JPS61128168A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は不溶性担体粒子を使用する免疫分析方法に関す
る。

（従来の技術） 本発明は、抗原抗体反応の測定方法に関する。

従来、ラテックス等の不溶性担体粒子に担持させた抗体
又は抗原と抗原又は抗体めるいはその混合物とを液体媒
体中で反応させ、その反応の進行く伴う反混合物の透過
率の減少（すなわち吸光度の増加）からその抗原抗体反
応の速度を測定し、さらにその速度から被検体中の抗原
又は抗体の濃度を定量する方法が知られている（特公超
ＩＦ−／／Ｊｒ７Ｊｒ号公報）。

そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃度を高い
精度で、迅速に定量しうる。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、この方法では、感度の点で、数ｎ　ｙ　
／ｄ程度までしか信頼しうる測定値は得られず生長ホル
モｙ、インスリン、ジゴキシン等のさらに高感度の測定
を必要とする項目については、必ずしも十分に満足しう
るものではない。

そこで、本発明者らは、上記のような抗原抗体反応の測
定において、さらに感度を向上させるぺく、種々検討を
重ねた結果、本発明に到達し九。

（問題点を解決するための手段） 本発明の要旨は、不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持
させ、この支持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体あ
るいはその混合物を液体媒体中で反応させて、該反応の
進行く伴う反応混合物の凝集の度合を測定する方法にお
いて、上記担体粒子として磁化可能粒子と標識粒子とを
用いて反応させ、ついで反応混合物に磁場を付与するこ
とＫよシ磁化した磁化粒子又は磁化粒子を含む凝集粒子
を反応混合物から分離し、この凝集粒子中の標識粒子を
、その標識によって検知することにより、反応混合物の
凝集の度合を標ｍｌ！！［度の増加として測定すること
を特徴とする免疫分析方法にろる。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明は、上記のとおり不溶性担体粒子に抗体又
は抗原を支持させ、この支持された抗体又は抗原に、抗
原又は抗体あるいはその混合物を液体媒体中で反応させ
て、この反応混合物の凝集の度合を測定する方法におい
て適用される。

不溶性担体粒子としては、測定を行なう時に用いられる
液体媒体に実質的に不溶性で、約１０μ程度以下、好ま
しくは、Ｏ，ＯＳ〜！、０μの平均粒径を有する有機高
分子物質の微粒子、たとえばポリスチレン、スチレン−
ブタジェン共重合体のような乳化重合によシ得られる有
機高分子のラテックス、おるいはシリカ、シリカ−アル
ミナ、アルミナのよう々無機酸化物等が用いられる。

本発明方法においてはこのような不溶性担体粒子（たと
えばラテックス粒子）に、測定しようとする被検体中の
抗原及び／又は抗体と反応しうる抗体又は抗原を担持さ
せる（感作する）。

この場合、担体に対し抗体又は抗原を物理的に吸着させ
てもよいし、化学的に吸着させてもよい。抗体は蛋白質
で構成されておシ、一方抗原はたとえは蛋白質、ポリペ
プチド、ステはイド、多！Ｓ類、脂賀、花粉等種々のも
のから々る。不溶性担体粒子にこのような抗体又は抗原
を担持させる方法はすでに多くの方法が提案されている
。不溶性担体に九とえばハプテンのような不完全抗原を
担持させる場合は、その担体をたとえばカップリング剤
により化学的に変性して、その抗原を化学的に吸着させ
るのが有利である。

上記抗体又は抗原を感作し念不溶性担体粒子（たとえば
ラテックス粒子）の濃度が通常０．００　／重量％以上
の懸濁液、好ましくは０．０　／　−／重量％程度の懸
濁液を用いる。

前記感作担体を液体媒体中において、抗原又は抗体６る
いはその混合物と実質的に一定条件下で反応させる。

本発明方法においては、上記不溶性担体粒子として、磁
化可能粒子と標識粒子の二種類が用いられる。

磁化可能粒子（以下、０粒子という）は、反応時に磁化
しておらず磁場を付与することにより磁化し、容易に液
体媒体から分離できる粒子を意味し、たと几ば、マグネ
タイト、フェライト等が好適に用いられる。たとえば、
この場合、マグネタイト、フェライト等を含んだラテッ
クス粒子を用いて、感作し、反応に供される。

また、標識粒子（以下、０粒子という）としては、ケイ
光色素を含む粒子、ラジオアイソトープ（Ｒ工）　１１
１工等を含む粒子、ま九、有機溶媒を添加することによ
り容易に溶媒中に溶出してくるような色素、ペルオキシ
ダーゼ等の酵素などが挙げられる。

たとえばケイ光色素を用いる場合１．不溶性担体粒子は
、たとえばラテックス重合の際に反応液にケイ光色素を
混合し、ラテックス粒子内に色素をとシ込んでいるもの
でも、ラテックス重合後、化学結合あるいは物理吸着等
を利用してラテックスを染色したものでもよい。

ケイ光色素としてはローダミン系色素（たとえばローダ
ミン−４Ｇ、テトラメチルローダミン）、アクリジン系
色素（たとえばアクリジンオレンジ）その他、シアニン
系色素、希土類、エオシン、フルオレツセイン、クマリ
ン誘導体、スチルベン誘導体などが挙げられる。

磁化可能粒子と標識粒子の使用割合は、特に制限されな
いが１通常、等を程度が用いられる。

抗原抗体反応に際しては、−抗体法、二抗体法が応用で
きる。−抗体法の場合、■、０粒子に同一の抗体を感作
し、抗原を含む溶液中に緩衝液と共に添加すると、抗原
抗体反応によシ粒子の凝集がおこり、０粒子と０粒子と
が同時に反応することにより■−■、■−■、■−■や
これらの組み合わさった凝集がおこる。一定時間インキ
エベートした後反応混合物に磁場を与えることによシ■
粒子わるいは０粒子を含む凝集粒子を反応混合物から容
易に分離することができる。

二抗体法の場合、たと、？、ばｂる抗原（Ｏとする）に
対して反応する２種の抗体を゛用い、０粒子、０粒子に
それぞれ異なる抗体を感作し抗原と反応させることによ
り■−０．■−〇−■、〇−■なる粒子を得る。一定時
筒抜の反応液に磁場を与えることによシ■粒子又は０粒
子と０粒子が凝集したものを容易に分離することができ
る。

これらの場合、反応容器の底に０粒子又は０粒子と０粒
子が凝集したものを集めて上清液を除去し、残った粒子
中の標識物を測定すると、反応液中の抗原濃度に比例し
た標識物が観察される。

標識物の測定には、たとえばケイ光色素の場合、励起光
及びケイ光を吸収しないような反応容器の底に集めた後
、容器の底から励起光を当てて出てくるケイ光を１１定
する系を用いると。

上清の除去は不要とをる。ま光、上清を除去した後、ア
ルコール等の有機溶媒を添加して、粒子から色素の溶出
を訃こなわせると、よシ高感度でｆｆ度の高い測定とな
る。

また、たとえば標識粒子としてケイ光色素を含んだラテ
ックスを用いフローセルを用いる測定法として、フロー
七ルの横方向からａ＃ｈｔ−与え、フローセルを流れる
反応液中の０粒子あるいは０粒子を含む凝集粒子が、磁
力により横方向にひきよせもれ之ところを、充分小さく
絞った励起光を当てることにより０粒子との凝集により
引きよせもれたケイ光粒子の数の増加を、度応液中の抗
原＃度の増加と関連させることができる。

測定は、通常反応開始後一定時間イン中ユペートシた後
行なわれる。

上記の方法により、反応混合物の凝集の度合を、一定時
間後の標識強度の増加として測定し、予め濃度既知の試
料によシ作製した抗原又は抗体の検量線を用いて、検体
中の抗体又は抗原の濃度を測定することができる。

（発明の効果） 本発明方法によれば、ラテックスを用いる抗原−抗体反
応により反応液中の共存物質に影響されない高精度で、
高感度な抗原又は抗体の定量が可能でめる。

（実施例） 以下、実施例により、本発明をさらに詳細く説明する。

実施例／ 平均粒径／μｍのＳ性うテククス（ローヌプーラン社製
）と、Ｄｏｖ　ＣｈｅｍｉＣｅ−１社ｆｉ／、／ａｍの
ラテックスにテトラメチルローダミンを染色した（ラテ
ックス／ｋｌに対し染料／　ｍｍｏｌを使用）ケイ光性
ラテックスにそれぞれ抗−ＡＰＩ’抗体を感作し１種々
の濃度のニーフェトプロティン（ＡＦＦ）溶液に緩衝液
とこれら二種のラテックス（等量）を添加しく　０．Ｏ
７重量％）。

一定時間抜細胞培養用フェル（内径７１１１！、深さ／
　ａｎ　）に一定量移し、下に磁石をおいて、フェルの
底に■−粒子及び０粒子を含む凝集粒子を集める。その
後上清を除去し、残ったケイ光粒子と０粒子にアルゴン
イオンレーザ−の！ｌμ、ｊｎｍの励起光を当て、ケイ
光性粒子から発せられるケイ光の強度を測定した。毎秒
カウントされるフォトン数をＡＦＰ濃度に対してプロッ
トしたものが図１である（検を線）。

この検量線を用いて、ＡＦＦ濃度未知の検体中の抗原濃
度を高感度で測定することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１で得られるＡＦＰについての検１線を
示す。 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　憂苦用　　　−ほか１名 図１ ＡＦＰ濃度輛ムＬ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持させ、この
   支持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体あるいはその
   混合物を液体媒体中で反応させて、該反応の進行に伴う
   反応混合物の凝集の度合を測定する方法において、上記
   担体粒子として磁化可能粒子と標識粒子とを用いて反応
   を行い、ついで反応混合物に磁場を付与することにより
   磁化した磁化粒子又は磁化粒子を含む凝集粒子を反応混
   合物から分離し、この凝集粒子中の標識粒子をその標識
   によって検知することにより、反応混合物の凝集の度合
   を標識強度の増加として測定することを特徴とする免疫
   分析方法。