JPS61105453A - 多数アガロ−ススラブゲルの連続電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は連続多数アガローススラブ（５ｔａｂ）ゲルの
電気泳動装置および種々の分子量を有する分子の混合物
から所定の成分を分離する方法、特に多種ＤＮＡ試料の
分離方法に関する。

アガロースゲル電気泳動の高感度性および高分解能を細
菌プラスミドを生成する公知の方法の簡便性と組合せる
ことにより、異なる生体から特定の遺伝子を単離し、遺
伝子ライブラリーを創作する組換型ＤＮＡの研究は効果
的に行うことができる。望ましいＤＮＡ７ラグメントを
保有するプラスミドは、望ましい遺伝マーカーまたは特
定のハイプリダイゼイシ、ン用プローブの不在において
さえも、もとのままの分子の大きさおよびアガロース中
における電気泳動の移動度との間の緊密な関係に基づい
て効果的に識別することができる。

しか°しながら、注文または市販の電気泳動装置の殆ど
は能力的に限界があり、主にこの理由のために上記の便
利な方法は大規模なりローニング実験において殆ど使用
されていない。２つの電気泳動装置および１つの（通常
高価な）電力供給源を用いた場合、研究者は（多くの種
類の中から）特定の組換型プラスミドを単に発見するの
に数日間または数週間を要した。なお上記組換型プラス
ミドはその後収集されるものである。

従って研究者ならびに生産業者が直面している主な問題
点は、種々の大きさのアガローススラブゲルで多数の検
査を同時に行うことのできる装置が不足していることで
ある。市販の装置の殆どは高価であり、同じ電力供給装
置斤に対して同時に使用できる市販の電気泳動装置は多
くて２つにすぎず、多数の検査、即ち多くのアガロース
スラブゲルを伴う操作には通常認められないほどの出費
が必要となる。電力供給源およびこの種の装置において
通常使用される白金電極は非常に高価であるので、上記
事項はまさに真実である。例えば、１２個のゲルを同時
に調査することのできる装置が企画されると、このよう
な場合それぞれが１つの単一スラブゲルと共に作動する
ように構成されている１２個のそのような市販装置およ
び６個の電力供給源が必要となる。なぜならば各電力供
給装置は２つの電気泳動装置に接続することができるか
らである◇ 従って多数のアガｑ−ススラブゲルを含み、投資費用が
できる限り少なく、同時に操作が容易で信頼性の高い装
置が要求されている。

そのような装置を概算で見積もってみると、２つの白金
電極を含む各装置は現在の貨幣価値で約５００〜６００
ドルにのぼる。さらに各電力供給装置は約５０００ドル
かかる。従って１２個のスラブゲルと共に作動する装置
を製造するためには、全額で約１０，０００ドルかかる
ことになる。さらに容易に理解されるように、上記部材
を含む装置は操作があまりにも面倒で興味のないもので
ある◇先行技術を調査してみると、電気泳動装置は周知
であることがわかる。これに関連して次の米国特許は注
目すべきである： ３．５７８．６０４　１９７１年５月１１日　　ウリエ
ル（υｒｉａｌ）４．０５９，５０１　１９７７年１１
月２２日　ストリックラー（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ） ４．１５１．０６５　１９７９年４月２４日　カブラン
（Ｋａｐｌａｎ）４．１９８．３８９　１９８０年４月
１５日　ワドスワース（ｗａａｓｗｏｒ七ｈ） ４．３９１．６８８　１９８３年７月１５日ハメリン（
Ｈａｍｓｌｉｎ）４．４１４７１５１　１９８３年１１
月２２日　ブラウン等（Ｅｒｏｗｎ　ｓｔ　ａｌ） 複数の電力供給装置と複数の従来の装置との組合せより
も操作性に優れかつ適合性の高い装置を開発するために
、本願発明者は電力供給装置の単一アウトレットを用り
て４つの異なるゲルスラブ上において多数のＤＭＡ試料
を分離する低コストアガローススラブゲル電気泳動装置
を企画した。

本願と同じ発明者の米国特許第４，５９１，６８８号に
は、実験室における他の実験の終結を不要に妨げまたは
遅らせるいら立たしい電気泳動装置および／または電力
供給装置に対する解決策としてスラブの重ね合せ構造が
提案されている。正規の操作において、上記重ね合せ構
造は大きさが変更可能な少なくとも４つのスラブゲルを
試験するために用いることができ、この場合これらゲル
は１つの単一電力供給装置に接続されている。もちろん
各電力供給装置に対して２つのアウトレットが用いられ
ているので、同じ型の第２装置は同じ電力供給装置に接
続することができる。

従って米国特許第４．３９１．６８８号の装置は、市販
の装置よりもゲルの数を増加させることができ、かつ分
離効果の大きな分析が容易にかつ迅速に行うことができ
る。さらに、下記において述べるカブランの米国特許第
４．１５１．０６５号の場合のように、ＤＮＡの大きな
分子を小さなＲＮＡまたはＤＮＡ分子で汚染する危険性
がない。しかしながら上記米国特許はいくつかの欠点を
有している。たとえば作業者は試験すべき種々のスラブ
ゲルを積み重ねなければならないので、同時に複数のス
ラブゲルを取り扱うことは大変複雑である。

またこの装置はスラブゲルを積み重ねることに基づいて
いるが、２つを超える微のステプゲルを積み重ねること
は殆ど不可能である。なぜならば取り扱いが難しく、ま
たもし３つの積み重ね構造が意図されるならば、要求さ
れる液溜めの槽の数のために、取り扱いは殆ど不可能に
なるからである。

従って米国特許第４．３９１．６８８号に述べられてい
る装置は正規の操作の下においてスラブゲルの２つの積
み重ね構造に限定される。このため、２つの装置を１つ
の電力供給源に接続する時、試験は多くて８個のスラブ
ゲルに限定される。

これに対して米国特許第３．５７８．６０４号に述べら
れているウリエルの装置は、多分複数の試料を保持する
ことのできる１つの単一スラグ層を含むように設計され
ている。この装置は異なった型のゲルで電気泳動を行う
ようには構成されていない。ウリエルの装置は上記米国
特許第４，５９１，６８８号の第１積み重ね構造にやや
似ているが、液体を収納している２つの容器は変更不可
能な特定の距離を置いて設けられている。従ってその装
置は種々の大きさを有するスラブゲルと共に使用するこ
とは不可能である。さらにウリエルの装置の場合、ゲル
を保持するために使用する支持体は非常に複雑であり、
液体との接続はゲルそれ自体によってなされている。い
ずれにしてもウリエルの特許は主に分離を行う特別な型
の媒質の製造に関係しており、なお上記媒質はもちろん
プラスミ゛ド組換型の分子の分離を妨げるアクリルアミ
ドを含んでいる〇 ストリックラーの米国特許第４．０５９．５０１号は特
別な理由なく非常に複雑な装置を開示している０ステプ
ゲルが装置の長手方向に移動するという事実のために、
多くのゲルを供う試験を同時に行うことは不可能になっ
ている。多くて２個のスラブゲルが同時に使用できるが
、同時に２０個までのゲルを試験したということはたい
へん興味のあることである。さらにこの装置はスプリン
グ手段４６を使用していること、およびスラブがこのス
プリング手段４６に沿って上昇することのために電気的
接触の問題を引き起こすのではないかと思われる。従っ
てこのストリ、・クラ−の装置は複数のスラブゲルを同
時に試験するためには適していない。

カブランの米国特許第４．１５１．０６５号に述べられ
ている装置は周知の市販の型であり、２つの１１Ｌ極を
備えた２つの容器を有しており、これら容器は相互に一
定の距離をおいて保持されている。

従ってこの装置は１つの大きさを有するスラブゲルとの
み使用することができるのである。このゲルは緩衝液に
接続され、さらにこの結果アガロースにより電極に接続
されている。浸透材をくり返し使用するために、上記ア
ガロースは高濃度で用いなければならない。周知のよう
に、アガロースは非常に高価であり、かつかなり急速に
品質低下するものである。このような装置の使用はアガ
ロース橋を供うために複雑である。この問題をある程度
解消するために、ゲルが緩衝液中に浸漬されている。し
かしながらこのことは、特に操作が速い場合、電気的過
充電の問題を引き起こす。従って作業者は各電力供給源
に対してただ１つの装置な使用しなければならない。

カブランの装置を用いる方法は１つの装置につき所定の
濃度を有する１つのゲルに限定されているので、試料の
数は限定され、従ってこの方法は異なった濃度を有する
アガロースゲルを同時に用いて実施することはできない
。カブランは寸法の大きなゲルを用い、かつ２列の液溜
めを設けることにより上記欠点を解消しようと試みた。

しかしながらこれらの操作条件のもとにおいては、小さ
な分子が大きな分子を隠蔽し、あらゆる作用を妨害する
ことになる。

米国特許第４．１９８．３８９号のワドスワースの発明
は免疫学の分野に関係している。さらにこの発明は液溜
めに緊密に関係するものであるが、ゲルに関する直接的
な作業ラインの生成とは無関係である。複数のゲルを収
納するように変更が可能であるとしても、そのことにつ
いては何も提示していない。ゲルに関してはたった１つ
の実施例しかなく、複数の装置を連続して操作するよう
に変更できるということについては何も教示していない
。

米国特許第４，４１６，７６１号のブラウンの特許は充
分に分離できないゲルを用いている。この特許において
は１つのサンプルに対して１つのｔＩ！、溜めが採用さ
れている。このＭｕは複雑であり、ゲルは上記すべての
欠点にさらされなければならない。いずれにしてもこの
特許は上記米国特許第４、５９１．６８８号よりも不適
格なものである。

本発明の目的はただ１つの電力供給源用アウトレットを
用いて、多数のスフ、トを有する複数の、たとえば少な
くとも１２個の一定のアガローススフプゲルが直列状に
配列されている装置を提供することである。

本発明の他の目的はプラスミドｐＡＴ１５３のハイド■
において挿入した人間のサイトメガロウィルスＤＮＡフ
ラグメントのおよその大きさを迅速に測定するために使
用できる電気泳動装置を提供することである。

本発明によれば、次の装置が提供される。即ち、相互に
可変距離を置いて本質的に平行に連続的にに設定され、
流動緩衝液を含んでいる一連の少なくとも３つの細長い
箱状容器と； 上記第１および最終容器のそれぞれには、単一の望まし
い電力供給源に接続されているｉ！極が設けられており
； それぞれスラブゲルを含んでいる複機の水平プレートと
；各プレートはｒａ接接状離隔した別個の容器の上方に
渡って架橋状に配置されており；上記水平プレートはこ
れらすべての容器間の間隙を被覆しており； 上記スラブゲルの一方の端部と所定の容器内に存在する
流動緩衝液との間で毛管接触することのできる第１手段
と； 上記スラブゲルの他方の端部と次の容器中に存在する流
動緩衝液との間で毛管接触することのできる第２手段と
から成ることを特徴とする多数アガローススラブゲルの
電気泳動装置。

本発明の好ましい具体例によれば、各容器の先端部は開
口されており、かつ水平な垂直隔をによって形成された
長方形断面を有しており、これら隔壁は底部および２つ
の端部によって相互に接続されており、上記水平プレー
トは２つの隣接する容器の向かい合う垂直隔壁上に載置
されている。

本発明の他の好ましい具体例によれば、上記第１および
最終容器内において電極支持体を構成している垂直プレ
ートを含み、少なくとも１つの電気的アウトレットが上
記電力供給源および電気伝導線に接続している上記垂直
プレート上に設けられ、上記伝導線は上記アウトレット
から垂直プレートに沿って上記流動緩衝液中に延びて上
記電極を構成している。

本発明のさらに他の好ましい具体例によれば、上記容器
内に設けられ、上記垂直プレートを垂直位置に保持する
手段が含まれる。たとえば、これら手段は上記第１およ
び最終容器の端部に対してそれぞれ固定されている一対
のブロックと、上記第１および最終容器の各外側隔壁に
対して固定さ　　　　　ｌれている第３ブロックとから
成り、上記電極支持体の内側が上記一対のブロックによ
って係止され、かつその外側が上記第３ブロックによっ
て係止されて上記電極支持体を垂直位置に保持するよう
に、上記ブロックが上記容器内に配列されている。

本発明のさらに他の好ましい具体例によれば、上記容器
、上記電極支持体および上記ブロックはアクリル酸メチ
ルのプラスチックから作られている。また上記電極支持
体はポリテトラフルオロエチレンから作られている。

スラブゲルはアガロースから成ることが好ましい。

さらに本発明によれば次の方法が提供される。

即ち、水平スラブゲルに形成された液溜めに種々の分子
量を有する各分子の溶液を加え、その後上記ゲルを電気
泳動により処理し、それぞれ特定の分子量に特徴的な局
在帯を生成し、上記分子の混合物から所定の成分を分離
する方法において：それぞれ流動緩衝液を含む少なくと
も３つの離隔した別個の連続容器を設け、ただし第１お
よび最終容器には電極が設けられ； 隣接する容器をそれぞれ水平に架橋しているスラブゲル
含有プレートを配置し、これらプレートは上記すべての
容器間の間隙を被覆しており；各上記スラブゲルの両端
部と、隣接対応容器中に存在する流動緩衝液との間で最
初に毛管接触を確立し； 第１および最終容器中に取り外し可能な垂直プレートを
配列し、電気伝導線は上記垂直面に沿って上記流動緩衝
液中に延びるように配列されて電極を構成し； 上記両１！極を望ましい単一の電力供給源に接続し； 上記ゲルスラブ内に生成した局在帯を視覚化することか
ら成る方法。

上記方法は多数ＤＮＡ試料の分離に好ましく適応するこ
とができ、かつ上記スラブゲルは通常アガロースから成
っている。

本発明の他の好ましい具体例によれば、次の方法が提供
される。即ち、異なるゲルスラブ上における多数Ｉ）Ｈ
Ａ試料を分離する方法において：相互に可変距離を置い
て平行な状態で設定可能な少なくとも３つの１ＩＪＩ隔
した別個の連続細長容器ご設け、各容器は垂直な平行隔
壁を有し、かつ第１および最終容器は取り外し可能な白
金Ｎ、極を含んでおり； 各上記容器に流動緩衝液を加え、上記第１および最終容
器内における上記流動緩衝液は上記取り外し可能な白金
電極と接触しており； 複数の水平ガラスプレート上にそのプレートの表面から
約２削の距離を置いてそのプレートと平行に液溜め形成
くし状部材を配置し、かつそのプレート上に５０Ｃで均
一化したアガロース溶液を注ぐことにより、列状の液溜
めを有する複数のアガロースゲルスラブを調整し； 各アガロースゲルスラブの液溜めにＤＮＡ試料を導入し
； 各水平プレートが隣接細長容器を水平に架橋するように
、アガロースゲルスラブ含有水平プレートを配列し； 各上記アガロースゲルスラブの各端部を吸収シート材の
一方の縁部で被覆し、各吸収シート材の他方の縁部を隣
接する容器中に存在する各流動緩衝液中に浸漬し； 各容器中に収納されている取り外し可能な白金電極を望
ましい単一の電力供給源に接続し、かつ電気泳動を行い
； 上記アガロースゲルスラブ中に生成した局在帯を視覚化
することから成る多１ＤＮＡ試料の分離方法。

上記電気泳動は通常一対のゲルにつき室温で約１５０ｖ
で約４時間行われる。さらに上記視覚化は緩衝液中の臭
化エチジウムでゲルを染色させ、かつ短波紫外光線で染
色ゲルを直接発光させることによって行われる。

次に、本発明を図面に従って詳細に説明する。

図面において、特に第１図から＠３図において、多数の
アガローススラブゲルの電気泳動用装置が例示されてい
る。この装置はこの装置自体および単一の電力供給源を
用いて、複数の、たとえば１２個の異なるスラブゲル上
において多数のＤｌｉＡ試料を分析するように特別に構
成されている。

図示されている装置は大部分プレクシグラス（Ｐｌｓｘ
ｉｇｌａｓ）　　（登録商標）から作られている。

この装置は複数の、たとえば１２個の同じような細長箱
状容器１，２．・・・１１および１２から成っている。

図面に示されているように、各容器の上端部は完全に開
放されており、かつ特にｉ８２図および第３図に示され
ているように、上記容器は長方形の断面形状を有してい
る。この実施例における容器は垂直隔壁１α、２α、・
・・１１α、１２αおよび１ｂ、２ｈ、・・・１１ｊ５
，１２Ａから作られている。図示されているように、隔
壁１ａおよび１ｈ、２αおよび２ｂ、・・・１１αおよ
び１１ｂ。

１２αおよび１２Ａはそれぞれ底部１ｃ、２ｃ。

−１１０，１２Ｃおよび端部分１ｃｔおよび１ｇ。

２ｄおよび２−９・・・１１ｄおよび１１１．１２ｄお
よび１２ｇによって相互に接続されている。上記部材の
すべてはプレクシグラスから作られているがこれら部材
はテフロン（Ｔｅｆｌｏｎバ登録商標、）のような他の
望ましい材料から作ることもできる。

複数の容器１，２．・・・１１および１２を組立てるた
めに、第１図および第２図にすべて示されているように
、取り外し可能な垂直プレート１３および１４は各容器
１および１２に対して垂直縦方向に配置されている。各
垂直プレー）１３または１４は電極支持体を構成すると
ともに１つの電気的アウトレット１５または１６が設け
られており、各アウトレットは当業者にとって周知の型
の望ましい単一電力供給源（図示せず）に接続するよう
に構成されている。各垂直プレート１３または１４は白
金ｌ１１１７または１９を有しており、この白金線はア
ウトレット１５または１６から垂直プレート１３または
１４に沿って容器１または１２に存在する流動緩衝液２
１または２３の中まで延びている。各垂直プレート１３
または１４のこの配列は、各容器１または１２と一体状
の電極を効果的に構成している。これら垂直板は実際プ
レクシグラスから作られているが、テフロンまたは他の
望ましい材料も使用することができる。プレクシグラス
はアクリル酸メチルブラチックの商標であり、これに対
してテフロンはポリテトラフルオロエチレンの商標であ
る。他の容器２・・・１１もまた同じ流動緩衝液２２・
・・２４を含んでいる。

垂直プレート１３および１４を垂直位置に確実に保持す
るために、各容器には一対のブロック２５および２７が
設けられ、これらブロックは内慄垂直隔壁１ｂおよび１
２αに対してそれぞれ固定されている。この構造は図面
の第１図に例示されている。各容器１および１２にはま
た第３ブロック２９が設けられており、この第３ブロッ
クは各外側垂直隔壁１ａまたは１２Ａに対して固定され
ている。図面において例示されているように、電極支持
体１３または１４を構成している垂直プレートの内側を
一対のブロック２５．２７によって係止するように、ブ
ロック２５，２７および２９は各容器１，１２の内側に
配列されている。

これに対して電極支持体１３または１４の外側は第５ブ
ロック２９により係止されている。この配列により各電
極支持体１３および１４は垂直位置に保持することがで
きる。

図面に示されているように、すべての容器１゜２、・・
・１１および１２は相互に本質的に平行に設定されてお
り、かつ２つの容器の間の距離を必要に応じて変更調節
できるように表面上に配弁されている。

例示されている装置は容器１，２．・・・１１，１２の
間における間隙を完全に被覆するように一対のアガロー
スゲルスラブ含有水平板３１および３３を含んでいる。

図示されているように、水平プレートは２つの連続する
細長箱状容器１，２．・・・１１．１２に渡って架橋状
に配列されている。容器１，２．・・・１１．１２に渡
ってプレート３１゜３３を配列する場合、これらプレー
トの縁部が容器３および５の内側隔壁１ｈ、２α；２ｈ
、・・・１１α；１１ｂ、１２ｅＬとそれぞれ平行にな
るように注意する必要がある。例示具体例において、後
に理解されるように、本発明の装置の実際の操作性を高
めるためにプレー）３１．　３５の外縁部は隔壁１ｂ、
２ａ；２ｂ、　・１１ａ；１１ｂ、１２α　　　　　［
をわずかに越えて延びている。図面において、連続状容
器を架橋するプレートは単に２つのみが示されているけ
れども、プレートおよび容器の太きさならびに多量の検
査を同時に行う必要性に応じて、それよりも多くのプレ
ートを各容器に渡って設けることができることは明らか
である。

上記において述べたように、プレート５１．５５上に形
成されたゲル３５は列状の液溜め３７を有しており、こ
の液溜め３７は容器１２に最も接近しているプレー）３
１．３５の縁部付近に、各プレー）３１．５５上に、こ
れらプレートの表面から約２關離して液溜め形成くし状
部材（図示せず）を配置することにより形成されたもの
である。

第１図に示されている状態でプレート３１，５３が容器
１，２．・・・１１，１２上に配置された後、二層工、
−・ゲイジ（ｔｗｏ−ｐｌｙ　Ｎｕ−Ｇｏｕ２＋・）（
登録商標）含浸材３９が配列され、この場合図面に例示
されているように、含浸材の一方の端部４１はゲル６５
を被覆するように設けられている。

含浸材３９の外端部分４５は図面に示されているように
懸架され、流動緩衝液２５中に浸漬されている。なおこ
の緩衝液２３は試験を開始する前にすべての容器に加え
られているものである。もちろん各ゲルに対して２つの
シート３９が用いられる。

本発明の操作は、その方法に関する説明のところですで
に述べたとおりである。

実施例 さらに本発明を次の実施例に従って説明する。

ウィルスＤＮＡの調製 人間のサイトメガロウィルス（ＨＯＭＶ）　菌株ＡＤ１
６９（バージ、　−（Ｈｏｒｓｈｅｙ　）、ペンシルバ
ニア響ステート・ユニバージティー（Ｐｅｎｎ５ｙｌｖ
ａｎｉａ　５ｔａｔｅυｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　）のドク
ター・ア・う、プ（Ｄｒ　ＩＦ、　Ｒａｐｐ　）から得
られた）を人間の工ＡＩＩＦＰ−１肺線維芽細胞中にお
いて繁殖し、ウィルスをポリエチレングリコール沈殿に
より細胞外流体から採取した。１０〜ｂ 配に従って急速沈降することによりウィルス粒子を精製
した。１％ＢＤＢおよび１５０μＰ／ＩＬｌ蛋自分解酵
素Ｋ（シグマ）による細胞溶解、それに続（０ａＯＬ−
臭化エチジウム中における等密度遠心法により、ＤＮＡ
を精製ウィルス粒子から単離した。

組換型プラスミドの構造、トランス７１クシ。

ンおよび単離 スベクター（８ｐ＠ａｔｏｒ　）等（ジャーナル・　オ
プ・バイｏｏジー（、Ｔ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　４２巻
、１９８２年、５５８〜５５２頁）によって述べられて
いるように、アンピシリン耐性およびテトラサイタリン
耐性マーカーを含むプラスミドｐＡＴ１５５　　を大腸
菌菌株ＨＢ１０１から抽出し、平衡０ａＯＬ−臭化エチ
ジウム遠心沈殿法により精製した。プラスミドおよびＩ
ｉＯＭＶ　ＤＮＡ５を２０ｍＭのトリスＨＯＬ、　ｐＨ
７，４，７ｍＭ　ＭｇＯ２２および（Ｓ　Ｑ　ｍＭのＮ
ａ０ｔ中において３７Ｃで２時間に渡り５〜１０単位の
限定エンドヌクレアーゼＨ１ｎａ　ｍ　（ベーリンガー
・マン八イム・カナダ（Ｂｏ＠ｈｒｉｎｇｓｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ　０ａｎａｄａ　）　）で別々に分割し、その
後７０Ｃで１０分間酵素により不活性化した◎さらにウ
ィルスＭｉｎｉ　ｌＩ［限定７ラグメントを自由端の４
＝１のモル比で直線状プラスミドと混合し存〇その後Ｄ
Ｉム濃度を２０μ？、４ｄ　　に稠節し、次にこの混合
物を２０１１Ｍのトリスｍａｔ、　ｐｉ！　Ｚ　６．１
０ｍＭのＭｇＯ１２ｅ　　１０　ｍＭのＤＴ！およびα
６關。

のムＴＰにおいて１〜２単位のＴ４ＤＭムリガーゼ（Ｂ
ＭＯ）により４Ｃで１６時間培養した。大腸菌への結紮
プラスミドのトランス７１クシ、ンは、ジーン（Ｇ＠−
・）、８巻、１９８０年、２６７〜２７８頁に開示され
ているハ、チソン（Ｈｕｔｏｈｉｓｏｎ　）およびハル
ボルソン（Ｈａｌマｏｒｓｏｎ　）の０ａＯｔ２方法に
より行った。さらにアンピシリンのみを含むｔ５−の栄
養プラス中に５０μ？、４ｕ　　のアンピシリンおよび
４μＰ／ｍのテトラサイクリンを含有する選択寒天プレ
ートから、ＨＢ１０１含有組換型ＨＯＭＶプラスミドの
コ四ニーを直接採取し、その後５７Ｃで一晩培養した。

次に工、ペンドルフ・マイクロ７１−ジ（Ｉｐｐ＠ｎ１
ｏｒｆ　ｍｉｏｒｏｆｕｇ＠）において培養菌を１２．
８００）で１分間遠心分離することにより細ｍペレ、ト
を調製した。２５％のスクロース、５０　ｍＭのトリｘ
ａａｔ、ｐＨ７，５，１００ｍＭのＩＩＩ　Ｄ　Ｔ　Ａ
、　　α１％のトリト＞Ｘ−１００および１り／コのリ
ソチームを含む２０μｔの溶液中に各ペレットを懸濁し
た。室温で１０分後、混合物を４０秒間熱湯に浸漬し、
その後室温で１０分間遠心分離した。試験管の底に溜っ
たゼラチン物質と接触させることなく上澄み液を除去し
、そしてアガロースゲル電気泳動による後のプラスミド
分析のために−７００で保存した。

アガロースゲル電気泳動による組換型プラスミドの識別 ＴＢ亘緩衝液（１１Ｍのトリス、ｐＨ８，５、α、ＩＭ
のホウ酸および２　ｍＭのＩＩＤ’ｌ’Ａ）の１００ｄ
中において調製した１％アガローススラブゲル（１４Ｘ
１８Ｘα５　ｍ　）上に、各清澄溶解液から採取した１
０μｔの７リコートを流し込んだ。向かい合う緩衝液含
有容器の内側上にアガロースゲルを注意深く２つずつ配
列し、かつそれらの両端部を二層ヌー−ゲイジ゛（登録
商標）（ジョンソン・アンド・ジ、ンソン、インフンボ
レーテ、ド（１Ｔｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　、Ｔｏｈｎｓ
ｏｎ、工ｎｏ、））含浸材で被覆した。各対のゲルに対
して１５０’ｌ全部で９００７）で室温において４時間
電気泳動を行った。電気泳動後、使用した１２個のゲル
を１μ２７ｄの臭化エチジウムで染色し紫外線照射の下
で写真に写した。各実験において公知の分子量を有する
超線輪化したプラスミドをマーカーとして用いたＯ 結果および検討 ７つの緩衝液容器の内側上に保持されている１２個の異
なったアガローススラブゲル上に２１６ＤｌｆＡ試料の
全部を流し込み、次に単一電力供給源を用いて上記ゲル
全体に対して９００７で４時間電気泳動を行った。それ
ぞれの場合に鋭いＤＭＡ帯が得られ、公知の大きさを有
する組換型プラスミドによって移動された距離はゲル相
互に対して比較的一定であった（第４図）。移行率と大
きさとの緊密な関係はそれぞれのＤ１ｆＡマーカーにつ
いても観察された。本発明の電気泳動装置によれば、最
も安価な装具を用いて１日に数百の１）ＨＡ試料を好都
合に分析することができる・また実験結果によると、本
発明の基礎電気泳動装置は多用性を有することが確認さ
れた。第４図（第１０レーン］においてゲルの最下方部
分に見出されるＤＮＡ帯は挿入物を伴わずｐＡｒ　１５
３を含んでいる。

ゲル中における他のすべてのｌｌｌｉ人分子はもとのク
ローニング媒介体よりゆっくり移行し、従ってＲＯＭＶ
　　ＤＭＡの少なくとも１つのＨｌｎａ　ｌｌｉ　ｙラ
グメントを含んでいる。そのような結果によれば、ｐＡ
’ｌ’　１５５のＨｌｎｄ　■　部位にｉける異質のＤ
ＭＡの挿入および組換型大腸菌クローンの選択の両方は
最適条件のもとで行われたことが示されている。

Ｄ１１Ａマーカーとして充分に特徴づけられたプラスミ
ドを用いて、１９２個の組換型プラスミドのそれぞれの
およその大きさを測定した。第６図に示されているよう
に、Ｈｌｎｄ　ｍ　７テグメントを保有するプラスミド
は４〜１０ｃｂの間の大きさに適切に分布されていた。

大きなプラスミド（４２ｋｂまで）は小さなものほど多
くは観察されなかった。このことは転換効率がプラスミ
ドの大きさの上昇と共に直線的に低下するという事実に
関係していると思われる。その後限定エンドヌクレアー
ゼ分割部位の分析によれば、ＨＯＭＶゲノムの７０％以
上が組換型の全系列において表示された。そのような結
果により、本発明の電気泳動装置は大規模なりローン作
業において有用であることが確認された。

アガロースゲル電気泳動はＤＮＡ分子を分析するのに簡
単で、便利でかつ安価な方法を提供する。

ＤＮＡゲノムの物理的遺伝地図作製はそのようなゲルに
大きく左右される。しかしながら、小さなＩＩＮＡフラ
グメント（α３　ｋｂ以下）の場合、通常用いられるゲ
ル装置においては検出するのに依然として難しいことが
時々ある０物理的遺伝地図の作成中そのような７ラグメ
ントを見落とした時、ＤｌｉＡ分子上におけるすべての
限定エンドヌクレアーゼ部位の正確な位置を保証するこ
とは不可能となる。この研究において、ＰＡＴ　１５３
よりほん　　　　１のわずか大きな４２個の組換型プラ
スミドは、超線輪化した形のり、ＨＡ分子を選別するこ
とにより検出した（第５図）。限られた数の大きさごと
のグループ（第６図）の中でしばしば観察されかつ常に
分布されるこれらプラスミドは、殆どＨＯＭＶゲノムの
わずかなｌ１ｉｎｌ　ｍフラグメントを保有している。

本発明の電気泳動装置は組換型クローンの選別のみなら
ず異なったウィルス性ゲノムの限定遺伝地図を作成する
ために、または精製中カラム流出液部分中におけるＤＮ
Ａ変性酵素の活性を追跡するために現在使用されている
。この独特な装置は多数の試料の相対的ＤＩム帯移動度
を比較するために２０以上の大規模なゲル中に等しい移
行率を付与し、かつ本発明の装置によれば、製造または
購入する場合もっと高価な他の装置により得られる結果
と明らかに等しい結果が得られる＠本発明装置の高い試
料の処理能力および簡便性のために各実験においてはそ
れにふされしいより安価な備品が要求される。用途の広
いことは本発明装置のもう１つの利点である：（１）大
型のスラブまたは小型のスラブを連続して実験すること
ができる；および（１１）低濃度および高濃度ゲルにお
ける１１人分子の同時移行もまた可能である。電極とゲ
ルスラブとの間に均一な電気的通路を設けるために緩衝
液保持能力の高い含浸材を用いる必要がある場合でも、
ゲルを連続して実験している間、特別な問題に遭遇する
ことはなかった。従って本発明の電気泳動装置はアガロ
ースゲル中におけるＤＮＡ分離に対して最も効果的で有
用なものであると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動装置の斜視図である；第２図
は第１図に例示された装！の正面図であり、部分的に断
面されている； 第３図は同じ装置の拡大断面図である；第４図は電気泳
動後、１２個の異なったアガローススラブゲル上に流し
込んだ２１６Ｄ１ｆＡ試料の帯を示している； 第５図はＨｚｎａ　ｍフラグメントを保有するプラスミ
ドの大きさの分布状態を示している；第６図は限定され
た数の大きさごとのグループにおける組換型プラスミド
の大きさの分布状態を示している。 １〜１２・・・容器、１α〜１２α、１ｂ〜１１・・・
隔壁、１３．１４・・・垂直プレート、１５．１６・・
・アウトレット、１７．１９・・・白金線、２１．２５
・・・緩衝液、２５，２７，２９・・・ブロック、３１
゜３３・・・水平プレート、３５・・・ゲル、３７・・
・液溜め、３９・・・含浸材。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、相互に可変距離を置いて本質的に平行に連続的に設
   定され、流動緩衝液を含んでいる一連の少なくとも３つ
   の細長い箱状容器と； 上記第１および最終容器のそれぞれには、単一の望まし
   い電力供給源に接続されている電極が設けられており； それぞれスラブゲルを含んでいる複数の水平プレートと
   ；各プレートは隣接状に離隔した別個の容器の上方に渡
   って加橋状に配置されており； 上記水平プレートはこれらすべての容器間の間隙を被覆
   しており； 上記スラブゲルの一方の端部と所定の容器内に存在する
   流動緩衝液との間で毛管接触することのできる第１手段
   と； 上記スラブゲルの他方の端部と次の容器中に存在する流
   動緩衝液との間で毛管接触することのできる第２手段と
   から成ることを特徴とする多数アガローススラブゲルの
   電気泳動装置。 ２、各容器の先端部は開口されており、かつ水平な垂直
   隔壁によって形成された長方形断面を有しており、これ
   ら隔離は底部および２つの端部によって相互に接続され
   ており、上記水平プレートは２つの隣接する容器の向か
   い合う垂直隔壁上に載置されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、上記第１および最終容器内において電極支持体を構
   成している垂直プレートを含み、少なくとも１つの電気
   的アウトレットが上記電力供給源および電気伝導線に接
   続している上記垂直プレート上に設けられ、上記伝導線
   は上記アウトレットから上記垂直プレートに沿って上記
   流動緩衝液中に延びて上記電極を構成していることを特
   徴とする特許請求の範囲第２項記載の装置。 ４、上記容器内に設けられ、上記垂直プレートを垂直位
   置に保持する手段を含むことを特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の装置。 ５、上記手段は上記第１および最終容器の端部に対して
   それぞれ固定されている一対のブロックと、上記第１お
   よび最終容器の各外側隔壁に対して固定されている第５
   ブロックとから成り、上記電極支持体の内側が上記一対
   のブロックによって係止され、かつその外側が上記第３
   ブロックによって係止されて上記電極支持体を垂直位置
   に保持するように、上記ブロックが上記容器内に配列さ
   れていることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の
   装置。 ６、上記容器、上記電極支持体および上記ブロックはア
   クリル酸メチルのプラスチックから作られていることを
   特徴とする特許請求の範囲第５項記載の装置。 ７、上記電極支持体がポリテトラフルオロエチレンから
   作られていることを特徴とする特許請求の範囲第５項記
   載の装置。 ８、毛管接触可能な上記手段は含浸性紙シートから成る
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の装置。 ９、毛管接触可能な上記手段が液体を吸収することがで
   きる合成シート材から成ることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の装置。 １０、上記スラブゲルがアガロースから成ることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の装置。 １１、相互に可変距離を置いて本質的に平衡な状態で連
   続的に設定可能であり、かつ流動緩衝液を含む少なくと
   も３つの細長い箱状容器と； 各容器の上端部は開口されており、かつ垂直な平行隔壁
   によって形成された長方形断面を有しており、この隔壁
   は底部および２つの端部によって相互に接続されており
   ； それぞれ電極支持体を構成している一対の取り外し可能
   な垂直プレートと； これら垂直プレートは第１および最終容器のそれぞれに
   おいて長手方向に設けられており； 各上記垂直プレート上に設けられ、かつ望ましい単一電
   力供給源に接続されている少なくとも１つの電気的アウ
   トレットと； 上記アウトレットから上記垂直プレートに沿って上記緩
   衝液中まで延びており、各容器と一体状の電極を構成し
   ている白金線と； 各上記細長容器の端部に対してそれぞれ固定された一対
   のブロックおよび上記第１および最終容器の各外側垂直
   隔壁に対して固定された第３ブロックと；上記電極支持
   体の内側が上記一対のブロックによって係止され、かつ
   その外側が上記第３ブロックによって係止され、これに
   より上記電極支持体を垂直位置に保持するように、上記
   ブロックが上記第１および最終容器の内側に配列され； 連続状細長箱状容器の上方に渡って架橋状に配列された
   少なくとも１つのアガロースゲルスラブ含有水平プレー
   トと；各水平プレートは隣接する箱状容器の向かい合う
   隔壁に沿ってそれぞれ平行な両端部を有しており； 各上記アガロースゲルスラブの端部を被覆している縁部
   と、上記細長箱状容器中に存在する各流動緩衝液中に浸
   漬されている他方の縁部とを有する吸収シート材とから
   成ることを特徴とする多数アガロースラブゲルの電気泳
   動装置。 １２、水平スラブゲルに形成された液溜めに種々の分子
   量を有する各分子の溶液を加え、その後上記ゲルを電気
   泳動により処理し、それぞれ特定の分子量に特徴的な局
   在帯を生成し、上記分子の混合物から所定の成分を分離
   する方法において： それぞれ流動緩衝液を含む少なくとも３つの離隔した別
   個の連続容器を設け、第１および最終容器には電極が設
   けられ； 隣接する容器をそれぞれ水平に架橋しているスラブゲル
   含有プレートを配置し、これらプレートは上記すべての
   容器間の間隙を被覆しており； 各上記スラブゲルの両端部と、隣接対応容器中に存在す
   る流動緩衝液との間で最初に毛管接触を確立し； 第１および最終容器中に取り外し可能な垂直プレートを
   配列し、電気伝導線は上記垂直面に沿って上記流動緩衝
   液中に延びるように配列されて電極を構成し； 上記両電極を望ましい単一の電力供給源に接続し； 上記ゲルスラブ内に生成した局在帯を視覚化することか
   ら成ることを特徴とする方法。 １３、上記スラブゲルがアガロースから成ることを特徴
   とする多数ＤＮＡ試料を分離する特許請求の範囲第１２
   項記載の方法。 １４、異なるゲルスラブ上における多数ＤＮＡ試料を分
   離する方法において： 相互に可変距離を置いて平行な状態で設定可能な少なく
   とも３つの離隔した別個の連続細長容器を設け、各容器
   は垂直な平行隔壁を有し、かつ第１および最終容器は取
   り外し可能な白金電極を含んでおり； 各上記容器に流動緩衝液を加え、上記第１および最終容
   器内における上記流動緩衝液は上記取り外し可能な白金
   電極と接触しており； 複数の水平ガラスプレート上にそのプレートの表面から
   約２ｍｍの距離を置いてそのプレートと平行に液溜め形
   成くし状部材を配置し、かつそのプレート上に５０℃で
   均一化したアガロース溶液を注ぐことにより、列状の液
   溜めを有する複数のアガロースゲルスラブを調製し； 各アガロースゲルスラブの液溜めにＤＮＡ試料を導入し
   ； 各水平プレートが隣接細長容器を水平に架橋するように
   、アガロースゲルスラブ含有水平プレートを配列し； 各上記アガロースゲルスラブの各端部を吸収シート材の
   一方の縁部で被覆し、各吸収シート材の他方の縁部を隣
   接容器中に存在する各流動緩衝液中に浸漬し； 各容器中に収納されている取り外し可能な白金電極を望
   ましい単一の電力供給源に接続し、かつ電気泳動を行い
   ； 上記アガロースゲルスラブ中に生成した局在帯を視覚化
   することから成る多数ＤＮＡ試料の分離方法。 １５、電気泳動が一対のゲルにつき室温で約１５０Ｖで
   約４時間行われることを特徴とする特許請求の範囲第１
   ３項または第１４項記載の方法。 １６、上記視覚化が緩衝液中の臭化エチジウムでゲルを
   染色させ、かつ短波紫外光線で染色ゲルを直接発光させ
   ることによって行われることを特徴とする特許請求の範
   囲第１３項または第１４項記載の方法。