JPS61122568A - 水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコースを半定量的に測定するための試験組成物、試験具および試験具の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、一般的には、酵素を含む診断試薬組成物に関
し、更に詳細には水性液体中に含まれる高濃度領域（ｈ
ｉｇｈ　ｒａｎｇｅ）のグルコースの酵素による半定量
的測定に関するものである。 ［有用性］ 尿や血液などの体液中に含まれるグルコースの半定量的
測定は、糖尿病に対する集団検診手段として重要である
ばかりでなく、糖類の摂取量をコントロールしなければ
ならない糖尿病患者にとって特に重要である。Ｓ尿病に
あっては、早期診断と継続的なコントロールが非常に重
要であるので、グルコース試験は、医師や臨床区室ある
いは家庭で糖尿病患者用の食事を取っている人にとって
極めて貴重であり、その実施が迅速かつ簡便なものであ
ると同時に、尿または血液中のグルコースの有意な変化
を検出できるだけの感度を有していなければならない、
糖尿病患者の尿グルコース濃度は、　５　、０００ａ＋
ｇ／ｄｆＬ程度かそれ以上の場合もあるので、ａ度１，
０００１ｇ／ｄｉ１．以上の高濃度領域の尿グルコース
濃度の半定量的測定が重要である８本明細書中にあって
、ｒ高濃度領域」のグルコースを　１，０ＯＯＢ／ｄｉ
　〜ＩＱ、０００ｍｇ／ｄＪＬあるいはそれ以上の濃度
のグルコースと定義するが、この高濃度領域のグルコー
スの半定量的評価は、糖尿病性昏睡と薬物やアルコール
、外傷によって惹起された昏睡との識別診断やインシュ
リン必要度の治療学的監視に役立つという少なくとも　
２つの理由によって重要である。非常車態における試験
でグルコースの濃度が非常に高い場合には、糖尿病性昏
睡の疑いがある。またインシュリンの投与量が不十分で
ある場合には、尿グルう−スレベルが高くなるので、高
濃度領域のグルコースを半定量的に測定できる試験は、
インシュリン必要度の治療学的監視にも有用である。 ［発明の音量］ 臨床的に実施される診断用グルコース試験は、多くの場
合、β−Ｄ−グルコースに対するグルコースオキシダー
ゼの酵素的作用　【反応式（１）】と、色の変化により
視覚的に検出可能な色素原（Ｃｒ）の酸化された状態（
Ｃｒ　ｔ　）への変化　［反応式（２）Ｊとに基づいて
いる。 ペルオキシダーゼ Ｈ２Ｏ２＋Ｃｒ　　　　　　　　　　　［２０＋　Ｃｒ
ｔ　　　・・・（２）この試験は、試験試料との接触後
に発現する色を適当なカラーチャートを用いて目視で比
較することによって、グルコース濃度を半定量的に測定
できる試験具を用いることができれば非常に便利である
。このような半定量的測定は、反応させた試験具の反射
率を計器で測定することによっても行うことができる。 米国特許第２，８４８，３０８号や同第２，９１２，３
０９号などの以前の特許には、いずれもグルコース試験
「スティック」が開示されており、これらの特許におけ
るグルコース試験にあっては、グルコースオキシダーゼ
、ペルオキシダーゼ、ａ−トリジンニ塩酸塩およびホウ
酸を含む微細な粉末混合物中にゼラチン溶液でコーティ
ングされたスティックを浸漬していた。この混合物の約
７５重量％はホウ酸であって、かかる特許にあっては、
ホウ酸はタルク、でん粉、クエン酸ナトリウム−クエン
酸混合物、酸化チタン、シリカゲルなどの「フィラー」
に置き換えることができるとされている。そして、この
ようにして作製したグルコーススティックは、グルコー
スを含む液で湿らすと青色に変色するものであった。 以来、グルコースの濃度の違いを半定量的に識別する技
法を改善するために、酵素を含むグルへ　　コース試験
組成物の構成成分を種々変更することが行なわれている
。しかしながら、改善された多数のシステムにあっても
、グルコースの濃度が約　５００■ｇ／ｄＩＬを越える
と、色素原の色が暗くなりすぎて高濃度領域のグルコー
スの濃度差を識別することが不可能である。英国特許明
細書第　１．４８４．３５９号には、色素原として、〇
−トリジン、テトラメチルベンチジンおよびテトラエチ
ルベンチジンを用い、　０．５０、１００．　２５Ｇ、
５００および　１，０００鵬ｇ／ｄｌのグルコースを含
む水性試験試料を試験した結果が記載されている。そし
てグルコース濃度が０から５０層ｇ／ｄｉに増加した場
合、これら色素原は、それぞれ、黄色から鮮明な緑色に
変色する。しかしながら、グルコース濃度が５００６／
ｄｌを越えると、酸化された色素原の色は黒ずんできて
、各色素原について、それぞれ、オリーブブラック、黒
色そして濃い緑色が観察される。こうした結果は、高濃
度におけるグルコースの半定量的測定の問題点、すなわ
ち既知の色素原では黒色もしくは濃い緑色が発現するた
めに５００ｍｇ／ｄｉを越えるグルコースを測定する場
合にはかかる試験具にあってはその有用性が減じられる
という問題点を際立たせるものである。かかる問題点は
、色の変化を計器を用いて測定する場合にあってはそれ
ほど重大ではないもののやはり存在する。 米国特許第４，３４０．１１１８９号にあっては、酵素
を含むグルコース試験具を用い１厘−アニシジンなどを
第２の色素原として添加することによって、視覚的に測
定可能なグルコースの濃度領域を拡大するのにある程度
成功している。中程度の濃度領域（すなわち、　５００
１ｇ／ｄ文〜　１，０００■ｇ／ｄｌ　）のグルコース
を定量する場合には、米国特許第４，３０３，７５３号
に開示されているように、水溶性ヨウ化物塩とポリ（ビ
ニルピロリドン）とを色素原として用いるグルコースオ
キシダーゼ錯形成法（ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ
　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で適切な定量を行うことが
できる。 一方、上述したのとは別に、ホウ酸もしくはその誘導体
による糖類のキレート化が報告されている　［ニス、エ
イ　バーカー（Ｓ、　Ａ、　Ｂａｒｋｅｒ）ら、［カル
ボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈ７ｄｒａｔｅ
Ｒｓｅａｒｃｈ）２８Ｊ　１９７３年３３〜４０ページ
参照］、シかしながら、出願人の知る限りでは、この現
象は、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコー
スの測定における問題点を解決するためには、まだ利用
されていない。 ［発明の概要］ 本発明は、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグル
コースを半定量的に測定するための試験組成物、試験具
および方法を提供するものであって、グルコースオキシ
ダーゼ、過酸化物活性成分、検出可能な比色応答を与え
ることのできる発色指示系およびｐ）！約７程度より大
きな初期ｐＨを与えることのできるホウ酸塩緩衝剤から
なることを特徴とするものである０本明細書中にあって
、高濃度領域（ｈｉｇｈ　ｒａｎｇｅ）のグルコースと
は、約　１，０００腸ｇ／ｄｆＬ〜約１０，０００鳳ｇ
／ｄ文の濃度領域のグルコースと定義する。試験組成物
は、キャリヤーマトリックスと一体化して固体状態の試
験具とすることもできる。高濃度領域のグルコースは、
　５分以内、好ましくは約２分はどで、目視または計器
により測定することができる０本発明は、高濃度領域の
グルコースの視覚による半定量的測定に、特に、有用で
ある。 ［発明の詳細な説明］ ｐＨ約７程度より大きな初期ｐＨを与えることのできる
ホウ酸塩緩衝剤を含むグルコースオキシダーゼ試験組成
物は、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコー
スの半定量的測定に有用であることが判明した。特に好
ましい試験フォーマットは、試験組成物とキャリヤーマ
トリックスとを一体化して固体状態の試験具を形成する
ことによって作製することができる０本発明の好ましい
適用対象は血液や血清、血漿、尿、を髄液などの体液で
あるが、本明細書にあって開示する試験組成物、試験具
および方法は、工業分野の水溶法にも適用可能であると
解すべきである。 高濃度領域のグルコースの濃度差の識別を改善すること
を目ざした実験的な努力にあっては、ヘ　　クエン酸塩
、リン酸塩、Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）
グリシンおよびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジンを
含む多くの緩衝剤がグルコースオキシダーゼ／ペルオキ
シダーゼ系とともに用いられてきたが、高濃度領域にお
けるグルコースの濃度差を識別する上で顕著な改善が実
現されているのは、　ｐＨ約７程度より大きな初期ｐＨ
を与えることのできるホウ酸基を緩衝剤に用いた場合の
みである。 １、試験構成成分 米国特許第４．３０９．７５３号に開示されているよう
なグルコースオキシダーゼ試験組成物は、５００〜１，
０００ｍｇ／ｄｉの濃度のグルコースの適切な半定量測
定を実現しえているが、かかる従来技術においてこれま
でに使用されてきた緩衝条件に代えて、ｐＨ約７程度よ
り大きな初期ｐＨを与えうるホウ酸塩緩衝剤を用いるこ
とによって、高濃度領域のグルコース、すなわち約　１
，０００１ｇ／ｄｉ〜約１０，０００−ｇ／ｄｉの濃度
領域のグルコースの半定量的測定が著しく改善された。 本発明にあっては、Ｚ−Ｂ（ＯＨ）２の形の酸と塩基と
の混合物をホウ酸塩緩衝剤と定義する。かかるホウ酸塩
緩衝剤における平衡は、概略的には、ＯＨ Ｚ−Ｂ（ＯＨ）２＋　８２０　　：　　Ｚ　−’９Ｂ　
−ＯＨ＋　Ｈ”ＯＨ ［式中、Ｚ基は、水酸基（−ＯＨ）もしくは何らかの電
子吸引性置換基であってよい、］で示される。 たとえば、Ｚが水酸基であれば、この化合物はホウ酸［
８（Ｑ）Ｉ）３］である。また２がフェニル基であれば
フェニルポロン酸となる。好適なポロン　ジヒドロキシ
トとしては、ホウ酸、フェニルポロン酸、ｐ−ニトロフ
ェニルポロン酸、４−メトキシフェニルポロン酸ならび
にその他の７レーンポロン酸およびその誘導体がある０
本発明においてアレーン基は、少なくとも　１個の芳香
環を含む炭化水素と定義されＺ置換基として使用できる
電子吸引性基の　１例であり、その芳香環は一〇（ＯＨ
）２基のアニオン形態を電子共鳴により安定化するよう
に位置させる。芳香環に置換基として電子吸引性基を含
むｐ−ニトロフェニルポロン酸のような７レ一ン誘導体
も、本発明においては有用である。 ホウ酸塩緩衝剤は、ホウ酸（Ｚ−ＯＨ）やフェニルポロ
ン酸などの７レ一ンボロン酸誘導体あるいはＺ−Ｂ（Ｏ
Ｈ）２化合物の混合物から、当業者にとっては公知の通
常用いられる実験室的方法により調製することができる
。たとえば、ホウ酸緩衝剤の溶液は、ホウ酸を水酸化ナ
トリウムや水酸化カリウムなどの塩基でｐＨ７より大き
な初期ｐＨまで滴定することにより調製することができ
る。ホウ酸緩衝剤を用いる場合には、初期ｐ）Ｉは約８
．５〜約８．５の間とするのが好ましい、乾燥試験組成
物に使用するためには、緩衝液から水を除去すればよく
、この場合、再び水に溶かして使用する際に所望の初期
ｐＨが得られるように粉末化しておく。 本発明にあって使用される好適な発色指示系には、ポリ
（ビニルピロリドン）と水溶性ヨウ化物塩の組合せおよ
び４−７ミノアンチピリンと適当なカップラー、すなわ
ち、ジクロロヒドロキシベンゼンスルホン酸、４−メチ
ルカテコール、２，４−ジヒドロキシ安息香酸および３
，６−シヒドロキシナフタレンー２．７−ジスルホン酸
などとの組合せがある。ポリ（ビニルピロリドン）はＧ
ＡＦ社にュ−ヨーク州ニューヨーク）からＰＶＰ−［１
５（平均分子量１０，０００）　、　ＰＶＰ−に３０（
平均分子量４０，０００）　、　ＰＶＰ−ＫｆｔＯ（平
均分子量１８０，０００）、　ＰＶＰ−に９０（平均分
子量３［ｔＯ，０００）など様々な平均分子量のものを
入手することができる。指示系として好ましいのはポリ
（ビニルピロリドン）と水溶性ヨウ化物塩の組合せで、
ポリ（ビニルピロリドン）は分子量が大きいもの（ＰＶ
Ｐ−に９０）が最も好ましい、水溶性ヨウ化物塩として
は、ヨウ化バリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、ヨウ化アンモニウムおよびヨウ化テトラアルキルア
ンモニウムが好適である。ヨウ化物塩はイオン化が可能
でなければならず、塩の陽イオン部分は、グルコース酸
化の酵素触媒作用を妨害してはならない０本発明におい
ては、経済的理由と入手のしやすさから、ヨウ化カリウ
ムが特に好ましい。 ち　　グアＬ、　Ｄ　−Ｘ第１′グー−ｔ／（Ｅ・０・
１・１・３・４）＃１“イルス拳うボラトリーズ社（イ
ンジアナ州エルクへ−ト）またはシグマ・ケミカル社（
ミズーリ州セントルイス）から入手することができる０
本発明にあって、有用な過酸化物活性を有する物質は、
様々な有機物や無機物の中から選ぶことができる。たと
えば、セイヨウワサビやジャガイモのペルオキシダーゼ
など、植物ペルオキシダーゼを使用することができる。 また不十分ではあるが。 ヘミン、ヘミン誘導体、ヘモグロビンおよびヘマチンを
使用することもできる。 更に、検出可能な応答の発生を妨害しなければ、湿潤剤
や安定剤、シックナーなどを添加することもできる。好
適な湿潤剤としては、シグマケミカル　社（ミズーリ州
セントルイス）から商標名サルコシル（５ａｒｋｏｓ２
１＠　）の下に入手可能なトラウロイルサルコシン；　
　ＧＡＦ社にューヨーク州ニューヨーク）によって販売
されているポリオキシエチル化されたエリルアルコール
（ａｅｌ！１ａｌｃｏｈｏｌ）の商標登録出願中のエマ
ルフォル（Ｅｍｕｌｐｈｏｒ）　ＯＮ　８７０およびシ
グマケミカル　社から入手することも可能なポリエチレ
ングリコール−ｐ−インオクチルフェニル　エーテルに
対するローム−アンド争ハス社の登録商標であるトライ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００がある。これらの構
成成分を使用して試験具を作製することはよく知られて
おり、従って、構成成分の選択には特別の技量を必要と
しない。 試験組成物は、びん入りの試薬の形、試薬の形の試験組
成物を含む脆弱なカプセルの形、丸剤または錠剤の形で
提供することができる。 ２、　キャリヤーマトリックス 本発明の好ましい形態は、適当なキャリヤーマトリック
スを水性試薬混合物の形の試験組成物で処理することに
よって作製される。 キャリヤーマトリックスは、試験組成物に関しては実質
的に不活性であり、かつ試験対象の水性試料に関しては
多孔性および／または吸収性である物質である限り、試
験組成物の構成成分と一体化できる物質であればいかな
る物質であってもよい。「キャリヤーマトリックス」と
は、水または他の生理的液体にさらしたときに溶解せず
構造に全く影響を受けない吸湿性または非吸湿性のマト
リックスのことである。使用できる好適な吸湿性マトリ
ックスとしては１紙、セルロース、木、合成樹脂フリー
ス、織物あるいは不織布などがある。使用できる好適な
非吸湿性マトリックスとしては、グラスファイバ、ポリ
マーフィルム、微孔性の膜などがある。 従って、本発明の試験具の作製においては、このような
キャリヤーマトリックスなる概念は全て使用できること
を認識すべきである。マトリックスと構成成分とを一体
化させるには、成分を液状または半液状で均一に合わせ
た系をマトリックスに含ませてから硬化させ、これによ
って、一体化することもできる。その他機孔性膜または
ポリマーフィルムを使用したマトリックスフォーマット
も考えられる。微孔性膜は、出来合いの膜を入トするか
、転相などの技法により作製することができる。好適な
ポリマーフィルムは、たとえばスチレンとブタジェンの
８０：４０の共重合体によって形成したラテックスポリ
マー懸濁液に基づいた市販のラテックス配合体を用いて
作製することができる。その他の天然または合成ポリマ
ーあるいはその混合物も使用することができる。このよ
うなフィルム配合体の例は、米国特許第３，８３０，９
５７号および同第４，３１２，８３４号に開示されてお
り、ここでは引例として挙げるにとどめる。 ３、試験具 好ましくは、試験具は、キャリヤーマトリックスと試験
組成物とを一体化し乾燥させて作製する。 本発明の好ましい方法にあっては、吸湿性キャリヤーマ
トリックス（たとえば濾紙）に試験組成物水溶液を含浸
させて乾燥し、次いで、乾燥させた含浸マトリックスを
支持部材に付着させる。マトリックスに含浸させる溶液
は、所望の初ＤｐＨが得られるように調製する。全血試
料を試験する場合には、乾燥含浸キャリヤーマトリック
スを試料でコーティングした後余分な試料を洗浄するか
ふへ　　　き取ればよい、乾燥は、一体化させた試験組
成物に悪影響を及ぼさない方法であればいかなる手段に
よって行なってもよいが、通常は、エアオーブンを用い
て行うのがよい、キャリヤーマトリックスと試験組成物
との一体化は、コーティング、浸漬、散布、噴霧、ある
いはプリンティングなどのいずれの方法によっても行う
ことができる。 乾燥キャリヤーマトリックスはカットして、たとえば硬
質または半硬質のポリスチレンフィルムストリップのよ
うな支持部材の一端に取り付けることができる。支持体
に乾燥マトリックスを固定化させるには、３Ｍ社（ミネ
ソタ州セントボール）製の商標名ダブル　スティックｅ
など市販の両面粘着テープを使用することができる。 ４、試験構成成分の濃度範囲 固体状態の試験具を作製するのに使用される試薬溶液中
の構成成分の濃度範囲は次のとおりである。 可能な範囲　　　　好ましい範囲 ペルオキ シ　　ｙ　　　Ｈゼ　　　２００〜５０００ＩＪ／ｍｌ
　　　　１０００〜２０００Ｕ／ｍｌ初　　期　　ｐ　
　）Ｉ　　　　　７〜１０　　　　　　　　　８．５〜
１１．５指　　示　　系 ＰＶＰ−に９Ｇ　０．１〜５．０％　０．５〜１．０　
％約９．０から約８．１の初期ｐＨで、できるだけ高濃
度（すなわち、０．７Ｍ〜約０．８Ｍ）のホウ酸塩を使
用するのが特に好ましい、この試薬溶液は、キャリヤー
マトリックスと試験組成物とを一体化させるのに使用さ
れる。かかるホウ酸塩緩衝剤は、好ましい初期ｐＨを与
える。すなわち、キャリヤーの乾燥後、試験具表面を湿
らすと緩衝剤により所望の初期ｐＨが与えられる。この
表面ｐＨは、表面電極を用いて測定することができる。 構成成分の上記濃度範囲および相対濃度は、試薬溶液が
紙キャリヤーマトリックスの含浸に用いられるような水
溶液であっても、試験構成成分と一体化させてポリマー
フィルムを作製するのに用いられる水性ポリマー懸濁液
であっても有効である。 紙キャリヤーマトリックスを使用する場合には、ホウ酸
緩衝剤を含む試験組成物をマトリックスと一体化させる
に先立って、フェニルポロン酸緩衝剤などのホウ酸塩緩
衝剤を用いてｐＨ約７程度より大きな初期ｐＨで紙を前
処理することができる。このような前処理により試験組
成物中のホウ酸塩緩衝剤と紙マトリックスとの相互作用
が防止されると推察される。 ５、使用方法 試験具は、試験試料中に少しの間浸漬するか、あるいは
試験試料をキャリヤーマトリックスに導くようにするの
がよい、この際、試験試料中に５００腸ｇ／ｄ１以上の
グルコースが存在すれば、検出可能な比色応答が発現す
る。ピペットやスワブあるいはスパーチルを用いて試料
と接触させることもできる。試料が尿である場合には浸
漬法が最も優れているが、血清試料である場合には通常
ピペットの使用が必要である。 半定量的なグルコース濃度の測定は、適当なカラーチャ
ートを用いて色を目視で比較することによって、あるい
は反応した試験具の反射率を計器で測定することによっ
て行うことができる。支持部材が透明である場合には、
試験具のいずれの側からも測定することができる。 以下にあげる例は、本発明の開発に当たって実施された
実験の例である。しかしながら、これらの例は本発明を
理解し易いように説明するものであって、本発明は、こ
れらの例に限定されるものではない、当業者であれば、
試験組成物の構成成分や反応パラメタに関し、望ましい
よ思われる変更や置換を行うことができるはずである。 略字 以下の例では次の略字を使用している。 １文　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ミ　　リ　　リ　　ッ　　ト　１１６文　　　　　
　　デシリットル ｇ鳳　　　　　　　グラム Ｎ　　　　　　　　モル °Ｃ摂氏温度 へ　　ＰＯＤ　　　　　　　　ペルオキシダーゼＧＯグ
ルコースオキシダーゼ ＤＨ９Ａ　　　　　　　ジクロロヒドロキシベンゼンス
ルホン酸 Ｐｏｌｙ（ＳｉＴ−Ｇｏ−ＭＡＡ）　　スチレンとメチ
ルメタクリレートとの共重合体 ＦＣ＆　Ｄ　雲５　　　　　黄色染料−カラーインデッ
クスナンバー１９１４０ ＰＶＰ−に９０　　　　　ＧＡＦ社（＝、−ヨーク州ニ
ューヨーク）製の平均分 子量３８０，０００のポリ（ビニ ルピロリドン） Ｓａｒｋｏｓｙｌの　　　シグマ・ケミカル社（ミズー
リ州セントルイス）製 の界面活性剤Ｎ−ラウロイル サルコシン υ　　　　　　　　１国際車位（Ｕ）は、　１分あたす
１マイクロモルの基質 の変換を触媒する酵素の量 である。 ｑｓ　　　　　　　　溶媒の量 ［例］ 例１ニホウ酸塩緩衝剤配合体 ホワットマン５４ＩＰ紙を下記成分を含む水溶液に浸漬
した。 ＰＶＰ−に９０　　　　　　　　　　　　　　Ｇ、１５
ｇｍＧＯ°　　　　　　　５０，００００ ＰＯＤ　　　　　　　　　　２４，００００ＫＩ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８ｇ層５ａｒｋ
ｏｓ７１　　　　　　０．ｌｓＭホウ酸緩衝剤　　　　
１４層文 （ＩＭ、水酸化ナトリウムでｐＨ８，７に調整）水　　
　　　　　　　　　　　　　　ｑｓ　　２０ｍＪｌ擦過
棒で余分な溶液を除去し、濾紙をエアオーブン中５０℃
で２０分間乾燥させた。乾燥後、試薬紙に両面接着テー
プを貼り、幅Ｑ、０５８ｃｍ（１１５インチ）のリボン
状に細長く切った。このリボンを細長いポリスチレン片
の幅の広い　１端に置き、０．０５８ｃｍ（１１５イン
チ）幅に細長く切って本発明の試験具を作製した。 グルコースを　０、５００．　１，０００．２，０００
．９．０００．５，０００および１０，０００ｍｇ／ｄ
Ｊｌ含む水性試験試料に上記試験具を浸漬すると、接触
させてから２分後、良好な視覚的変化が観察された。 例２：最適に調整したホウ酸塩を含まない配合体との比
較 ホウ酸塩緩衝剤を用いて例１により作製した試験具を、
最適に調整された市販のグルコースオキシダーゼ／ペル
オキシダーゼ試験配合・体ディアスティクスの（インジ
アナ州エルクハート、マイルス争うボラトリーズ社エイ
ムズ・ディビジョン）と比較した。ディアスティックス
配合体にはクエン酸の緩衝剤（ｐＨ７，２）とＰＶＰ／
Ｋ　Ｉ指示薬とが含まれている。いずれの配合体にあっ
ても、試験結果の読取りは、グルコース濃度の識別度が
最大となる時に行ったが、この最適読取り時間はホウ酸
塩配合体にあっては　１２０秒、市販品のホウ酸塩を含
まない配合体にあっては３０秒である。これらの時間を
越えると、いずれの配合体にあっても色が黒ずんできて
、濃度識別能が低下する０両配合体間の比較を容易にす
るため、比色計マクベス１５００にューヨーク州ニュー
／＜−り、コールモーゲン社製）によって反射率を測定
した。 様々な濃度のグルコースを含む試料と接触させた後の２
試験具間のΔＥを、これら反射率データを用いて計算し
た。ΔＥは、　３次元色空間における　２試験具間の全
体的な色の差を示す量であり。 次式で計算される［ディー・ビー・ジュツト（Ｄ。 ８、　Ｊｕｄｄ）とジー拳ワイスツェッキ（Ｇ、　Ｗｙ
ｓｚｅｃｋｉ）「ビジネス、科学、工業における色（Ｃ
ｏｌｏｒ　１ｎＢｕｓｉｎｅｓｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　
ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔ、ｒｙ）　Ｊニューヨーク、ジョ
ン・ウィリー・アンド・サンプ（１９７５年）を参照］
。 ΔＥ＝【（ΔＬ本）２◆（Δａ零）２＋（Δｂ本）２］
　’なお、式中、ΔＬｔは２つの試料間の明るさの差を
示す量で、Ｏ（完全な黒）から１００（完全な白）まで
の値をとる。Δａ嵩は２試料間の赤色度−緑色度の差を
示す量であり、Δｂ明士黄色度−青色度の差を示す量で
ある。Ｌ寡、６本およびｂ本は、　４００〜７００ｎｍ
の波長の反射率から計算される。目視試験へ　　の場合
には、カラーチャートで定められた濃度レベルの差は発
現する色の違いを肉眼で区別できる程度に大きくなけれ
ばならない、２つの色の違いは、２色間のΔＥが１色度
単位違えば肉眼により識別することができる。しかしな
がら、実際上は１色が識別されうるには、異なる濃度レ
ベル間のΔＥが３単位またはそれ以上でなければならな
い、濃度レベル間のΔＥが大きいほど肉眼で濃度レベル
を識別することが容易である。 クエン酸塩−ＰＶＰ／Ｋｌ配合体は、グルコース１．０
００　ｍｇ／ｄＪＬを含む水性試験試料に接すると緑色
がかった黄褐色になり、試験試料中のグルコース濃度が
高くなるにつれて漸次濃い茶色になっていく、ところが
、ホウ酸塩−ＰＶＰ／Ｋ　Ｉ配合体にあっては、　５０
０■ｇ／ｄ４のグルコースに接したときは黄色であり、
グルコース濃度が高くなるにつれて漸次茶色が濃くなっ
ていく。 濃度レベル間のΔＥ グルコース濃度　クエン酸塩　　ホウ酸塩ネガティブ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・４７・・・・・
・・・・・・・・・・・・・２５１．０００ｍｇ／ｄＪ
Ｌ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｌ・・・・・・
・・・・・・・・・・・・１４２．０００ｍｇ／ｄｉ ・・・…・・・・・・・・・・・・３・・拳・・・・・
・・・・・・・・・・１２９．０００−ｇ／ｄｊＬ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・２・・・・・・
・・・・・・・・・・・・１３ｓ、ｏｏｏ腸ｇ／ｄｌ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・　１・・・・・
・・・・・・・・・・・・・１２１０．０００腸ｇ／ｄ
皇 読取り時間　　　　　３０秒　　　　　１２０秒濃度レ
ベル間のΔＥの値は、高濃度領域のグルコース（すなわ
ち、約　１，０００ｍｇ／ｄｉ〜約１０，０００ｔａｇ
／ｄｆＬの範囲のグルコース）の測定において、ホウ酸
塩配合体が最適化された市販のクエン酸塩配合体よりは
るかに優れていることを示している。 例３：＠衝剤のみを変えた場合の直接比較前記ホウ酸塩
配合体を、構成成分もしくは諸条件の中で緩衝剤のみを
変えた場合の配合体と比較した。 ホウ酸塩配合体　クエン酸配合体 ＰＶＰ−に９０　　　　　　　０．１５ｇｍ　　　　　
　　　　　　０．１５ｇｍＧＯ５０，０００Ｕ　　　　
　５０，０００　Ｕ、　　ＰＯＤ　　　　　　２４，０
００υ　　　　２４，０００　ＵＫｌ　　　　　　　　
　　　　　Ｇ、８ｇ層　　　　　　　　　　　０．６ｇ
量５ａｒｋｏｓｙ＋＠　　　　　０．＊ｍｌ　　　　　
　　　　　　　Ｏ，１ｉ＋見ホウ酸　　　　１４　ｔａ
ｎ　　　　　　　−（１％　、水酸化ナトリウムでｐＨ
８，７に調整）クエン酸・Ｈ２Ｏ−０、８５ｇ履 水　　　　　　　　　　　　ｑｓ　　２０ｍＩＬ　　　
　　　　　　ｑｓ　　２０ｍｆＬｐＨ８，７５，５ 各含浸溶液の最終的な緩衝剤濃度は、いずれも０．７Ｍ
であった。各含浸溶液を用い、゛例１に記載したのと同
様にしてグルコース試験具を作製した。 作製した試験具を高濃度のグルコースを含む水溶液に浸
漬し、比色計マクベス１５００　にューヨーク州ニュー
バーグ、コールモーゲン社製）で読み数って濃度間（１
濃度とそのすぐ上の濃度の間）のΔＥを計算した。 濃度レベル間のΔＥ グルコース濃度　クエン酸塩　　ホウ酸塩ネガティブ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・５１・・・・・
・・・・・・・・・・・・・２５１．０００ｍｇ／ｄｊ
Ｌ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｌ・・・・・・
・・・・・・・・・・・・１４２．０００ｍｇ／ｄＪＬ ・・・…・・・・・・・・磨・・＋１３・・・・・・・
・・・・・・・・・・・１２９．０００腸ｇ／ｄＪＬ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・１・−・・・・
・・・・・・・・・・・−１３５，０００腸ｇ／ｄｉ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・０・・・・・・
・・・・・・・・・・螢−１２１ｔｏ、ｏｏｏ■ｇ／ｄ
文 読取り時間　　　　　１２０秒　　　　　１２０秒濃度
レベル間のΔＥの値は、高濃度領域のグルコース（すな
わち、約ｔ、ｏｏｏ−ｇ／ｄ文〜約ｔｏ、ｏｏ。 ■ｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度）の測定において、
ホウ酸塩配合体がクエン酸塩配合体よりはるかに優れて
いることを示している。 例４＝従来のホウ酸塩配合体との比較 ホウ酸をフィラーとして用いたグルコースオキシダーゼ
／ペルオキシダーゼ配合体（米国特許第２，９１２，３
０９号および同第２．８４８，３０８号の例■）を試験
組成物として用い、キャリヤーマトリックスに含浸させ
た。このようにして作製した試験具について、高濃度領
域のグルコースに対する応答を試験した。 ＰＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５膳ｇＧｏ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２００騰８０−トリジンニ塩酸塩　
　　　２００ｍｇホウ酸　　　　　　　　　　１８００
鵬ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
５ｔｊＬ米国特許第２，９１２，３０９号および同第２
，８４８，３０８号記載の組成物を水に溶解して水性含
浸溶液を調製した。この溶液はｐＨ２，５で、ホウ酸は
完全には溶解しなかった。それにもかかわらず、この溶
液でホワットマン５４濾紙の含浸を行った。含浸させた
紙を５０℃で２０分間乾燥した。この含浸紙から、前述
したようにして、試験具を作製した。 試験具を、ネガティブ、　　１，０００．２，０００．
４．０００および８，０００曽ｇ／ｄｆＬのグルコース
を含む尿に浸漬し、６０秒後に、比色計マクベス１５０
０を用いてΔＥの値を記録した（読取り時間がもっと長
くなると、色は黒ずんでき、ΔＥの値は小さくなる）。 グルコースの濃度　　　　ΔＥ ネガティブ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｌ
ＯＬ、０００ｍｇ／ｄ文 ・・・・・・・φ・・・・・・・・・・・・・・・・１
２．０００鳳ｇ／ｄ文 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１
４．０００ｍｇ／ｄ文 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０
８　、０００ｍｇ／ｄ文 従って、　ｐＨの小さいホウ酸を「フィラー」として用
いる従来の配合体によっては水性試験試料中の高濃度レ
ベルのグルコースを識別し得る試験組成物を提供するこ
とができないことは明らかである。 例５：前処理紙 試験組成物と一体化させるに先立って、ホワットマン５
４濾紙を０．２Ｍフェニルポロン酸緩衝剤の水溶液（ｐ
）１９．５）で前処理した。この前処理した紙を乾燥さ
せておき、然る後。 ホウ酸塩緩衝剤（０，８Ｍ、ｐＨ９，５）　　５　　ｔ
ａｎＧＯ（１２，５００Ｕ／ｍＪｌ　）　　　　　　　
　０．８　ｔａｆＬＰＯＤ　　（８，８０００／ｍＡ　
　）　　　　　　　　　　　　　　　１．Ｏｍ１ＤＨ９
Ａ　　（０，５Ｍ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．０　　ｍ１４−７ミノアンチピリン　（
ＩＮ）　　　　０．２５ｍ！ＬＦＣ＆　５　　黄色染料
　（１，８８％）０．３謂立木　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ｑａ　　１０．Ｏｔｏ文を含む含
浸溶液に浸漬した。 このようにして作製した試験具は５００ｍｇ／ｄｆＬ〜
１０．０００ｍｇ／ｄＪＬの範囲の尿グルコース濃度に
応答した。ある程度強く着色した臨床床の妨害を除くた
めに黄色の染料を加える。この染料は指示系の発色原で
はなく、グルコース濃度レベルの視覚的識別に何ら影響
を及ぼさない、試験具の色は、グルコース濃度が高くな
るにつれて黄色（ネガティブ）から茶色、そして赤色へ
と変化する６発生する検知可能な比色応答を約４５〜Ｂ
θ秒で読み取ることができ、ネガティブ、５０Ｇ、　１
，０００．２，０００．９．０００および５，０００ｍ
ｇ／ｄＪＬのグルコースの視覚的識別は良好である。 例Ｂ：ポリマーフィルム 水性試験試料中の約　５００５ｇ／ｄｆｆｉ〜約１０，
０００ｍｇ／ｄｉＬのグルコースに応答する試験具を、
試験組成物と一体化させたポリマーフィルムで作製する
ことができる。可能な構成の　１つは次のとおりである
。 パ　−　ト　Ａ ５　　　　ホウ酸カリウム　（ＩＮ、ｐＨ９，５）　　
　５４　　　ｇ■分散剤　　　　　　　　　　　　　０
．２３　ｇ■顔料　　　　　　　　　　　　　７，０８
層消泡剤　　　　　　　　　　　　０．００７ｇｍ界面
活性剤　　　　　　　　　　　０．２０　ｇ層シックナ
ー　　　　　　　　　　　〇Ｊ２　ｇ層パ　−　ト　Ｂ ホウ酸カリウム（ＩＭ、ｐＨ９，５）　　　４゜５■文
ＧＯ（５０００Ｕ／ａ　！Ｌ　）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．４４ｓＪＬＰＯＤ　　　（４０
００Ｕ／ｍ見　）　　　　　　　　　　　　　　　０．
４　　ｍ１ＰＶＰ−に９０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．８　　ｇｙａＫｌ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．Ｏｇ■パ　
−　ト　Ｃ Ｐｏｌｙ（ＳＴ−Ｇｏ−ＭＭＡ）　　　　　　　　　　
　　０．８５ｇｍ分散（４２％スチレン） パー）ＡとパートＢを混合して攪拌し、均一なペースト
状になったら、凝固を防ぐために緩やかにかき混ぜなが
らパートｃを慎重に加える。こうして得られたポリマー
懸濁液をトリサイト・（ポリスチレン）などのプラスチ
ック支持体に塗布しエアオーブン中５０℃で２０分間乾
燥する。 このようにして作製した試験具は、高濃度領域の（すな
わち、５００ｍｇ／ｄｌ　〜約１０．ＯＱＯｍｇ／ｄｌ
　ｆ）範囲の）尿グルコースに応答するものと確実に予
期できる。 本発明の技術的思想に基づけば、本発明は、上述したよ
うな実施態様にのみ限定されるものではなく、種々の変
更および変法が可能であることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコース
   を半定量的に測定するための試験組成物であって、グル
   コースオキシダーゼ、過酸化物活性成分、検出可能な比
   色応答を与えることのできる発色指示系およびｐＨ約７
   程度より大きな初期ｐＨを与えることのできるホウ酸塩
   緩衝剤からなることを特徴とする試験組成物。 ２、前記ホウ酸塩緩衝剤がホウ酸緩衝剤またはフェニル
   ボロン酸緩衝剤である特許請求の範囲第１項記載の試験
   組成物。 ３、前記ホウ酸塩緩衝剤がホウ酸緩衝剤であり、かつ前
   記発色指示系が水溶性ヨウ化物塩とポリ（ビニルピロリ
   ドン）である特許請求の範囲第２項記載の試験組成物。 ４、前記ホウ酸緩衝剤がｐＨ約８．５〜約９．５の間の
   初期ｐＨを与えることができる特許請求の範囲第３項記
   載の試験組成物。 ５、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコース
   を半定量的に測定するための試験具であって、 （ａ）キャリヤーマトリックスと、 （ｂ）グルコースオキシダーゼ、過酸化物活性成分、検
   出可能な応答を与えることのできる発色指示系およびｐ
   Ｈ約７程度より大きな初期ｐＨを与えることのできるホ
   ウ酸塩緩衝剤を含み、前記キャリヤーマトリックスと一
   体化された試験組成物とからなることを特徴とする試験
   具。 ８、前記ホウ酸塩緩衝剤がホウ酸緩衝剤またはフェニル
   ボロン酸緩衝剤である特許請求の範囲第５項記載の試験
   具。 ７、前記ホウ酸塩緩衝剤がホウ酸緩衝剤であり、かつ前
   記発色指示系が水溶性ヨウ化物塩とポリ（ビニルピロリ
   ドン）である特許請求の範囲第６項記載の試験具。 ８、前記ホウ酸緩衝剤がｐＨ約８．５〜約９．５の間の
   初期ｐＨを与えることができる特許請求の範囲第７項記
   載の試験具。 ９、水性試験試料中に含まれる高濃度領域のグルコース
   を半定量的に測定するための試験具の作製方法であって
   、 （ａ）グルコースオキシダーゼ、過酸化物活性成分、検
   出可能な応答を与えることのできる発色指示系およびｐ
   Ｈ約７程度より大きな初期ｐＨを与えることのできる約
   ０．２モル〜約０．８モルのホウ酸塩緩衝剤を含む試験
   組成物をキャリヤーマトリックスと一体化させ、次いで （ｂ）乾燥させる、各工程からなることを特徴とする方
   法。 １０、前記ホウ酸塩緩衝剤がホウ酸緩衝剤であり、かつ
   前記発色指示系が水溶性ヨウ化物塩とポリ（ビニルピロ
   リドン）である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、前記ホウ酸緩衝剤がｐＨ約８．５〜約９．５の間
   の初期ｐＨを与えることができる特許請求の範囲第１０
   項記載の方法。 １２、前記キャリヤーマトリックスが紙であり、かつ前
   記方法がこの紙マトリックスと前記試験組成物との一体
   化に先立って前記紙マトリックスをホウ酸塩を用いて前
   処理し初期ｐＨを約７にする更なる工程を含む特許請求
   の範囲第９項記載の方法。