JPS609798B2 - ニコチン光学対掌体の識別定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はｄ−ニコチンと１−ニコチンの混合物中のｄー
ニコチン及び１−ニコチンを固定化微生物センサーを用
いてそれぞれ識別定量する方法に関する。 ニコチンにはｄーニコチンと１ーニコチンの２種の光学
異性体が知られているが、天然に存在するニコチンはす
べて１ーニコチンである。 ところが近年、薬理学及び神経生理学の領域において１
ーニコチンの光学対称体としてのｄ−ニコチンに対する
関０が高まり、ｄーニコチンの利用分野の拡大とともに
、感度が高く簡便なｄーニコチン及び１−ニコチンの混
合物からそれぞれの光学異性体を識別定量する方法の確
立が必要とされるようになってきた。本発明はこのよう
な要望に応えるためになされたものである。一般に、異
性体混合物の分別定量はそれぞれの化学的性質及び物理
的性質が極めて類似しているために非常に困難な場合が
多く、従来、ｄ−ニコチンと１−ニコチンの混合物（以
下（ｄ十１）ーニコチンともいう）中のｄ−ニコチン及
び１ーニコチンを固別に定量するためには、次のような
方法がとられていた。 すなわち、

【１はず検体から（ｄ＋１）−ニコチンを真
空蒸留又は分取クロマトグラフィーにより精製。分離す
る。（２ー次に分離した（ｄ十１）−ニコチンの旋光度
を測定し、その値から（ｄ＋１）ーニコチン中のｄ一体
と１一体の比を算出する。剛別にＵＶ吸収スペクトル法
又はガスクロマトグラフ法（例えばＣ．０．Ｗｉｌｌｉ
ｔｓｅｔａｌ．、Ａｈａｌ．Ｃｈｅｍ．、２２、４３０
（１９５０）、Ｊ．Ｒ．Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、
Ｊ．Ａ．０．Ａ．Ｃ．、６２、２２９（１９７９）参照
）により（ｄ＋１）−ニコチンの全量を定量する。‘４
｝（ｄ＋１）ーニコチンの全量を前記の比率で案分して
１ーニコチンとｄーニコチンのそれぞれの量を算出する
。しかし、従釆公知の定量法は旋光度を測定する前に（
ｄ＋１）−ニコチンの精製・分離が必要であり、また感
度が低いので多量の検体（数１０の夕）を必要とする等
の欠点があった。 本発明は検体中のｄーニコチン及び１−ニコチンを繁雑
な前処理操作ないと短時間にしかも高感度で精度よく定
量する方法を提供することを目的としたものである。 近年、固定化微生物の技術が著しく進展するに及んで、
これの電気計測への応用も盛んに試みられるようになり
、固定化微生物センサーを利用したグルコースの定量（
１．Ｋａｒ岬ｅ、Ｓ．Ｍｉｔｓｕｄａ、Ｓ．Ｓ雌肌ｉ、
Ｅｍｏｐ．Ｊ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、７３４３（１９７９））をはじめ各種の微生
物センサーによるメタノール、酢酸、メタンガス等の定
量が報告されている（軽部征夫、化学、Ｎｏ．７、５２
４（１９８１））。 しかしながら、光学異性体を同時に識＊＊別定量できる
バイオセンサーは（酵素、微生物、オルガネラセンサー
を含め）いまだ全く知られていない。本発明者等はｄ−
ニコチン及び１−ニコチンの定量に対する微生物センサ
ーの利用について種々検討した結果、ｄ−ニコチン及び
１ーニコチンを同時に同程度資化する微生物すなわちｄ
ｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌の誘導・管理、並びに
（ｄ＋１）−ニコチンの中から１ーニコチンだけを選択
的に迅速に資化する微生物すなわち１一ニコチンオキシ
ダーゼ生産菌をたばこ畑の土壌から分離することに成功
し、これらをそれぞれ固定化して酸素電極と組み合せ、
検体中のｄ−ニコチン及び１ーニコチンの濃度に応じた
資化にともなう溶存酸素濃度変化を電気化学的に計測す
ることによって、ｄーニコチン及び１ーニコチンの濃度
を迅速に高感度で定量し得ることを見出し本発明をなす
に至った。 すなわち、本発明はｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌
を固定化した微生物センサーによりｄーニコチン及び１
ーニコチンの総量を定量し、同時に１−ニコチンオキシ
ダーゼ生産菌を固定化した微生物センサーにより１−ニ
コチン量だけを選択的に定量し、さらに両者の差として
ｄーニコチン量を定量することを特徴とするニコチン光
学対掌体の識別定量法である。 以下、本発明について詳細に説明する。 まず、使用菌株とその維持管理及び培養法について述べ
る。 従来ニコチン分解菌としては、その分解経路により次の
２種が知られている（山下、清水、玉置、農化、３７、
総５（１９６３））。○｝ 次式のようにニコチン分解
の第１段階でｄーニコチン及び１ーニコチンのピリジン
環の６位が水酸化される。ｄｌ−ニコチンオキシダーゼ
生産菌。‘２） 次式のように分解の第１段階で１ーニ
コチンだけからＮ−メチルミオスミンを生じ、ｄーニコ
チンは分解しない１一ニコチンオキシダーゼ生産菌。 ‘１’１こ属するｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌と
してはアースロバクター・グロビフオルミス（〜ｔｈｒ
ｏＭｃｔｏｒｇｌｏｂｉｆｏ肌ｉｓ）及びシュードモナ
ス・ニ コ チ ノ フ ア ガ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｎｉｃｏｔｉｎｏｆａｇａ）が、又■に属する１一
ニコチンオキシダーゼ生産菌としてはアルカリゲネス・
パラドキサス（Ｎｃａｌｉｇｅ船ｓｐａｒａｄｏ刈ｓ）
、アースロバクタ−・グロビフオルミス及びシュードモ
ナス・プチダ（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓ ｐｕｔｉｄａ）
が報告されている（例えばＳ．Ｍａｅ船、Ｔ．Ｋｉｓａ
ｋｉ、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５、５６
５（１９８１）、Ｍ．Ｃ．Ｄｅｔｒａｇｌｉａ、Ａ．Ｍ
．ＴｏｍｅＧｋｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｊｏｌ．、３９ １０６７（１９８０）参照）。 しかしながら、本発明のニコチン定量用の固定化微生物
センサーに適用し得る菌株は単にニコチンを分解できれ
ば良いという訳ではなく、生育が早いこと、ニコチンの
資化速度が速いこと、不用の色素を生成しないこと、固
定化後もニコチン資化能が長期安定であること、又と〈
にｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌にあってはｄ−ニ
コチンと１−ニコチンに対する資化能が同程度であるこ
と等の条件を満たす菌あることが必要である。本発明者
等は多数の適用試験の結果、本発明に適用しうる１−ニ
コチンオキシダーゼ生産菌としては、シュードモナス・
ブチダＪＴＳ−９が上記の条件を満たす菌であることが
認めた。本菌はたばこ連作畑の土壌より単離したニコチ
ン資化性菌であるが、その菌学的性質は以下の通りであ
る。 １ 形：梓菌、０．８〜０．９×１．３〜２．５仏机２
鞭毛：極毛４〜５本３ グラム染色：陰性 ４ 肉汁寒天平板培養：集落は円形で周緑はなめらかで
、凸レンズ状に盛上がり、半透明である。 ５ 肉汁液体培養：生育し、混濁する。 鞘はつくらない。６ ０Ｆテスト：好気的に酸を生成す
る。 ７ 酸素との関係：好気性 ８ カタラーゼ：腸性 ９ リトマス牛乳：凝固しない。 １０ 色素の生成：キングＢ培地で蟹光色素を生成する
。 １１ レバンの生成：陰性 １２ アルキニンデヒドロゲナーゼ：陽性１３ オキシ
ダーゼ：陰性 １４ 硝酸塩の還元：陰性 １５ ゼラチンの加水分解：ゼラチンを液化しない。 １６ 澱粉の加水分解：陰性 １７ ポリーＰーハィドロキシ酪酸の蓄積：なし。 １８ 炭素源の利用 グルコース：利用する トレハロース：利用しない メソイノシトール：利用しない ゲラニオール：利用しない Ｌーバリン：利用する Ｂーアラニン：利用する ＤＬ−アルキニン：利用する ペンジルアミン：利用する １９ 栄養要求性：ない ２０ 卵黄培地：陰性 ２１ 生育温度：２５〜３０ｑＣが最適。 ４１度℃で生育しない。 ２２ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量：６０．２ 以上の結果をパージェイス・マニュアル・オプ．デター
ミナテイブ・バクテリオロジイ（技て戦′ｓ Ｍａｎ
雌ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｎｎｉ岬ｔｉｖｅ欧ｃｔｅ
ｒｉｏｌｏ戦）第８版に基づき、本菌をシュードモナス
・プチダ（ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）と同定
した。 なお、本菌は微生物工業技術研究所に寄託しており、受
託番号は徴工研菌寄第６１４６号である。 本菌の菌体は例えば次のような培養によって、その培養
ブロスから遠心分離等の分離手段によって採取する。す
なわち、通常１−ニコチンを０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ．
）含むニュートリェント・アガ−（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡ
ｇｅｒ、Ｄｉｆｃｏ社製）斜面塔地に培養し、５℃に保
存されている該１一ニコチンオキシダーゼ生産菌の１白
金耳分を、例えば次の組成の液体塔地Ａを１０の【入れ
た２コブ付５０の【客ェルレンマイャー・フラスコ（三
角フラスコ）に移植し、２８ｏｏで２独寿間振とう培養
する。 液体培地Ａの組成：リン酸１カリＩ夕、硫酸マグネシウ
ム７水加物０．５夕、硫酸第一鉄７水化物の１％（ｗＶ
ｖｏｌ力Ｋ客液を０．３私、塩化カルシウム２水加物の
１％（ｗＶｖｏｌ力Ｋ溶液を０．３舷、硫酸マンガン４
〜５水加物の０．０６％ふｔ／ｖｏｌ）水溶液を０．１
汎‘、イースト・エキス１夕、１ーニコチン塩酸塩、１
夕、以上に蒸留水を加え全量を１そとする（ｐＨ６．０
〜６．５）。 つ１．・で、この培養物を同一組成の培地１０叫を入れ
た５０叫客２コブ付フラスコの中へ０．５肌【移し、２
８ｑｏで１曲時間、回転振とう培養する。 この培養物を８０仇ｐｍで１０分間遠心分離して沈澱し
た菌体を採取し、生理食塩水で洗浄して遠心分離する。
この洗浄分離操作をさらに２回くり返して、該菌体を得
る。なお、菌体採取の方法は上記万法に限定されるもの
ではないが、望ましくは比較的栄養に乏しく、１−ニコ
チンのみを炭素・窒素源として含む培地に生育させ、そ
の対数増殖期の後半において菌体を採取するのが好まし
い。 一方、ｄｌ−ニコチンオキシダ−ゼ生産菌としては多数
のアースロバクター属及びシュードモナス属に属するｄ
ｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌を、唯一の炭・窒素源
としてｄ−ニコチンを含む以下に示す組成の液体塔地Ｂ
に１０数代継代培養した後、選抜した結果、アースロバ
クター・グロビフオルミス ＩＦＯ１２９５６及びＩＦ
Ｏ １２１３８が良好な菌株であることを認めた。なお
、ＩＦＯは日本微生物株保存連盟加入機関である財団法
人発酵研究所を表わす。すなわち、この両菌株は最初は
ｄーニコチン分解館が低いが、液体塔地Ｂに継代培養し
てｄーニコチンに馴致させると次第に活性が上がり、１
−ニコチン分解態と同程度のｄーニコチン分解館を示す
ようになる。 一度このような活性に達した菌株は例えば次のように維
持管理して培養することにより、活性が保持された望ま
しい菌体を得ることが可能であることを見出した。すな
わち、ｄ−ニコチンを０．１％Ｗｔ／ｖｏｌ）含む液体
塔地Ｂに約２％の寒天を加えて調製した斜面塔地に上記
の総代培養を終えたｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌
を培養し、５℃に保存しておく。 この一白金耳を液体培地Ｂを１０机入れた２コブ付５０
の【三角フラスコに移植し、２８ｏ○で２４時間振とう
培養する。０ 液体培地Ｂの組成：リン酸１カリ１夕、
硫酸マグネシウム７水化物０．５夕、硫酸第一鉄７水化
物の１％（ｗＶｖｏｌ力Ｋ溶液を０．３の‘、塩化カル
シウム２水加物の１％ＷＶｖｏｌ力下、溶液を０．３叫
、硫酸マンガン４〜５水化物の０．０６％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）水溶液を０．１の‘、イースト。 エキス０．１夕、Ｄ−ニコチン塩酸塩１夕「以上に蒸留
水を加え全量１〆とする。ついで、この培養物を液体培
地Ｂを１０の‘入れた５０のと客２コブ付三角フラスコ
の中へ０．５叫移し、２８午０で１糊時間、回転振とう
培養する。 この培養物を８００仇ｐｍで１０分間遠心分離して沈澱
した菌体を採取し、生理食塩水で洗浄して遠心分離する
。この洗浄分離操作をさらに２回くり返して、該菌体を
得る。なお、菌体採取の方法は上記万法に限定されるも
のではないが、望ましくは比較的栄養に乏しく、ｄ−ニ
コチンのみを炭・窒素源として含む培地に生育させ、そ
の対数増殖期の中間において菌体を採取するのが好まし
い。 次にこれらの菌体を以下に記載する方法で固定化する。 菌体固定化の方法には一般に包括法、吸着法があり、そ
のいずれによっても目的に沿った固定化菌体を得ること
が可能である。すなわち、前記のようにして得られた１
一ニコチンオキシダーゼ生産菌ＪＴＳ−９の湿菌体１の
９を０．１の‘の生理食塩水に懸濁し、５．５柵の円形
に切り抜いた多孔性アセチルセルローズ膜（ミリポァ社
製、ＨＡ型、孔径０．２Ａｍ、膜厚１５０しｍ）上に滴
下し、軽く吸引することにより菌体を吸着・固定化する
。一方、ｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌 ＩＦＯ−
１２９５６の湿菌体２地を０．１の【の生理食塩水に懸
濁し、直径５．５側の円形に切り抜いた多孔性アセチル
セルロース膜に同様に吸着・固定化する。次に、前記の
１一ニコチンオキシダーゼ生産菌及びｄｌ−ニコチンオ
キシダーゼ生産菌をそれぞれ吸着・固定化した円形膜（
直径５．５柵）を市販（例えば石川製作所製）の隅膜酸
素電極の酸素透過膜上に装着し、さらにナイロンネット
で被覆してニコチンセンサーを製作する。ここで用いた
隅膜酸素電極は、白金カソード、鉛アノード、水酸化ナ
トリウムの内部液からなり、白金カソード表面は酸素透
過性のテフロン膜で被覆されている。第１図に１−ニコ
チンセンサー並びにｄｌ−ニコチンセンサーの構成の１
例を示す。第１図において、１は陽極（鉛アノード）、
２はテフロン膜、３は】一ニコチンオキシダーゼ生産菌
固定化膜又はｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌固定化
膜、４はナイロンネット、５は陰極（白金カソード）、
６は○ーリングを示す。 本発明によるｄ−ニコチンと１ーニコチンの識別定量の
原理は、検体中の（ｄ十１）−ニコチンと１−ニコチン
のそれぞれの濃度に応じた固定化菌体による資化に伴な
う溶存酸素の濃度変化を測定し、その変化値から各ニコ
チンの濃度を算出することにある。 本発明において溶存酸素濃度変化は市販の酸素電極を使
用し、電流値（〃Ａ）として検出し、つぎに電圧差（肌
Ｖ）に変換して記録、計測することができる。次に本発
明に使用するニコチン光学対掌体識別定量装置および該
装置による定量法について具体的に説明する。 第２図に該定量装置の概要を例示した。第２図において
、７は２ペン記録計、８は電流−電圧変換増幅器、９は
１ーニコチンセンサー・１０はｄｌーニコチンセンサー
、１ １はニコチン試料液（検体）、１２は恒温水槽、
１３は定量注入ループ、１４は空気飽和緩衝液、１５は
空気供給ポンプ、１６はフローセルｔ １７は計算器を
示す。 定量法としてはまず、溶存酸素飽和の０．１モル濃度の
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を０．５の‘／分の流速で
フローセル１６（例えばアクリル樹脂製、直径０．位か
、高さ０．８肌、容量０．２３の

【）へ移送すると、溶
存酸素と固定化菌体の呼吸とがバランスした定常電流値
が得られる。 ついで、各種濃度の１ーニコチン試料液１１を間欠的に
定量注入ループ１３により注入し１ーニコチンの資化に
ともなう菌体の溶存酸素消費量、すなわち、電流減少量
を１−ニコチンセンサー１０によって同時に測定する。
電流は約狐オームの抵抗を用いて電圧に変換し、記録計
７及び計算器１７に記録する。同様に各種濃度のｄーニ
コチン試料液１１を間欠的に定量注入ループ１３により
注入し、ｄーニコチンの変化にともなう菌体の溶存酸素
消費量、すなわち電流減少量をｄｌ−ニコチンセンサー
１０によって測定する（この場合、１−ニコチンセンサ
ーは作動しない）。さらに各種混合割合の（ｄ＋１）−
ニコチンを注入ループ１３により注入し、（ｄ＋１）−
ニコチンに対する酸素消費量を（ｄ＋１）ーニコチンセ
ンサー１川こよって測定・記録し、同時に（ｄ十１）−
ニコチン中の１ーニコチンのみを１ーニコチンセンサ−
９によって測定・記録する。測定中の０．１モル濃度の
リン酸緩衝液と試料液の温度は２８℃に保つことが望ま
しい。上記の測定によって得られたデータをもとに、１
−ニコチンに対する１ーニコチンセンサーの応答性を検
討した結果を第３図に示す。すなわち、検体中の１ーニ
コチン濃度の少なくとも５〜６０の９′その範囲で、１
−ニコチン濃度の対数と電流値の間に直線関係が成立す
る。又、ｄーニコチン又は１ーニコチンに対する（ｄ＋
１）−ニコチンセンサーの応答性を検討した結果を第４
図に示す。すなわち、検体中のｄーニコチン又は１−ニ
コチン濃度が少なくとも５〜６０雌／その範囲で、ｄ−
ニコチン又は１ーニコチン濃度の対数と電流値（電圧値
）の間に直線関係が成立し、ｄ−ニコチンと１−ニコチ
ンに対する応答感度は同じであった。さらに第１表左欄
に示した混合割合の（ｄ＋１）−ニコチンを注入したと
ころ、両センサーとも直ちに電流値が減少し、２分で濃
度に対応した電流値に達し、６分で分析を終了したが、
その場合の１ーニコチンセンサーと（ｄ＋１）ーニコチ
ンセンサーの応答値から計算器により求めた（ｄ＋１）
ーニコチン中のｄーニコチンと１ーニコチンの値は第１
表右欄分析値のように良く一致した。本ニコチン光学対
掌体識別定量装置中の】ーニコチンセンサーは少なくと
も２０日以上、ｄｌーニコチンセンサーは少なくとも１
８日以上安定であった。 第１表 以上詳細に説明したように、本発明の方法によれば、ほ
とんど前処理操作ないこ簡便に、高感度で精度よくｄ−
ニコチンと１−ニコチンとを識別定量することが可能で
あり、従来の分析法にみられない顕著な効果を有する。 次に本発明の実施例を以下に示す。実施例 １−ニコチンのラセミ化反応における識別定量例１−ニ
コチンをキシレソに溶解し、ナトリウムアミドを触媒と
して加えて加熱するとラセミ化反応がおこり、ｄ−ニコ
チンが生成してくる。 この反応過程で第２表の時間経過時に反応液の一部を採
取して猿遇し、ロータリーェバポレーターでキシレンを
完全に留去し、０．１モル濃度のリン酸緩衝液にその濃
度が５〜５０の９／クになるように希釈してそれぞれ分
析用試料とした。これらの試料を本発明の方法で識別定
堕した実験結果を第２表に示した。結果は出発時の１−
ニコチン量を１００とした比率で表示した。第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の１‐−ニコチンセンサー並びにｄｌ−
ニコチンセンサーの構成の１例、第２図は本発明のニコ
チン光学対掌体識別定量装置の１例、第３図は１ーニコ
チンに対する１ーニコチンセンサーの応答曲線（検量線
）、第４図はｄ−ニコチンと１ーニコチンに対するｄｌ
−ニコチンセンサーの応答曲線（検量線）を示す。 １・・・・・・陽極、２…・・・テフロン膜、３・・・
・・・１一ニコチンオキシダーゼ生産菌固定化膜又はｄ
ｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌固定化膜、４・…・・
ナイロンネット〜 ５…・・・陰極、６・・・・・・○
−リング、７・・・…２ペン記録計、８・・・・・・電
流−電圧変換増幅器、９……１ーニコチンセンサー、１
０……ｄｌーニコチンセンサー「 １１…・・・ニコ
チン試料液、１２・・・・・・恒温水槽、竃３・・・・
・・定量注入ループ、１４・・・・・・空気飽和緩衝液
、１５・…・・空気供給ポンプ、１６…．・・フローセ
ル、１７…・・・計算器、１８・・・…べリスタポンプ
。 外１顔 汁Ｚ図 外３図 グ斗函

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌を固定化した微
   生物センサーによりｄ−ニコチン及びｌ−ニコチンの総
   量を定量し、同時にｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌を
   固定化した微生物センサーによりｌ−ニコチン量だけを
   選択的に定量し、さらに両者の差としてｄ−ニコチン量
   を定量することを特徴とするニコチン量を定量すること
   を特徴とするニコチン光学対掌体の識別定量法。 ２ 微生物センサーが、ニコチンの濃度に応じて微生物
   がニコチンを資化することによって生じる溶存酸素濃度
   変化を電気化学的に計測することを特徴とする固定化微
   生物センサーである特許請求の範囲第１項記載のニコチ
   ン光学対掌体の識別定量法。 ３ ｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌がアースロバク
   ター属に属する細菌であり、ｌ−ニコチンオキシダーゼ
   生産菌がシユードモナス属に属する細菌である特許請求
   の範囲第１項記載のニコチン光学対掌体の識別定量法。 ４ ｄｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌がアースロバク
   ター・グロビフオルミスＩＦＯ１２９５６又はＩＦＯ１
   ２５３８であり、ｌ−ニコチンオキシダーゼ生産菌がシ
   ユードモナス・プチダＪＩＳ９である特許請求の範囲第
   １項及び第３項記載のニコチン光学対掌体の識別定量法
   。