３５ｂｐ；　Ｈｐａｌ−Ｈｌｎ
   ｄｌ［，３９ｂｐ；　Ｈｌｎｄｌｌ−ＢａｍＨＩ、３４
   ５ｂｐ（ここでｂｐは塩基対をさす）を有する前記特許
   請求の範囲第３項記載のプラスミドｐＨＰ３６゜ ５）開始ＡＴＧコドンを欠くβ−ガラクトシダーゼ遺伝
   子を包含し、プロモーター−オはレータ−が前記遺伝子
   の方向を向き、そのプラスミドの分子量が約４．８Ｘ１
   ０’ダルトンであり、そのプラスミドが下記の制限地図
   、すなわちＰｓｔＪ−Ｈｌｎｄ［ｌ、１３００ｂｐ；　
   ０１ａｌ−０１ａｌ、６００ｂｐ：　Ｈｐａｌ−Ｈｌｎ
   ｄｌｌ［，３９ｂｐ：　Ｈｐａｌ−ＢａｍＨｌ、４５ｂ
   ｐを有する前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミド
   ｐＡＰ１６゜ ６）β−ガラクトシダーゼおよび工ＦＮニーβのアミノ
   末端をコーディングする融合遺伝子を包含し、工ＦＮ−
   βをコーディングする遺伝子がそのシグナル配列が除去
   されるように編集（ｅｄｉｔ　）されており、プロモー
   ター−オはレータ−がその編集された工ＦＮ−β遺伝子
   の方向を向き、そのプラスミドの分子量が約５．ｌＸ１
   ０’ダルトンであり、そのプラスミドが下記の制限地図
   、すなわちＰｅｔｌ−Ｈｐａｌ、１３２０ｂｐ；　Ｈｐ
   ａｌ−０１ａｌ、２７ｂｐ；　０１ａｉ−Ｐｓｔｌ、１
   ４５ｂｐ；　Ｐｅｔｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、２７０ｂｐ；
   Ｈｌｎｄｌｌ−ＢａｍＨｌ　、　６ｂｐを有するｐＫＧ
   Ｐ１２−２．ｐＫＧＰ１３−１９およびｐＫＧＰ９−２
   ５からなる群から選択される前記特許請求の範囲第２項
   記載のプラスミド。 ７）生物学的に活性な工ＦＮ−βをコーディングする遺
   伝子を包含し、プロモーター−オはレータ−がＩＦＮ−
   β遺伝子の方向を向き、そのプラスミドの分子量が約３
   ．（Ｘ１０’ダルトンであり、そのプラスミドが下記の
   制限地図、すなわちＰｓｔｌ−Ｈｐａｌ、１３３０ｂｐ
   ；　ＨｐＩＬＩ−０’ｌａｌ、２７ｂｐ：　０１ａｌ−
   Ｐｓｔｌ　、　１４５ｔｌｐを有するｐＫＧＰ１２−２
   Ｒ，ｐＫＧＰ１３−１９ＲおよびｐＫＧＰ９−２５Ｒか
   らなる群から選択される前記特許請求の範囲第２項記載
   のプラスミド。 ８）β−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子および
   テトラサイクリン抵抗性をコーディングする遺伝子を包
   含し、さらにβ−ラクタマーゼ遺伝子の方向を向いたト
   リゾトフアンプロモーター−オはレータ−Ｓ　ｈ　ｉ　
   ｎ　ｅ　−Ｉｈｌｇａｒｎ。 配列をも包含し、そのプラスミドの分子量が約２．８×
   １０６ダルトンであり、そのプラスミドが前記の部分制
   限地図、ずなわちＰｓｔｌ−Ｋｃｏ川。 ７５０ｂｐ；　ＦｉｃｏＲｌ−Ｈｐａｌ、１０１］ｂｐ
   ；　Ｉ（ｐａｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、３００ｂｐ：　Ｈｌ
   ｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ、ろ４５Ｊ）’ｆ有するプラス
   ミドｐＫＧＰ４３つ ９）生物学的に活性なＩＦＮ−βをコーティングする遺
   伝子を包含し、そのプラスミドが工ＦＮ−β遺伝子の方
   向を向いたトリシトファンプロモーター−オペレーター
   　Ｓ　ｈｉ　ｎ　ｅ−Ｄａ　１　ｇａ　ｒ　ｎ’ｏ配列
   を有し、そのプラスミドの分子量が約３．７Ｘ１０”ダ
   ルトンであり、そのプラスミドが以下の制限地図、すな
   わちＰｅｔｌ−Ｈｐａ１，１５３Ｑｂｐ；　Ｈｐａｌ−
   ０１ａｌ、２７ｂｐ；　Ｃ１ａｌ−Ｐｓｔｌ、１４５ｂ
   ｐを有するプラスミ　ド　ｐＫＧＰ１３１９Ｒｔｒｐ６
   　。 １０）前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミドによ
   り形質転換されたプラスミド。 １１）前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミドによ
   り形質転換された大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｌ）細菌っ１２Ｘ
   ｌ）　ｐＬＤ　１０２型のプラスミドをＨｐａｌおよび
   Ｂａ１Ｎを用いて制限し、 （ｉｉ）　ｔｒｐ−プロモーター−オはレータ−を含有
   するＨｐａ［／Ｂａ１ｌ断片を単離および精製し、（１
   １ｉ）　Ｈｐａ［［／Ｂａ１ｌ断片をＴａｑ　ｌで限定
   消化することにより修飾し、そして （ψ　前記の修飾された断片をｐＢＲ３２２のＣ１ａｌ
   切断点に挿入する 工程からなるｐＫＧＰ４３およびｐＫＧＰ３６からなる
   群から選択されるプラスミドの調製法。 １３）（ｉ）１）ＢＲ３２２型プラスミドをＰｓｔｌお
   よびＢａｍＨｌを用いて制限してＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ
   断片を得そしてこの断片を精製し、 （ｌｉ）　（ａ）　ｐＫＧＰ　１２−２型、（ｂ）　ｐ
   ＫＧＰ　１３−１９型または（Ｃ）１）ＫＧＰ９−２５
   型のプラスミドをアＳｔＫを用いて制限しそしてβ−２
   クタマーゼのアミノ末端、ｐＫＧＰ３６　Ｐ、００−８
   ．Ｄ、　（プロモーター−オペレーター　Ｓｈｉｎｏ−
   Ｄａｌｇａｒｎｏ　）　ｚ　＝　ットおよび編集された
   ｎｒＮ−７１遺伝子のアミノ末端を含有する断片を精製
   し、 （ｉｉＤ　ｐ　３８４７型のプラスミドをＰｓｔｌおよ
   びＢｇｌ［を用いて制限しそして工ｉ＋’Ｎ−β遺伝子
   のカルボｉシル末端断片を含有する断片を精製し、そし
   て ４ｖ）　工程（１）、（１υおよび工ｍ（ｌｉ）の＝＞
   、（ｂ）または（Ｃ）の断片を連結する、 工程からなるプラスミドｐＫＧＰ　１２−２Ｒ％ｐＫＧ
   Ｐｉ５−１９ＲおよびｐＫＧＰ　９−２５Ｒの調製法。 １４）（１）　ｐＫａｐ　４３型のプラスミドをＨｐａ
   　ｌおよびＨｌｎｄｌ［を用いて制限しそしてＨｌｎｄ
   ｌｌ　、切断点を充填して充填された）Ｉｉｎａｌｌｌ
   末端およびＨｐａ　ｌ末端を有する断片を得、 （Ｉｔ）　ｐＫＧＰ１３−１９Ｒ型のプラスミドをＨｐ
   ａｌ　ｔ：用いて制限してＨｐａ）断片を得、そして０
   １１）工程（１）の断片と工程（１１）の断片とを連結
   させる、 工程からなるプラスミドｐＫＧＰ　１３−１９Ｒ−ｔｒ
   　ｐ６の調製法。 １５Ｘｌ）　Ｉ）ＬＧ　４００型のプラスミドをＰｓｔ
   ｌおよびＨｌｎｄｌｌを用いて制限してＰｓｔｌ／ｆ（
   ｉｎｄｌｌｌ断片を得、（ＩＩ）　ｐＫＧＰ３６型のシ
   ラスミドをＰｓｔｌおよびＨｌｎｄｌｌで制限しそして
   プロモーター−オペレーターを含有する断片を単離およ
   び精製しそして Ｇ１１）　ｐＫＧＰ３６のプロモーター−オはレータ−
   含有断片をｐＬＧ４００のＰｓｔｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌ断
   片に連結させる、 工程からなるプラスミドｐＡＰ１６の調製法。 １６　Ｘｉ）　細菌細胞を指定逼れる光学濃度まで生育
   させ、 （１１）　塩化カルシウム溶液で処理することにより細
   胞壁を修止し、 ０１１）　コンピテントな細胞をプラスミドを含有する
   連結されたＤＮＡ混合物と混合し、そしてＭ　その混合
   物を培養してシラスミドの挿入を行わしめる、 工程からなる前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミ
   ドをとり込１せる（ｉｎｃｌｕｄｅ）ための細菌微生物
   の修飾法。 １７）前記特許請求の範囲第１０項記載の微生物の生物
   学的に純粋な培養物。 １８）β−２クタマーゼまたはβ−ラクタマーゼおよび
   工ＦＮ−βを発現しうる前記特許請求の範囲第１０項記
   載の微生物の突然変異体の生物学的に純粋な培養物。 １９）β−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子およ
   び工Ｌ−２（インターロイキン−２）をコーディングす
   る遺伝子を包含し、そのプラスミドの分子量が約１．７
   Ｘ１０’ダルトンであり、そのプラスミドが下記の部分
   的な制限地図、すなわち工Ｌ−２遺伝子を包含するＨｌ
   ｎｄｌｌｌ−ＩＬ−２日ｔｕ　ｌ切断点、４５０ｂｐ　
   １　工Ｌ−２遺伝子を含まない工Ｌ−’ｌ　５ｔｕｌ切
   断点−Ｈ１ｎ（Ｌ　ＩＩＩ　２３２５ｂｐ　ｓ　を有す
   るシラスミドｐＢＲＫ工Ｌ−２゜ ２０）β−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子およ
   びテトラサイクリン抵抗性をコーデイングする遺伝子を
   包含し、ｔｒｐプロモータ一オはレータ−がｔθｔＲ遺
   伝子の方向を向き、そのプラスミドの分子量が約３．０
   Ｘ１０’ダルトンであり、そのプラスミドが下記の部分
   制限地図、すなわちＨｌｎｄｌ［１−Ｐｅｔｌ　３５８
   ６１）ｐｌＰｓｔｌ−Ｃ１ａ１７７５ｂｐ　、　Ｔｒｐ
   　Ｐ、Ｏ，を包含する０１ａｌ−０１ａ１７９０ｂｐ　
   、０１ａｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ　４ｂｐ　ｔ−有するプラ
   スミドｐＫＧＰ３６・ｔｒｐ。 ２１）β−ラクタマーゼをコーディングする遺伝子およ
   び工Ｌ−２をコーディングする遺伝子を包含し、そのプ
   ラスミドの分子量が約２．ｌＸ１０”ダルトンであり、
   そのシラスミドが下記の部分的制限地図、すなわち、　
   ＩＬ、−２遺伝子を包含ｔ’　ルＨ１ｎｄｌｌｌ−Ｐｅ
   ｔｌ　２０００ｂｐ、Ｔｒｐ　Ｐ、ｏ、　（トリプトフ
   ァンプロモーター−オペレーター）を包含するＰｓｔｌ
   −ＨｌｎａＩｌｌ　１５６９ｂｐを有するプラスミドｐ
   ＴｒｐＫＩＬ−２゜ ２２）前記特許請求の範囲第２．１項記載のシラスミド
   により形質転換された微生物。 ２３ＸＩ）　ｐＢＲｇ工Ｌ−２型のプラスミドをＨｌｎ
   ａｌｌｌおよびＰｓｔｌ　ｆ用いて制限しセして工Ｌ−
   ２Ｒ伝子を含有する断片をｎ製し、 （Ｉｔ）　ｐＫＧＰ３６−ｔｒｐ型のプラスミドをｕｉ
   ｎａｌｆｌおよびｐｓｔｌ　ｆ用いて制限しそしてｔｒ
   ｐ　Ｐ、Ｏ。 を含有する断片を精製し、そして （ｉｉｉ）　工程（１）と工程（ｉｉ）の断片を連結さ
   せる、工程からなる前記特許請求の範囲第２１項記載の
   プラスミドの調製法。 ２４）前記特許請求の範囲第２２項記載の微生物の生物
   学的に純粋な培養物。 ２５）成熟した工Ｌ−２の第１番目の二トンである開始
   コドンを包含しそして ０ＧＡＴＡＡＧＯＴＴＡＴＧＧＯＴ ＴＡＴＴＯＧＡＡＴＡＣＯＧＡ なる配列を有する分子（Ａ）。