JPS61152700A - タンパク質固定用膜担体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、タンパク質固定用の膜担体およびその製造法
に関し、さらに詳しくは、その表面が一定の間隔をおい
て部分的に親水化されており、タンパク質の非特異的な
吸着が抑制きれた疎水性高分子膜からなるタンパク質固
定用膜担体とその製造法に関するものである。

［従来技術］ ヒトの血液、尿あるいはリンパ液等の体液および／また
は生体組織中の特定の化学成分を分析して、疾患の予防
、診断、治療を助けるための臨床検査は各種医療機関に
おいて殆ど日常的に行われている重要な業務であるが、
今後も予防医学の発展、また治療医学の高度化、さらに
は健康に対する一般的な意識の向上部にも伴ってその機
会は益々増加し、かつ多様化するものと思われる。この
ような目的で実施される臨床検査は、微量で検査できる
こと、操作が簡単で迅速に行えること、および正確な結
果（情報）が得られることなどの基本的な要求条件があ
る。

一方、酵素は高い基質特異性や温和な条件下での触媒作
用など他の化学試薬にはない有用な特徴を持っているの
で、臨床検査の分野にも広く利用されつつあるが、周知
の如く遊離の酵素は値段が高く、しかも安定性に欠ける
ので、かかる酵素は通常高分子材料に固定化されて使用
されることが多い。

また、最近生体の微量化学成分の検出、定量の一手段と
して免疫測定法が繁用されているが、この方法において
も、免疫反応に関与する抗原および抗体などは多くの場
合適当な担体に固定化して使用きれる。

このように酵素、抗原、抗体をはじめとする各種タンパ
ク質を担体に固定化する場合に重要なことは、 ■担体に結合固定されるタンパク質の密度が高いこと、 ■抗原抗体反応においては、この反応による結合以外の
非特異的吸着が極力少ないこと、さらに■担体が薄膜で
あり、固定化膜を種々の電極と組合せて酵素電極法で測
定する場合、酵素と基質との反応生成物の膜透過速度が
大きいことなどである。

ところで、膜担体の主な製造方法としては、従来キャス
ティング法と呼ばれる方法がよく知られている（　Ｓ、
　Ｋａｔｏ、　Ｍ、　Ａｉｚａｗａ、　Ｓ、　５ｕｚｕ
ｋｉ、　Ｊ、　Ｍｅｍｂｒ。

Ｓｃｉ、　、　３．２９（１９７８）およびＮ、　Ｗ＠
１ｉｋｙ、　Ｈ，Ｈ，Ｗｅｅｔａｌｌ。

Ｅｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２．２９３＜１９
６５　）など参照）、シかし、このキャスティング法で
は、膜の作成に熟練を要するばかりでなく再現性も悪い
。

このような状況に鑑みて本発明者等は、タンパク質固定
用膜担体を簡単、かつ経済的に提供すべく鋭意研究を重
ねた結果、先（こ高分子膜を低温ブラスマで処理するこ
とにより膜表面を灰化して得られる高分子膜からなる膜
担体とその製造法に関する発明をなし、これを特許出願
した（特願昭５８−１９９８５６号）。

この方法によれば、きわめて簡単かつ再現性よく膜担体
を製造することができ、また、得られた膜担体は、該担
体に結合し得るタンパク質の密度が高く、これを抗原抗
体反応に利用したときには、この反応による結合以外の
非特異的吸着が少なくて、との種膜担体としての基本的
要求条件を充分に具備しており、実用的にはほぼ満足し
得るものである。

しかしながら、かかる膜担体は、その膜表面全域にわた
ってタンパク質固定化のための処理が施されているので
、実際に該膜上にタンパク質を固定化しようとする場合
には、まず当該膜を所定の大きさに切断して、これをタ
ンパク質溶液に浸漬して固定化するか、または該膜を平
板の上に載置し、この上にタンパク質溶液を均一に展開
せしめて固定化し、その後に膜を適当な大きさに切断し
て使用しなければならなかった。すなわち、これらのタ
ンパク質固定化膜を例えば酸素電極に取り付けて、生体
微量成分の検出、定量を電気的出力として測定する試み
が最近実用化されつつあるが、このような電極利用によ
る測定の場合には、該タンパク質が固定化きれるところ
は電極に接する部分だけで充分であり、その他の部分は
不要であって、高価なタンパク質を無駄にするだけであ
る。また、上記固定化方法のうち後者によれば、膜担体
全体におけるタンパク質の固定化濃度を均一化するのが
やや困難でもある。

［発明が解決しようとする問題点１ 以上のような次第で、本発明者等はその後もかかるタン
パク質固定化用膜担体の改良、特に電極利用による実用
性向上を目積してさらに種々研究を重ねた結果、本発明
を完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、上記従来技術における固定化タン
パク質の無駄使いを極力少なくして、その経済的効果を
きらに向上させると共に、タンパク質の固定化濃度（密
度）を任意に調節し得る膜担体を提供しようとするもの
である。

口問題点を解決するための手段］ 本発明は上記目的を達成するために疎水性高分子膜の表
面を、それぞれ一定の間隔をおいて部分的に親水化処理
することを特徴とするものである。従って、本発明の一
つの要旨は、その表面がそれぞれ一定の間隔をおいて部
分的に親水化処理された疎水性高分子膜からなるタンパ
ク質固定用膜担体に存する。

本発明の膜担体は、無孔膜でもよいが、酵素電極法に利
用する場合は多孔性でなければならない、多孔性の場合
、孔径は少なくとも２５０人であるのが好ましい。

膜厚は特に制限されないが、親水化処理前の厚さは１０
０μｍを越えないのが好ましい、これより厚くなると、
親水化処理を低温プラズマによる灰化処理で行う場合に
はブラスマ灰化に時間がかかり不利である。また、膜が
薄すぎると種々の取り扱いに不便となるので、厚膜は２
５μｍ以上であるのが好ましい、なお、処理後の厚さは
１５μｍ以上が好ましいが、別に支持材料を用いる場合
にはこれより薄くてもよい。

かかる疎水性高分子膜は、構成元素として炭素、水素お
よび要すれば酸素とからなり、取り扱い上支障のない機
械的強度を持った高分子材料からなる膜であればよく、
例えばポリオレフィン、特にポリプロピレン、ポリカー
ボネートなどが好適である。

本発明膜担体は、かかる疎水性高分子膜の表面を、それ
ぞれ一定の間隔をおいて部分的に親水化処理して得られ
るが、親水化処理の具体的手段としては、ある種の界面
活性剤（例えば非イオン型または両性のフッ素化界面活
性剤（旭硝子■製サーフロンＳ−１３２）を滴下してこ
れを浸透きせる方法もあるが、既知のプラズマ発生装置
を用いて低温プラズマによる表面灰化処理で行うのが有
利である。すなわち、プラズマ発生装置の電極上に疎水
性高分子膜を固定し、プラズマ処理放電管内を排気した
後、酸素または酸素を含む気体もしくは水蒸気を一定の
圧力まで導入し、適当な濁波数（例えば５ＫＨ２）の電
源から電力を供給し、前記気体の低温プラズマを生起さ
せ、排気しながら一定圧力、一定電流の下で高分子膜を
表面から灰化する。このとき、高分子膜は、それぞれ一
定の間隔をおいて所定形状の透孔が穿設されている遮へ
い板に重ねられ、該遮へい板面がプラズマ放電空間に対
面するようにして電極上に固定する６な３゜該遮へい板
は放電電極に電気的に接続していることが好ましいが、
必ずしも接続していなくてもよい、このようなプラズマ
処理は、前記遮へい板の透孔が表裏一致するようにして
疎水性高分子膜の表、裏画面について行う、プラズマ処
理時の放電管内の圧力は０．１５〜Ｉ　Ｔｏｒｒが一般
に採用きれる。圧力が０．１５τｏｒｒより低いと放電
により高電圧を必要とし、またＩ　Ｔｏｒｒより高いと
その処理効率が低下する。また、電流密度は０．０５〜
０．５ｍＡ／ｃｍ”が好ましい、前記遮へい板は、材質
としては鉄、ステンレス、アルミニウムなどが使用可能
であるが、工作の容易性、電導性、放電に対する表面安
定性さらには軽量といった点から特にアルミニウムが好
適である。また、かかる遮へい板に穿設される透孔は、
任意の形状に設計することができるが、通常は円形でよ
い０円形の場合その直径は０゜５〜１５ｍｍの範囲から
選ぶのが実用上好適であり、その場合の穿設ピッチは約
５〜２０ｍｍとする。要するに、本発明によればこの遮
へい板の透孔部に対応して疎水性高分子膜が部分的に親
水化処理されるので、例えば酵素電極への利用など、該
膜担体の最終使用形態に応じて、親水化処理すべき高分
子膜の大きさ、延いては単位面積当りの親木化処理部分
の個数および形状を決定すればよい、　以上のようにし
て親水化処理された疎水性高分子膜は、第１図に例示す
るように高分子膜１の表面に、それぞれ一定の間隔をお
いて部分的に親水化処理された複数のスポット２ｍ、　
２ｂ、　２ｃ・・・を有する。この親水性スポット部分
は、その表面から膜厚方向に裏面まで一様に親水化きれ
ており、その他の部分は疎水性を保持している。従って
、該処理済の高分子膜を水平にし、親水性スポット部分
に水滴を落とすと、その周囲の膜表面が疎水性であるた
め該親水性スポットの表面に半球状の水滴を形成、保持
させることができる１例えば、直径６ｍｍの円形の親水
性スポットの場合には、最大的１００μｍの水滴を保持
することができる０通常２５〜５０μｍの水滴を親水性
スポットに滴下して半球状の水滴を形成させた場合、膜
全体を約３０°傾斜させても親水性スポット上に該水滴
を安定に保持し得る。

このようなことから１枚の疎水性高分子膜に複数個の親
水性スポットをそれぞれ一定の間隔で形成させた後、該
親水性スポットに種々の有用な機能性物質、例えば酵素
、抗原または抗体等の水溶液を接触させ、その機能性物
質を固定化し、該親水性スポットに所望機能を与えるこ
とができる。

疎水性高分子膜の部分的親水化を前述したプラズマ処理
で行った場合には、親水化処理膜の表面に以下の手順に
よりタンパク質の固定化に必要なアルデヒド基を導入す
る。すなわち、高分子膜の親水性スポットの表面にオク
タメチレンジアミン水溶液を滴下し、室温で２０〜６０
分放置する。使用するオクタメチレンジアミン水溶液の
濃度は０．０１〜５％（ｗ／ｖ以下同じ）、液量は１〜
１００μｍである０次に、濾紙を用いて親水性スポット
上にある液滴を吸い取った後風乾する。液量が１〜５μ
ｍのときは濾紙で吸い取ることなしに水分を全部蒸発き
せることによって親水性スポットに添加するオクタメチ
レンジアミンの量をより正確に制御することができる。

もちろん、親水性スポットが形成された疎水性高分子膜
をそのままオクタメチレンジアミン水溶液に浸漬後濾紙
で挾んで水切りを行ってから風乾してもよい０次に、膜
全体をグルタルアルデヒド水溶液に浸漬し、該膜の親水
性スポットにタンパク質を固定化するためのアルデヒド
基を導入する。グルタルアルデヒド水溶液の濃度は１〜
１０％の範囲から選ばれ、通常は５％程度でよい、この
グルタルアルデヒド水溶液への膜の浸漬時間は２０分以
上、通常３０〜６０分で充分である。最後に該高分子膜
を水洗して未反応のグルタルアルデヒドを除去し、タン
パク質固定化′用の膜担体を得る。

ところで、このようにして得られる膜担体へのタンパク
質の固定化に際して、そのタンパク質の固定化量は実際
上、次のような方法でフントロールされる。すなわち、
その１つは本発明膜担体の親水性スポット当りに滴下す
るオクタメチレンジアミン水溶液の濃度と液量を調節し
、該オクタメチレンジアミン水溶液を滴下した後、風乾
し、次いでグルタルアル−ヒト水溶液に浸漬し、水洗後
タンパク質を含む液中に入れ、飽和するまでタンパク質
誉固定化させる方法である。この場合のオクタメチレン
ジアミン水溶液の量は１〜５μｍ／スポットである。ま
た、別の方法としては、膜担体の親水性スポットにオク
タメチレンジアミン水溶液（濃度２．５〜５％）を滴下
するか、あるいは、膜全体をオクタメチレンジアミン水
溶液中に浸漬した後、該膜を濾紙で挾んで余分の液を吸
い取り、風乾後、′５％のグルタルアルデヒド水溶液中
に浸漬した後、水洗、濾紙で水切り後風乾する０次に、
この膜担体の親水性スポットに所望のタンパク質の量を
含む液を滴下し、全部のタンパク質が固定きれるまで放
置して固定化した後、残存する過剰のアルデヒド基を他
のアミノ基を持つ化合物（例えばグリシン）の水溶液で
処理して不活性化するものである。ざらに、もう一つの
方法としては、膜担体の親水性スポット当りに滴下する
オクタメチレンジアミンの濃度と液量をそれぞれ０．０
１〜０．２５％、１〜５μｍに調節し、オクタメチレン
ジアミン水溶液を滴下して風乾する。

次にこれをグルタルアルデヒド水溶液に浸漬し、水洗後
濾紙で水切りしてから風乾し、最後に所望のタンパク質
溶液を２５〜１００μｍ滴下し、そのまま放置して固定
化するものであり、この場合タンパク質は、オクタメチ
レンジアミンによって決まるアルデヒド基に対して過剰
に滴下する。この後２者の方法は本発明膜担体における
親木性スボットの特徴を有効に利用するものであって、
固定化に使用きれるタンパク質の量を必要最少限にとど
めることができる。以下、実施例により本発明を具体的
に詳述する。

［実施例コ 実施例１ 第２図に例示するように市販のポリプロピレン膜１（商
品名：ジュラガード＃　２５００、ポリプラスチックス
株式会社製）を１５０ｍｍＸ１５０ｍｍ大に裁断し、こ
れにほぼ同形大のアルミニウム製遮へい板３（透孔：直
径６１１１１１．３６個穿設）を重ねて既知のプラズマ
放電電極２にセットする。次いで、プラズマ放電管７内
を排気ポンプ６で排気し、　５　ｘｌＯ−”Ｔｏｒｒま
で排気した後、ガス導入管８から放電管内に水蒸気を導
入し、管内を０．５Ｔｏｒｒに保ちながら電源４から５
ＫＨ２，１００ｍＡ（電流密度０　、１４ｍＡ／ｃｍ　
”　）、５００ｖの電力を供給して３分開放寛を行った
。その後該ポリプロピレン膜を裏返し、裏面についても
同様に処理し、該高分子膜の前記遮へい板の透孔部３１
に対応する部分を親水化処理する。このようにして得た
高分子膜を水面に浮かべたところ、親水化処理された円
形スポットの部分が完全に濡れ、その他の部分は撥水性
を示した。（第１図参照）。

実施例２ 実施例１と同様の手順でジュラガード＃　２４００を水
蒸気プラズマ処理（ｌｏｏｍＡ、　５００Ｖ、　８分、
両面処理）した後、２．５％オクタメチレンジアミン水
溶液に室温で３０分浸漬し、次いで担体膜を東洋濾紙Ｎ
ｏ、２で挾み、余分の液を吸い取る。室温で乾燥した後
５％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬し、室温下３０分
放置し、次いで蒸留水で３回洗浄し、きらにｐＨ７，２
のリン酸ナトリウム緩衝液で１回洗浄した後、東洋濾紙
Ｎｏ、　２で挾んで水切りを行い、風乾する。

次に、該膜を適当な支持台上に置き（このとき当該膜担
体の親水性スポットにはなるべく支持台が触れないよう
にするのが好ましい）、グルツースオキシダーゼ（Ｇ　
ＯＤ　、　１０２０／ｍｇ）　５　ｍｇをリン酸ナトリ
ウム緩衝液５０ｍ１に溶解した液１容と、牛血清アルブ
ミン５ｍｇをリン酸ナトリウム緩衝液５゜ｍｌに溶解し
た液９容の混合液を、各親水性スポット　当り５μｍ（
Ｇ　ＯＤ　：　０．００５Ｕ）ずつ滴下し、室温で２０
分放置して固定化する。これをリン酸ナトリウム緩衝液
で３回洗浄後、当該固定化膜（親水性スポット部分）を
過酸化水素電極に取付け、基質としてグルツース２０ｍ
ｇを含む３０ｍ１のリン酸緩衝液中に浸し、このときの
出力電流を測定することによって固定化膜のＣＯＤ活性
のバラツキを調べた。その結果、前記親水性スポット１
２個の平均は１２８ｎＡであって、その変動係数（ｃ、
ｖ、）は３．２％であった。比較実験として、同じくジ
ュラガード＃２４００を遮へい板を使用せずにその全面
をプラズマ処理し、以後前記と同じＣＯＤ！解液２０ｍ
１中にｗ分間浸漬する以外は、前記と全く同様の操作を
行って固定化膜を得、この固定化膜についても前記と同
様にそのＣＯＤ活性を測定してみたところ、該固定化膜
１２枚の平均値は１３５ｎＡで、そのｃ、　ｖ、は５．
６％であった。

実施例３ 膜担体の親水性スポットに滴下するオクタメチレンジア
ミンの量と該膜親木性スポットに固定化されるタンパク
質量との関係をみるた゛め、実施例１で得た膜担体の親
水性スポット１個当りに滴下するオクタメチレンジアミ
ン量を０〜１２．５μｇ（０−０，２５％、５μｌ）の
範囲で変化浮せ滴下後、風乾し、次いで５％グルタルア
ルデヒド水溶液に３０分間浸漬したのち、蒸留水で３回
洗浄し、さらにｐＨ７，２のリン酸ナトリウム緩衝液で
１回洗浄した。この膜を濃度０．０２ｍｇ／　ｍｌのＧ
ＯＤ液２０ｍ１中に入れて、室温下に９０分間かきまぜ
て固定化を行った。このときに固定化きれるタンパク質
（グルツースオキシダーゼ）の量の変化を過酸化水素電
極によるＣＯＤ活性の出力電流でみた。結果は第１表お
よび第３図に示すとおりであって、Ｇ。

Ｄ活性による過酸化水素電極の出力電流は、膜担体の親
水性スポットに滴下したオクタメチレンジアミンの量に
ほぼ比例するものである。

（以下余白） 第　　１　　表 従って、このような結果から本発明の膜担体によれば、
その親水性スポットに滴下するオクタメチレンジアミン
の量（濃度）を変えることによって、該膜担体に固定化
すべきタンパク質の量を任意に調節し得ることが判る。

実施例４ 直径６ｍｍの透孔を持つアルミニウム製遮へい板を用い
てジュラガード＃　２４００を実施例１に準じてプラズ
マ処理した後、該膜担体を室温下で３０分間２．５％オ
クタメチレンジアミン水溶液に浸漬し、次に東洋濾紙Ｎ
ｏ、２で挾んで余分の液を除去した後、風乾する０次い
で５％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬しく室温下６０
分）、次に蒸留水で３回、さらにリン酸ナトリウム緩衝
液で１回洗浄する。このようにして得られた膜担体をそ
の親水性スポット毎にカットし、この膜拒体を２枚重ね
て第４図に例示する加圧透過式固定化装置にセットする
。すなわち、該固定化装置の加圧透過用固定板２１に、
前記膜担体２０を２枚重ねて挾み込み固く固定する。こ
の場合、必要ならば図示するように膜担体２０の下面に
適当な支持部材２２（例えばガラスフィルター）をおい
てもよい１次に、膜担体上のタンパク質液充填室２６に
固定化用ＣＯＤ液（ＧＯＤｌｍｇをリン酸ナトリウム緩
衝液で５０ｍ１中に希釈溶解した液）を所定量入れ、該
タンパク質充填室上方に連なる加圧管２４から水銀柱で
約２００ｍｍの圧空を加え、ＣＯＤ液を膜担体下方の液
出口２５に排出し、膜担体２０にＧＯＤを固定化させる
。かかる固定化操作を各々の膜担体について実施し、各
々の膜担体についてそれぞれ前記ＣＯＤ液を１５μｍ、
３０μｍ、４５μｍ、６０μｍ、７５μｍおよび１５０
μｍ通過させる６次に同様にして０．１ｍｌのリン酸ナ
トリウム緩衝液を通過させて、各々ＣＯＤ固定化膜を洗
浄する。その後固定化装置から固定化膜を取り外し、緩
衝液で２回洗浄した後、該固定化膜のＧＯＤ活性をみる
ため、線膜を過酸化水素電極に取り付けて、基質として
グルコース２０ｍｇを緩衝液３０ｍ１に加えた液に浸し
、その時の出力電流を測定した。結果は、第２表のとお
りである。

第　　２　　表 以上の結果からも明らかなように、ＣＯＤは第１枚目の
膜担体にほぼ完全に固定化され、第２枚目の膜担体には
殆どＣＯＤが存在しなかったことが判る。また、ＣＯＤ
の添加量と固定膜のＣＯＤ活性による出力ｉ流とは良好
な比例関係にあることが判る。従って、この方法によれ
ば固定化に使用するＣＯＤなどのタンパク質をほぼ１０
０％有効に膜担体に固定化できるので、任意の量の固定
化を容易に達成し得るばかりでなく、その固定化のため
の処理時間も約２〜５分で充分であり、きわめて短時間
ですむ。

［発明の効果］ 本発明膜担体は、以上詳述したような構成を有し、タン
パク質を画定化すべき膜の親水性部分がそれぞれ一定の
間隔をおいてスポット的に形成されているので、必要な
所に所望のタンパク質を無駄に使用することなく必要量
だけきわめて効率よく、かつ経済的に固定化することが
できる。また固定化したタンパク質は測定感度にバラツ
キの少ないすぐれた固定化膜として得ることができる。

さらに、このようなことから固定化膜におけるタンパク
質の固定化量を任意に調整することも容易である。

本発明膜担体は前述したように親水性スポット配列膜な
ので、これに所定のタンパク質を固定化し、かつ特定の
電極に組合せ、これを例えば臨床検査の目的に使用する
ような場合には、１検体測定の都度、固定化膜、すなわ
ちスポットを順次交換することができ、検査の自動化に
大きく貢献し得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明膜担体を模型的に示す平面図、第２図は
公知のプラズマ放電管使用による本発明膜担体の製造法
の一例を示す図、第３図は本発明膜担体の親水性スポッ
トに滴下するオクタメチレンジアミンの量とそれに固定
化されるタンパク質（ＣＯＤ）の量の関係を示す図、第
４図は、本発　−明膜担体にタンパク質を固定させるた
めの一手段を例示する図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）その表面がそれぞれ一定の間隔をおいて、部分的
   に親水化処理された疎水性高分子膜からなるタンパク質
   固定用膜担体。
2. （２）親水化処理された領域が直径０．５〜１５ｍｍの
   円形である特許請求の範囲第（１）項記載の膜担体。
3. （３）親水化処理が酸素または酸素を含む気体もしくは
   水蒸気の低温プラズマによって表面灰化処理されたもの
   である特許請求の範囲第（１）項記載の膜担体。
4. （４）疎水性高分子膜が多孔性である特許請求の範囲第
   （１）項記載の膜担体。
5. （５）疎水性高分子膜がポリオレフィンである特許請求
   の範囲第（４）項記載の膜担体。
6. （６）ポリオレフィンがポリプロピレンである特許請求
   の範囲第（５）項記載の膜担体。
7. （７）疎水性高分子膜の表面を、それぞれ一定の間隔を
   おいて部分的に親水化処理することを特徴とするタンパ
   ク質固定用膜担体の製造法。
8. （８）親水化処理を酸素または酸素を含む気体もしくは
   水蒸気の低温プラズマによる表面灰化処理で行うもので
   ある特許請求の範囲第（７）項記載の製造法。
9. （９）低温プラズマによる表面灰化処理を、疎水性高分
   子膜の表面に、一定の間隔で所定形状の透孔を持った遮
   へい板を重ね合せて行うものである特許請求の範囲第（
   ８）項記載の製造法。