JPS6097274A - アルブミン検出用組成物およびアルブミン検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアルブミンのアラ七イに関する。さらに詳しく
は、本発明は、全面または血清のような生物学的液体中
のアルブミンを検出または定量する方法に関する。

従来の技術 アルブミも蛋白質の中で大きさが最も小さいが量が最も
多く、一般に約６９．０００の分子量を有し、哺乳類の
血漿中の総蛋白質の−余りを構成している。アルブミン
は肝臓で合成され、その半減期は約４週間である。人体
において、アルブミンは次の２つの重要な役割を有する
；（α）血液と＃Ａ織との間の体液平衡を調整し；そし
て（ｂ）ビリルビン、脂肪酸、フルチゾール、チロキシ
ンならびにスルホンアミド及びバルビッール酸＃Ｘを含
む多数の薬物のような、水にわずかしか溶解しない種々
の物質に対する運搬分子として機能する。

、働者に血清アルブミンの欠乏があるか否かを分析する
のが重要な場合がよくある。このような欠乏のある患者
は、漿液の異常な蓄積を特徴とする浮腫を起こす。さら
に、アルブミン欠乏は、前述したわずかに可溶な物質の
身体全体への運搬を制限する可能性がある。

血清アルブミンの測定については、種々の原理に基づい
てずでに多くの方法が述べられている。

これらのうち、染料結合法に基づく方法は自動化が容易
で且つ再現性のある結果を提供するので、特にポピユラ
ーである。はとんどの染料結合法は、アルブミンのよう
な蛋白質に結合した時にｐＨの変化に特有の色の変化を
受けるｐＨ指示薬染料を用い、溶液のｐＨは緩衝液で一
定に保たれる。このような作用を示す代表的な指示薬染
料はメチルオレンジ、ブロモクレゾールパープル、ブロ
モフェノールブルー及びブロモクレゾールグリーンであ
る。たとえば、ブロモクレゾールグリーンを用いるアッ
セイはＪ、Ｅ、　Ｇ、ガスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓ
ｏｎ　）によって０１ｉｎ、　Ｏｈｅｍ、、　２２（５
）、６１６〜６２２ページ（１９７６年）に記載されて
いる。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、これらの公知アルブミンアッセイには多
くの問題が伴う。たとえば、指示薬染料はアルブミンと
の結合において独占的には特異的ではない。むしろ、体
内に認められる多数の他の蛋白質、たとえば、グ四プリ
ン類も指示薬染料に結合して、色の変化を生ずる。この
ため、指示薬染料を用いるアッセイは、アルブミンに対
して充分には特異的でなく、これらのいわゆる「妨害」
蛋白質との結合の影響を非常に受けやすいので、不正確
になりやすい。

さらに、公知アルブミンアッセイに用いられる指示薬染
料は比較的に狭いｐＨ範囲内でのみ有効である。この狡
い範囲外では、染料は蛋白質との結合時に色の変化を生
じないか、早まって色を変化させる。さらにまた、この
ような指示薬染料な用いるアルブミンアッセイは一般に
、アルブミンへの染料の結合を増大させ且つｐＫａシフ
トの結果として染料吸収スペクトルにおいて色を変化さ
せるために比較的低いｐＨ（たとえば、ブロモクレゾー
ルグリーンを用いる場合には４０；ブロモクレゾールパ
ープルを用いる場合には５．２）において実施する。し
かしながら、比較的普通に用いられる染料、たとえば、
ブロモクレゾールグリーン及びブロモクレゾールパープ
ルのｐＨ変化は酸性のｐＨ値であるため、これらの染料
とアルブミン以外の蛋白質分子との非特異的結合が増大
する〇この望ましくない作用は、蛋白質のほとんどが酸
性のｐＨ値で正に荷電しているのに対し、染料分子は負
に荷電しているという事実による。これより高いｐＨ値
においては、はとんどの蛋白質は負に荷電し、非特異的
なイオン相互作用は減少する。

本発明の目的は、生物学的液体中に認められることの多
いアルブミン以外の他の蛋白質よりもアルブミンに対す
る特異性が高く、比較的広いｐＨ範囲において、特にア
ルカリ性のｐＨにおいて有用なアルブミンアッセイを提
供することにある。

問題を解決するための手段 本発明によれば、アルブミンの検出方法は、（１）アル
ブミンを含む液体のサンプルとオキソノール染料とを接
触せしめて、該オキソノール染料のλｍａＸをシフトさ
せ、そして（２）シフトしたλｍａｘにおける吸光度を
検知する工程を含んでなる。

発明の効果 このアッセイはアルカリ性のｐＨにおいて使用できるの
で、比較的低いｐＨにおいて起こり得る可能性のあるア
ッセイ妨害を回避するのに使用できる。本発明のアッセ
イはアルブミンに対する選択性が高く、アルブミンと結
合した時にスペクトル吸収に検出可能なシフトを生ずる
オキソノール染料を用いる。新たなｊｍａｘ（吸ピーク
）における吸光度はアルブミン量と化学量論的に相関し
得るので未知サンプル中のアルブミンを定量できる。

作用 本発明は、水性液体中のアルブミンの検出またはアッセ
イへのオキソノール染料の使用に関する。

本発明によれば、生物学的液体、たとえば、ヒトまたは
動物の全面、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、髄液、
喀痰、汗等、ならびに糞便分泌物中のアルブミンを分析
できる。さらに、骨格筋、心臓、腎臓、肺、肝臓、脳、
骨髄、皮膚などのようなヒトまたは動物の組織の液体標
本の使用も可能である。

オキソノール染料は、たとえば、ザ・セオリーＰｒｏｃ
ｅｓｓ　）　、ジエームズ（Ｊａｍｅｌｌ　）　Ｈａｓ
第４版、マクミリアン働パブリジングやコー （ＭａｏＭｉｌｌｉａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｏｏ
、　）　、ニューヨーク、１９４〜１９６ページに記載
されているような共鳴カルボキシルイオン発色系 を有する。一般に、本発明に有用な染料は次の構造： を有するものまたはそれらの等価のアルカリ金属塩また
はアンモニウム＠（ヒ“リジニウムを含む）である。こ
の構造中、πはゼロまたは３以下の正の整数、好ましく
は１または２である。

Ｒ１，Ｒ２及びＲ３は独立して、水素、アルキル（好ま
しくは炭素数１〜１０、たとえば、置換されたまたは未
置換のメチル、エチル、プロピル及びそれらの異性体、
ベン≠ジル、クロロメチルなど）、シクロアルキル（好
ましくは炭素数４〜１２、たとえば、置換されたまたは
未置換のシクロブチル、シクロペンデル、シクロヘキシ
ルなど）、アリール（好ましくは炭素数か６〜１８で、
環中に窒素、酸素または硫黄原子を有し、たとえば、置
換されたまたは未置換の炭素環式または複素環式基、た
とえば、フェニル、ナフチル、キシリル、ピリジルなど
）、アルコキシ（好ましくは炭素数１〜１０、たとえば
、置換されたまたは未置換のメトキシ、クロロメトキシ
、エトキシ、プロポキシ、インジキシなど及びそれらの
異性体）、アリールオキシ（好ましくは炭素数が６〜１
８で、環中に窒素、酸素または硫黄原子を有し、たとえ
ば、置換されたまたは未置換の７エノキシなど）、ヒド
ロキシ、カルボキシ（または等価のアルカリ金属塩もし
くはアンモニウム塩）、アルコキシカルボニル（好まし
くは炭素数２〜１２、たとえば、置換されたまたは未置
換のメトキシカルボニル、エトキシカルボニルなど及び
それらの異性体）、アミン（モノアミン及びジアミノを
含み、たとえば、アニリル）、または非芳香族複素環式
基（好ましくけ炭素′＃、５〜１２、たとえば、置換さ
れたまたは未Ｉ臂換のビペリル、テトラヒドロピラニル
など）である。好ましくは、Ｒ，Ｒ及びＲは独立して、
水素または前に定義したアルキルもしくはアリールであ
る。

２及びｚｌ　は独立して、５〜７員の炭素環または複素
環（Ｗ換または未置換）を完成するのに必要な炭素、窒
素、酸素または硫黄原子を表わす。

２及びｚｌ　は同一であっても異っていてもよく、環は
芳香族及び非芳香族のいずれであってもよい。

好ましくは、２及びｚｌ　は炭素及び窒素原子のみな表
わす。より好ましくは、２及びｚｌ　は独立して、５ま
たは６員の置換されたまたは未置換の複素環を完成する
のに必要な炭素または窒素原子を表わ丁。これらの環は
独立して、Ｒ，Ｒ及びＲ３に関して前に定義した基なら
びにオキソ及びチオキソ基の１個またはそれ以上で置換
されることができる。

本発明の実施に有用な染料の例は次の通りである： 本発明の実施に有用なオキソノール染料は市販されてい
る〔たとえば、ニューヨーク州ロチェスターのイースト
マン・コダックｅカンパニー（Ｋｉａｓｔｍａｎ　Ｋｏ
ｄａｋ　ｃｏｍｐａｎｙ　）がら〕が、あるいは当業界
における通常の技術を有する者によって容易に製造でき
る。

本発明のアッセイは一般に、必ずしもそうでなくてもよ
いが、５〜１１のｐＨにおいて実施する。

指示薬染料をｍいる公知のアルブミンアッセイは極めて
狭いｐＨ１ｉ２囲に限定されるので、これはアルブミン
アッセイとしては比較的広いｐＨ範囲である。本発明の
実施において、任意の適当な緩衝剤で所望のｐＨを保持
することができる（たとえば、Ｈ，Ｅ、グツド（（）ｏ
ｏｄ　）ら、Ｂｉｏｏｈｅｍ、　、５（２）、４６７〜
４７７ページ、１９６６年を参照〕。有用な緩衝剤とし
ては燐＃塩、硼＃塩、酢酸塩などを挙げることができ、
硼酸塩が好ましい。

他の緩衝剤の例は公知である。以下に述べる要素中に使
用する場合には、緩衝剤は使用条件下において（Ｔなわ
ち、水性液体サンプルで湿らせる場合）約５〜約１１の
範囲のｐＨを生ずるように遺灰する。

本発明は、最初に前述のオキソノール染料を活性成分と
する組成物′ｔ−調製することによって実施できる。ま
た、適当なｐＨを保持するために適当な緩衝剤を含ませ
ることもできる。オキソノール染料の最終濃度は、試験
液中に存在する可能性のある妨害物の彰響２最小限にと
どめるのに充分に低いが、信頼性のある定量結果を生ず
るのに充分に高いものでなければならない。一般に、オ
キソノール染料の最終濃度は１０−４〜１０−６モル／
２、好ましくは１×１０〜４×１０　モル／Ｊ３である
。通常、２〜２Ｄｒｎ２の染料ｆＩＤ［１１〜２０００
ｍ１の緩衝液と混合する。

本発明の方法は、「湿潤化学」とも称される溶液分析法
、及び「乾燥化学」とも称される乾式分析法に適応させ
ることができる。たとえば、全て水性媒体中で実施する
溶液アッセイにおいては相互作用試薬としてオキソノー
ル染料を含む組成物３分光光度計中に置いて吸収スペク
トルを測定する。この組成物はさらに緩衝剤を含むこと
もできる。次いでアルブミンを含んでいると考えられる
液体のサンプルを分光光度計中の組成物に加え、スペク
トル吸収を再び監視して、スペクトルのシフトが起こっ
たか否かを分析する。然る後に、新たな（すなわち、シ
フトした）λＷａＸ　（吸収ピーク）における光学濃度
を、あらかじめ決定した検ｔｍと比較して、液体サンプ
ル中のアルブミン量を予測する。この溶液アッセイ法は
以下の例１及び２により詳細に述べる。

「乾燥化学コア、セイに使用する場合には、本発明はオ
キソノール染料を含む乾燥分析要素を用いて実施できる
。たとえば、要素は米国特許第３．９９２，１５８号Ｃ
１９７６年１１月１６日にプルツィビロヒッツ（Ｐｒｚ
ｙｂｙ：Ｌｏｗｉｏｚ　）らに対して発行〕、同第４．
　Ｄ　４２．３３５号（１９７７年８月１６日にクレメ
ンッ（０１６ｍｅｎｔ　）に対して発行〕、同第４．１
３２．５２８号（１９７９年１月２日にアイケンベリー
（］！！１ｋｅｎｂｅｒｒｙ　）らに対して発行〕、同
第４．１４４．３０６号（１９７９年３月１３日にフィ
ガラス（Ｆｉｇｕｅｒａｓ　）に対して発行〕、同第４
．２５８，００１号（１９８１年３月２４日にパース（
Ｐｉｅｒｃｅ　）らに対して発行〕及び同第４，２９２
．２７２号（１９８１年９月２９日にキタジマらに対し
て発行）中に記載されているような、ディ、ブーアンド
−リード式（ｄｉｐ−ａｎｄ−ｒｅａｄ　）繊維試験片
または繊維もしくは非繊維多層要素であることができる
。この要素をアルブミンを含むと考えられる液体サンプ
ル（たとえば、１〜２０．１）と物理的に接触させるこ
とによってアルブミンの存在または景を測定する。この
ような接触は、たとえば、適当な計量分配手段から手ま
たは機械でスポットまたは計量分配することによって可
能である。あるいは、要素は液体サンプル中に浸漬Ｔる
。液体サンプルと接触させる前後に要素中の染料のスペ
クトル吸収を測定し、スペクトル吸収のシフトを評価し
て液体中のアルブミンの存在及び量を測定する。

本発明の要素は一般に、オキソノール染料を含む吸収剤
試薬帯域を少なくとも１つ有する。この帯域は自立性で
ある（すなわち、その結合性を保持するのに充分硬質の
材料からなる）か、または寸法安定性の支持体上に支持
される。

要素中の試薬（すなわち、染料及び緩衝剤）の破Ｍｌ量
は分析する液体に応じて広範囲に変化させることができ
る。たとえば、オキソノール染料は一般に０．０１〜３
１／イ、好ましくは０．０３〜１１／ｍ２の被ｉｔで存
在する。任意成分である緩衝剤は一般に０．１〜１０ｙ
／イ、好ましくは０．５〜６グ／ｍ″の被覆量で存在す
る。

これらの要素を用いる分析方法は手動であっても自動で
あってもよく、この方法において要素は供給用巻取、チ
ップパケットまたは他の供給源から引き取られ、適当な
ディスペンサーなどから自由液滴、接触スポットまたは
他の形態の液体サンプルを受け取るように配置される。

サンプル適用後、要素には、試験結果２早くまたは容易
に得るために望ましいであろう任意の状態調整、たとえ
ば、インキュベーション、加熱などの処理を行なう。

然る後に、オキソノール染料ご液体サンプル中のアルブ
ミンと反応せしめ、適当な反射または透過分光分析装置
が設けられた帯域に要素を通すことによってスペクトル
吸収を測定する。

実施例 以下の例は本発明の実１（ｉを説明するものである。

これらの例中、ヒトのトランスフェリンはシグマ・ケミ
カル社（Ｓｉｇｍａ　Ｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｏｏ、　、ミ
ズーリ州セントルイス）から純度９０％の標品として入
手した。ヒトのアルファ、ベータ及びガンマグロブリン
ならびにウシのガンマグロブリンはマイルズ鳴うボラト
リーズ社（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ’ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

工１１Ｑ、、インジアナ州エルクハート）から入手し、
それ以上精製せずに用いた。オキソノール染料及び緩衝
剤はイーストマン・オーガニック・ケミカルズ（Ｅａｓ
ｔｍａｎ　Ｏｒｇａｎｉｏ　Ｏｈｅｍｉｃａｌａ、ニュ
ーヨーク州ロチェスター）から入手した。特に断わらな
い限り、使用した化学薬品は全て試薬用であった。生化
学的な材料は全て、使用するまで４′ｃで貯蔵した。

アルブミンキャリブレーク−は、リンゲル液（Ｍａｉｌ
、　０．９％、０ａＯ１２０，０６３％及びＫＯｌｏ、
０３％から成る等張溶液）中でヒト血清アルブミンＣマ
イルズ・ペンテ、クスーフラクション■（Ｍｉｌｅｓ　
Ｐｅｎｔｅｘ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ　）　〕　から重
量法によって調製した。キャリブレータ−濃度は１０秒
ブ四モクレゾールグリーン法〔ガスタフンン（Ｇｕｓｔ
ａｆｓｏｎ　）　、Ｇ１１ｎ、　Ｏｈｉｍ、、　２２　
（５）、　６１６〜６２２ページ、１９７６年参照〕を
用いて定めた。ヒトの血清は地方病院から入手した。直
ちに使用しないサンプルは一８０Ｃで冷凍保存した。

プールしたヒトの血清サンプルから調製したキャリブレ
ータ−はリンゲル液で稀釈して別の濃度にし、前述のよ
うにして定量した。

例１ アルブミンの溶液アッセイ 前述の染料■を含んでなる１、　４　Ｂ　Ｘ　１０−５
モル／−１１ｉ！染料溶液を５０ミリモル／Ｊ燐酸塩緩
衝液ｐＨ８，１）中で調製した。この溶液のサンプルを
キュベツト中に入れ、常用の分光光度計で吸収スペクト
ル（４００〜６００　ｎｍ　）を記録した。次いで、こ
の染料溶液に少量のヒト血清アルブミン（ＩＸｌｏ　モ
ル／２）を加え、再び吸収スペクトルを記録した。第１
図に示されるように、アルブミンを含まない染料溶液が
見掛の吸収極大が約５２０　ｎｍ　の狭いスペクトルを
示したのに対し、アルブミンの存在においては吸収極大
は約５５５ｎｍまで約３５　ｎｍシフトした。

例２ アルブミンに関する検量線の作成 プールしたヒト血清から前述のようにして１．２９Ｐ／
ｄ４．２．１１　ｙ／ｄ−ｅ　、　３．０４　ｆ／ｄ１
３及ヒ４．７９ｆ／ｄ、、ｅの濃度のキャリブレータ−
を調製した。各キャＩＪ　フＬ、　−Ｊ　−（０，０１
５＋＋＋ｌ）を、例１に記載したようにして調製した染
料溶液１ｍｌを含むキュベツトに加えた。各キュベツト
に蓋をし、数回ゆるやかに振盪し、常用の分光光度計中
に入れた。

各測定のブランクとして燐酸塩緩衝液を用いた。

２分後、各サンプルについて５６５　ｍｍにおける吸光
度ご記録した。吸光度のデータを用いて、勾配８１及び
切片−１，７Ｘ１０’の検量線を作成した。曲線は約５
　’！／ｄ１３まで直線である。

例３ アルブミンＧこ対する染料■の結合特異性種々の血清蛋
白質、たとえば、ヒトのアルブミン、アルファグロブリ
ン及びベータグロブリン、ならびにウシのガンマグロブ
リンに対する染料Ｉの結合特異性を、染料スペクトルに
おける種々の蛋白質の影響を観察することによって測定
した。

種々の量の５％蛋白質水溶液を３．１２Ｘ１０’モル／
ｐ染料溶液１　ｍｌに加え、５０ミリモル／石燐酸塩緩
衝液と対照した。得られた各染料−蛋白質溶液２２分間
のインキュベーション時間Ｑこゆるやかに振盪し、５６
５ｍｍ　における吸光度を前述のし？ ようとり録した。以下の第１表に示した結果は、アルブ
ミンの場合にのみ染料の吸光度の変化が蛋白質量に相関
するため、染料■がアルブミンに特異的であることを示
している。その他の血清蛋白質フラクションは染料の吸
収スペクトルに濃度変化を生じなかった。

例４ 前述の染料■〜■のアルブミン結合特異性を次のように
して評価した。ヒトのアルブミン及びアルファグロブリ
ンならびにウシのガンマグロブリンを含む５％蛋白質溶
液のアリコート（３０μ沼）を染料溶液５ｍｌに加え、
燐酸塩緩衝液ブランクと対照した（染料■及び■の溶液
１　ｍｌには蛋白質溶液の１０ＩＬｅ及び１５μ形アリ
フートを各々加えた）。

染料濃度を以下の第■表に示す。各染料−蛋白質溶液？
ｉ：２分間のインチュベーシ□ン時間の間Ｇこゆるやか
に振盪し、前述のようにして極大吸光度（λｍａｘ　）
を記録した。第■表に示した結果は、染料■〜■がアル
ブミンに対して高い特異性を有することを示している。

吸光度は染料に応じて種々の波長で測定した。

以下余白 例５ これは、本発明のアルブミンアッセイの蛋白質感受性と
従来のアルブミンアッセイの蛋白質感受性とを比較する
比較例である。

個々のプールしたヒト血清サンプルにヒトのアルファ、
ベータ及びガンマグロブリンならびにトランスフェリン
（ガンマグロブリンの一成分）′ｆｔ加えて、アルブミ
ンレベル（総蛋白に基づく）カ異常に低い人間の血清に
類似した試験サンプルを作った。種々の量の蛋白質を含
む得られた血清−蛋白質溶液を、例１のアッセイ組成物
を用いて分析した。デュポン・アカ（Ｄｕｐｏｎｔ　ａ
ｃａ　）　（４，５分終点）アッセイ及び１０秒プロモ
クレゾールグリーンア、セイを対照アッセイとして用い
た〔後者は０１ｉｎ、　Ｏ’ｈｅｒｎ、、　２２　（５
）、　６１６〜６２２ページ（１９７Ｓ　）に記載され
ている〕。これらのアッセイの結果を以下の第■表に示
した。これらの結果は本発明のアッセイがここに示した
妨害血清蛋白質の全てに対してこれらの濃度において一
般に不感受性であることを示している。対照アルブミン
アッセイはいくつかの妨害物質に対しては不感受性であ
るがそれ以外に対しては感受性が高かった。

以下余白 例６ 本発明に係るアルブミン測定に対するｐＨの影響を、５
６５ｎｍの染料Ｉ２ｍａｘにおけるアルブミン−染料複
合体の吸光度に対するｐＨの影響を観察することによっ
て評価した。

染料溶液は、５０ミリモル／２の２種の異なる燐酸壌緩
衝液（ｐＨ６，３及び８．１）及び５０ミリモル／Ｊの
硼酸壌緩衝液（ｐＨ１０）中に１．４８Ｘ１０−５モル
／−ｅの染料■を用いて例１に記載したようにして調製
した。

以下の第■表に示した種々の量の５　Ｐ／ｄ１３アルブ
ミン原液を染料溶液に加え、各サンプルの得られた光学
濃度（吸光度）を常用の分光光度計を用いて記録した。

第■表に示した結果は、各ｐＨにおいて吸光度の差がほ
とんどないことを示している。従って、本発明のアッセ
イは適当なＭ衝液を用いて広いｐＨ範囲にわたって有用
である。

以下急白 第１Ｖ表 ０　０．０３１　０．０２５　０．０３０５　０．２５
５　０．１７０’　０．１８０１０　０．３４０　０．
２５０　０．２６０

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に用いるオギソノール染料Ｍｌ独の吸
収スペクトル及びオギソノール染料にアルブミンを加え
た場合の吸収スペクトルを示すグラフ図である。 以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　（１）　アルブミンを含む液体のサンプルとオキ
   ソノール染料とを接触せしめて、該オキソノール染料の
   λｍａＸをシフトさせ、そして （２）シフトしたλｗａｘにおける吸光度を検知する 工程を含んでなるアルブミンの検出方法。 ２、活性成分としてオキソノール染料を含んでなるアル
   ブミン検出用組成物。