JPS61159164A - ミクロ化学発光アツセイシステム - Google Patents
ミクロ化学発光アツセイシステムInfo
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- JPS61159164A JPS61159164A JP60209893A JP20989385A JPS61159164A JP S61159164 A JPS61159164 A JP S61159164A JP 60209893 A JP60209893 A JP 60209893A JP 20989385 A JP20989385 A JP 20989385A JP S61159164 A JPS61159164 A JP S61159164A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は熱、電離線、あるいは特定の物質たとえば細胞
型、抗原／抗体、または酵素もしくはその基質の存在お
よび／ｌたは量？検出するために発光反応を利用するこ
とに関する。より詳細には、本発明は血清アルブミンお
よび発光物質（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ ；熱、電離線ま
たは特定の被分析体の存在下で、存在する熱、電離線ま
たは被分析体の量に比例する量の光を放出するもの）か
ら形成される複合体を利用する方法に関する。
型、抗原／抗体、または酵素もしくはその基質の存在お
よび／ｌたは量？検出するために発光反応を利用するこ
とに関する。より詳細には、本発明は血清アルブミンお
よび発光物質（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ ；熱、電離線ま
たは特定の被分析体の存在下で、存在する熱、電離線ま
たは被分析体の量に比例する量の光を放出するもの）か
ら形成される複合体を利用する方法に関する。
本発明は出願中の”不溶性の架橋した細胞性オキシダー
ゼ−パーオキシダーゼ系″（以下”Ｉ ＣＣ０ＰＳ”の
略称によシ表示する；米国特許出願第２５１，６９４号
、１９８１年４月７日出願）に基づく。その発明は２種
の架橋した酵素（一方はオキシダーゼ、他方はパーオキ
シダーゼ）からなる組酸物、およびこの組成物全腫瘍の
増殖および免疫病の抑制に使用すること全目的とする。
ゼ−パーオキシダーゼ系″（以下”Ｉ ＣＣ０ＰＳ”の
略称によシ表示する；米国特許出願第２５１，６９４号
、１９８１年４月７日出願）に基づく。その発明は２種
の架橋した酵素（一方はオキシダーゼ、他方はパーオキ
シダーゼ）からなる組酸物、およびこの組成物全腫瘍の
増殖および免疫病の抑制に使用すること全目的とする。
その発明の好ましい実施態様はパーオキシダーゼをグル
タルアルデヒド中でオキシダーゼと架橋すること、およ
びウシ血清アルブミンを架橋酵素の不溶性支持体として
使用することである。この組成物は標的細胞の細胞成分
を酸化することにより機能すると思われる。
タルアルデヒド中でオキシダーゼと架橋すること、およ
びウシ血清アルブミンを架橋酵素の不溶性支持体として
使用することである。この組成物は標的細胞の細胞成分
を酸化することにより機能すると思われる。
発光酸化にパーオキシダーゼを用いる反応は当技術分野
で多数知られている（たとえば米国特許第３，０９９，
６０５号、第３，５６４，５８８号、第３．８８０．９
３４号、第４，３５３，９８４号および第４．３９１，
９０４号明細書参照）。これら既知の発光酸化反応によ
シ本発明者は、上記出願の教示に従ってＩＣＣ０ＰＳ
’ｉ用いて細胞成分を酸化するよりもむしろ発光体ｔ−
ｉｓ化する発光反応にｘｃｃｏｐｓ系を用いることを試
みた。このようにＩＣＣ０ＰＳを発光反応に使用するた
めには、オキシダーゼが過酸化水素の生成全触媒するこ
と、言いかえれば発光体を酸化することが必要である。
で多数知られている（たとえば米国特許第３，０９９，
６０５号、第３，５６４，５８８号、第３．８８０．９
３４号、第４，３５３，９８４号および第４．３９１，
９０４号明細書参照）。これら既知の発光酸化反応によ
シ本発明者は、上記出願の教示に従ってＩＣＣ０ＰＳ
’ｉ用いて細胞成分を酸化するよりもむしろ発光体ｔ−
ｉｓ化する発光反応にｘｃｃｏｐｓ系を用いることを試
みた。このようにＩＣＣ０ＰＳを発光反応に使用するた
めには、オキシダーゼが過酸化水素の生成全触媒するこ
と、言いかえれば発光体を酸化することが必要である。
発光物質の酸化は去−オキシダーゼにより触媒される。
本発明のミクロ化学発光アッセイ法（以下”ＭＣＬＡＳ
”の略称により表示する）はルミノール、ルミノール誘
導体、および他の芳香族もしくは疎水性の発光性化合物
が血清アルブミンに非共有結合によシ結合し、触媒（た
とえばｘｃｃｏｐｓにょシ要求されるパーオキシダーゼ
およびオキシダーゼ）を排除し、一方それらの発光特性
は高い効率で保持されるという知見に基づく。事実これ
らの化合物がそれらの発光特性を保持するだけでなく、
血清アルブミンがオキシダーゼおよびパーオキシダーゼ
として、また発光反応の効率を高める触媒として実際に
機能すると思われる。
”の略称により表示する）はルミノール、ルミノール誘
導体、および他の芳香族もしくは疎水性の発光性化合物
が血清アルブミンに非共有結合によシ結合し、触媒（た
とえばｘｃｃｏｐｓにょシ要求されるパーオキシダーゼ
およびオキシダーゼ）を排除し、一方それらの発光特性
は高い効率で保持されるという知見に基づく。事実これ
らの化合物がそれらの発光特性を保持するだけでなく、
血清アルブミンがオキシダーゼおよびパーオキシダーゼ
として、また発光反応の効率を高める触媒として実際に
機能すると思われる。
ルミノール、ルミノール誘導体、またハ芳香族もしくは
疎水性の発光性化合物と蛋白質との組合せは新規ではな
い。たとえば米国特許第４．１０４，０２９号明細書に
は、ルミノールおよび他ノルミノール誘導体がルミノー
ルまタハルミノール誘導体のアミノ基を介して各種蛋白
質に共有結合することが示されている。特にその明細書
にはグルタルアルデヒｌ−＃全結合剤として用いてルミ
ノールをルミノールのアミノ基を介してインシュリンに
共有結合させることが示されている。しかしグルタルア
ルデヒドはルミノールまたはルミノール誘導体への血清
アルブミンの結合を促進することはなく、その明細書に
はこれを行うのに適した方法に関しては何ら示唆されて
いない。
疎水性の発光性化合物と蛋白質との組合せは新規ではな
い。たとえば米国特許第４．１０４，０２９号明細書に
は、ルミノールおよび他ノルミノール誘導体がルミノー
ルまタハルミノール誘導体のアミノ基を介して各種蛋白
質に共有結合することが示されている。特にその明細書
にはグルタルアルデヒｌ−＃全結合剤として用いてルミ
ノールをルミノールのアミノ基を介してインシュリンに
共有結合させることが示されている。しかしグルタルア
ルデヒドはルミノールまたはルミノール誘導体への血清
アルブミンの結合を促進することはなく、その明細書に
はこれを行うのに適した方法に関しては何ら示唆されて
いない。
・ 英国特許第２，（１０８，２４７号明細書には、
ペプチビ結合による抗体へのルミノールの共有結合、お
よび赤血球の存在下で起こる光放出反応につき示されて
いる。赤血球のヘモグロビンが過酸化水素の生成を触媒
し、過酸化水素がルミノールを酸化する。上記明細書も
化学発光反応をｐＨ，温度、溶剤の摺性の変化により、
また入射電離線により誘発しうろことは示唆しているが
、これらの結果を達成する方法またはこの系の利用性に
ついては何ら示唆していない。
ペプチビ結合による抗体へのルミノールの共有結合、お
よび赤血球の存在下で起こる光放出反応につき示されて
いる。赤血球のヘモグロビンが過酸化水素の生成を触媒
し、過酸化水素がルミノールを酸化する。上記明細書も
化学発光反応をｐＨ，温度、溶剤の摺性の変化により、
また入射電離線により誘発しうろことは示唆しているが
、これらの結果を達成する方法またはこの系の利用性に
ついては何ら示唆していない。
さらに、血清アルブミンは発光反応に対する抑制剤とし
て作用することが当技術分野で知られているので、血清
アルブミ／とルミノールモジくはルミノール誘導体との
複合体を形成することを試みる理由はなかった。たとえ
ばエッチ・アール・シュレーダーら（”化学発光を伴う
特異的な蛋白質結合反応の監視”、５７、メソッヅ・イ
ン・エンザイモロジー、４２４．４２４および４３９（
１９７８））およびそこに引用される参考文献は、ルミ
ノールのアミノ残基にアルキル基が結合することにより
発光物質としてのルミノールの効率が実質的に低下する
と述べている。他にもルミノールおよびインルミノール
上のアミノ基への共有結合により発光が１００倍はど低
下する可能性があることが記載されている（シー・エヌ
・ツェルナーラ、５９、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティー、２５８０（１９３７）、お
よびビー・アール・ブランキニら、１１１１アナリテイ
カル・バイオケミストリー、８７（１９８１））。従っ
て、血清アルブミンがルミノールに結合したとしてもこ
れにより発光反応は弱まると予想されたであろう。
て作用することが当技術分野で知られているので、血清
アルブミ／とルミノールモジくはルミノール誘導体との
複合体を形成することを試みる理由はなかった。たとえ
ばエッチ・アール・シュレーダーら（”化学発光を伴う
特異的な蛋白質結合反応の監視”、５７、メソッヅ・イ
ン・エンザイモロジー、４２４．４２４および４３９（
１９７８））およびそこに引用される参考文献は、ルミ
ノールのアミノ残基にアルキル基が結合することにより
発光物質としてのルミノールの効率が実質的に低下する
と述べている。他にもルミノールおよびインルミノール
上のアミノ基への共有結合により発光が１００倍はど低
下する可能性があることが記載されている（シー・エヌ
・ツェルナーラ、５９、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティー、２５８０（１９３７）、お
よびビー・アール・ブランキニら、１１１１アナリテイ
カル・バイオケミストリー、８７（１９８１））。従っ
て、血清アルブミンがルミノールに結合したとしてもこ
れにより発光反応は弱まると予想されたであろう。
過去に血清アルブミンの触媒作用についての報告がある
。たとえばウシ血清アルブミンはホ、トクロミツクアゾ
ベンゼン化合物のシス−トランス反応を触媒する能力を
もつことが報告されている（アール・ロブリーンら、６
、バイオケミストリー、２２８１ （１９６７））。発
光反応とは無関係な系において、ウシ血清アルブミンは
マイインハイマー複合体の分解を駆動させる良好な触媒
であるが、ヒト血清アルブミンは不活性であることが報
告されている（アール・ティラーら、９５、ジャーナル
・オプ・アメリカン・ケミカルソサエティー、５８１９
（１９７３）；またスターギルら、４８５、ビオヒミ力
・ビオフイジ力・アクタ、２３６（１９７７）も参照さ
れたい）。また、結晶ウシ血清アルブミンをルミノール
含有溶液に添加することによりルミノールの螢光偏光が
１５倍増加することも報告されている（ピー・エム・プ
リチャードら％３１、バイオケミ、バイオフィシ、リサ
、コミュ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
。たとえばウシ血清アルブミンはホ、トクロミツクアゾ
ベンゼン化合物のシス−トランス反応を触媒する能力を
もつことが報告されている（アール・ロブリーンら、６
、バイオケミストリー、２２８１ （１９６７））。発
光反応とは無関係な系において、ウシ血清アルブミンは
マイインハイマー複合体の分解を駆動させる良好な触媒
であるが、ヒト血清アルブミンは不活性であることが報
告されている（アール・ティラーら、９５、ジャーナル
・オプ・アメリカン・ケミカルソサエティー、５８１９
（１９７３）；またスターギルら、４８５、ビオヒミ力
・ビオフイジ力・アクタ、２３６（１９７７）も参照さ
れたい）。また、結晶ウシ血清アルブミンをルミノール
含有溶液に添加することによりルミノールの螢光偏光が
１５倍増加することも報告されている（ピー・エム・プ
リチャードら％３１、バイオケミ、バイオフィシ、リサ
、コミュ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ−）１３１ （
１９６８））。
１９６８））。
この先行技術には特定の被分析体のアッセイの一部とし
ての各種の光放出反応も示されている。
ての各種の光放出反応も示されている。
これらの方法は発光物質を酸化するためにＨ２Ｏ２の存
在に依存する場合が多く、従ってこれらはオキシダーゼ
により触媒される反応をパーオキシダーゼにより触媒さ
れる酸化／還元反応と結びつける。これらの反応は多数
の人々により文献に記載されており、総括がダブリュー
・アール・ザイッの“酵素により発生した過酸化物の化
学発光の検出”（５７、メンツズ・イン・エンザイモロ
ジー、４４５（１９７８）に見られる。
在に依存する場合が多く、従ってこれらはオキシダーゼ
により触媒される反応をパーオキシダーゼにより触媒さ
れる酸化／還元反応と結びつける。これらの反応は多数
の人々により文献に記載されており、総括がダブリュー
・アール・ザイッの“酵素により発生した過酸化物の化
学発光の検出”（５７、メンツズ・イン・エンザイモロ
ジー、４４５（１９７８）に見られる。
発光物質に非共有結合した場合に血清アルブミンが光放
出反応の触媒として作用するという知見から、この複合
体を熱、電離線および多数の特異的被分析体を検出する
ための発光アッセイに使用する多くの可能性が生じる。
出反応の触媒として作用するという知見から、この複合
体を熱、電離線および多数の特異的被分析体を検出する
ための発光アッセイに使用する多くの可能性が生じる。
必要なすべては、発光反応を誘発する手段である。本発
明の血清アルブミン−ルミノール複合体の場合、血清ア
ルブミン−ルミノールまたは血清アルブミン−ルミノー
ル銹導体複合体の発光反応を誘発するために必要なすべ
ては、塩基の添加である。血清アルブミン−発光物質複
合体がヘム蛋白質に結合している場合、光放出反応を誘
発するために必要なすべては熱の付与である。ヘム蛋白
質一血清アルブミン−発光物質複合体が酸化酵素に結合
している場合、発光反応を誘発するために必要なすべて
はその酸化酵素に特異的な基質の存在である。
明の血清アルブミン−ルミノール複合体の場合、血清ア
ルブミン−ルミノールまたは血清アルブミン−ルミノー
ル銹導体複合体の発光反応を誘発するために必要なすべ
ては、塩基の添加である。血清アルブミン−発光物質複
合体がヘム蛋白質に結合している場合、光放出反応を誘
発するために必要なすべては熱の付与である。ヘム蛋白
質一血清アルブミン−発光物質複合体が酸化酵素に結合
している場合、発光反応を誘発するために必要なすべて
はその酸化酵素に特異的な基質の存在である。
これらの系の各種成分は扱いやすくかつ入手しやすいた
め、本発明に従来のアッセイ法に勝る利点となる多数の
特性が与えられる。たとえば特定の体液中のグルコース
の存在を米国特許第３．０９９，６０５号明細書（フリ
ー）に示される化学発光法により、おるいは文献および
上記特許に続く他の特許に示される手法に対してなされ
た改良法により試験することが長年の間実際に行われて
きた。この方法の感度が比較的低いこと、およびこの方
法によりグルコースの存在量を定量するのは困難である
という事実は、この方法の有用性に影響を与える制限事
項である。これらの制限は本発明により克服できる。
め、本発明に従来のアッセイ法に勝る利点となる多数の
特性が与えられる。たとえば特定の体液中のグルコース
の存在を米国特許第３．０９９，６０５号明細書（フリ
ー）に示される化学発光法により、おるいは文献および
上記特許に続く他の特許に示される手法に対してなされ
た改良法により試験することが長年の間実際に行われて
きた。この方法の感度が比較的低いこと、およびこの方
法によりグルコースの存在量を定量するのは困難である
という事実は、この方法の有用性に影響を与える制限事
項である。これらの制限は本発明により克服できる。
一般に用いられる他の分析法は、しばしばラジオイムノ
アッセイ（またはＲＩＡ ）と呼ばれる方法である。Ｒ
ＩＡは放射性化学物質を用いるという事実により特色づ
けられる。これらの化学物質の放射能により、これらの
試薬の取扱い、保存および廃棄に際して問題が生じる。
アッセイ（またはＲＩＡ ）と呼ばれる方法である。Ｒ
ＩＡは放射性化学物質を用いるという事実により特色づ
けられる。これらの化学物質の放射能により、これらの
試薬の取扱い、保存および廃棄に際して問題が生じる。
本発明は試薬の価格および入手上の制限などという付随
する問題、試薬の保存、取扱いおよび廃棄における問題
、ならびにＲＩＡを特色づける分離およびトランスファ
ーという必要工程なしに、ＲＩＡの特異性を提供する。
する問題、試薬の保存、取扱いおよび廃棄における問題
、ならびにＲＩＡを特色づける分離およびトランスファ
ーという必要工程なしに、ＲＩＡの特異性を提供する。
ＲＩＡと同様に生物発光アッセイ法はきわめて感受性が
高く、操作する者の側に高度の手腕を必要とせず、また
取扱い、保存および廃棄の問題を生じないという利点を
もつ。しかしこれに関してはほとんど研究がなされてお
らず、従って標準法がなく、ある例と他との比較もなさ
れていない。
高く、操作する者の側に高度の手腕を必要とせず、また
取扱い、保存および廃棄の問題を生じないという利点を
もつ。しかしこれに関してはほとんど研究がなされてお
らず、従って標準法がなく、ある例と他との比較もなさ
れていない。
酵素結合免疫吸収剤アッセイ法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋ
ｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、 ＥＬ
ＩＳＡ）は感度が高く、比較的速やかに実施でき、自動
化して多数の試料を同時にアッセイす右ことができ、か
つ比較的少量の試薬を使用する。しかしＥＬ Ｉ ＳＡ
は同様な試料から得られる結果の再現が困難であり、操
作する者の側に高度の手腕を必要とすることにより特色
づけられる。さらに酵素−抗体結合体を標準化し、ある
いは結合反応の効率を測定する試みはほとんどなされて
いない。螢光抗体アッセイ法もきわめて感度が高く、少
量の試薬を必要とするにすぎない。しかしこれらも操作
する者の側に高度の手腕を必要とし、抑制が多く、時間
がかかる。さらにこれらは最良の場合でも半定量的であ
り、時には定性的な性質のものであるにすぎない。
ｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、 ＥＬ
ＩＳＡ）は感度が高く、比較的速やかに実施でき、自動
化して多数の試料を同時にアッセイす右ことができ、か
つ比較的少量の試薬を使用する。しかしＥＬ Ｉ ＳＡ
は同様な試料から得られる結果の再現が困難であり、操
作する者の側に高度の手腕を必要とすることにより特色
づけられる。さらに酵素−抗体結合体を標準化し、ある
いは結合反応の効率を測定する試みはほとんどなされて
いない。螢光抗体アッセイ法もきわめて感度が高く、少
量の試薬を必要とするにすぎない。しかしこれらも操作
する者の側に高度の手腕を必要とし、抑制が多く、時間
がかかる。さらにこれらは最良の場合でも半定量的であ
り、時には定性的な性質のものであるにすぎない。
抗体に関する化学発光アッセイ法においてルミノール標
識された被分析体を使用することも知られている。たと
えばシー・ニス・ヘルシュらの”ヒト免疫グロブリンＧ
のルミノール補助による競合結合イムノアッセイ法”（
メンツズ・イン・エンサイモロシー、ニス・ピー・コロ
ウィックおよびエン・オー・カブラン編、７３巻、免疫
化学的手法（１９８１）、６０８−６１５頁）には、沈
降物を化学発光につき調べる沈降素反応、および第２抗
体または分離剤の使用による非沈降性抗体−抗原複合体
に利用するための、上記方法の変法が記載されている。
識された被分析体を使用することも知られている。たと
えばシー・ニス・ヘルシュらの”ヒト免疫グロブリンＧ
のルミノール補助による競合結合イムノアッセイ法”（
メンツズ・イン・エンサイモロシー、ニス・ピー・コロ
ウィックおよびエン・オー・カブラン編、７３巻、免疫
化学的手法（１９８１）、６０８−６１５頁）には、沈
降物を化学発光につき調べる沈降素反応、および第２抗
体または分離剤の使用による非沈降性抗体−抗原複合体
に利用するための、上記方法の変法が記載されている。
より詳ｍＫは、この方法はＩ、９Ｇへのルミノールの共
有結合、およびルミノール−Ｉ、９Ｇ複合体と抗工ｇＧ
抗原を混合して沈降物を形成すること、次いでこれをヘ
ミンおよびＨ２Ｏ２と接触させて光を放出させることを
伴う。
有結合、およびルミノール−Ｉ、９Ｇ複合体と抗工ｇＧ
抗原を混合して沈降物を形成すること、次いでこれをヘ
ミンおよびＨ２Ｏ２と接触させて光を放出させることを
伴う。
前記ヘルシュらが述べた方法は、ルミノールを他の免疫
グロブリン、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に結合
させること、およびジアゾ化されたルミノールをウシ血
清アルブミンおよびＨＣＧに結合させることに応用され
ている。この最後の結合はジエイ・ニス・ニー・シンプ
ソンら（２７９、ネイチャー（ロンドン）、６４６（１
９７９））が述べた方法の変法により達成される。この
変法により形成されるルミノール−Ｈ０Ｇ結合体は各Ｈ
ＯＧ分子に共有結合したルミノール分子１０個を含有し
ていた。これらの結合体の化学発光効率はルミノール−
ＩｇＧ結合体の効率に比べて低下しており、ルミノール
−ジアゾ−ＨＣＡ結合体の場合は発光反応の効率はルミ
ノール−ＩＩＩＧを伴う反応の効率の０．５〜４％であ
った。
グロブリン、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に結合
させること、およびジアゾ化されたルミノールをウシ血
清アルブミンおよびＨＣＧに結合させることに応用され
ている。この最後の結合はジエイ・ニス・ニー・シンプ
ソンら（２７９、ネイチャー（ロンドン）、６４６（１
９７９））が述べた方法の変法により達成される。この
変法により形成されるルミノール−Ｈ０Ｇ結合体は各Ｈ
ＯＧ分子に共有結合したルミノール分子１０個を含有し
ていた。これらの結合体の化学発光効率はルミノール−
ＩｇＧ結合体の効率に比べて低下しており、ルミノール
−ジアゾ−ＨＣＡ結合体の場合は発光反応の効率はルミ
ノール−ＩＩＩＧを伴う反応の効率の０．５〜４％であ
った。
感度、柔軟性、試薬の安価なこと、および操作する者に
要求される手腕が低いことは、本発明にこれら先行技術
によるアッセイ法のいずれにもない利点を与える。たと
えば血清アルブミンは比較的安価であり、容易に入手で
き、かつ多くの生化学的化合物に対して比較的不活性で
ある。その感受性を示す例は、赤血球上におけるレクチ
ン−血清アルブミン−ルミノール複合体を伴う本発明に
より行われるアッセイは塩基（たとえば水酸化ナトリウ
ム）により活性化される場合、試薬約８０アツトモル（
ａｔｔｏｍｏｌｅ）［０，０８フ工ムトモル（ｆｅｍｔ
ｏｍｏｌｅ） ］の感度限界をもつという事実である。
要求される手腕が低いことは、本発明にこれら先行技術
によるアッセイ法のいずれにもない利点を与える。たと
えば血清アルブミンは比較的安価であり、容易に入手で
き、かつ多くの生化学的化合物に対して比較的不活性で
ある。その感受性を示す例は、赤血球上におけるレクチ
ン−血清アルブミン−ルミノール複合体を伴う本発明に
より行われるアッセイは塩基（たとえば水酸化ナトリウ
ム）により活性化される場合、試薬約８０アツトモル（
ａｔｔｏｍｏｌｅ）［０，０８フ工ムトモル（ｆｅｍｔ
ｏｍｏｌｅ） ］の感度限界をもつという事実である。
一般のアッセイ法、たとえばＨ２Ｏ２−ミクロ・ミーオ
キシダーゼ系またはＨ２Ｏ２−ヘマチンパーオキシダー
ゼ系により達成される最高感度はピコモル濃度において
１５０アットモル（０，１５フ工ムトモル）である。ル
ミノールも容易に入手でき、かつ安価である。血清アル
ブミンもルミノールも取扱いまたは保存において重大な
問題を生じない。本発明は柔軟性が高く、抗原性でない
多くのものを含む広範な生物学的物質の検出に用いるこ
とができる。
キシダーゼ系またはＨ２Ｏ２−ヘマチンパーオキシダー
ゼ系により達成される最高感度はピコモル濃度において
１５０アットモル（０，１５フ工ムトモル）である。ル
ミノールも容易に入手でき、かつ安価である。血清アル
ブミンもルミノールも取扱いまたは保存において重大な
問題を生じない。本発明は柔軟性が高く、抗原性でない
多くのものを含む広範な生物学的物質の検出に用いるこ
とができる。
さらにこれを利用して細胞媒介免疫の迅速アッセイを初
めて提供することができた。過敏症の検査に現在採用さ
れている方法は、あらかじめ抗原または分裂促進剤（ｍ
ｉ ｔｏｇｅｎ）により刺激されたリンパ球のＤＮＡへ
のトリチウム化チミジンの取込みを測定することによる
。トリチウム化チミジンアッセイ法は３日間のインキュ
ベーションおよび放射性物質の使用を必要とする。放射
性物質を必要としない本発明方法を採用すると、アッセ
イを１時間以内に行うことができる。本発明により得ら
れる結果は一貫して再現性があり、迅速に、また操作す
る者を徹底的に訓練することなく達成することができる
。
めて提供することができた。過敏症の検査に現在採用さ
れている方法は、あらかじめ抗原または分裂促進剤（ｍ
ｉ ｔｏｇｅｎ）により刺激されたリンパ球のＤＮＡへ
のトリチウム化チミジンの取込みを測定することによる
。トリチウム化チミジンアッセイ法は３日間のインキュ
ベーションおよび放射性物質の使用を必要とする。放射
性物質を必要としない本発明方法を採用すると、アッセ
イを１時間以内に行うことができる。本発明により得ら
れる結果は一貫して再現性があり、迅速に、また操作す
る者を徹底的に訓練することなく達成することができる
。
本発明は血清アルブミン−発光物質複合体を用いて細胞
に対する電離線、熱および過酸化による傷害を検出する
方法を目的とする。
に対する電離線、熱および過酸化による傷害を検出する
方法を目的とする。
本発明は、ヘム蛋白質、血清アルブミン、および発光物
質からなり、ヘム蛋白質が血清アルブミンに結合し、発
光物質が血清アルブミンに非共有結合している化学発光
アッセイ用結合体についても記述する。ヘム蛋白質一血
清アルブミン−発光物質結合体は熱を検出するための組
成物として、またその方法に使用できる。熱または電離
線を検出するためのヘム蛋白質一血清アルブミン−発光
物質結合体を収容したデバイスも製造できる。
質からなり、ヘム蛋白質が血清アルブミンに結合し、発
光物質が血清アルブミンに非共有結合している化学発光
アッセイ用結合体についても記述する。ヘム蛋白質一血
清アルブミン−発光物質結合体は熱を検出するための組
成物として、またその方法に使用できる。熱または電離
線を検出するためのヘム蛋白質一血清アルブミン−発光
物質結合体を収容したデバイスも製造できる。
本発明は特異的結合対（リガンドおよび抗リガンドから
なる）のりガントを検出および定量するための組成物お
よび方法であって、血清アルブミンへのりガントの結合
、該血清アルブミンへのヘム蛋白質の結合、および該血
清アルブミンへの発光物質の非共有結合から形成される
複合体、ならびにこの複合体を特異的結合対の抗リガン
ドへの結合に使用することよりなるものをも目的とする
。
なる）のりガントを検出および定量するための組成物お
よび方法であって、血清アルブミンへのりガントの結合
、該血清アルブミンへのヘム蛋白質の結合、および該血
清アルブミンへの発光物質の非共有結合から形成される
複合体、ならびにこの複合体を特異的結合対の抗リガン
ドへの結合に使用することよりなるものをも目的とする
。
本発明は細胞成分の過酸化を起こす可能性のある刺激に
より引き起こされる、細胞に対する損傷の可能性を検知
するための組成物および方法についても記述する。
より引き起こされる、細胞に対する損傷の可能性を検知
するための組成物および方法についても記述する。
従って本発明の目的は、熱または電離線の検出および定
量のための方法および組成物を提供することである。
量のための方法および組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、細胞に対する過酸化による損傷を
検出および定量するための方法および組成物を提供する
ことである。
検出および定量するための方法および組成物を提供する
ことである。
本発明の他の目的は、熱または電離線の検出および定量
のためのデバイスを提供することである。
のためのデバイスを提供することである。
本発明の他の目的は、特異的結合対の一員である特異的
被分析体の検出および定量のための方法、ならびにその
方法に使用するための組成物を提供することである。
被分析体の検出および定量のための方法、ならびにその
方法に使用するための組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、特異的結合対の一員である特異的
被分析体の検出および定量のためのデバイスを提供する
ことである。
被分析体の検出および定量のためのデバイスを提供する
ことである。
本発明の他の目的は、特異的細胞型の検出および定量の
ための方法、およびその方法に用いられる組成物を提供
することである。
ための方法、およびその方法に用いられる組成物を提供
することである。
本発明の他の目的は、特異的細胞型の検出および定量の
ためのデバイスを提供することである。
ためのデバイスを提供することである。
本発明の他の目的は、多種の細胞型を含む液体または半
固体中の特異的細胞型を検出および定量するために、ま
た液体または半固体中の特異的被分析体（特異的結合対
の一員である）を検出および定量するために採用できる
化学発光アッセイ法を提供することである。
固体中の特異的細胞型を検出および定量するために、ま
た液体または半固体中の特異的被分析体（特異的結合対
の一員である）を検出および定量するために採用できる
化学発光アッセイ法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、特異的結合対の一員である
特定のリガンドを検出するための、信頼性のある高感度
の簡単な方法およびその方法に使用するための組成物で
おって、費用が少なく、かつ各種リガンドの検出に容易
に適用できるものを提供することである。
特定のリガンドを検出するための、信頼性のある高感度
の簡単な方法およびその方法に使用するための組成物で
おって、費用が少なく、かつ各種リガンドの検出に容易
に適用できるものを提供することである。
本発明の他の目的は、調製するための費用が少なく、各
種の抗体／抗原対について使用できる化学発光イムノア
ッセイに用いる組成物を提供することである。
種の抗体／抗原対について使用できる化学発光イムノア
ッセイに用いる組成物を提供することである。
本発明のこれらの目的、および本明細ＩＦ全体を通して
明らかになると思われる他の目的は、下記の詳細な記述
により達成される。
明らかになると思われる他の目的は、下記の詳細な記述
により達成される。
第１図は架橋したヘモグロビン−ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）−ルミノールゲルの熱化学発光を示すグラフで
ある。これらの結果は水浴で加熱さし、直チニヘノクマ
ンＬＳ ２３０シンチレーシヨン計数計（アウトオブコ
インシデンスモート″）ニヨり計数されたゲル懸濁液ｌ
−から得られた。
ＢＳＡ）−ルミノールゲルの熱化学発光を示すグラフで
ある。これらの結果は水浴で加熱さし、直チニヘノクマ
ンＬＳ ２３０シンチレーシヨン計数計（アウトオブコ
インシデンスモート″）ニヨり計数されたゲル懸濁液ｌ
−から得られた。
第２図はワサビダイコン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）パ
ーオキシダーゼーウ、シ血清アルブミン−ルミノールで
標識された多様な種の赤血球の熱化学発光を示すグラフ
である。黒丸はランドレースーデュロック（Ｌａｎｄｒ
ａｃｅ −Ｄｕｒｏｃ ）交配ブタの細胞を表わし、白
丸は小型ブタの細胞、白い四角はスプラークードーレイ
（Ｓｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙ）ラットの細胞、黒
い四角はヒト赤血球を表わす。実線はランドレースーデ
ュロツクのデータに関する回帰線であり、一点破線はラ
ットのデータに関する回帰徐、破線はプールした小型ブ
タおよびヒトのデータに関する回帰線である。
ーオキシダーゼーウ、シ血清アルブミン−ルミノールで
標識された多様な種の赤血球の熱化学発光を示すグラフ
である。黒丸はランドレースーデュロック（Ｌａｎｄｒ
ａｃｅ −Ｄｕｒｏｃ ）交配ブタの細胞を表わし、白
丸は小型ブタの細胞、白い四角はスプラークードーレイ
（Ｓｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙ）ラットの細胞、黒
い四角はヒト赤血球を表わす。実線はランドレースーデ
ュロツクのデータに関する回帰線であり、一点破線はラ
ットのデータに関する回帰徐、破線はプールした小型ブ
タおよびヒトのデータに関する回帰線である。
第３図はボーランドーチャイナ（ＰｏｌａΩｄ−Ｃｈｉ
ｎａ ）ブタから得た赤血球（ＲＢＧ）の熱化学発光を
示すグラフである。白丸はルミノール、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）およびワサビダイコンノミ−オキシダー
ゼ（ＨＲＰ）で標識したＲＢＣを表わし、黒丸はＢＳＡ
およびＨＲＰで標識したＲＢＣを表わし、白い四角はグ
ルタルアルデヒドで処理したＲＢＣを表わす。
ｎａ ）ブタから得た赤血球（ＲＢＧ）の熱化学発光を
示すグラフである。白丸はルミノール、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）およびワサビダイコンノミ−オキシダー
ゼ（ＨＲＰ）で標識したＲＢＣを表わし、黒丸はＢＳＡ
およびＨＲＰで標識したＲＢＣを表わし、白い四角はグ
ルタルアルデヒドで処理したＲＢＣを表わす。
第４図はルミノール−ウシ血清アルブミン−ワサビダイ
コンパーオキシダーゼで標識したヒト赤血球（ＲＢＣ）
の熱化学発光を示すグラフである。黒い四角は正常なヒ
トＲＢＣ；のデータを表わし、白丸はハロタン（ｈａｌ
ｏｔ、ｈａｎｅ）暴露した正常ＲＢＣのデータ、黒丸１
ｄｌ−１０ルー２．４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ
）で処理したＲＢＣ１白い四角はハロタンに暴露したＣ
ＤＮＢ処理ＲＢＣを表わす。
コンパーオキシダーゼで標識したヒト赤血球（ＲＢＣ）
の熱化学発光を示すグラフである。黒い四角は正常なヒ
トＲＢＣ；のデータを表わし、白丸はハロタン（ｈａｌ
ｏｔ、ｈａｎｅ）暴露した正常ＲＢＣのデータ、黒丸１
ｄｌ−１０ルー２．４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ
）で処理したＲＢＣ１白い四角はハロタンに暴露したＣ
ＤＮＢ処理ＲＢＣを表わす。
第５図はハロタン暴露がルミノールおよびワサビダイコ
ンパーオキシダーゼで標識したランドレースーデュロツ
ク交配ブタ由来赤血球の熱化学発光に与える影響を示す
グラフである。白丸は未処理のブタ赤血球から得たデー
タを表わし、黒い四角はハロタン暴露したブタ赤血球か
ら得たデータを表わす。
ンパーオキシダーゼで標識したランドレースーデュロツ
ク交配ブタ由来赤血球の熱化学発光に与える影響を示す
グラフである。白丸は未処理のブタ赤血球から得たデー
タを表わし、黒い四角はハロタン暴露したブタ赤血球か
ら得たデータを表わす。
第６図は、吸着されたルミノールを含有する架橋したコ
ンカナバリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）およびウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）の溶液Ｚ ｔｔｔｌを装填したＧ−２５
セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム（４８ｍｌ
）からの画分の化学発光を示すグラフである。架橋はグ
リシン１００■の添加により停止された。
ンカナバリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）およびウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）の溶液Ｚ ｔｔｔｌを装填したＧ−２５
セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム（４８ｍｌ
）からの画分の化学発光を示すグラフである。架橋はグ
リシン１００■の添加により停止された。
第７図はあらかじめ抗原で感作されたマウスから得た肺
細胞め化学発光を示すグラフである。黒い四角は対照群
から得たデータを表わし、白丸は感作の２日後に検査さ
れた細胞から得たデータ、白い四角は感作の４日後に検
葺された細胞から得たデータを表わす。
細胞め化学発光を示すグラフである。黒い四角は対照群
から得たデータを表わし、白丸は感作の２日後に検査さ
れた細胞から得たデータ、白い四角は感作の４日後に検
葺された細胞から得たデータを表わす。
本発明は特定の化合物（発光物質と総称される）の酸化
に際しての化学発光に関する。最も一般的な発光物質の
１つはルミノール（５−アミノ−２゜３−ジヒト９０フ
タラジンー１．４−ジオン）であり、これは強塩基、酸
化剤および触媒の添加により発光するであろう。同様に
発光物質として作用するルミノール誘導体は多数あり、
これにはイソルミノールおよびジエチルインルミノール
が含まれ、 “これらはルミノール誘導体のう
ち比較的よく知られたもののうちの２種である。”ルミ
ノール誘導体”という語はルミノール、およびルミノー
ルのアミノフタルヒドラジド 置換することにより形成された化合物を意味する。
に際しての化学発光に関する。最も一般的な発光物質の
１つはルミノール（５−アミノ−２゜３−ジヒト９０フ
タラジンー１．４−ジオン）であり、これは強塩基、酸
化剤および触媒の添加により発光するであろう。同様に
発光物質として作用するルミノール誘導体は多数あり、
これにはイソルミノールおよびジエチルインルミノール
が含まれ、 “これらはルミノール誘導体のう
ち比較的よく知られたもののうちの２種である。”ルミ
ノール誘導体”という語はルミノール、およびルミノー
ルのアミノフタルヒドラジド 置換することにより形成された化合物を意味する。
発光物質として最も活性の高いルミノール誘導体は，置
換基がアルキル架橋基を介してイソルミノールのアミノ
残基に結合したものである。これらの誘導体には下記の
ものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
換基がアルキル架橋基を介してイソルミノールのアミノ
残基に結合したものである。これらの誘導体には下記の
ものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
これらのルミノール誘導体の製法はエッチ・アール・シ
ュジーｙ−らの５７、′メソツヅ・イン・エンザイモロ
ジー”、４２５．４４５（１９７８）にまとめられてお
り、これをここに参考のために引用する。本発明に用い
た場合に発光物質として作用する他の化合物には、フェ
ノールパイルば一ト、インドール−３−パイルベート、
トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファンもしくは
他のドリフトファン誘導体、インドールプロピオン酸、
およびインドゝ−ル酢酸が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。発光物質の酸化に際して発せられる
光はルミノメータ−またはシンチレーション計数計、た
とえばサイエンス・アプリケーションズ社製３０００型
積分ルミノメータ−１またハ（ツクマン拳インスソルメ
ンツ社製（−タ液体シンチレーション計数計により測定
することができる。
ュジーｙ−らの５７、′メソツヅ・イン・エンザイモロ
ジー”、４２５．４４５（１９７８）にまとめられてお
り、これをここに参考のために引用する。本発明に用い
た場合に発光物質として作用する他の化合物には、フェ
ノールパイルば一ト、インドール−３−パイルベート、
トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファンもしくは
他のドリフトファン誘導体、インドールプロピオン酸、
およびインドゝ−ル酢酸が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。発光物質の酸化に際して発せられる
光はルミノメータ−またはシンチレーション計数計、た
とえばサイエンス・アプリケーションズ社製３０００型
積分ルミノメータ−１またハ（ツクマン拳インスソルメ
ンツ社製（−タ液体シンチレーション計数計により測定
することができる。
ルミノールの各種誘導体はそれらの化学発光活性におい
てかなりの差を示す。たとえばアミノナフチルヒトゝラ
ジビ類およびチロキシン−ナフチルヒドラジド のアミノフタルヒドラジド誘導体よりも低い水準で検出
できる（シュレーダーら、前掲文献４４０頁）。
てかなりの差を示す。たとえばアミノナフチルヒトゝラ
ジビ類およびチロキシン−ナフチルヒドラジド のアミノフタルヒドラジド誘導体よりも低い水準で検出
できる（シュレーダーら、前掲文献４４０頁）。
発光物質として作用しうる前記の非ルミノール誘導体も
それらの発光特性において若干の差を示す。
それらの発光特性において若干の差を示す。
さらに発光反応はｐＨ依存性である。ルミノールは特に
ｐＨの変化に対してきわめて敏感であり、約１０のｐＨ
においてその最も効果的な発光を示すことができ、８以
下のｐＨにおいては水にわずかしか溶解しない。ルミノ
ールの発光反応のｐＨ依存性および溶解性は、過去にお
いてアッセイ法としての化学発光法の有用性を制限して
きた因子である。
ｐＨの変化に対してきわめて敏感であり、約１０のｐＨ
においてその最も効果的な発光を示すことができ、８以
下のｐＨにおいては水にわずかしか溶解しない。ルミノ
ールの発光反応のｐＨ依存性および溶解性は、過去にお
いてアッセイ法としての化学発光法の有用性を制限して
きた因子である。
血清アルブミンは血漿蛋白質のうち最も豊富なものであ
り、その機能の一つは溶解性の乏しい多くの代謝産物の
輸送体として作用することである。
り、その機能の一つは溶解性の乏しい多くの代謝産物の
輸送体として作用することである。
血清アルブミンの三次元構造は、分子の一方側にポケッ
トが形成されたものである。アルブミンが □そ
の輸送機能を果たすのを助けるのはこのポケットである
。このポケットは芳香族および／″！たは疎水性の分子
に対して大きな親和性をもつからである。ルミノールお
よびその誘導体の多くは、発光物質として作用しうる前
記の他の分子の多くと同様に芳香族および／または疎水
性である。本発明は、ルミノール、ルミノール誘導体、
および非ルミノール系発光物質がこのポケッ）において
血清アルブミンと非共有結合し、この非共有結合は発光
反応を抑えるのではなく、アルブミンを発光反応のきわ
めて有効な触媒として作用させる結果となるであろうと
いう知見に基づく。さらに、これはきわめて有効な触媒
であるため、ルミノール以外の前記化合物もこの様式で
血清アルブミンと非共有結合した場合、発光物質として
使用できる。
トが形成されたものである。アルブミンが □そ
の輸送機能を果たすのを助けるのはこのポケットである
。このポケットは芳香族および／″！たは疎水性の分子
に対して大きな親和性をもつからである。ルミノールお
よびその誘導体の多くは、発光物質として作用しうる前
記の他の分子の多くと同様に芳香族および／または疎水
性である。本発明は、ルミノール、ルミノール誘導体、
および非ルミノール系発光物質がこのポケッ）において
血清アルブミンと非共有結合し、この非共有結合は発光
反応を抑えるのではなく、アルブミンを発光反応のきわ
めて有効な触媒として作用させる結果となるであろうと
いう知見に基づく。さらに、これはきわめて有効な触媒
であるため、ルミノール以外の前記化合物もこの様式で
血清アルブミンと非共有結合した場合、発光物質として
使用できる。
ここで用いる”血清アルブミン”という語は、血漿の主
要蛋白成分である分子量６ ８，０ ０ ０〜６ ９、
０ ０ ０の蛋白質を意味する。本発明の方法および組
成物はすべてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）について述
べられているが、当業者にはヒトまたは他の供給源から
の血清アルブミンも有利に使用できることが理解される
であろう。但し、実際には本発明において明らかなよう
に血清アルブミンが触媒として作用する能力はその供給
源により異なる可能性があることを示す証拠が幾つかあ
る。たとえばタイラーらの６、”バイオケミストリー”
、２２８１（１９６７）にはウシ血清アルブミンはある
用途において触媒活性を示したが、ヒト血清アルブミン
は不活性であったと報告されている。
要蛋白成分である分子量６ ８，０ ０ ０〜６ ９、
０ ０ ０の蛋白質を意味する。本発明の方法および組
成物はすべてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）について述
べられているが、当業者にはヒトまたは他の供給源から
の血清アルブミンも有利に使用できることが理解される
であろう。但し、実際には本発明において明らかなよう
に血清アルブミンが触媒として作用する能力はその供給
源により異なる可能性があることを示す証拠が幾つかあ
る。たとえばタイラーらの６、”バイオケミストリー”
、２２８１（１９６７）にはウシ血清アルブミンはある
用途において触媒活性を示したが、ヒト血清アルブミン
は不活性であったと報告されている。
ここで用いる”二官能性架橋剤”′という語は、本発明
のアッセイ系の■白質成分を重合させうる試薬を意味す
る。たとえば後記の実施例に示した方法はすべて、試薬
をゲル化させる架橋剤としてグルタルアルデヒド９また
はＮ−スクシンイミジル−３− （２−ピリジルジチオ
）プロピオネートを使用することを示す。同様に使用で
きる他の二官能性架橋剤には、カルボジイミドゝ、たと
えば１−エチル−３−（３−：）メチル−アミノプロピ
ル）カルボジイミド、無水コハク酸、およびジー・ビー
・ブラウンの４４、。メンッズ・イン・エンザイモロジ
ー”、２６３−２８０（１９７０）に記載されたものが
含まれる。これをここに参考のために引用する。
のアッセイ系の■白質成分を重合させうる試薬を意味す
る。たとえば後記の実施例に示した方法はすべて、試薬
をゲル化させる架橋剤としてグルタルアルデヒド９また
はＮ−スクシンイミジル−３− （２−ピリジルジチオ
）プロピオネートを使用することを示す。同様に使用で
きる他の二官能性架橋剤には、カルボジイミドゝ、たと
えば１−エチル−３−（３−：）メチル−アミノプロピ
ル）カルボジイミド、無水コハク酸、およびジー・ビー
・ブラウンの４４、。メンッズ・イン・エンザイモロジ
ー”、２６３−２８０（１９７０）に記載されたものが
含まれる。これをここに参考のために引用する。
ここで用いる“ヘム蛋白質”という語は、発光物質の酸
化に際して酸化剤（たとえば超酸化物および過酸化物）
の生成および利用を触媒する反応に関与しうる生物学的
分子を意味する。本発明により有利に使用されるヘム蛋
白質にはヘモグロビン、ミオグロビン、カタラーゼおよ
びパーオキシダーゼが含まれるが、これらに限定される
ものではない。パーオキシダーゼはワサビダイコンパー
オキシダーゼ、ラクトパーオキシダーゼ、ミクロパーオ
キシダーゼ、または他のいずれのパーオキシダーゼであ
ってよい。”ヘム蛋白質”という語は、ヘモグロビンを
含有し、本発明の教示に従ってゲル中で架橋された場合
にヘム蛋白質として機能しうる物質、たとえば赤血球を
も意味する。
化に際して酸化剤（たとえば超酸化物および過酸化物）
の生成および利用を触媒する反応に関与しうる生物学的
分子を意味する。本発明により有利に使用されるヘム蛋
白質にはヘモグロビン、ミオグロビン、カタラーゼおよ
びパーオキシダーゼが含まれるが、これらに限定される
ものではない。パーオキシダーゼはワサビダイコンパー
オキシダーゼ、ラクトパーオキシダーゼ、ミクロパーオ
キシダーゼ、または他のいずれのパーオキシダーゼであ
ってよい。”ヘム蛋白質”という語は、ヘモグロビンを
含有し、本発明の教示に従ってゲル中で架橋された場合
にヘム蛋白質として機能しうる物質、たとえば赤血球を
も意味する。
ここで用いる”ポリアミノ化合物”という語は２個以上
のアミノ基を有し、従って特異的リガント９のアルデヒ
ド部分および血清アルブミン−発光物質複合体のアルブ
ミンと結合することができる生物学的分子を意味する。
のアミノ基を有し、従って特異的リガント９のアルデヒ
ド部分および血清アルブミン−発光物質複合体のアルブ
ミンと結合することができる生物学的分子を意味する。
本発明により有利に使用できるポリアミノ化合物にはリ
シン、ヘキセンジアミン、スＲルミジン、エチレンジア
ミンおよびプトレシン（１，４−ブタンジアミン）が含
まれるが、これらに限定されるものではない。
シン、ヘキセンジアミン、スＲルミジン、エチレンジア
ミンおよびプトレシン（１，４−ブタンジアミン）が含
まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の発光反応はエネルギー伝達ゲル（ＥＴＧ）系用
としても適している。ＥＴＧ系は、電磁エネルギー（熱
から紫外線、電雅凍に及ぶ）を化学エネルギーまたは他
のエネルギー水準の電磁線（すなわち波長の変化）に変
えることができる、ゲルマトリックス中の半合成または
合成酵素から構成される系である。ＥＴ（、はポリマー
状の酵素、マトリックス蛋白質状のもしくは合成した形
の酵素、マトリックス蛋白質状のもしくは合成のポリマ
ー、取込まれた基質、および取込まれた（結合した）溶
剤から構成される。ある簡単な系ではポリマーマトリッ
クスも触媒として作用すると思われる。
としても適している。ＥＴＧ系は、電磁エネルギー（熱
から紫外線、電雅凍に及ぶ）を化学エネルギーまたは他
のエネルギー水準の電磁線（すなわち波長の変化）に変
えることができる、ゲルマトリックス中の半合成または
合成酵素から構成される系である。ＥＴ（、はポリマー
状の酵素、マトリックス蛋白質状のもしくは合成した形
の酵素、マトリックス蛋白質状のもしくは合成のポリマ
ー、取込まれた基質、および取込まれた（結合した）溶
剤から構成される。ある簡単な系ではポリマーマトリッ
クスも触媒として作用すると思われる。
ゲルの状態は溶剤とポリマーマトリックスの間の相互作
用により維持される。たとえばマトリックスが負に帯電
しており、溶剤が非プロトン性（中性）（たとえばジメ
チルスルホキシビまたはアセトン）またはプロトン性（
水）あるいはこれら２者の組合せであってもよい。十分
に膨潤した負のゲルは水素イオン圧により維持されるで
あろう（ティー・タナ力、”ゲル”、サイエンティフィ
ック・アメリカン、１９８１年１月、１２４−１３８頁
）。この圧力は負に帯電したマトリックスポリマー分子
に一定の温度で水素イオンが衝突することにより生じる
力である。ポリマーマトリックスの疎水性結合および水
素イオン圧はゲルの状態を維持する２つの相対する力で
ある。ゲルはゲルの温度を低下させることにより、また
は負に帯電したマトリックスを電気化学的に中和するこ
とによって水素イオン含量を低下させることにより、破
壊することができる。
用により維持される。たとえばマトリックスが負に帯電
しており、溶剤が非プロトン性（中性）（たとえばジメ
チルスルホキシビまたはアセトン）またはプロトン性（
水）あるいはこれら２者の組合せであってもよい。十分
に膨潤した負のゲルは水素イオン圧により維持されるで
あろう（ティー・タナ力、”ゲル”、サイエンティフィ
ック・アメリカン、１９８１年１月、１２４−１３８頁
）。この圧力は負に帯電したマトリックスポリマー分子
に一定の温度で水素イオンが衝突することにより生じる
力である。ポリマーマトリックスの疎水性結合および水
素イオン圧はゲルの状態を維持する２つの相対する力で
ある。ゲルはゲルの温度を低下させることにより、また
は負に帯電したマトリックスを電気化学的に中和するこ
とによって水素イオン含量を低下させることにより、破
壊することができる。
マトリックス中に高濃度の水素イオンが存在すると、温
度を低下させることまたはゲルを静電場に置くことによ
りゲルは連続指数的に破壊されるであろう。プロトン溶
剤を非プロトン溶剤で一部入れ換えることにより水素イ
オン濃度を臨界的水準にまで低下させると、エネルギー
の入力または出力をごくわずかに変化させることにより
ゲルの容積が急変するであろう。これらの状態により真
の相転移が生じる（ティー・タナ力、アイ・ニシン、ニ
ス・ティー・サンおよびニス・ウェノーニシオ、”電場
におけるゲルの破壊”、２１Ｓ、サイエンス、・４６７
〜４６９（１９８２））。この変化は数時間にわたって
容量が大きく変化することにより物理的に証明される。
度を低下させることまたはゲルを静電場に置くことによ
りゲルは連続指数的に破壊されるであろう。プロトン溶
剤を非プロトン溶剤で一部入れ換えることにより水素イ
オン濃度を臨界的水準にまで低下させると、エネルギー
の入力または出力をごくわずかに変化させることにより
ゲルの容積が急変するであろう。これらの状態により真
の相転移が生じる（ティー・タナ力、アイ・ニシン、ニ
ス・ティー・サンおよびニス・ウェノーニシオ、”電場
におけるゲルの破壊”、２１Ｓ、サイエンス、・４６７
〜４６９（１９８２））。この変化は数時間にわたって
容量が大きく変化することにより物理的に証明される。
負に帯電したマトリックスは２価の陽イオン、たとえば
カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンによっても
中和および架橋され、水素イオンがマトリックスから除
かれるであろう。その結果は同じであり、すなわちゲル
が破壊される。
カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンによっても
中和および架橋され、水素イオンがマトリックスから除
かれるであろう。その結果は同じであり、すなわちゲル
が破壊される。
ゲルが熱力学的バリヤー（転移エンタルピー）により阻
止されている物理的相または化学的活性の転移寸前の状
態に置かれている場合−このエネルギーの入力または出
力により急激な変化が起こるであろう。化学反応をこの
方法で開始または促進する場合は、これを力学的に補助
しなければならない。
止されている物理的相または化学的活性の転移寸前の状
態に置かれている場合−このエネルギーの入力または出
力により急激な変化が起こるであろう。化学反応をこの
方法で開始または促進する場合は、これを力学的に補助
しなければならない。
ルミノールおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から形
成された複合体は基本的な構造ブロックをなし、これは
本発明によるＥＴＧ系用に改変することができる。たと
えばこのＢＳＡ発光物質複合物を悪性過温症の検出のた
めのアッセイ法としてのＥＴＧ系に使用できる。このア
ッセイはオキシヘモグロビンが赤血球（ＲＢＣ）中で自
然自動酸化され、超酸化物を生成し、次いで過酸化水素
および脂肪過酸化物を生成するという事実により可能と
なる。自動酸化はＲＢＣにおいて種々の内生酵素、たと
えば超酸化物ジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチ
オンパーオキシダーゼなど、これら駿化物の分解を触媒
するものにより抑制される。これらの酵素の欠損は、患
者から得たＲＢＣを二官能性架橋剤と混合し、次いで血
清アルブミン、ヘム蛋白質および発光物質を添加してゲ
ルを調製することにより検出できる。このゲルを次いで
加熱する。加熱されたゲルの熱化学発光が温度に伴って
大まかに指数的に増大することは、患者が悪性過温症に
伴う欠損１または２以上を伴っていることの陽性の指示
である。化学発光反応の活性化に対する熱力学的バリヤ
ーは、ゲルに塩基を添加することにより低下させること
ができる。
成された複合体は基本的な構造ブロックをなし、これは
本発明によるＥＴＧ系用に改変することができる。たと
えばこのＢＳＡ発光物質複合物を悪性過温症の検出のた
めのアッセイ法としてのＥＴＧ系に使用できる。このア
ッセイはオキシヘモグロビンが赤血球（ＲＢＣ）中で自
然自動酸化され、超酸化物を生成し、次いで過酸化水素
および脂肪過酸化物を生成するという事実により可能と
なる。自動酸化はＲＢＣにおいて種々の内生酵素、たと
えば超酸化物ジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチ
オンパーオキシダーゼなど、これら駿化物の分解を触媒
するものにより抑制される。これらの酵素の欠損は、患
者から得たＲＢＣを二官能性架橋剤と混合し、次いで血
清アルブミン、ヘム蛋白質および発光物質を添加してゲ
ルを調製することにより検出できる。このゲルを次いで
加熱する。加熱されたゲルの熱化学発光が温度に伴って
大まかに指数的に増大することは、患者が悪性過温症に
伴う欠損１または２以上を伴っていることの陽性の指示
である。化学発光反応の活性化に対する熱力学的バリヤ
ーは、ゲルに塩基を添加することにより低下させること
ができる。
この方法はＢＳＡ−発光物質複合体をレクチンに結合さ
せることにより簡略化できる。レクチンは特定の細胞型
、特にＲＢＣ１白血球および腫瘍細胞の表面に見出され
る特定の炭水化物に対し特別な親和性をもつ蛋白質また
は糖蛋白質である。多くは植物から得られるが、幾つか
はブトつ園カタツムリ（ヘトリックス・ポマチア、Ｈｅ
ｔｒｉｘｐｏｍａｔ、１ａ）などの動物から分離される
。レクチンを血清アルブミン−発光物質複合体に結合さ
せる、と、赤血球に対する血清アルブミン−発光物質複
合体の親和性が増大することによりＥＴＣ，における架
橋が行われる。この調製物において温度が高くなると熱
化学発光が増大することは、悪性過温症を示す。
せることにより簡略化できる。レクチンは特定の細胞型
、特にＲＢＣ１白血球および腫瘍細胞の表面に見出され
る特定の炭水化物に対し特別な親和性をもつ蛋白質また
は糖蛋白質である。多くは植物から得られるが、幾つか
はブトつ園カタツムリ（ヘトリックス・ポマチア、Ｈｅ
ｔｒｉｘｐｏｍａｔ、１ａ）などの動物から分離される
。レクチンを血清アルブミン−発光物質複合体に結合さ
せる、と、赤血球に対する血清アルブミン−発光物質複
合体の親和性が増大することによりＥＴＣ，における架
橋が行われる。この調製物において温度が高くなると熱
化学発光が増大することは、悪性過温症を示す。
コンカナバリンＡはＲＢＣおよびＴ細胞リンパ球に対し
て特に親和性をもつレクチンであり、本発明に有利に用
いられる。アッセイに用いられる細胞型に応じて使用で
きる他のレクチンには大豆レクチン、麦芽レクチン（ア
クルチニン）、ヘリックス・ポマチアーレクチンおよび
ヒラマメ（ｌｅｎｔｉｌ）レクチンが含まれるが、これ
らに限定されるものではない。
て特に親和性をもつレクチンであり、本発明に有利に用
いられる。アッセイに用いられる細胞型に応じて使用で
きる他のレクチンには大豆レクチン、麦芽レクチン（ア
クルチニン）、ヘリックス・ポマチアーレクチンおよび
ヒラマメ（ｌｅｎｔｉｌ）レクチンが含まれるが、これ
らに限定されるものではない。
種々のレクチンを血清アルブミン−発光物質複合体と併
用することにより、悪性過温症の検出用以外のアッセイ
に使用できるようにアッセイを設定することができる。
用することにより、悪性過温症の検出用以外のアッセイ
に使用できるようにアッセイを設定することができる。
たとえば熱感受性、遺伝的欠損症、栄養欠乏、または有
毒化合物もしくは自動醸化性薬物への暴露を測定するた
めの熱化学発光アッセイ法を設定することができる。こ
れらはすべて内生カタラーゼ、超酸化物ジスムターゼ、
グル゛コース−６−ホスフニートテヒビロゲナーゼ、グ
ルタチオンおよびグルタチオンレダクターゼの活性の欠
乏として、あるいはビタミンＥ、ビタミンＡまたはビタ
ミンＣの欠乏として現われる。この種のアッセイはＲＢ
Ｃをレクチン−血清アルブミン−発光物質結合体でコー
ティングし、このコーティングされたＲＢＣを加熱する
ことによって行われる。過度の熱化学発光は自動酸化性
化学物質に暴露されたことにより生じる欠損または損傷
の陽性の指示である。この種のアッセイは自動酸化性薬
物の存在下でアッセイを行うことにより、この種の薬物
に対する感受性についての試験法として特に有用である
。この種の感受性試験を行いうる薬物には下記のものが
含まれる。
毒化合物もしくは自動醸化性薬物への暴露を測定するた
めの熱化学発光アッセイ法を設定することができる。こ
れらはすべて内生カタラーゼ、超酸化物ジスムターゼ、
グル゛コース−６−ホスフニートテヒビロゲナーゼ、グ
ルタチオンおよびグルタチオンレダクターゼの活性の欠
乏として、あるいはビタミンＥ、ビタミンＡまたはビタ
ミンＣの欠乏として現われる。この種のアッセイはＲＢ
Ｃをレクチン−血清アルブミン−発光物質結合体でコー
ティングし、このコーティングされたＲＢＣを加熱する
ことによって行われる。過度の熱化学発光は自動酸化性
化学物質に暴露されたことにより生じる欠損または損傷
の陽性の指示である。この種のアッセイは自動酸化性薬
物の存在下でアッセイを行うことにより、この種の薬物
に対する感受性についての試験法として特に有用である
。この種の感受性試験を行いうる薬物には下記のものが
含まれる。
毒素
バラクアト
麻酔薬
７１０タン
鎮痛薬
アセトアニリド
アセトフェネチジン（ツェナセチン）
アセチルサリチル酸
アセトアミノフェン
抗けいれん薬
フェニルトイン
フ馬ナセミｒ
フエノパルビトール
カルパマゼビン
メフイニトイン
食欲喪失薬
クロルフエンターミン
スルファニルアミトゝ
スルファピリジン
シアフェニルスルホン
チアゾールスルホン
Ｎ−アセチルスルファニルアミＰ
サリチルアゾスルファピリジン（アズルファジン）スル
ホアセトアミド スルファメトキシピリダジン（カイネツクス）プリマキ
ン ・ ノミマキ／ にンタキン キノサイド キナクリン（アタブリン） フラノリジン フルメタノール ニトロフラントイン（フラダンチン） ニトロフラゾン クロラムフェニコール アミノグリコシド系抗生物質 すなわちストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラ
マイシン メトロニダゾール（フラギル） その他 ナフタリン トリニトロトルエン メチレンブルー ナルジキシン酸 フェニルヒドラジン キニン キニジン アスコルビン酸 ニリダゾール レクチンー血清アルブミン−発光物質結合体を用いて特
定の細胞型を同定および／または定量するだめのＥＴＧ
系を設定することもできる。必要なすべては、目的とす
る標的細胞の表面に存在する炭水化物に対して特に親和
性をもつレクチンを選ぶことである。たとえば赤血球お
よび、Ｔ細胞リンパ球に対して特に親和性をもつレクチ
ンコンカナバリアＡ、血清アルブミン、および発光物質
を含有する結合体を、これらの細胞系を含有する疑いの
ある試料と架橋させることができる。標識された細胞が
存在する場合、これは塩基を添加した際発光し、その化
学発光の量は存在するこれらの型の細胞の数に比例する
。赤血球のみを検出または定量したい場合は、発光反応
を、熱により誘発することができる。Ｔ細胞の存在また
は数、あるいはＴ細胞および赤血球双方の数を調べるた
めには、レクチン−血清アルブミン−発光物質結合体を
ＥＴＧ内でヘム蛋白質と架橋させる。その結果、放出さ
れる熱化学発光の強度は存在する細胞の数と比例するで
あろう。
ホアセトアミド スルファメトキシピリダジン（カイネツクス）プリマキ
ン ・ ノミマキ／ にンタキン キノサイド キナクリン（アタブリン） フラノリジン フルメタノール ニトロフラントイン（フラダンチン） ニトロフラゾン クロラムフェニコール アミノグリコシド系抗生物質 すなわちストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラ
マイシン メトロニダゾール（フラギル） その他 ナフタリン トリニトロトルエン メチレンブルー ナルジキシン酸 フェニルヒドラジン キニン キニジン アスコルビン酸 ニリダゾール レクチンー血清アルブミン−発光物質結合体を用いて特
定の細胞型を同定および／または定量するだめのＥＴＧ
系を設定することもできる。必要なすべては、目的とす
る標的細胞の表面に存在する炭水化物に対して特に親和
性をもつレクチンを選ぶことである。たとえば赤血球お
よび、Ｔ細胞リンパ球に対して特に親和性をもつレクチ
ンコンカナバリアＡ、血清アルブミン、および発光物質
を含有する結合体を、これらの細胞系を含有する疑いの
ある試料と架橋させることができる。標識された細胞が
存在する場合、これは塩基を添加した際発光し、その化
学発光の量は存在するこれらの型の細胞の数に比例する
。赤血球のみを検出または定量したい場合は、発光反応
を、熱により誘発することができる。Ｔ細胞の存在また
は数、あるいはＴ細胞および赤血球双方の数を調べるた
めには、レクチン−血清アルブミン−発光物質結合体を
ＥＴＧ内でヘム蛋白質と架橋させる。その結果、放出さ
れる熱化学発光の強度は存在する細胞の数と比例するで
あろう。
架橋したヘム蛋白質および発光物質−血清アルブミン複
合体を含有するＥＴＧは熱量計としても使用できる。こ
のゲルを不層曲支持マトリックスに施すか、あるいは試
験管またはバイアルに入れてもよい。化学発光反応を開
始するために必要なすべては熱源であり、放出される光
の奇はゲルに与えられる熱の量に正比例する。
合体を含有するＥＴＧは熱量計としても使用できる。こ
のゲルを不層曲支持マトリックスに施すか、あるいは試
験管またはバイアルに入れてもよい。化学発光反応を開
始するために必要なすべては熱源であり、放出される光
の奇はゲルに与えられる熱の量に正比例する。
血清アルブミン−発光物質複合体をそのまま、細胞に対
する過酸化傷害の検出および定量に用いることもできる
。過酸化傷害は入射電ｓ線、過温症、自動酸化性化合物
の存在、あるいは過酸化酵素および酸化酵素の存在、一
過性の虚血、あるいは炎症により起こる可能性がある。
する過酸化傷害の検出および定量に用いることもできる
。過酸化傷害は入射電ｓ線、過温症、自動酸化性化合物
の存在、あるいは過酸化酵素および酸化酵素の存在、一
過性の虚血、あるいは炎症により起こる可能性がある。
この種の刺激が与えられた結果、細胞の表面に糖蛋白質
および不飽和脂肪酸の過酸化生成物としてアルデヒド基
が形成される。可溶性血清アルブミン−発光物質結合体
の血清アルブミンは、シック塩基反応によりこのアルデ
ヒド９基に付着するであろう。細胞に結合しない過剰の
可溶性結合体は洗い去られ、塩基と接触した際に細胞結
合発光物質がアルブミンにより酸化される。生じる発光
は、過酸化性の刺激が与えられた際に形成された表面ア
ルデヒド基の数に比例する。血清アルプｉンー発光物質
複合体がヘム蛋白質およびホリアミノ化合物と結合して
おり、この結合体が損傷を受けた細胞の表面のアルデヒ
ド基に付着している場合、発光反応は熱により誘発され
る。アッセイ実施を容易にするために、細胞を不トフイ
支持マトリックスに付着させることもできる。たとえば
適宜な溶剤に懸濁した赤血球をガラススライド９上で風
乾し、あるいはカラム内のビーズその他の支持体に付着
させ、上記結合体およびシッフ塩基反応に必要な還元剤
を添加する。未結合の結合体を溶剤の追加により洗い流
し、発光反応を場合に応じ塩基の添加または加熱により
誘発する。
および不飽和脂肪酸の過酸化生成物としてアルデヒド基
が形成される。可溶性血清アルブミン−発光物質結合体
の血清アルブミンは、シック塩基反応によりこのアルデ
ヒド９基に付着するであろう。細胞に結合しない過剰の
可溶性結合体は洗い去られ、塩基と接触した際に細胞結
合発光物質がアルブミンにより酸化される。生じる発光
は、過酸化性の刺激が与えられた際に形成された表面ア
ルデヒド基の数に比例する。血清アルプｉンー発光物質
複合体がヘム蛋白質およびホリアミノ化合物と結合して
おり、この結合体が損傷を受けた細胞の表面のアルデヒ
ド基に付着している場合、発光反応は熱により誘発され
る。アッセイ実施を容易にするために、細胞を不トフイ
支持マトリックスに付着させることもできる。たとえば
適宜な溶剤に懸濁した赤血球をガラススライド９上で風
乾し、あるいはカラム内のビーズその他の支持体に付着
させ、上記結合体およびシッフ塩基反応に必要な還元剤
を添加する。未結合の結合体を溶剤の追加により洗い流
し、発光反応を場合に応じ塩基の添加または加熱により
誘発する。
この方法を赤血球以外の細胞型、特にマクロファージ、
単球、顆粒球、腫瘍細胞、ならびに−次細胞培養系およ
び株細胞培養系に対する過酸化傷害の測定用に改変する
ことができる。これを改変して、酸素依存性の抗腫傷薬
、たとえばプレオマイシンおよびＩ ＣＣ０ＰＳ系（出
願中の米国特許出願第２５１，６９４号明細書に記載）
に対する腫瘍細胞および正常細胞双方の細胞膜の感受性
を証明するために用いることもできる。
単球、顆粒球、腫瘍細胞、ならびに−次細胞培養系およ
び株細胞培養系に対する過酸化傷害の測定用に改変する
ことができる。これを改変して、酸素依存性の抗腫傷薬
、たとえばプレオマイシンおよびＩ ＣＣ０ＰＳ系（出
願中の米国特許出願第２５１，６９４号明細書に記載）
に対する腫瘍細胞および正常細胞双方の細胞膜の感受性
を証明するために用いることもできる。
抗原、抗体その他の蛋白性分子を血清アルブミン−発光
物質複合体の血清アルブミンに結合させることもできる
。この種の結合体を、特異的被分析体がリガンドおよび
その抗リガンドからなる特異的結合対の一員である場合
、その被分析体（リガンド）を検出および定量するアッ
セイに使用できる。この結合対は基質およびその基質に
特異的な酵素であるか、あるいは抗原およびその抗原に
特異的な抗体であってもよい。特異的酵素を二官能性架
橋剤により血清アルブミン−発光物質複合体に結合させ
、その酵素が代謝する基質を含有する疑いのある溶液を
酵素−血清アルブミン−発光物質結合体と混合する。酵
素はその基質から還元性当量体を酸素に伝達し、過酸化
物、超酸化物および遊離水酸基を生成し、これが発光物
質を酸化する。塩基性条件下で生じる発光の量は溶液中
に存在する特異的基質の量に正比例するであろう。
物質複合体の血清アルブミンに結合させることもできる
。この種の結合体を、特異的被分析体がリガンドおよび
その抗リガンドからなる特異的結合対の一員である場合
、その被分析体（リガンド）を検出および定量するアッ
セイに使用できる。この結合対は基質およびその基質に
特異的な酵素であるか、あるいは抗原およびその抗原に
特異的な抗体であってもよい。特異的酵素を二官能性架
橋剤により血清アルブミン−発光物質複合体に結合させ
、その酵素が代謝する基質を含有する疑いのある溶液を
酵素−血清アルブミン−発光物質結合体と混合する。酵
素はその基質から還元性当量体を酸素に伝達し、過酸化
物、超酸化物および遊離水酸基を生成し、これが発光物
質を酸化する。塩基性条件下で生じる発光の量は溶液中
に存在する特異的基質の量に正比例するであろう。
もちろん血清アルブミン−発光物質複合体を酵素ではな
く基質と結合させることもできる。
く基質と結合させることもできる。
この方法はデヒドロゲナーゼと共に用いる場合に特に有
用である。たとえば血液中に存在する乳酸の盪を定量し
たい場合は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を使用す
る。酸化性ヌクレオチド補因子も必要である。この補因
子はＬＤＨの場合はニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチｒ（ＮＡＤ）であってもよく、あるいは用いられ
る個々のデヒドロゲナーゼに応じてニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ） 、
フラビン・アデニン・ジヌクレオチド（Ｆ、ＡＤ）、ま
たはフラビンモノヌクレオチド” （ＦＭＮ）であって
もよい。
用である。たとえば血液中に存在する乳酸の盪を定量し
たい場合は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を使用す
る。酸化性ヌクレオチド補因子も必要である。この補因
子はＬＤＨの場合はニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチｒ（ＮＡＤ）であってもよく、あるいは用いられ
る個々のデヒドロゲナーゼに応じてニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ） 、
フラビン・アデニン・ジヌクレオチド（Ｆ、ＡＤ）、ま
たはフラビンモノヌクレオチド” （ＦＭＮ）であって
もよい。
酵素（または基質）がヘム蛋白質一血清アルブミンー発
光物質結合体と結合している場合、発光反応を熱により
誘発することもできる。ヘム蛋白質を用いる場合、酵素
は還元性当量体を酸素およびヘム蛋白質に直接に伝達す
る。血清アルブミン−発光物質複合体を抗原または抗体
と結合させることもでき、これは抗原／抗体結合対の対
応する貰子、架橋剤および塩基の存在下で発光するであ
ろう。ウィルス性抗原たとえば肝炎Ｂ抗原、または細菌
性抗原は、対応する抗原をそれぞれの抗体−血清アルブ
ミン−発光物質結合体と結合させることにより検出でき
る。ヘム蛋白質を抗体／抗原−血清アルブミン−発光物
質結合体と共有結合させ、発光反応を塩基ではなく熱に
より誘発させることができる。
光物質結合体と結合している場合、発光反応を熱により
誘発することもできる。ヘム蛋白質を用いる場合、酵素
は還元性当量体を酸素およびヘム蛋白質に直接に伝達す
る。血清アルブミン−発光物質複合体を抗原または抗体
と結合させることもでき、これは抗原／抗体結合対の対
応する貰子、架橋剤および塩基の存在下で発光するであ
ろう。ウィルス性抗原たとえば肝炎Ｂ抗原、または細菌
性抗原は、対応する抗原をそれぞれの抗体−血清アルブ
ミン−発光物質結合体と結合させることにより検出でき
る。ヘム蛋白質を抗体／抗原−血清アルブミン−発光物
質結合体と共有結合させ、発光反応を塩基ではなく熱に
より誘発させることができる。
血清アルブミン−発光物質複合体を蛋白質Ａと結合させ
て、抗体−抗原結合反応に応じて多数のアッセイに使用
するための”万能試薬”を調製することもできる。蛋白
質Ａは黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁から分離され、抗原−抗体結
合を阻害することなく数種の免疫グロブリンのＦｃ領域
に特異的に結合することが示された。蛋白質Ａがこのよ
うに多数の免疫グロブリンと結合しうるため、蛋白質Ａ
−血清アルブミンー発光物質結合体を前記のように特定
の抗原（たとえば細菌性抗原または肝炎Ｂ抗原）の存在
に関する化学発光イムノアッセイに用いる抗体を含む結
合体を形成するために万能試薬として使用できる。抗体
−蛋白質Ａ−血清アルプばンー発光物質結合体をヘム蛋
白質と結合させて、反応を塩基ではなく熱により誘発さ
せることもできる。
て、抗体−抗原結合反応に応じて多数のアッセイに使用
するための”万能試薬”を調製することもできる。蛋白
質Ａは黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁から分離され、抗原−抗体結
合を阻害することなく数種の免疫グロブリンのＦｃ領域
に特異的に結合することが示された。蛋白質Ａがこのよ
うに多数の免疫グロブリンと結合しうるため、蛋白質Ａ
−血清アルブミンー発光物質結合体を前記のように特定
の抗原（たとえば細菌性抗原または肝炎Ｂ抗原）の存在
に関する化学発光イムノアッセイに用いる抗体を含む結
合体を形成するために万能試薬として使用できる。抗体
−蛋白質Ａ−血清アルプばンー発光物質結合体をヘム蛋
白質と結合させて、反応を塩基ではなく熱により誘発さ
せることもできる。
蛋白質Ａ−血清アルブミンー発光物質結合体を用いて下
記により食品試料中の細菌、たとえばサルモネラ菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓＰ、）を検出することができる
。食品の試料をガラススライドに、または試験管もしく
はバイアルの内側に施し、次いで試料でコーティングさ
れた不溶性支持体を、適宜な細菌に対するＩ、Ｇを含有
する抗血清と共にインキュベートする。次いで曹白質Ａ
−血清アルブミンー発光物質結合体を添加し、未結合の
結合体を洗い去り、化学発光反応を塩基で誘発させる。
記により食品試料中の細菌、たとえばサルモネラ菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓＰ、）を検出することができる
。食品の試料をガラススライドに、または試験管もしく
はバイアルの内側に施し、次いで試料でコーティングさ
れた不溶性支持体を、適宜な細菌に対するＩ、Ｇを含有
する抗血清と共にインキュベートする。次いで曹白質Ａ
−血清アルブミンー発光物質結合体を添加し、未結合の
結合体を洗い去り、化学発光反応を塩基で誘発させる。
サルモネラ・ニューポート（Ｓ、ｎｅｗｐｏｒｔ）、サ
ルモ・ネラ・アナツム（Ｓ 、 ａｎａｔｕｍ）または
ねずみチフス菌（Ｓ 、 ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）
の場合、試料がホルマリンで不溶性支持体に固定されて
いるときは、適宜なサルモネラＨ抗原に対する抗血清（
すなわちねずみチフス菌に対しては１、相１、またはサ
ルモネラ・ニューポートもしくはサルモネラ・アナツム
に対してはｅ、ｈ、相ｌ）を含有するＩｙＧを用いる。
ルモ・ネラ・アナツム（Ｓ 、 ａｎａｔｕｍ）または
ねずみチフス菌（Ｓ 、 ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）
の場合、試料がホルマリンで不溶性支持体に固定されて
いるときは、適宜なサルモネラＨ抗原に対する抗血清（
すなわちねずみチフス菌に対しては１、相１、またはサ
ルモネラ・ニューポートもしくはサルモネラ・アナツム
に対してはｅ、ｈ、相ｌ）を含有するＩｙＧを用いる。
加熱、酸およびアルコールによりＨ抗原は破壊されるの
で、試料をこれらの試薬のうちの１種により固定してＯ
抗原を露出させ、次いでこれを適宜な抗血清により検出
することができる。
で、試料をこれらの試薬のうちの１種により固定してＯ
抗原を露出させ、次いでこれを適宜な抗血清により検出
することができる。
適宜な抗原をもつサルモネラ細胞を含有する陽性の対照
を使用できる。これらの細胞を用いて、上記と同じ方法
によりＨおよび○抗原に対する未知の血清中の特異的抗
体を検出することもできる。
を使用できる。これらの細胞を用いて、上記と同じ方法
によりＨおよび○抗原に対する未知の血清中の特異的抗
体を検出することもできる。
数種の抗原に対する抗体を含有する非対応抗血清を用い
る場合、適宜なＨまたはＯ抗原を抗血清と共に添加して
抗体をブロックし、試料中に存在する特異的抗原を同定
することができる。サルモネラ菌以外の細菌、および鞭
毛、菌体、きょう（莢）膜もしくは細胞膜抗原に対する
適宜な抗血清もしくはモノクローナル抗体を上記方法へ
置き換えて、他の多数の細菌に関する特異的イムノアッ
セイを設定することができる。これらの方法を用いて競
合結合アッセイを行うこともできる。
る場合、適宜なＨまたはＯ抗原を抗血清と共に添加して
抗体をブロックし、試料中に存在する特異的抗原を同定
することができる。サルモネラ菌以外の細菌、および鞭
毛、菌体、きょう（莢）膜もしくは細胞膜抗原に対する
適宜な抗血清もしくはモノクローナル抗体を上記方法へ
置き換えて、他の多数の細菌に関する特異的イムノアッ
セイを設定することができる。これらの方法を用いて競
合結合アッセイを行うこともできる。
蛋白質Ａ−血清アルブミンー発光物質結合体を用いて肝
炎Ｂ抗原などの抗原に対する簡便なアッセイを行うこと
もできる。Ｆ紙または酢酸セルロースディスクに蛋白質
Ａおよび血清アルブミンを含浸させ、架橋し、次いで肝
炎Ｂ抗原に対する抗体でコーティングし、保存のため凍
結乾燥する。
炎Ｂ抗原などの抗原に対する簡便なアッセイを行うこと
もできる。Ｆ紙または酢酸セルロースディスクに蛋白質
Ａおよび血清アルブミンを含浸させ、架橋し、次いで肝
炎Ｂ抗原に対する抗体でコーティングし、保存のため凍
結乾燥する。
アッセイを行うべき時点で血清または血漿をＦ紙または
ディスクに蛋白質Ａ−血清アルブミンー発光物質結合体
と共に添加し、未結合の抗血清および蛋白質入−血清ア
ルブミンー発光物質を洗い流す。塩基の添加に際して発
せられる化学発光の量は存在する肝炎Ｂ抗原の量に比例
するであろう。
ディスクに蛋白質Ａ−血清アルブミンー発光物質結合体
と共に添加し、未結合の抗血清および蛋白質入−血清ア
ルブミンー発光物質を洗い流す。塩基の添加に際して発
せられる化学発光の量は存在する肝炎Ｂ抗原の量に比例
するであろう。
抗リガンドへのりガンピの結合を伴うアッセイはいずれ
においても（リガンドまたは抗リガンドのいずれかがリ
ガンド／抗すガンビー血清アルブばンー発光物質からな
る結合体の一部である）、検出したいりガン）＃／抗リ
すンノドに結合した結合体のみが発光することが重要で
ある。結合した結合体のみを発光させるための簡便な方
法は、抗リガンドへのリガンドの結合が起った時点で相
の変化を伴うよ、うにアッセイを実施することである。
においても（リガンドまたは抗リガンドのいずれかがリ
ガンド／抗すガンビー血清アルブばンー発光物質からな
る結合体の一部である）、検出したいりガン）＃／抗リ
すンノドに結合した結合体のみが発光することが重要で
ある。結合した結合体のみを発光させるための簡便な方
法は、抗リガンドへのリガンドの結合が起った時点で相
の変化を伴うよ、うにアッセイを実施することである。
この相変化は結合したりガンビー抗リガンド８複合体の
沈殿または凝集により、あるいはリガンドまたは抗リガ
ンドのいずれかを固定化することにより達成できる。た
とえば前記の免疫学的アッセイの場合、カラムにセファ
ロースＡ（蛋白質Ａが付着した多ｓ＠）ビーズ（ファル
マシア）を装填シ、検出したい抗原上の決定因子に対し
て特異的な抗体を添加する。抗体をビーズに結合させ（
すなわち固定化されたリガンド）、抗原（抗リガンド）
を含有する液体試料を添加し、この抗原が固定化された
抗体に結合する。次いで抗体−蛋白質Ａ−血清アルブミ
ンー発光物質結合体をカラムに添加し、結合抗原上の第
２決定因子に対する特異性について結合体の抗体を選択
し、これにより結合抗原に結合体を結合させる。未結合
の結合体を次いでカラムから洗い流し、各両分を溶離し
、発光反応を誘発させる。抗原を固定化することにより
、すなわちこれを大型の蛋白質と複合体を形成させ、こ
れをゲル中で架橋させることによりアッセイを行うこと
もできる。同じ手法を用いて酵素（またはこの酵素に対
する基質）または細胞型（またはこの細胞型に選択的に
結合するレクチン）を固定化することができる。
沈殿または凝集により、あるいはリガンドまたは抗リガ
ンドのいずれかを固定化することにより達成できる。た
とえば前記の免疫学的アッセイの場合、カラムにセファ
ロースＡ（蛋白質Ａが付着した多ｓ＠）ビーズ（ファル
マシア）を装填シ、検出したい抗原上の決定因子に対し
て特異的な抗体を添加する。抗体をビーズに結合させ（
すなわち固定化されたリガンド）、抗原（抗リガンド）
を含有する液体試料を添加し、この抗原が固定化された
抗体に結合する。次いで抗体−蛋白質Ａ−血清アルブミ
ンー発光物質結合体をカラムに添加し、結合抗原上の第
２決定因子に対する特異性について結合体の抗体を選択
し、これにより結合抗原に結合体を結合させる。未結合
の結合体を次いでカラムから洗い流し、各両分を溶離し
、発光反応を誘発させる。抗原を固定化することにより
、すなわちこれを大型の蛋白質と複合体を形成させ、こ
れをゲル中で架橋させることによりアッセイを行うこと
もできる。同じ手法を用いて酵素（またはこの酵素に対
する基質）または細胞型（またはこの細胞型に選択的に
結合するレクチン）を固定化することができる。
本発明の化学発光反応は、特定の免疫刺激物質に対する
感受性の検出にも使用できる。末梢リン、ｅ球または他
の単核細胞を患者から採取する。抗原および血清アルブ
ミン−発光物質複合体を結合させ、未結合の結合体を洗
い流し、洗浄細胞に添加した塩基により化学発光反応を
誘発させ、結合体に対する受容体を数える。結合体の存
在下における細胞の自然発光を利用して、これらの免疫
反応性細胞の代謝応答を測定する。化学発光反応の大き
さはｉ４胞の細胞性免疫反応に比例する。
感受性の検出にも使用できる。末梢リン、ｅ球または他
の単核細胞を患者から採取する。抗原および血清アルブ
ミン−発光物質複合体を結合させ、未結合の結合体を洗
い流し、洗浄細胞に添加した塩基により化学発光反応を
誘発させ、結合体に対する受容体を数える。結合体の存
在下における細胞の自然発光を利用して、これらの免疫
反応性細胞の代謝応答を測定する。化学発光反応の大き
さはｉ４胞の細胞性免疫反応に比例する。
レクチン、抗原性蛋白質（たとえば免疫グロブリンなど
の血清蛋白質）、細菌による産生物（たとえば黄色ぶど
う球菌からの蛋白質Ａ、ミコバクテリウム菌蛋白質、ま
たはリボ多糖類〕、ウィルス性抗原（狂犬病、麻疹、肝
炎、ヘルペス、ジステンパー、イヌおよびネコの微小ウ
ィルス族、あるいはヒトＴ細胞白血病ウィルス）、また
は真菌性抗原〔ヒストプラスマ・カブスラーツム（Ｈｉ
ｓｔ、ｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コク
シジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ
１ｍｍ１ｔｉｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙ
ｃｅｓ）、またはクリプトコツカス・ネオホルマンス（
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ） ］
を］血脣アルブミンー発元物質複合に結合させて特異的
な化学発光細胞性免疫刺激物質を調製することができる
。
の血清蛋白質）、細菌による産生物（たとえば黄色ぶど
う球菌からの蛋白質Ａ、ミコバクテリウム菌蛋白質、ま
たはリボ多糖類〕、ウィルス性抗原（狂犬病、麻疹、肝
炎、ヘルペス、ジステンパー、イヌおよびネコの微小ウ
ィルス族、あるいはヒトＴ細胞白血病ウィルス）、また
は真菌性抗原〔ヒストプラスマ・カブスラーツム（Ｈｉ
ｓｔ、ｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コク
シジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ
１ｍｍ１ｔｉｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙ
ｃｅｓ）、またはクリプトコツカス・ネオホルマンス（
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ） ］
を］血脣アルブミンー発元物質複合に結合させて特異的
な化学発光細胞性免疫刺激物質を調製することができる
。
結合は、血清アルブミン−発光物質複合体に結合すべき
分子の性質に応じて種々の方法により行われる。一部接
近可能なアミノ基を含む免疫刺激物質へ血清アルブミン
−発光物質複合体を結合させるためにはグルタルアルデ
ヒドを用いる。糖蛋白質またはリポ多粘類などのｌ；Ｊ
質については、結合は過ヨウ素酸塩により炭水化物部分
を酸化することによって行われる。蛋白質Ａおよび他の
蛋白質もＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
□ジチオ）プロピオネートを用いて血清アルブ
ミン−発光物質複合体に結合させることができる。
分子の性質に応じて種々の方法により行われる。一部接
近可能なアミノ基を含む免疫刺激物質へ血清アルブミン
−発光物質複合体を結合させるためにはグルタルアルデ
ヒドを用いる。糖蛋白質またはリポ多粘類などのｌ；Ｊ
質については、結合は過ヨウ素酸塩により炭水化物部分
を酸化することによって行われる。蛋白質Ａおよび他の
蛋白質もＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
□ジチオ）プロピオネートを用いて血清アルブ
ミン−発光物質複合体に結合させることができる。
イムノアッセイに関する血清アルブミン−発光物質複合
体の他の用途は、器官移植の症例における同包移植片の
拒絶の潜在性を測定することである。提供者および被移
植者の双方から全血を採取し、白血球を分離する。提供
者の細胞の試料を、細胞増殖を停止する試薬で処理する
。提供者のリンパ球を、トリチウム化チミジン含有媒質
中で無傷の被移植者のリンパ球と混合する。被移植者の
細胞がＤＮＡを合成している状態の場合、トリチウム化
チミジンは新たに合成されたＤＮＡに取込まれるであろ
う。細胞を次いで原紙上に採集し、血清アルブミン−発
光物質複合体を二官能性架橋剤と共に添加する。提供者
の細胞は化学発光し得ないが、被移植者の細胞は放射性
チミジンを取込みうる唯一の細胞であるので化学発光す
ることができ、その発光量は被移植者の細胞により取込
まれる（３Ｈ）−チミジンの量に比例するであろう。放
出される光の量は提供者の細胞に対する被移植者の細胞
の免疫応答に比例するであろう。
体の他の用途は、器官移植の症例における同包移植片の
拒絶の潜在性を測定することである。提供者および被移
植者の双方から全血を採取し、白血球を分離する。提供
者の細胞の試料を、細胞増殖を停止する試薬で処理する
。提供者のリンパ球を、トリチウム化チミジン含有媒質
中で無傷の被移植者のリンパ球と混合する。被移植者の
細胞がＤＮＡを合成している状態の場合、トリチウム化
チミジンは新たに合成されたＤＮＡに取込まれるであろ
う。細胞を次いで原紙上に採集し、血清アルブミン−発
光物質複合体を二官能性架橋剤と共に添加する。提供者
の細胞は化学発光し得ないが、被移植者の細胞は放射性
チミジンを取込みうる唯一の細胞であるので化学発光す
ることができ、その発光量は被移植者の細胞により取込
まれる（３Ｈ）−チミジンの量に比例するであろう。放
出される光の量は提供者の細胞に対する被移植者の細胞
の免疫応答に比例するであろう。
このアッセイの結果は、トリチウム化された細胞は螢光
を発しく液体シンチレーション用カクテルを用いない場
合ですら）、かつ化学発光するという事実のため、増強
される。放出される光の量はこれが螢光と化学発光の和
であるため増大するのみでなく、液体シンチレーション
用カクテルを必要としないためアッセイの成分がすべて
原紙上に近接して保持され、これにより光放出反応の効
率が螢光のみの場合に比して高まる。同様な放射性標識
、採集、および計数法か Ｃ，Ｎα、 Ｐ、３５３．４
０におよび４５０αで標識した細胞成分に採用される。
を発しく液体シンチレーション用カクテルを用いない場
合ですら）、かつ化学発光するという事実のため、増強
される。放出される光の量はこれが螢光と化学発光の和
であるため増大するのみでなく、液体シンチレーション
用カクテルを必要としないためアッセイの成分がすべて
原紙上に近接して保持され、これにより光放出反応の効
率が螢光のみの場合に比して高まる。同様な放射性標識
、採集、および計数法か Ｃ，Ｎα、 Ｐ、３５３．４
０におよび４５０αで標識した細胞成分に採用される。
血清アルブミン−発光物質結合体は下記の方法によりオ
ートラジオグラフィーの増強にも用いられる。トリチウ
ム化した肺細胞をガラススライド上に均一な薄層状に固
定し、次いで血清アルブミン−発光物質複合体および二
官能性架橋剤と接触させる。次いでこのスライドを写真
フィルム用乳剤でコーティングし、適宜な対照スライド
と共に一定期間露光し続ける。得られるオートラジオダ
ラムは、フィルムが通常の直接電離線効果、アミノフタ
レート螢光および発光を受けるため、通常のオートラジ
オダラムよりも増強されるであろう。
ートラジオグラフィーの増強にも用いられる。トリチウ
ム化した肺細胞をガラススライド上に均一な薄層状に固
定し、次いで血清アルブミン−発光物質複合体および二
官能性架橋剤と接触させる。次いでこのスライドを写真
フィルム用乳剤でコーティングし、適宜な対照スライド
と共に一定期間露光し続ける。得られるオートラジオダ
ラムは、フィルムが通常の直接電離線効果、アミノフタ
レート螢光および発光を受けるため、通常のオートラジ
オダラムよりも増強されるであろう。
さらに、発光物質とアミノフタレートの間で、これらの
分子が架橋血清アルブミンの疎水性結合部位において近
接するため共振エネルギー伝達が起こり、その結果量子
収量が増大する。伝達効率はゲルの状態（破壊の程度）
に依存し、ゲルの状態は溶剤含量（プロトン溶剤／非プ
ロトン溶剤の比）、温度、および外部から与えられる電
場により制御される。
分子が架橋血清アルブミンの疎水性結合部位において近
接するため共振エネルギー伝達が起こり、その結果量子
収量が増大する。伝達効率はゲルの状態（破壊の程度）
に依存し、ゲルの状態は溶剤含量（プロトン溶剤／非プ
ロトン溶剤の比）、温度、および外部から与えられる電
場により制御される。
この方法を末梢白血球、組織薄片、組織切片、腫瘍細胞
、−次細胞、および株細胞のオートラジオグラフィーに
適したものにすることができる。
、−次細胞、および株細胞のオートラジオグラフィーに
適したものにすることができる。
オートラジオグラフィー法は５１Ｃｒ、３５Ｂ、１４Ｃ
１３Ｈ１２４Ｎα、３２Ｐ、４０Ｋ、４５０ｃＬ、１３
１丁または他の放射性同位体で標識した生物学的成分（
すなわち蛋白質、炭水化物、脂質、ホルモン、細胞膜、
または細胞小器官）に適合させることができる。これを
放射性標識された電気泳動ポリアクリルアミド９法、ま
たはラジオ、グラフ用フィルムを用いる固体支持ラジオ
イムノアッセイ法に適用することができる。
１３Ｈ１２４Ｎα、３２Ｐ、４０Ｋ、４５０ｃＬ、１３
１丁または他の放射性同位体で標識した生物学的成分（
すなわち蛋白質、炭水化物、脂質、ホルモン、細胞膜、
または細胞小器官）に適合させることができる。これを
放射性標識された電気泳動ポリアクリルアミド９法、ま
たはラジオ、グラフ用フィルムを用いる固体支持ラジオ
イムノアッセイ法に適用することができる。
オートラジオグラフィーは試料に接触した（付着しては
いない）フィルム上の銀粒子を数えることにより、また
はフィルム濃度測定を行うことにより定量できる。後者
の手法は固体支持ラジオイムノアッセイまたは放射性標
識電気泳動ポリアクリルアミドゲル法に採用される。
いない）フィルム上の銀粒子を数えることにより、また
はフィルム濃度測定を行うことにより定量できる。後者
の手法は固体支持ラジオイムノアッセイまたは放射性標
識電気泳動ポリアクリルアミドゲル法に採用される。
本発明による血清アミノずンー発光物質複合体を用いて
実施できる他のアッセイは、試料のＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ含量を測定することである。特に、ＮＡＤＨおよ
びＮＡＤＰＨ含量は、たとえば食品試料中に存在する。
実施できる他のアッセイは、試料のＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ含量を測定することである。特に、ＮＡＤＨおよ
びＮＡＤＰＨ含量は、たとえば食品試料中に存在する。
それまで生存していた細胞の数の尺度として採用できる
。たとえば細菌細胞の場合、一定の条件下では比較的安
定なＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が維持されるので、それまで生
存していた細胞の存在数の測定が可能となる。細菌の死
後、ＮＡＤＨは急速にＮＡＤに変化するので、存在する
ＮＡＤＨの量は試料中に存在する生存１ｔ−ＩＯ胞の適
確な指標となる。
。たとえば細菌細胞の場合、一定の条件下では比較的安
定なＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が維持されるので、それまで生
存していた細胞の存在数の測定が可能となる。細菌の死
後、ＮＡＤＨは急速にＮＡＤに変化するので、存在する
ＮＡＤＨの量は試料中に存在する生存１ｔ−ＩＯ胞の適
確な指標となる。
ＮＡＤＨ含号はＮＡＤＨ依存メトヘモグロビンレダクタ
ーゼ、チトクロームｂ５、ヘモグロビンおよび血清アル
ブミン−発光物質複合体を二官能性架橋剤により加架さ
せてＥＴＧ系を形成させることにより、あるいはチトク
ロームｂ５を含有させる代わりに鉄エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することによりアッセイされる
。このゲルの熱化学発光に関する標準曲線は、ゲルを加
熱し、各温度で放出される光の量を記録し、次いで既知
量のＮＡＩ）Ｈを含有するゲルについて同じデータを記
録することにより作成できる。放出される光の量はＮＡ
ＤＨ濃度に比例する。基線基準を用いて多数回分のゲル
の同等性を判定する。ＮＡＤＨ含量をアッセイするため
には、試料を細胞溶解させ、次いで試料Ｉ ＥＴＧに添
加する。
ーゼ、チトクロームｂ５、ヘモグロビンおよび血清アル
ブミン−発光物質複合体を二官能性架橋剤により加架さ
せてＥＴＧ系を形成させることにより、あるいはチトク
ロームｂ５を含有させる代わりに鉄エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することによりアッセイされる
。このゲルの熱化学発光に関する標準曲線は、ゲルを加
熱し、各温度で放出される光の量を記録し、次いで既知
量のＮＡＩ）Ｈを含有するゲルについて同じデータを記
録することにより作成できる。放出される光の量はＮＡ
ＤＨ濃度に比例する。基線基準を用いて多数回分のゲル
の同等性を判定する。ＮＡＤＨ含量をアッセイするため
には、試料を細胞溶解させ、次いで試料Ｉ ＥＴＧに添
加する。
試料中に存在する、それまで生存していた真核細胞の数
は、ＮＡＤＨ依存メトヘモグロビンレダクターゼの代わ
りにＮＡＤＰＨ依存メトヘモグロビンレダクターゼを用
いるととＫより測定できる。
は、ＮＡＤＨ依存メトヘモグロビンレダクターゼの代わ
りにＮＡＤＰＨ依存メトヘモグロビンレダクターゼを用
いるととＫより測定できる。
ＮＡＤＰＨの濃度は生存真核細胞の細胞形質においては
ＮＡＤＨの濃度よりもはるかに高いからである。この調
製物にはチトクロームｂ５は含まれず、ＥＴＧ内忙内辺
取込たフラビン・アブ二ノ・ジヌクレオチＶ （ＦＡＤ
） ｉたはフラビン・モノヌクレオチド（ＦＭＮ ）を
含有する。生存する細菌または真核細胞に関するアッセ
イのいずれにおいても、メトヘモグロビンレダクターゼ
およびヘモグロビンの代わりに赤血球溶血物（適切な蛋
白質含量をもつ）を用いることができる。
ＮＡＤＨの濃度よりもはるかに高いからである。この調
製物にはチトクロームｂ５は含まれず、ＥＴＧ内忙内辺
取込たフラビン・アブ二ノ・ジヌクレオチＶ （ＦＡＤ
） ｉたはフラビン・モノヌクレオチド（ＦＭＮ ）を
含有する。生存する細菌または真核細胞に関するアッセ
イのいずれにおいても、メトヘモグロビンレダクターゼ
およびヘモグロビンの代わりに赤血球溶血物（適切な蛋
白質含量をもつ）を用いることができる。
本発明は下記の実施例（限定ではない）を参照すること
により、いっそう良く理解される。
により、いっそう良く理解される。
実施例 １
熱の検出
ヘモグロビン（シグマ・ケミカルズ社、セント・ルイス
、ミズーリ州）１０１１ＩＩｉ、ウシ血清アルブミン（
シグマ）３００η、およびルばノール（シグマ）１０ｒ
ＩＩｇを７）Ｈ６，９のリン酸塩緩衝化食塩液（ＰＢＳ
）ＬＯｙｔｌ中で混合し、溶液を０．２２−：クロン
の訓、面周フィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）で濾過して不溶のルミノールを除去した。この溶液に
２５％グルタルアルデヒド（シグマ）１１０μｌを添加
した。溶液を冷蔵庫内でゲル化させ、次いでゲル対ＰＢ
Ｓ （ＰＨ７，４） １ ： １０の比率で摩砕した。
、ミズーリ州）１０１１ＩＩｉ、ウシ血清アルブミン（
シグマ）３００η、およびルばノール（シグマ）１０ｒ
ＩＩｇを７）Ｈ６，９のリン酸塩緩衝化食塩液（ＰＢＳ
）ＬＯｙｔｌ中で混合し、溶液を０．２２−：クロン
の訓、面周フィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）で濾過して不溶のルミノールを除去した。この溶液に
２５％グルタルアルデヒド（シグマ）１１０μｌを添加
した。溶液を冷蔵庫内でゲル化させ、次いでゲル対ＰＢ
Ｓ （ＰＨ７，４） １ ： １０の比率で摩砕した。
次いでこのゲル忠濁液１ゴをバイアルに入れ、水浴中で
加熱し、はツクマンＬＳ ２３０シンチレーシヨン計数
計（アウトオブコインシデンスモー１−′）に直ちに入
れた。結果を第１図に示す。
加熱し、はツクマンＬＳ ２３０シンチレーシヨン計数
計（アウトオブコインシデンスモー１−′）に直ちに入
れた。結果を第１図に示す。
実施例 ２
悪性過温症の検出のための熱化学発光アッセイ悪性過温
症の集団病歴をもつランドレースーデュロツク交配ブタ
、悪性過温症を近文したボーランド・チャイナブタ、ス
プラーク・ドーレイラット、および正常なヒトから赤血
球（ＲＢＧ ）を得た。
症の集団病歴をもつランドレースーデュロツク交配ブタ
、悪性過温症を近文したボーランド・チャイナブタ、ス
プラーク・ドーレイラット、および正常なヒトから赤血
球（ＲＢＧ ）を得た。
新たに採取したＲＢＣ（抗凝固薬としてクエン酸ナトリ
ウムを含有〕を血漿不含となるまで洗浄し、ｐＨ６，９
の０．１ Ｍ −ＰＢＳにグルタルアルデヒド頁シ／
マ） ０．５％（”／′ｖ）ヲ含有ｊル０．１５４Ｎａ
Ｇｌ （！：共に懇濁シた。グルタルアルデヒド゛によ
る架橋を４℃で２時間行った。細胞を未結合グルタルア
ルデヒド不含となるまで洗浄し、６００ＸＪで遠心分離
し、ワサビダイコンパーオキシダーゼ（ＨＲＰ 、シグ
ヤ■型）１■／尻ｔおよびＢＳＡ （シグマ）１■／ｍ
ｌｃ非共有結合したルミノール（シグマ）ヲ含ム）をＰ
Ｈ６，９のＰＢＳに再懸濁した。この調製液を４℃で一
夜インキユベートした。細胞を洗浄し、０．５％Ｄ−グ
ルコースを含有するｐＦ：１７．４のＰＢＳ中に保存し
た。
ウムを含有〕を血漿不含となるまで洗浄し、ｐＨ６，９
の０．１ Ｍ −ＰＢＳにグルタルアルデヒド頁シ／
マ） ０．５％（”／′ｖ）ヲ含有ｊル０．１５４Ｎａ
Ｇｌ （！：共に懇濁シた。グルタルアルデヒド゛によ
る架橋を４℃で２時間行った。細胞を未結合グルタルア
ルデヒド不含となるまで洗浄し、６００ＸＪで遠心分離
し、ワサビダイコンパーオキシダーゼ（ＨＲＰ 、シグ
ヤ■型）１■／尻ｔおよびＢＳＡ （シグマ）１■／ｍ
ｌｃ非共有結合したルミノール（シグマ）ヲ含ム）をＰ
Ｈ６，９のＰＢＳに再懸濁した。この調製液を４℃で一
夜インキユベートした。細胞を洗浄し、０．５％Ｄ−グ
ルコースを含有するｐＦ：１７．４のＰＢＳ中に保存し
た。
光放出反応を誘発させるために、細胞を水浴中で３０〜
５５℃の範囲内の希望する温度±０．２℃に加熱シ、ベ
ックマンＬＳ２３０液体シンチレーション計数計（アウ
トオブコインシデンスモードに調整）で直ちに計数した
。結果を第２図に示す。各点は各１×１０個の細胞の試
料３種の平均を表わす。計器の標準偏差は±２％であっ
た。黒丸はランドレースーデュロツク交配ブタの細胞を
表わし、白丸は小型ブタの細胞、白い四角はスプラーク
・ト９−レイラットの細胞、黒い四角はヒトｍ犯を表わ
す。
５５℃の範囲内の希望する温度±０．２℃に加熱シ、ベ
ックマンＬＳ２３０液体シンチレーション計数計（アウ
トオブコインシデンスモードに調整）で直ちに計数した
。結果を第２図に示す。各点は各１×１０個の細胞の試
料３種の平均を表わす。計器の標準偏差は±２％であっ
た。黒丸はランドレースーデュロツク交配ブタの細胞を
表わし、白丸は小型ブタの細胞、白い四角はスプラーク
・ト９−レイラットの細胞、黒い四角はヒトｍ犯を表わ
す。
実線ハラノドレースーデュロツク交配ブタに関する回帰
線（相関係数ｒ−０，９７９）であり、一点破線はラッ
トのデータの回帰線（ｒ＝０．９４０ ）であ
・す、単純な破線はヒトおよび小型ブタのデータを合わ
せた回帰線（ｒ＝Ｑ、９５９、両者を区別できなかった
ので合計した）である。
線（相関係数ｒ−０，９７９）であり、一点破線はラッ
トのデータの回帰線（ｒ＝０．９４０ ）であ
・す、単純な破線はヒトおよび小型ブタのデータを合わ
せた回帰線（ｒ＝Ｑ、９５９、両者を区別できなかった
ので合計した）である。
第３図はポーランドーチャイナブタから得たＲＢＧの熱
化学発光を示す。白丸はルミノール、ＢＳＡおよびＨＲ
Ｐで標識された３Ｘ１０８個の細胞の試料９種を表わし
、黒丸はＢＳＡおよびＨＲＰでコーティングされた３Ｘ
１０８個の細胞の試料９種を表わし、白い四角はグルタ
ルアルデヒドで架橋した３Ｘ１０’個の細胞の試料９種
を表わす。ボーラント９−チャイナブタから得たルばノ
ール標識ＲＢＣに関する平均標準偏差は±１２．１％（
９，３〜１７．１％の範囲）であり；グルタルアルデヒ
ドのみで処理した細胞については標準偏差は±１０．６
％（６，６〜２０．４％）であり； ＢＳＡおよび■ψ
でコーティングした細胞については標準偏差は±１４．
７％（１０，８〜１８．７％）であった。
化学発光を示す。白丸はルミノール、ＢＳＡおよびＨＲ
Ｐで標識された３Ｘ１０８個の細胞の試料９種を表わし
、黒丸はＢＳＡおよびＨＲＰでコーティングされた３Ｘ
１０８個の細胞の試料９種を表わし、白い四角はグルタ
ルアルデヒドで架橋した３Ｘ１０’個の細胞の試料９種
を表わす。ボーラント９−チャイナブタから得たルばノ
ール標識ＲＢＣに関する平均標準偏差は±１２．１％（
９，３〜１７．１％の範囲）であり；グルタルアルデヒ
ドのみで処理した細胞については標準偏差は±１０．６
％（６，６〜２０．４％）であり； ＢＳＡおよび■ψ
でコーティングした細胞については標準偏差は±１４．
７％（１０，８〜１８．７％）であった。
ＲＢＣと無関係に各試薬から発せられる発光を制御する
ために、ＨＲＰ １η／１ｔｔｅおよびＢＳＡ−ルばノ
ール１１１１９ ／ ｒｄ （ＰＨ７，４のＰＢＳ中）
を加熱し、発光を測定した。これらの試薬の熱化学発光
はバックグラウンドの水準であった。
ために、ＨＲＰ １η／１ｔｔｅおよびＢＳＡ−ルばノ
ール１１１１９ ／ ｒｄ （ＰＨ７，４のＰＢＳ中）
を加熱し、発光を測定した。これらの試薬の熱化学発光
はバックグラウンドの水準であった。
実施列 ３
グルタチオン欠損症の検査
新たに採取したヒト赤血球（ＲＢＣ）をグルタルアルデ
ヒド、ワサビダイコンパーオキシダーゼ、ＢＳＡおよび
ルミノールと実施例２に記載したと同じ方法で架橋させ
た。ヒトＲＢＣの試料多数を、内在ダルタチオン排除の
ために発光標識の前に１−クロル−２，４−ジニトロベ
ンゼン（ＣＤＮＢ ）で前処理した。この排除は試料を
、ＣＤＮＢ Ｏ，５ｍＭを含有するｐＨ７，４のＰＢＳ
中で水浴中において３７℃で１５分間インキュベートす
ることにより行われた。次いで細胞を洗浄し、前記のよ
うにＨＲＰ 、ルミノールおよびＢＳＡで標識するため
に新たなｐＨ６，９のＰＢＳに再懸濁した。代謝ストレ
ッテであるハロタン（２−ブロム−２−クロル−１，１
，１−トリフルオルエタン）の作用を調べるために、ハ
ロタン２０μｌを正常ＲＢＣおよびＣＤＮＢ処理ＲＢＣ
双方の試料１．０コに熱化学発光誘発前に添加した。揮
発性ハロタンの逃散を防ぐためにシンチレーションバイ
アルをシールした。試料を水浴中で３０〜５０℃の範凹
円の希望する温度±０．２℃に加熱し、放出される光ｔ
＜ツクマンＬＳ２３０液体シンチレーション計数計（ア
ウトオプコインシデンスモービに調整）で直ちに測定し
た。結果を第４図に示す。各データ点は３×１０個の細
胞の試料３種の平均を表わす。黒い四角は正常なと）
ＲＢＧに関するデータを表わし、白丸はハロタン暴露し
た正常なヒ） ＲＢＣを表わし、黒丸はＣＤＮＢ処理し
たＦｊＢＣを表わし、白い四角はハロタン暴露したＣＤ
ＮＢ処理ＲＢＣから得たデータを表わす。
ヒド、ワサビダイコンパーオキシダーゼ、ＢＳＡおよび
ルミノールと実施例２に記載したと同じ方法で架橋させ
た。ヒトＲＢＣの試料多数を、内在ダルタチオン排除の
ために発光標識の前に１−クロル−２，４−ジニトロベ
ンゼン（ＣＤＮＢ ）で前処理した。この排除は試料を
、ＣＤＮＢ Ｏ，５ｍＭを含有するｐＨ７，４のＰＢＳ
中で水浴中において３７℃で１５分間インキュベートす
ることにより行われた。次いで細胞を洗浄し、前記のよ
うにＨＲＰ 、ルミノールおよびＢＳＡで標識するため
に新たなｐＨ６，９のＰＢＳに再懸濁した。代謝ストレ
ッテであるハロタン（２−ブロム−２−クロル−１，１
，１−トリフルオルエタン）の作用を調べるために、ハ
ロタン２０μｌを正常ＲＢＣおよびＣＤＮＢ処理ＲＢＣ
双方の試料１．０コに熱化学発光誘発前に添加した。揮
発性ハロタンの逃散を防ぐためにシンチレーションバイ
アルをシールした。試料を水浴中で３０〜５０℃の範凹
円の希望する温度±０．２℃に加熱し、放出される光ｔ
＜ツクマンＬＳ２３０液体シンチレーション計数計（ア
ウトオプコインシデンスモービに調整）で直ちに測定し
た。結果を第４図に示す。各データ点は３×１０個の細
胞の試料３種の平均を表わす。黒い四角は正常なと）
ＲＢＧに関するデータを表わし、白丸はハロタン暴露し
た正常なヒ） ＲＢＣを表わし、黒丸はＣＤＮＢ処理し
たＦｊＢＣを表わし、白い四角はハロタン暴露したＣＤ
ＮＢ処理ＲＢＣから得たデータを表わす。
悪性適温症の病歴をもつ集団から得たランド９レースー
デユロツクＲＢＣの熱化学発光にノ・ロタンが与える影
響も調べた。細胞を前記と同じ方法で調製し、Ｉ Ｘ
１０’個の細胞を含有する細胞試料１ゴにハロタン２０
μｌを添加した。結果を第５図に示す。白丸は未処理Ｒ
ＢＣから得たデータを表わし、黒い四角はハロタンでス
トレスを与えたブタＲＢＣを表わす。
デユロツクＲＢＣの熱化学発光にノ・ロタンが与える影
響も調べた。細胞を前記と同じ方法で調製し、Ｉ Ｘ
１０’個の細胞を含有する細胞試料１ゴにハロタン２０
μｌを添加した。結果を第５図に示す。白丸は未処理Ｒ
ＢＣから得たデータを表わし、黒い四角はハロタンでス
トレスを与えたブタＲＢＣを表わす。
実施例 ４
自動酸化欠損症の指標としての熱化学発光の証明熱化学
発光アッセイ法が自動酸化欠損症の指標として実際に有
効であることの証明を補助するために、ラットＲＢｃｆ
用いて抑制試験を行った。ＲＢＣを前記実施例２および
３に記載したと同様に採取および前処理した。次いで超
酸化物ジスムターゼ（シグマ）、カタラーゼ（シグマ）
、硫酸銅（フィッシャー）または亜硝酸ナトリウム（フ
ィッシャー）をｐＨ７，４のＰＢＳ中の標識ラットＲＢ
Ｇ （１×１０個）の細胞懸濁液１ ｔｒｔｌに添加し
た。各１ ｎｌの試料３種を５組調製した。３試料の一
組には超酸化物ジスムターゼ５μｇを入れ、−組にはカ
タラーゼ６０μｌ、−組には硫酸銅９．０７７Ｍ、−組
には亜硝酸ナトリウム３３．０μＭを入れた。酵素は熱
化学発光アッセイ中、溶解状態を保った。細胞を熱化学
発光アッセイの前に３０分間予備インキュ、＜−ジョン
したのち、硫酸鋼または亜硝酸ナトリウム不含となるま
で遠心分離および再懸濁により洗浄した。細胞を化学発
光測定前に５０℃に加熱した。
発光アッセイ法が自動酸化欠損症の指標として実際に有
効であることの証明を補助するために、ラットＲＢｃｆ
用いて抑制試験を行った。ＲＢＣを前記実施例２および
３に記載したと同様に採取および前処理した。次いで超
酸化物ジスムターゼ（シグマ）、カタラーゼ（シグマ）
、硫酸銅（フィッシャー）または亜硝酸ナトリウム（フ
ィッシャー）をｐＨ７，４のＰＢＳ中の標識ラットＲＢ
Ｇ （１×１０個）の細胞懸濁液１ ｔｒｔｌに添加し
た。各１ ｎｌの試料３種を５組調製した。３試料の一
組には超酸化物ジスムターゼ５μｇを入れ、−組にはカ
タラーゼ６０μｌ、−組には硫酸銅９．０７７Ｍ、−組
には亜硝酸ナトリウム３３．０μＭを入れた。酵素は熱
化学発光アッセイ中、溶解状態を保った。細胞を熱化学
発光アッセイの前に３０分間予備インキュ、＜−ジョン
したのち、硫酸鋼または亜硝酸ナトリウム不含となるま
で遠心分離および再懸濁により洗浄した。細胞を化学発
光測定前に５０℃に加熱した。
次表は超酸化物ジスムターゼ、カタラーゼ、硫酸銅およ
び亜硝酸ナトリウムによる化学発光抑制を示す（各数値
は３試料の平均を表わす）。
び亜硝酸ナトリウムによる化学発光抑制を示す（各数値
は３試料の平均を表わす）。
な し １４９，５１９±２７
７７ １００超酸化物ジスムターゼ ４９，４７６
±６９５８ ３３．８カタラーゼ ４６
．５６６±９１２３ ３１．２８ＣｕＳＯ４３４，
１４５±２６９１ ２３．３ＮｃＬＮＯ２３１，１
８２±２９８３ ２１．３Ｓ、Ｄ、＊＝標準偏差；
空のバイアルのｃｐｍは±４６６２（Ｎ＝３ ）であっ
た。
７７ １００超酸化物ジスムターゼ ４９，４７６
±６９５８ ３３．８カタラーゼ ４６
．５６６±９１２３ ３１．２８ＣｕＳＯ４３４，
１４５±２６９１ ２３．３ＮｃＬＮＯ２３１，１
８２±２９８３ ２１．３Ｓ、Ｄ、＊＝標準偏差；
空のバイアルのｃｐｍは±４６６２（Ｎ＝３ ）であっ
た。
超酸化物ジスムターゼおよびカタラーゼによる化学発光
反応の抑制は、それぞれ超酸化物および過酸化水素が反
応に関与していることを示す。硫酸銅および亜硝酸ナト
リウム（オキシヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換
する）も反応を抑制した。これはオキシへそグロビンが
自動酸化反応に関与していることを示す。
反応の抑制は、それぞれ超酸化物および過酸化水素が反
応に関与していることを示す。硫酸銅および亜硝酸ナト
リウム（オキシヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換
する）も反応を抑制した。これはオキシへそグロビンが
自動酸化反応に関与していることを示す。
実施例 ５
細胞に対する過酸化傷害の測定
、細胞が受けた過酸化傷害の程度は２方法によりアッセ
イできる。一方法においては、あらかじめ過酸化剤に暴
露されたヒトその他の動物から得た新たなヘパリン加血
液１ｍＡ’を４００ＸＦで１５分間遠心分離し、細胞の
１０倍容量のｐＨ６，９ＰＢＳに再懸濁した。次いでこ
の洗浄を反復し、細胞を再度遠心分離して、ｐＨ６，９
のＰＢＳに吸収されたルミノールで飽和したＢ５Ａｌ■
に再懸濁した。細胞をこの調製液中４℃で２時間インキ
ュベートし、次いでｐＨ７，４のＰＢＳ中で３回洗浄し
た。次いで水素化ホウ素カリウム２ ｍＭを含有するｐ
Ｈ７，４のＰＢＳに細胞を再懸濁し、氷上で３０分間イ
ンキュベートし、次いでｐＨ７，４のＰＢＳ中で３回洗
浄した。
イできる。一方法においては、あらかじめ過酸化剤に暴
露されたヒトその他の動物から得た新たなヘパリン加血
液１ｍＡ’を４００ＸＦで１５分間遠心分離し、細胞の
１０倍容量のｐＨ６，９ＰＢＳに再懸濁した。次いでこ
の洗浄を反復し、細胞を再度遠心分離して、ｐＨ６，９
のＰＢＳに吸収されたルミノールで飽和したＢ５Ａｌ■
に再懸濁した。細胞をこの調製液中４℃で２時間インキ
ュベートし、次いでｐＨ７，４のＰＢＳ中で３回洗浄し
た。次いで水素化ホウ素カリウム２ ｍＭを含有するｐ
Ｈ７，４のＰＢＳに細胞を再懸濁し、氷上で３０分間イ
ンキュベートし、次いでｐＨ７，４のＰＢＳ中で３回洗
浄した。
化学発光の量はｏ、ＩＮ−ＮαＯＨ０，１〃Ｊ″ｆ！：
ＲＢｃ（１：２０に希釈）０．５ｙＪに添加し、ルミ
ノーメ −ターまたはシンチレーション計数計（アウト
オブコインシデンスモービに調整）により放出される光
を測定することにより測定された。
ＲＢｃ（１：２０に希釈）０．５ｙＪに添加し、ルミ
ノーメ −ターまたはシンチレーション計数計（アウト
オブコインシデンスモービに調整）により放出される光
を測定することにより測定された。
陰性の対照は、細胞をウシ血清アルブミンおよびルミノ
ールと接触させる前に水素化ホウ素カリウムで前処理す
ることにより作成された。陽性の対照は、細胞を過ヨウ
素酸ナトリウムで過酸化することにより作成された。細
胞を、ｐＨ７，４のＰＢＳに＃解した１、５ ｍＭ −
ＮａＩＯ３で処理した。この処理を氷上で１５分間続け
、次いで細胞をＰＨ７，１ＬのＰＢＳ中で３回洗浄し、
前記のようにＢＳＡおよびルばノールで処理した。
ールと接触させる前に水素化ホウ素カリウムで前処理す
ることにより作成された。陽性の対照は、細胞を過ヨウ
素酸ナトリウムで過酸化することにより作成された。細
胞を、ｐＨ７，４のＰＢＳに＃解した１、５ ｍＭ −
ＮａＩＯ３で処理した。この処理を氷上で１５分間続け
、次いで細胞をＰＨ７，１ＬのＰＢＳ中で３回洗浄し、
前記のようにＢＳＡおよびルばノールで処理した。
このアッセイを行うための第２の方法は、上記のＢＳＡ
−ルミノール複合体の代わりにヘモグロビン−８ＳＡ−
ルミノール結合体を用いるものである。
−ルミノール複合体の代わりにヘモグロビン−８ＳＡ−
ルミノール結合体を用いるものである。
この結合体はヘモグロビン２η／ｄをＢＳＡ ２η／ｄ
、ルミノールＩ ＴＩ９ ／ ｔｄ！、および２５％グ
ルタルアルデヒド”（ＰＨ６，９のＰＢＳ中）５μｌ／
−を混合することにより調製された。次いでこの混合物
を０．２２μの細菌用フィルター（ミリポア）に導通し
、４℃で１時間インキユベートシた。インキュベーショ
ンののち、ポリアミノ化合物であるリシン１００■の添
加により架橋反応を停止した。試料をＧ−２５セフアデ
ツクス（ファルマシア）カラム（４８ｍ／）に装填し、
４ｄずつ採取した。これらの画分を５０℃に加熱し、直
ちにルミツメ−ターまたはベータ液体シンチレーション
計数計（アウトオブコインシデンスモー１−”）で測定
することにより熱化学反応を調べた。発光反応は塩基、
塩基および過酸化水素の添加によって、あるいは４２℃
よりも高いいずれかの温度に加熱することによって誘発
することもできる。
、ルミノールＩ ＴＩ９ ／ ｔｄ！、および２５％グ
ルタルアルデヒド”（ＰＨ６，９のＰＢＳ中）５μｌ／
−を混合することにより調製された。次いでこの混合物
を０．２２μの細菌用フィルター（ミリポア）に導通し
、４℃で１時間インキユベートシた。インキュベーショ
ンののち、ポリアミノ化合物であるリシン１００■の添
加により架橋反応を停止した。試料をＧ−２５セフアデ
ツクス（ファルマシア）カラム（４８ｍ／）に装填し、
４ｄずつ採取した。これらの画分を５０℃に加熱し、直
ちにルミツメ−ターまたはベータ液体シンチレーション
計数計（アウトオブコインシデンスモー１−”）で測定
することにより熱化学反応を調べた。発光反応は塩基、
塩基および過酸化水素の添加によって、あるいは４２℃
よりも高いいずれかの温度に加熱することによって誘発
することもできる。
実施例 ６
特異的細胞型の同定および定量
赤血球を同定のため下記のように標識した。標識用試薬
は２■／ｒｔｔｌのレクチンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
Ａ ） ０．２ｔｎｌｌをｐＨ６，９のＰＢＳ １．
６１ｎＩ！、２１１ｑ／ｗｔｌのＢＳＡｏ、２ｍ／、
２５％グルタルアルデヒド″１０μノ、およびルミノー
ル２ｍ９を混合することにより調製された。この調製液
を０．２２μのフィルター（ミリポア）に導通し、冷蔵
庫内で１時間インキュベートした。インキュベーション
ののち、グリシン１００■の添加により反応を停止した
。架橋した試料を、ｐＨ７，４のＰＢＳ中で平衡化した
Ｇ−２５セフアデツクス（ファルマシア）カラム（４８
ｄ）に装填シた。
は２■／ｒｔｔｌのレクチンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
Ａ ） ０．２ｔｎｌｌをｐＨ６，９のＰＢＳ １．
６１ｎＩ！、２１１ｑ／ｗｔｌのＢＳＡｏ、２ｍ／、
２５％グルタルアルデヒド″１０μノ、およびルミノー
ル２ｍ９を混合することにより調製された。この調製液
を０．２２μのフィルター（ミリポア）に導通し、冷蔵
庫内で１時間インキュベートした。インキュベーション
ののち、グリシン１００■の添加により反応を停止した
。架橋した試料を、ｐＨ７，４のＰＢＳ中で平衡化した
Ｇ−２５セフアデツクス（ファルマシア）カラム（４８
ｄ）に装填シた。
４１ｎＩ！ずつの画分をカラム゛力・ら採取し、各４ｒ
ｔｔｌの画分から０．５ｍ／の試料を１＝ｌＯのヒトＲ
ＢＣ（ｐＨ７，４のＰＢＳ中）ｌｄに添加した。この調
製液を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで細
胞をｐＨ７，４のＰＢＳで３回洗浄し、ｐＨ７，４のＰ
ＢＳ ・２ｄに再懸濁した。
ｔｔｌの画分から０．５ｍ／の試料を１＝ｌＯのヒトＲ
ＢＣ（ｐＨ７，４のＰＢＳ中）ｌｄに添加した。この調
製液を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで細
胞をｐＨ７，４のＰＢＳで３回洗浄し、ｐＨ７，４のＰ
ＢＳ ・２ｄに再懸濁した。
０、ＩＮ−ＮｃＬＯＨ１００μｌを細胞悪濁液０．５コ
に添加することにより化学発光反応を活性化し、発光反
応をルミノメータ−（６に調整）で計数した。
に添加することにより化学発光反応を活性化し、発光反
応をルミノメータ−（６に調整）で計数した。
６に調整したルミノメータ−によるＣＰＭ （１分当た
りの計数）はアウトオブコインシデンスモードに調整さ
れたイックマンＬＳ２３０による１０ ＸＣＰＭに相
当していた。結果を第６図にグラフで示す。
りの計数）はアウトオブコインシデンスモードに調整さ
れたイックマンＬＳ２３０による１０ ＸＣＰＭに相
当していた。結果を第６図にグラフで示す。
実施例 ７
薬物感受性の測定
特定の有毒化合物に対するある個体の感受性を下記によ
り測定した。Ｃｏｎ Ａ −ＢＳＡ−ルばノール結合体
を上記実施例６の方法に従って調製し、次いで上記化合
物に対して感受性？もつ疑いのある個体から得たＲＢＣ
を実施例６に記載したと同じ方法により結合体でコーテ
ィングした。結合体でコーティングしたＲＢＣ試料を、
有毒化合物の存在下で、次いで不在下で２５〜５０℃の
温度に加熱し、発光を測定した。ルミノールを酸化させ
る過剰の超酸化物、過酸化水素、および遊離水酸基の産
生の結果である過剰の発光は感受性を示す。
り測定した。Ｃｏｎ Ａ −ＢＳＡ−ルばノール結合体
を上記実施例６の方法に従って調製し、次いで上記化合
物に対して感受性？もつ疑いのある個体から得たＲＢＣ
を実施例６に記載したと同じ方法により結合体でコーテ
ィングした。結合体でコーティングしたＲＢＣ試料を、
有毒化合物の存在下で、次いで不在下で２５〜５０℃の
温度に加熱し、発光を測定した。ルミノールを酸化させ
る過剰の超酸化物、過酸化水素、および遊離水酸基の産
生の結果である過剰の発光は感受性を示す。
実施例 ８
マウス牌則胞の細胞媒介既往応答
リン酸塩緩衝化食塩液（ＰＢＳ 、 ｐＨ７，４）にル
ばノール（ベーカー・ケミカルズ社、フィリプスバーグ
、ニュージャージ州）３■／ｄを懸濁し、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ） （シグマ）３■／ｌｄを溶解するこ
とにより、免疫化用ルミノール混合物を調製した。ＰＢ
Ｓ （ｐＨ６，９）中ルミノール１■／ｄおよびＢＳＡ
ｌｙ／ｍ／の新たに調製した溶液の１：５希釈液を作
成することにより化学発光アッセイ用のルミノール指示
薬を調製した。ルミノール混合物は双方とも室温で調製
され、０．２μｍのゲルマン・アクロディスク（Ｇｅｌ
ｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃ）により濾過して不溶のルミ
ノールを除去し、使用時まで暗所に４℃で保存された。
ばノール（ベーカー・ケミカルズ社、フィリプスバーグ
、ニュージャージ州）３■／ｄを懸濁し、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ） （シグマ）３■／ｌｄを溶解するこ
とにより、免疫化用ルミノール混合物を調製した。ＰＢ
Ｓ （ｐＨ６，９）中ルミノール１■／ｄおよびＢＳＡ
ｌｙ／ｍ／の新たに調製した溶液の１：５希釈液を作
成することにより化学発光アッセイ用のルミノール指示
薬を調製した。ルミノール混合物は双方とも室温で調製
され、０．２μｍのゲルマン・アクロディスク（Ｇｅｌ
ｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃ）により濾過して不溶のルミ
ノールを除去し、使用時まで暗所に４℃で保存された。
雄ＣＢＡ ／ ＪまたはＢＡＬＢ ／ ｃｊマウス（ジ
ャクソン・ラボラトリーズ、バー７−−バー、メイン州
）（２５〜３０１）を１２／１２の暗／明サイクルで、
食物および水を任意に与えて飼育した。対照動物は食塩
液０．５ ｄで処理され（皮下または腹腔内）、実験動
物にはルミノール−ＢＳＡ抗原０．２ｄを皮下に投与し
た。
ャクソン・ラボラトリーズ、バー７−−バー、メイン州
）（２５〜３０１）を１２／１２の暗／明サイクルで、
食物および水を任意に与えて飼育した。対照動物は食塩
液０．５ ｄで処理され（皮下または腹腔内）、実験動
物にはルミノール−ＢＳＡ抗原０．２ｄを皮下に投与し
た。
免疫処理後２日目および４日目に急激な頚脱臼によりマ
ウスを層殺し、それらの膵臓を摘出した。
ウスを層殺し、それらの膵臓を摘出した。
膵臓をＨＥＰＥＳ （Ｎ −２−ヒビロキシエチルピＲ
ラジンーＹ−２−エタンスルホン酸、シグマ）２０ｍｌ
で緩衝化した室温のノ・ンク緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）
ＣｐＨ７，４）中で細かく裂いた（膵臓２０ｍｑ／ｄ
（ＨＢＳＳ） ）。この懸濁液′ｔ−６Ｘ、９で３分
間遠心分離して組織破片を除去した。トリ・ξンブルー
色素の排除により細胞の生存性を判定し、細胞濃度を生
存細胞８〜１２×ｌＯ３個／酊３に調整した。染色固定
したスライドについてなされた鑑別計数により、この懸
濁液はリンパ球９４〜９６％であることが示された。
ラジンーＹ−２−エタンスルホン酸、シグマ）２０ｍｌ
で緩衝化した室温のノ・ンク緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）
ＣｐＨ７，４）中で細かく裂いた（膵臓２０ｍｑ／ｄ
（ＨＢＳＳ） ）。この懸濁液′ｔ−６Ｘ、９で３分
間遠心分離して組織破片を除去した。トリ・ξンブルー
色素の排除により細胞の生存性を判定し、細胞濃度を生
存細胞８〜１２×ｌＯ３個／酊３に調整した。染色固定
したスライドについてなされた鑑別計数により、この懸
濁液はリンパ球９４〜９６％であることが示された。
試料を暗保存用ガラスシンチレー７ョンバイアル中で３
７℃の振とり水浴中において２５分間インキユベートシ
たのち、ルミノール−ＢＳＡ 抗原混合物１００μｌを
各バイアルに添加した。化学発光をルミノールの添加前
、添加時、および添加後５分毎にベックマンＬ８２３０
Ｗ液体シンチレーション計数計（アウトオブコインシデ
ンスモードに調整、ゲイン３５０、プレセット０．２分
、ウィンドウ０−１００）。各読みの間、細胞は３７℃
に維持された。
７℃の振とり水浴中において２５分間インキユベートシ
たのち、ルミノール−ＢＳＡ 抗原混合物１００μｌを
各バイアルに添加した。化学発光をルミノールの添加前
、添加時、および添加後５分毎にベックマンＬ８２３０
Ｗ液体シンチレーション計数計（アウトオブコインシデ
ンスモードに調整、ゲイン３５０、プレセット０．２分
、ウィンドウ０−１００）。各読みの間、細胞は３７℃
に維持された。
インヒドロでの抗原の一次および二次暴露に対する肺細
胞の化学発光応答は下記のとおりであった。
胞の化学発光応答は下記のとおりであった。
群 総化学発光 平均化学発光（ｃ ｍＸ１
０ ） （ｃｐｍｘｌｏ ）対照 １６９
．４±６８．７ ２４．２±２５．９２日目
４８４．７±１５５．６ ６９２±５８，８
２系列のマウスの応答に差が認められなかったので、こ
れらのデータを合計した。総化学発光はルミノール添加
後５分から３５分までのｃｐｍ （バックグラウンド以
上）を表わし、平均化学発光はルミノール添加後５分か
ら３５分までのすべての測定値の平均である。実際の結
果を第７図にグラフで示す。黒い四角は対照群から得た
データを表わし、白丸は２日目の群から得たデータ、白
い四角は４日目の群から得たデータを表わす。対照群は
４匹のマウスからなり、２日目および４日目の群は各３
匹のマウスであり、各マウスにつき７回の測定を行った
。４日目の群の平均は対照および２日目の群双方の平均
と異なる。ｐ） ０．０１ （ダンカンの多重範囲試験
）。
０ ） （ｃｐｍｘｌｏ ）対照 １６９
．４±６８．７ ２４．２±２５．９２日目
４８４．７±１５５．６ ６９２±５８，８
２系列のマウスの応答に差が認められなかったので、こ
れらのデータを合計した。総化学発光はルミノール添加
後５分から３５分までのｃｐｍ （バックグラウンド以
上）を表わし、平均化学発光はルミノール添加後５分か
ら３５分までのすべての測定値の平均である。実際の結
果を第７図にグラフで示す。黒い四角は対照群から得た
データを表わし、白丸は２日目の群から得たデータ、白
い四角は４日目の群から得たデータを表わす。対照群は
４匹のマウスからなり、２日目および４日目の群は各３
匹のマウスであり、各マウスにつき７回の測定を行った
。４日目の群の平均は対照および２日目の群双方の平均
と異なる。ｐ） ０．０１ （ダンカンの多重範囲試験
）。
実施例 ９
移植の症例における同種移植片拒絶の潜在性の測定
提供者および被移植者双方から、バリン加全血１０ｄを
採取した。ファイコルーノーイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｈｙｐａｑｕｅ） ４ ｍｌをそれぞれ１６Ｘ１０５
龍のポリカーボネート製試験管に添加し、このファイコ
ル−ハイバーク上に２〜６−の血液を積層した。２００
０ｘＪで２０分間遠心分離した。赤血球はレット上方の
液体中にある白血球をすべて採取した。ウシ胎仔血清Ｃ
ＦＯ８） ５％を含有する緩衝塩類溶液１０ｍＪを添加
し、３００〜３５０ｘ、！７で１５分間遠心分雅した。
採取した。ファイコルーノーイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｈｙｐａｑｕｅ） ４ ｍｌをそれぞれ１６Ｘ１０５
龍のポリカーボネート製試験管に添加し、このファイコ
ル−ハイバーク上に２〜６−の血液を積層した。２００
０ｘＪで２０分間遠心分離した。赤血球はレット上方の
液体中にある白血球をすべて採取した。ウシ胎仔血清Ｃ
ＦＯ８） ５％を含有する緩衝塩類溶液１０ｍＪを添加
し、３００〜３５０ｘ、！７で１５分間遠心分雅した。
２回洗浄し、２５０ｘＩｉで１０分間遠心分離した。コ
ールタ−細胞計数計で細胞を計数し、細胞濃度を１〜６
Ｘ１０７個／ゴに調整した。緩衝塩類溶液中のマイトマ
イシン０２５μｇ（膜濾過し、滅菌したマイトマイシン
０．５■／ｄの溶液５０μ））を細胞憑濁液１ｍＩ！に
つき添加した。
ールタ−細胞計数計で細胞を計数し、細胞濃度を１〜６
Ｘ１０７個／ゴに調整した。緩衝塩類溶液中のマイトマ
イシン０２５μｇ（膜濾過し、滅菌したマイトマイシン
０．５■／ｄの溶液５０μ））を細胞憑濁液１ｍＩ！に
つき添加した。
この調製液を３７℃で２０分間、暗所でインキユベート
シた。前記のようにＦｅ２５％を含有す一６２衝塩類溶
液中で３回洗浄した。未処理の応答細胞、ならびに抑制
された刺激および応答細胞の濃度を、Ｌ−グルタばン、
ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸およびＦｅ２５
％を補充したＲＰＭ１１６４０媒地中２Ｘ１０６個／１
ｔｔｌに調整した。対照培養として、抑制されない応答
細胞０．５ ｍｌを抑制された応答細胞０．５ ｄと１
２Ｘ７５ｍｍの試験管中で混合した。
シた。前記のようにＦｅ２５％を含有す一６２衝塩類溶
液中で３回洗浄した。未処理の応答細胞、ならびに抑制
された刺激および応答細胞の濃度を、Ｌ−グルタばン、
ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸およびＦｅ２５
％を補充したＲＰＭ１１６４０媒地中２Ｘ１０６個／１
ｔｔｌに調整した。対照培養として、抑制されない応答
細胞０．５ ｍｌを抑制された応答細胞０．５ ｄと１
２Ｘ７５ｍｍの試験管中で混合した。
被験培養として、未処理の応答細胞０．５ ｒｔｔｌを
処理した刺激細胞０．５ ｍｌと混合した。
処理した刺激細胞０．５ ｍｌと混合した。
試験管を斜面培饗台に乗せ、３７℃の加湿インキュベー
ター中で、空気中５％Ｃ０２の雰囲気においてインキュ
ベートした。各培養物をトリチウム化（３Ｈ）−チミジ
ン０．１．ｄ（１〜２マイクロキユリー）で７２〜９６
時間処理した。
ター中で、空気中５％Ｃ０２の雰囲気においてインキュ
ベートした。各培養物をトリチウム化（３Ｈ）−チミジ
ン０．１．ｄ（１〜２マイクロキユリー）で７２〜９６
時間処理した。
下記により細胞を採取した。吸引濾過装置中に保持され
た別個のぼりポアフィルター（０，４５μｍ）を用いて
、各培養慧濁液から磁気攪拌後に＃胞物質を取出した。
た別個のぼりポアフィルター（０，４５μｍ）を用いて
、各培養慧濁液から磁気攪拌後に＃胞物質を取出した。
低温の緩衝塩溶液２ ｔｎｌ ｆ各試験管に添加し、次
いでこれを磁気攪拌した。内容物をフィルター上に注い
だ。この操作を反復した。次いで細胞をフィルター上で
低温の１０％トリクロル酢酸１０１１Ｌｌで連続２回洗
浄した。次いでフィルターを９５％エタノールまたは無
水メタノール２ばで連続３回洗浄した。
いでこれを磁気攪拌した。内容物をフィルター上に注い
だ。この操作を反復した。次いで細胞をフィルター上で
低温の１０％トリクロル酢酸１０１１Ｌｌで連続２回洗
浄した。次いでフィルターを９５％エタノールまたは無
水メタノール２ばで連続３回洗浄した。
ルミノール（あらかじめ０．２２μｍのフィルターで濾
過して不溶性ルミノールを除去したもの）で飽和したＢ
５Ａ３０〜／−の水溶液を調製し、ＰＨ６，９に調整し
た。この溶液に２５％グルタルアルデヒド２０μｌ／ｍ
ｅを添加した。溶液を１０分間、または流号比が少なく
とも５０％低下するまでフィルターに導通した。このフ
ィルターを再び無水メタノールで除水し、乾燥させ、ベ
ータシンチレーション計数計で計数した。ディスク上の
既知量の放射性同位体物質（３Ｈ−標識）を含有する標
準品を調製して、計数効率およびクエンチングを測定し
なければならない。
過して不溶性ルミノールを除去したもの）で飽和したＢ
５Ａ３０〜／−の水溶液を調製し、ＰＨ６，９に調整し
た。この溶液に２５％グルタルアルデヒド２０μｌ／ｍ
ｅを添加した。溶液を１０分間、または流号比が少なく
とも５０％低下するまでフィルターに導通した。このフ
ィルターを再び無水メタノールで除水し、乾燥させ、ベ
ータシンチレーション計数計で計数した。ディスク上の
既知量の放射性同位体物質（３Ｈ−標識）を含有する標
準品を調製して、計数効率およびクエンチングを測定し
なければならない。
実施例 １０
オートラジオグラフの増強
牌細胞を加湿した細胞培養インキュベーター中のロッカ
ー上で３７℃において約６時間インキユヘートすること
により（３Ｈ）チミジン（培地１ ｍｌ中１０μＧｉ）
で標識した。細胞を培養皿から試験管中へ取出し、標識
されていないチミジン１ ｍＭで２回洗浄した。細胞を
遠心分離し、バンクの緩衝塩類溶液に１〜２Ｘ１０個／
ｄの濃度に再懸濁した。
ー上で３７℃において約６時間インキユヘートすること
により（３Ｈ）チミジン（培地１ ｍｌ中１０μＧｉ）
で標識した。細胞を培養皿から試験管中へ取出し、標識
されていないチミジン１ ｍＭで２回洗浄した。細胞を
遠心分離し、バンクの緩衝塩類溶液に１〜２Ｘ１０個／
ｄの濃度に再懸濁した。
０．５％アガロースコーティングしたスライド９の中央
に細胞試料０．１ｄを置いた。この試料に２％酢酸０．
１ ｍを添加した。ゲルの表面にガラス棒をころがすこ
とにより試料および酢酸を一緒に薄い層状に広げた。こ
のスライドを低温の炎に速やかに数回通すことにより乾
燥させた。乾燥および冷却後にスライドを蒸留水に２０
回浸漬して塩類を除去した。次いでスライドを蒸留水中
のＢＳＡ−ルミノール複合体１■／−で覆った。試料を
前記のように低温の炎中で乾燥させた。次いでスライド
９を０．５％グルタルアルデヒドで覆い、４℃で３０分
間固定した。スライドを再び４℃の蒸留水中で洗浄した
。室温にまで外温させたのちスライドヲ安全灯下で標準
法（ジエイ・ワトソン、肺臓細胞培養物ノオートラジオ
グラフイー、“細胞免疫における精選された方法”中、
ビー・ミシエルおよびニス・エム健シイシ編；サンフラ
ンシスコニタフリュー・エッチ・フリーマン社、１９８
０年、１６６−１７２頁参照〕で浸漬することによりフ
ィルム乳剤（ＮＴＢ−２ニュークリアートラック乳剤、
イーストマン・コダック社）でコーティングした。
に細胞試料０．１ｄを置いた。この試料に２％酢酸０．
１ ｍを添加した。ゲルの表面にガラス棒をころがすこ
とにより試料および酢酸を一緒に薄い層状に広げた。こ
のスライドを低温の炎に速やかに数回通すことにより乾
燥させた。乾燥および冷却後にスライドを蒸留水に２０
回浸漬して塩類を除去した。次いでスライドを蒸留水中
のＢＳＡ−ルミノール複合体１■／−で覆った。試料を
前記のように低温の炎中で乾燥させた。次いでスライド
９を０．５％グルタルアルデヒドで覆い、４℃で３０分
間固定した。スライドを再び４℃の蒸留水中で洗浄した
。室温にまで外温させたのちスライドヲ安全灯下で標準
法（ジエイ・ワトソン、肺臓細胞培養物ノオートラジオ
グラフイー、“細胞免疫における精選された方法”中、
ビー・ミシエルおよびニス・エム健シイシ編；サンフラ
ンシスコニタフリュー・エッチ・フリーマン社、１９８
０年、１６６−１７２頁参照〕で浸漬することによりフ
ィルム乳剤（ＮＴＢ−２ニュークリアートラック乳剤、
イーストマン・コダック社）でコーティングした。
オートラジオグラム露光は７日間以内行った。
、数枚の対照スライドを露光期間にわたって標準法によ
り（イーストマン・コダック社Ｄ−１９現像液）１６℃
で３〜５分間現像し、８〜１０分間急速固定すべきであ
る。
り（イーストマン・コダック社Ｄ−１９現像液）１６℃
で３〜５分間現像し、８〜１０分間急速固定すべきであ
る。
実施例 １１
特異的および非特異的な免疫刺激物質に対するマウス牌
細胞の酸化応答 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．６ 、Ｆ 、ヒツ
ジ赤血球（ＲＢＣ）の２％溶液０．２ ｎｔｌ、完全７
０インド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント（ＣＦＡ） ０
．２ ｄで、またはＢＳＡを含むＣＦＡで免疫処理した
ＣＢＡ／Ｊマウスから、前記実施例８に記載したと同じ
方法でマウス牌細胞を調製した。実施例８に記載したと
同じ方法でルミノールを吸収させたＢＳＡにより牌細胞
調製液を政務した。
細胞の酸化応答 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．６ 、Ｆ 、ヒツ
ジ赤血球（ＲＢＣ）の２％溶液０．２ ｎｔｌ、完全７
０インド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント（ＣＦＡ） ０
．２ ｄで、またはＢＳＡを含むＣＦＡで免疫処理した
ＣＢＡ／Ｊマウスから、前記実施例８に記載したと同じ
方法でマウス牌細胞を調製した。実施例８に記載したと
同じ方法でルミノールを吸収させたＢＳＡにより牌細胞
調製液を政務した。
最大量の化学発光はＢＳＡ含有または不含のＣＦＡで免
疫処理したマウスの牌細胞により記録された。
疫処理したマウスの牌細胞により記録された。
ＢＳＡおよびヒツジＲＢＣで免疫処理したマウスから得
た牌細胞の化学発光反応は変動し、ＢＳＡに対する特異
的リン・ぞ球性酸化応答と非特異的リンパ球性酸化応答
の組合せであることが明らかになった。
た牌細胞の化学発光反応は変動し、ＢＳＡに対する特異
的リン・ぞ球性酸化応答と非特異的リンパ球性酸化応答
の組合せであることが明らかになった。
実施例 １２
大腸菌抗原に対するヒトリンパ球の酸化応答ヒト末梢リ
ンパ球（および他の単核球）を７アイコルーハイパーク
法により、新たに彩取したヘノミリン加全血１０ｄから
採取した。これらの細胞をＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（ＰＨ
７，４）に再懸濁して１０６個／プの濃度となし、大腸
菌（Ｅ、Ｇｏｌｉ）ＬＰＳ−ウシ血清アルブミンＣＢＳ
Ａ）−ルミノール結合体に暴露し、実施例８に記載した
ように発光を記録した。
ンパ球（および他の単核球）を７アイコルーハイパーク
法により、新たに彩取したヘノミリン加全血１０ｄから
採取した。これらの細胞をＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（ＰＨ
７，４）に再懸濁して１０６個／プの濃度となし、大腸
菌（Ｅ、Ｇｏｌｉ）ＬＰＳ−ウシ血清アルブミンＣＢＳ
Ａ）−ルミノール結合体に暴露し、実施例８に記載した
ように発光を記録した。
大腸ｌｉｔ ＬＰＳ抗原−ＢＳＡ−ルミノール結合体は
下記により調製された。大腸菌ＬＰＳ （大腸菌由来の
リポ多糖類、５０ ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）
２０ｄ中に希釈したもの）の２峯勺の溶液を、Ｋ１０４
４０μＭを含有する過ヨウ素酸塩溶液０．４ ｄと混合
した。この溶液を２５℃で４時間攪拌した。反応をエチ
レングリコール（０，４５ｍＭ）０．０２５ｄの添加に
より終結し、さらに３０分間攪拌した。溶液を透析可能
な物質がそれ以上存在しなくなるまで５０ ｍＭ酢酸塩
緩衝液ＣＰＨ５，５９）に対して透析した。
下記により調製された。大腸菌ＬＰＳ （大腸菌由来の
リポ多糖類、５０ ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）
２０ｄ中に希釈したもの）の２峯勺の溶液を、Ｋ１０４
４０μＭを含有する過ヨウ素酸塩溶液０．４ ｄと混合
した。この溶液を２５℃で４時間攪拌した。反応をエチ
レングリコール（０，４５ｍＭ）０．０２５ｄの添加に
より終結し、さらに３０分間攪拌した。溶液を透析可能
な物質がそれ以上存在しなくなるまで５０ ｍＭ酢酸塩
緩衝液ＣＰＨ５，５９）に対して透析した。
透析されたリポ多糖類を、ＢＳＡ ２７ｎｑ／ｎｔｌｆ
含有する等容量の水と混合した。溶液ｉＱ、ＩＮ−Ｎα
○ＨでｐＨ９に調整し、２５℃で１時間攪拌した。次い
で溶液を０．ｌＮ−ＨＧｄでｐＨ７，０に調整した。
含有する等容量の水と混合した。溶液ｉＱ、ＩＮ−Ｎα
○ＨでｐＨ９に調整し、２５℃で１時間攪拌した。次い
で溶液を０．ｌＮ−ＨＧｄでｐＨ７，０に調整した。
この溶液にルξノール１ｍグ／ゴを添加した。混合物を
３０分間攪拌し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ
−で濾過した。Ｆ液をＧ−２５セフアデツクスカラムに
導通して遊離ルミノールを除去した。各画分を大腸菌Ｏ
抗原（リポ多糖類）に対して特異的な抗体（固体支持体
上に固定化）に結合させ、固体支持体を塩基（ｏ、ＩＮ
−ＮαＯＨ）で覆って発光を活性化することによりア
ッセイした。発光は液体シンチレーション計数計により
前記と同じ方法で測定された。
３０分間攪拌し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ
−で濾過した。Ｆ液をＧ−２５セフアデツクスカラムに
導通して遊離ルミノールを除去した。各画分を大腸菌Ｏ
抗原（リポ多糖類）に対して特異的な抗体（固体支持体
上に固定化）に結合させ、固体支持体を塩基（ｏ、ＩＮ
−ＮαＯＨ）で覆って発光を活性化することによりア
ッセイした。発光は液体シンチレーション計数計により
前記と同じ方法で測定された。
実施例 １３
化学発光イムノアッセイ用の万能試薬の調製ニー・スロ
リアおよびディー・ペイン（７３巻、免疫化学技術、ジ
エイ・ジエイ・２ンコ゛ンおよびエッチ・７オン・ブナ
キス編、ニューヨーク・アカデミツク・プレス、１８３
−１９１頁（１９８１年））により記述された方法の変
法により蛋白質Ａ？ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結
合させた。ＢＳＡ ２．０■をｐＨ７，５のＰＢＳ ０
．２ｄに溶解し、次いでエタノールに溶解したＮ−スフ
レニルイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）（７００μｍ１／ｕｇ） ０．２ｍ
ｌと混合した。５ＰＤＰを攪拌しながら満願し、溶液を
その後２５℃でさらに３０分間時々攪拌した。
リアおよびディー・ペイン（７３巻、免疫化学技術、ジ
エイ・ジエイ・２ンコ゛ンおよびエッチ・７オン・ブナ
キス編、ニューヨーク・アカデミツク・プレス、１８３
−１９１頁（１９８１年））により記述された方法の変
法により蛋白質Ａ？ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結
合させた。ＢＳＡ ２．０■をｐＨ７，５のＰＢＳ ０
．２ｄに溶解し、次いでエタノールに溶解したＮ−スフ
レニルイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）（７００μｍ１／ｕｇ） ０．２ｍ
ｌと混合した。５ＰＤＰを攪拌しながら満願し、溶液を
その後２５℃でさらに３０分間時々攪拌した。
過剰の試薬お・よび低分子量の反応生成物を、ｐＨ７，
５のＰＢＳ中で平衡化したＧ−２５セフアデツクスでゲ
ル濾過することにより除去した。各画分を合わせて限外
濾過により０．３ｍＡ’に濃縮した。蛋白質Ａ１．４２
■および５ＰＤＰ （エタノール中７００〜／ａｔＪ）
０．０６ｍｌを用いて同様に蛋白質Ａを調製した。Ｇ
−２５でゲル濾過したのち各画分を合わせて０．３ｄに
濃縮した。
５のＰＢＳ中で平衡化したＧ−２５セフアデツクスでゲ
ル濾過することにより除去した。各画分を合わせて限外
濾過により０．３ｍＡ’に濃縮した。蛋白質Ａ１．４２
■および５ＰＤＰ （エタノール中７００〜／ａｔＪ）
０．０６ｍｌを用いて同様に蛋白質Ａを調製した。Ｇ
−２５でゲル濾過したのち各画分を合わせて０．３ｄに
濃縮した。
２−♂リジルジスルフィド基をジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）で最終濃度０．０５Ｍにおいて還元してＢＳＡの
チオール化生成物を得た。過剰のＤＴＴおよびピリジン
−２−チオンをＧ−２５ゲル濾過により除去した。チオ
ール化されたＢＳＡ、および２−ピリジルジスルフィド
９含有蛋白質Ａを２５℃で２０時間混合した。次いでル
ミノールを計合体に１１１１ｖｖｔｌの量添加し、前記
実施例１２に記載したように濾過し、そしてＧ−２５セ
フアデツクスカラム（４８ｍＪ）でゲル濾過した。
ＴＴ）で最終濃度０．０５Ｍにおいて還元してＢＳＡの
チオール化生成物を得た。過剰のＤＴＴおよびピリジン
−２−チオンをＧ−２５ゲル濾過により除去した。チオ
ール化されたＢＳＡ、および２−ピリジルジスルフィド
９含有蛋白質Ａを２５℃で２０時間混合した。次いでル
ミノールを計合体に１１１１ｖｖｔｌの量添加し、前記
実施例１２に記載したように濾過し、そしてＧ−２５セ
フアデツクスカラム（４８ｍＪ）でゲル濾過した。
特異的抗原に結合したガンマグロブリンを含有する固体
支持体に一定の画分のうち０．２ゴｅ添加することによ
り、蛋白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体の存在につ
き各画分を試験した（すなわちパーオキシダーゼおよび
抗パーオキシダーゼ抗体）。
支持体に一定の画分のうち０．２ゴｅ添加することによ
り、蛋白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体の存在につ
き各画分を試験した（すなわちパーオキシダーゼおよび
抗パーオキシダーゼ抗体）。
この両分を固体表面上で２５℃において３０分間インキ
ユヘートシ、未結合物質ｆ：ｐＨ７，４のＰＢＳで洗い
流した。固体支持体を０．Ｉ Ｎ−ＮａＯＨで覆い、発
光を測定することによって、その画分中の蛋白質Ａ −
ＢＳＡ−ルばノール結合体の存在を判定できる。
ユヘートシ、未結合物質ｆ：ｐＨ７，４のＰＢＳで洗い
流した。固体支持体を０．Ｉ Ｎ−ＮａＯＨで覆い、発
光を測定することによって、その画分中の蛋白質Ａ −
ＢＳＡ−ルばノール結合体の存在を判定できる。
実施例 １４
化学発光イムノアッセイにおける万能試薬の使用ヒト赤
血球（ＲＢＣ）をメタノールまたは酸固定（すなわち２
％酢酸）により顕微鏡用スライドに付着させた〔両方法
とも当技術分野で知られている〕。ＲＢＣ上の特異的抗
原部位に対する抗体を含有する疑いのある血清を、コー
ティングされたスライドの表面で室温において３０分な
いし２時間（または４℃で一夜）インキュベートした。
血球（ＲＢＣ）をメタノールまたは酸固定（すなわち２
％酢酸）により顕微鏡用スライドに付着させた〔両方法
とも当技術分野で知られている〕。ＲＢＣ上の特異的抗
原部位に対する抗体を含有する疑いのある血清を、コー
ティングされたスライドの表面で室温において３０分な
いし２時間（または４℃で一夜）インキュベートした。
次いでスライドをリン酸塩緩衝化食塩液（ＰＢＳ） （
ｐＨ７，４）でリンスして、未結合抗体を除去した。
ｐＨ７，４）でリンスして、未結合抗体を除去した。
上記実施例１３に記載した方法に従って調製した蛋白質
Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体を次いでＰＢＳ溶液（
ＰＨ７，４）中においてスライド表面に添加した。スラ
イド９を室温で３０分ないし２時間（または４℃で一夜
）インキュベートし、遊離試薬をＰＢＳ （ｐＨ７，４
）で洗い流した。次いでスライドに０．Ｉ Ｎ −Ｎα
ＯＨを流すことにより発光反応を誘発した。
Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体を次いでＰＢＳ溶液（
ＰＨ７，４）中においてスライド表面に添加した。スラ
イド９を室温で３０分ないし２時間（または４℃で一夜
）インキュベートし、遊離試薬をＰＢＳ （ｐＨ７，４
）で洗い流した。次いでスライドに０．Ｉ Ｎ −Ｎα
ＯＨを流すことにより発光反応を誘発した。
実施例 １５
食品中のねずみチフス菌の検出
ホモジナイズまたは液化した食品試料をガラススライド
の表面、またはバイアルもしくは試験管内に置いた。試
料を乾燥させ、次いで１０％緩衝化（ＰＨ７，４）ホル
マリンで固定した。試料スライＶｆｐＨ７，４のＰＢＳ
中で緩和に洗浄し、風乾した。
の表面、またはバイアルもしくは試験管内に置いた。試
料を乾燥させ、次いで１０％緩衝化（ＰＨ７，４）ホル
マリンで固定した。試料スライＶｆｐＨ７，４のＰＢＳ
中で緩和に洗浄し、風乾した。
スライド上の試料を次いで、ねずみチフス菌の１、相Ｉ
Ｈ抗原に対する工ｙＧ含有抗血清の１：１０００希釈液
で覆った。試料を３７℃の加湿された室内で１時間イン
キュベートした。未結合抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（ｐＨ７，４）で洗い流した。次いで試料をｐＨ７，６
のＰＢＳ中１０１０１ｌ１７ノ蛋白質Ａ −ＢＳＡ −
ルミノール結合体の溶液（前記実施例１３の方法に従っ
て調製）で覆った。試料を３７℃で３０分間インキユベ
ートシ、次いでｐＨ７，６のＰＢＳ中で洗浄して遊離蛋
白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノールを除去した。スライドを
風乾した。表面に０．Ｉ Ｎ −ＮａＯＨを流すことに
より試料を活性化し、化学発光を前記のように測定した
。
Ｈ抗原に対する工ｙＧ含有抗血清の１：１０００希釈液
で覆った。試料を３７℃の加湿された室内で１時間イン
キュベートした。未結合抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（ｐＨ７，４）で洗い流した。次いで試料をｐＨ７，６
のＰＢＳ中１０１０１ｌ１７ノ蛋白質Ａ −ＢＳＡ −
ルミノール結合体の溶液（前記実施例１３の方法に従っ
て調製）で覆った。試料を３７℃で３０分間インキユベ
ートシ、次いでｐＨ７，６のＰＢＳ中で洗浄して遊離蛋
白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノールを除去した。スライドを
風乾した。表面に０．Ｉ Ｎ −ＮａＯＨを流すことに
より試料を活性化し、化学発光を前記のように測定した
。
実施例 １６
肝炎Ｂ抗原の検出
原紙または酢酸セルロースディスクに、グルタルアルデ
ヒドにより十分な濃度で架橋してゲルを形成した蛋白質
ＡおよびＢＳＡを含浸した。ゲル生成前にゲル成分を含
有する溶液をフィルターディスク内へ押し込んだ。ゲル
化後にグリシン１００■を含有スるＰＢＳ（ＰＨ６，９
）１ｍでディスクを洗浄した。ディスクを除水し、−４
０℃のフリーザー内に使用時まで保存した。使用する時
点でディスクをＰＢＳ （ｐＨ７，４）中の抗体の１：
１０００希沢液中で４℃において一夜インキユベートす
ることにより、ディスクを抗肝炎Ｂ抗原抗体でコーティ
ングした。ＢＳＡ １％を含有するＰＢＳ（ｐＨ７，４
）中に２０回浸漬することによりディスクを洗浄した。
ヒドにより十分な濃度で架橋してゲルを形成した蛋白質
ＡおよびＢＳＡを含浸した。ゲル生成前にゲル成分を含
有する溶液をフィルターディスク内へ押し込んだ。ゲル
化後にグリシン１００■を含有スるＰＢＳ（ＰＨ６，９
）１ｍでディスクを洗浄した。ディスクを除水し、−４
０℃のフリーザー内に使用時まで保存した。使用する時
点でディスクをＰＢＳ （ｐＨ７，４）中の抗体の１：
１０００希沢液中で４℃において一夜インキユベートす
ることにより、ディスクを抗肝炎Ｂ抗原抗体でコーティ
ングした。ＢＳＡ １％を含有するＰＢＳ（ｐＨ７，４
）中に２０回浸漬することによりディスクを洗浄した。
ディスクは長期保存のため一７０℃で凍結乾燥するか、
または４℃で加湿しておくことができる。
または４℃で加湿しておくことができる。
血清または血漿（０，１ｄ）を肝炎Ｂ抗原の検出のため
ディスクに添加し、加湿した室内で３７℃において１時
間インキュベートした。次いでＰＢＳＣＰＨ７，４）に
２０回浸漬することによりディスクを洗浄した。この洗
浄ののちディスクを再び抗肝炎Ｂ抗原抗体と共に加湿さ
れた室内で３７℃において１時間インキュベートした。
ディスクに添加し、加湿した室内で３７℃において１時
間インキュベートした。次いでＰＢＳＣＰＨ７，４）に
２０回浸漬することによりディスクを洗浄した。この洗
浄ののちディスクを再び抗肝炎Ｂ抗原抗体と共に加湿さ
れた室内で３７℃において１時間インキュベートした。
再びディスクをｐＨ７，４のＰＢＳ中で洗浄した。最後
に前記実施例１３の記載と同様にして調製された蛋白質
Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体（０，１ｄ）をディス
クに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。デ
ィスクを再び未結合蛋白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノール不
含となるまで洗浄した。化学発光反応はディスクの表面
に０．ＩＮ −ＮａＯＨＱ、ｌ−を添加することにより
誘発され、放出された光をベータシンチレーション計数
計（アウトオブコインシデンスモードに調整）で測定し
た。
に前記実施例１３の記載と同様にして調製された蛋白質
Ａ −ＢＳＡ−ルミノール結合体（０，１ｄ）をディス
クに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。デ
ィスクを再び未結合蛋白質Ａ −ＢＳＡ−ルミノール不
含となるまで洗浄した。化学発光反応はディスクの表面
に０．ＩＮ −ＮａＯＨＱ、ｌ−を添加することにより
誘発され、放出された光をベータシンチレーション計数
計（アウトオブコインシデンスモードに調整）で測定し
た。
実施例 １７
アルコール含量のアッセイ
アルコール検出用のデヒドロゲナーゼ発光ゲル１ｄｌｆ
６Ｎ−（Ｎ−（６−アミノヘキシル〕カルバモイルメチ
ル］ −ＮＡＤ ’ｉ）アルコールデヒドロゲナーゼに
結合させることにより製造できる。この結合法はエム・
オー・マラソン、ピー・オー・ラルンンおヨヒケー・モ
スバッハ（８６，ヨーロピアン・ジャーナル・オズ・バ
イオケミストリー、４５５−４６３（１９７８））によ
り記述された方法の変法である。
６Ｎ−（Ｎ−（６−アミノヘキシル〕カルバモイルメチ
ル］ −ＮＡＤ ’ｉ）アルコールデヒドロゲナーゼに
結合させることにより製造できる。この結合法はエム・
オー・マラソン、ピー・オー・ラルンンおヨヒケー・モ
スバッハ（８６，ヨーロピアン・ジャーナル・オズ・バ
イオケミストリー、４５５−４６３（１９７８））によ
り記述された方法の変法である。
アルコールデヒドロゲナーゼについては、要約するとこ
の方法は下記のとおりである。
の方法は下記のとおりである。
（１）結合および生成物の精製は４℃で行う。
（２）５ｍＭのＮ６−（Ｎ −（６−７＜ ／ ヘキシ
ｋ ） カルバモイルメチル） −ＮＡＤ ｌ含有する
５０ｍＭ トＩＪエタノールアミン緩衝液（ＰＨ７，５
） １．３−に精製したウマ肝臓アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（５■）を添加する。
ｋ ） カルバモイルメチル） −ＮＡＤ ｌ含有する
５０ｍＭ トＩＪエタノールアミン緩衝液（ＰＨ７，５
） １．３−に精製したウマ肝臓アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（５■）を添加する。
（３） 結合試薬である″塩酸１−エチルー３−（３
−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド１および
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをそれぞれ最終濃度５０
ｍＭおよび２５ ｍＭとなるように添加する。
−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド１および
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをそれぞれ最終濃度５０
ｍＭおよび２５ ｍＭとなるように添加する。
（４）上記のカルボシイハトは４等分して１２時間毎に
添加し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２等分して０時
間口および１２時時間口供給する。
添加し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２等分して０時
間口および１２時時間口供給する。
（５） 合計４８時間の結合時間ののち（途中でＮ
ａＯＨによりｐＨを７．５に調整する）、グリシン緩衝
液（ＰＨ７．５）ｔ”添加して最終濃度Ｏ、ＩＭとなし
、残存力ルポジイミビまたは活性化されたカルボキシル
基と反応させる。
ａＯＨによりｐＨを７．５に調整する）、グリシン緩衝
液（ＰＨ７．５）ｔ”添加して最終濃度Ｏ、ＩＭとなし
、残存力ルポジイミビまたは活性化されたカルボキシル
基と反応させる。
（６）次いで反応液を０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ＰＨ７．５）中の０．０ ５ Ｍグリシン（３１
ずつ３回交換）に対して１５時間透析する。
衝液（ＰＨ７．５）中の０．０ ５ Ｍグリシン（３１
ずつ３回交換）に対して１５時間透析する。
（力 次いで反応液を、０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液Ｃ
ＰＨ ７． ５ ）で平衡化したセファクリル（Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ （ファルマシア）のカラム
（１×９５ｃｒｒＬ）に施す。蛋白質含有画分を合わせ
て、炭酸水素塩緩衝液４１に対して一夜透析する。
ＰＨ ７． ５ ）で平衡化したセファクリル（Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ （ファルマシア）のカラム
（１×９５ｃｒｒＬ）に施す。蛋白質含有画分を合わせ
て、炭酸水素塩緩衝液４１に対して一夜透析する。
アルコールデヒビロゲナーゼーＮＡＤ複合体Ｏ．３１ｎ
ｇ’ｒワサビダイ、コンパ−オキシダーゼ（ＨＲＰ）１
０■およびＢＳＡ−ルミノール複合体３０■と混合した
。この調製液は前記実施例１の方法により、ただし実施
例１の調製液のヘモグロビンの代わりにＨＲＰを用いて
調製された。この溶液に２５％グルタルアルデヒド２０
μｌ／ｙｔｔｌを添加した。
ｇ’ｒワサビダイ、コンパ−オキシダーゼ（ＨＲＰ）１
０■およびＢＳＡ−ルミノール複合体３０■と混合した
。この調製液は前記実施例１の方法により、ただし実施
例１の調製液のヘモグロビンの代わりにＨＲＰを用いて
調製された。この溶液に２５％グルタルアルデヒド２０
μｌ／ｙｔｔｌを添加した。
この溶液１”紙に吸収させた（あるいはプラスチック製
もしくは酸洗浄したガラス製スライド、カバーガラス上
に、または１０Ｘ５０ｍ＋ａの試験管の内側に広げた）
。この溶液を加湿された室内で４℃に一夜放置し、不活
性支持体上にゲル被膜を形成させた。エタノールを含有
する試料をこのゲルに添加したところ化学発光反応が起
こった。この反応の強さは試料中のアルコール濃度と正
比例していた。既知のエタノール濃度の溶液を多数調製
し、これらの溶液をゲルの表面に添加し、放出された光
を測定することによって標準曲線をプロットした。この
ために、５０μＭ〜１０ｍＭの量のエタノールを０．２
Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ ８．０ ）中に７綱のラクト
アルデヒドを含有する溶液に添加し、各溶液をゲルの表
面に３０℃で添加した。
もしくは酸洗浄したガラス製スライド、カバーガラス上
に、または１０Ｘ５０ｍ＋ａの試験管の内側に広げた）
。この溶液を加湿された室内で４℃に一夜放置し、不活
性支持体上にゲル被膜を形成させた。エタノールを含有
する試料をこのゲルに添加したところ化学発光反応が起
こった。この反応の強さは試料中のアルコール濃度と正
比例していた。既知のエタノール濃度の溶液を多数調製
し、これらの溶液をゲルの表面に添加し、放出された光
を測定することによって標準曲線をプロットした。この
ために、５０μＭ〜１０ｍＭの量のエタノールを０．２
Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ ８．０ ）中に７綱のラクト
アルデヒドを含有する溶液に添加し、各溶液をゲルの表
面に３０℃で添加した。
実施例 １８
ＮＡＤＨ含量の測定による生存細菌のアッセイメトヘモ
グロビンレダクターゼ（ １１ｎｖＬｌ）およびチトク
ロームｂｓ （ ＩＩＱ’／ｍ）を前記実施例１３に記
載したと同様な方法によりＳＰＤＰと結合させた。
グロビンレダクターゼ（ １１ｎｖＬｌ）およびチトク
ロームｂｓ （ ＩＩＱ’／ｍ）を前記実施例１３に記
載したと同様な方法によりＳＰＤＰと結合させた。
この方法における唯一の差は、実施例１３に記載した方
法における蛋白質Ａの代わりにメトヘモグロビンレダク
ターゼを用いた点である。セファデックスＧ−２５ゲル
濾過ののち、チトクロームｂ５を含有する画分（吸光分
光分析により測定した波長４ ０ ５ ｎｍの光の吸収
に基づく）を合わせた。これらの画分を限外濾過により
濃縮し、蛋白質溶液１ゴを得た。この濃縮液を， ＢＳ
Ａ−ルミノール複合体３０７９／ｄおよびヘモグロビン
１１り〜を含有するＰＨ６．９のＰＢ８９ｍ７に添加し
た。次いで二官能性結合剤グルタルアルデヒド（２５％
グルタルアルデヒド２０μｌ／ｌｒｔｌ）ｋ溶液に攪拌
混入した。チトクロームｂ５ １２ ５℃でＢＳＡ−ル
ミノール複合体に添加された鉄−エチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ） ０．５マイクロモル／−で置き換
えてもよい。
法における蛋白質Ａの代わりにメトヘモグロビンレダク
ターゼを用いた点である。セファデックスＧ−２５ゲル
濾過ののち、チトクロームｂ５を含有する画分（吸光分
光分析により測定した波長４ ０ ５ ｎｍの光の吸収
に基づく）を合わせた。これらの画分を限外濾過により
濃縮し、蛋白質溶液１ゴを得た。この濃縮液を， ＢＳ
Ａ−ルミノール複合体３０７９／ｄおよびヘモグロビン
１１り〜を含有するＰＨ６．９のＰＢ８９ｍ７に添加し
た。次いで二官能性結合剤グルタルアルデヒド（２５％
グルタルアルデヒド２０μｌ／ｌｒｔｌ）ｋ溶液に攪拌
混入した。チトクロームｂ５ １２ ５℃でＢＳＡ−ル
ミノール複合体に添加された鉄−エチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ） ０．５マイクロモル／−で置き換
えてもよい。
生成するゲルを用いて７紙を飽和し、ガラス製もしくは
プラスチック製スライドをコーティングし、または自由
な状態のゲルとした。ゲルを蒸留水で浸漬により、また
はガラス濾過器上で洗浄した。
プラスチック製スライドをコーティングし、または自由
な状態のゲルとした。ゲルを蒸留水で浸漬により、また
はガラス濾過器上で洗浄した。
自由な状態のゲルは組織粉砕機によりその１０倍容量の
蒸留水中で摩砕した。ゲルを蒸留水中で懸濁および遠心
分離（３００Ｘｇ、１０分間）により３回洗浄した。ゲ
ルを２５〜５０℃に加熱し、各温度において放出される
光の号を記録し、次いで温度対発光をプロットすること
により、標準の熱化学発光プロットが得られた。この操
作をｐＨ ７． ５のリン酸塩緩衝液中５０ｎＭ〜１０
ｍＭの範囲の濃度のＮＡＤＨを含む懸濁液またはコーテ
イング液中で、新鮮なゲルを用いて反復した。一定の温
度における熱化学発光の増大は、ＮＡＤＨ９度に比例す
る。
蒸留水中で摩砕した。ゲルを蒸留水中で懸濁および遠心
分離（３００Ｘｇ、１０分間）により３回洗浄した。ゲ
ルを２５〜５０℃に加熱し、各温度において放出される
光の号を記録し、次いで温度対発光をプロットすること
により、標準の熱化学発光プロットが得られた。この操
作をｐＨ ７． ５のリン酸塩緩衝液中５０ｎＭ〜１０
ｍＭの範囲の濃度のＮＡＤＨを含む懸濁液またはコーテ
イング液中で、新鮮なゲルを用いて反復した。一定の温
度における熱化学発光の増大は、ＮＡＤＨ９度に比例す
る。
試料中の生存細菌細胞の数を測定するために、細胞をま
ず当技術分野で既知の方法により界面活性剤を用いて細
胞溶解し、溶解した細胞を含有する溶液をゲルに添加し
た。放出されるＮＡＤＨの量はその前に試料中に存在し
ていた生存細胞の数に直接依存する。従って化学発光反
応により放出される光の量は試料中にその前に存在して
いた生存細胞の数に比例する。
ず当技術分野で既知の方法により界面活性剤を用いて細
胞溶解し、溶解した細胞を含有する溶液をゲルに添加し
た。放出されるＮＡＤＨの量はその前に試料中に存在し
ていた生存細胞の数に直接依存する。従って化学発光反
応により放出される光の量は試料中にその前に存在して
いた生存細胞の数に比例する。
以上の実施例は本発明の現在好ましい実施態様を説明す
るためのものであり、限定ではない。
るためのものであり、限定ではない。
第１図は架橋したヘモグロビン−ウシ血清アミブばン（
ＢＳＡ）−ルミノールゲル（１：１０希釈）の熱化学発
光を示すグラフである。 第２図はワサビダイコン、６−オキシダーゼ−ウシ血清
アルブミン−ルミノールで標識された多様な種の赤血球
の熱化学発光を示すグラフである。 ・＝ランビレースーデュロック交配ブタの細胞０＝小型
ブタの細胞 口＝スプラークービーレイラットのｉＦａ胞１＝ヒト赤
血球 □＝ラント９レースーデュロックのデータに関する回帰
線 一一−−−＝ラットのデータに関する回帰線−−−−−
−＝小型ブタ上ヒトのデータに関する回帰線第３図はボ
ーラント５−チャイナブタから得た赤血球（ＲＢＣ）の
熱化学発光を示すグラフである。 Ｏ＝ルミノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および
ワサビダイコンパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した
ＦｔＢＣ ・＝ ＢＳＡ オ、１：びＨＲＰテ標識ＬりＷ２Ｃ口；
グルタルアルデヒドで処理したＲＢＧ第４図はルミノー
ル−ＢＳＡ −ＨＲＰで標識したヒト赤血球（ＦｔＢＣ
）の熱化学発光を示すグラフである。 ■＝正常なヒトＲＢＣ Ｏ＝ハロタン暴露した正常ＲＢＧ ・＝１−クロル−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ
）で処理したＲＢＧ 口＝ハロタンに暴露したＣＤＮＢ処理ＷＢＣ第５図はハ
ロタン暴露がルミノールおよびＨＲＰで標識したランド
レースーデュロック交配ブタ由来赤血球の熱化学発光に
与える影＃を示すグラフである（１００〜グリシン下の
コンカナバリンＡ）。 ・＝未処理のブタ赤血球 ローハロタン暴露したブタ赤血球 第６図は、吸着されたルばノールを含有する架橋したコ
ンカナバリンＡおよびＢＳＡの溶液を装填したＧ−２５
セフアデツクスカラムからの画分の化学発光を示すグラ
フである。 第７図はあらがじめ抗原で感作されたマウスから得た肺
細胞の化学発光を示すグラフである。 閣＝対照群 Ｏ＝感作の２日後に検査された細胞 口＝感作の４日後に検査された細胞 第６図 ｘｔｏｏ。 フラクション番号 第７図 時間（分） 手続補正書（方式） 昭和 ６１年 ２月グ日 昭和６Ｑ年＞＊ｉ＊願第 ２０？Ｓ’７３ 号６、補正
をする者 事件との関係 出 願 人 住所 へ ＠） ン°°！ナサン・エル゛斗−−レ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和Ａｔ年 ７月 ４日（発送
日）６、補正の対象
ＢＳＡ）−ルミノールゲル（１：１０希釈）の熱化学発
光を示すグラフである。 第２図はワサビダイコン、６−オキシダーゼ−ウシ血清
アルブミン−ルミノールで標識された多様な種の赤血球
の熱化学発光を示すグラフである。 ・＝ランビレースーデュロック交配ブタの細胞０＝小型
ブタの細胞 口＝スプラークービーレイラットのｉＦａ胞１＝ヒト赤
血球 □＝ラント９レースーデュロックのデータに関する回帰
線 一一−−−＝ラットのデータに関する回帰線−−−−−
−＝小型ブタ上ヒトのデータに関する回帰線第３図はボ
ーラント５−チャイナブタから得た赤血球（ＲＢＣ）の
熱化学発光を示すグラフである。 Ｏ＝ルミノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および
ワサビダイコンパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した
ＦｔＢＣ ・＝ ＢＳＡ オ、１：びＨＲＰテ標識ＬりＷ２Ｃ口；
グルタルアルデヒドで処理したＲＢＧ第４図はルミノー
ル−ＢＳＡ −ＨＲＰで標識したヒト赤血球（ＦｔＢＣ
）の熱化学発光を示すグラフである。 ■＝正常なヒトＲＢＣ Ｏ＝ハロタン暴露した正常ＲＢＧ ・＝１−クロル−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ
）で処理したＲＢＧ 口＝ハロタンに暴露したＣＤＮＢ処理ＷＢＣ第５図はハ
ロタン暴露がルミノールおよびＨＲＰで標識したランド
レースーデュロック交配ブタ由来赤血球の熱化学発光に
与える影＃を示すグラフである（１００〜グリシン下の
コンカナバリンＡ）。 ・＝未処理のブタ赤血球 ローハロタン暴露したブタ赤血球 第６図は、吸着されたルばノールを含有する架橋したコ
ンカナバリンＡおよびＢＳＡの溶液を装填したＧ−２５
セフアデツクスカラムからの画分の化学発光を示すグラ
フである。 第７図はあらがじめ抗原で感作されたマウスから得た肺
細胞の化学発光を示すグラフである。 閣＝対照群 Ｏ＝感作の２日後に検査された細胞 口＝感作の４日後に検査された細胞 第６図 ｘｔｏｏ。 フラクション番号 第７図 時間（分） 手続補正書（方式） 昭和 ６１年 ２月グ日 昭和６Ｑ年＞＊ｉ＊願第 ２０？Ｓ’７３ 号６、補正
をする者 事件との関係 出 願 人 住所 へ ＠） ン°°！ナサン・エル゛斗−−レ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和Ａｔ年 ７月 ４日（発送
日）６、補正の対象
Claims (201)
- （１）電離線検出装置において、発光物質；血清アルブ
ミン、 該発光物質は該血清アルブミンと非共有的に結合して、
発光物質−血清アルブミン複合体を形成する； 二官能性架橋剤；及び 不溶性支持マトリックス 該発光物質−血清アルブミン複合体が該二官能性架橋剤
中の不溶性支持マトリックス上で架橋している から成る装置。 - （２）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピル
ベート、インドールプロピオン酸、インドール酢酸、イ
ンドールピルベート、トリプトファン、Ｎ−アセチルト
リプトファン、及びその他のトリプトファン誘導体から
選択する特許請求の範囲第１項記載の装置。 - （３）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求の
範囲第１項記載の装置。 - （４）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲第
１項記載の装置。 - （５）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カル
ボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジル
−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから成
る群から選択する特許請求の範囲第１項記載の装置。 - （６）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドである
特許請求の範囲第１項記載の装置。 - （７）次の要素： ヘム蛋白質、血清アルブミン及び発光物質から成る共役
体であって、該発光物質が該血清アルブミンに非共有結
合している共役体； 二官能性架橋剤；及び 不溶性支持マトリックス から成る電離線検出装置であって、該共役体が該二官能
性架橋剤中の該不溶性支持マトリックス上で架橋してい
る装置。 - （８）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピル
ベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファン
、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン誘
導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸から
成る群から選択する特許請求の範囲第７項記載の装置。 - （９）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求の
範囲第７項記載の装置。 - （１０）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第７項記載の装置。 - （１１）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン及
びペルオキシダーゼから成る群から選択する特許請求の
範囲第７項記載の装置。 - （１２）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カ
ルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジ
ル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第７項記載の装置。 - （１３）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドであ
る特許請求の範囲第７項記載の装置。 - （１４）ヘム蛋白質、発光物質及び血清アルブミンから
成る共役体を含有する電離線検出用組成物であつて、該
発光物質が該血清アルブミンに非共有結合しており、該
共役体が二官能性架橋剤中で架橋してゲルを形成してい
る組成物。 - （１５）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン
誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸か
ら成る群から選択する特許請求の範囲第１４項記載の組
成物。 - （１６）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第１４項記載の組成物。 - （１７）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第１４項記載の組成物。 - （１８）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カ
ルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジ
ル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第１４項記載の組成
物。 - （１９）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドであ
る特許請求の範囲第１４項記載の組成物。 - （２０）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン、
及びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求
の範囲第１４項記載の組成物。 - （２１）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求の
範囲第１４項記載の組成物。 - （２２）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許請
求の範囲第１４項記載の組成物。 - （２３）ヘモグロビン、ルミノール及び血清アルブミン
から成る共役体を含有する電離線検出用組成物であつて
、該ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合してお
り、該ヘモグロビンは該血清アルブミンに結合しており
、該共役体がグルタールアルデヒド中で架橋してゲルを
形成している組成物。 - （２４）パーオキシダーゼ、ルミノール及び血清アルブ
ミンから成る共役体を含有する電離線検出用組成物であ
つて、該ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合し
、該パーオキシダーゼが該血清アルブミンに結合し、該
共役体がグルタールアルデヒド中で架橋してゲルを形成
する組成物。 - （２５）発光物質、ヘム蛋白質及び血清アルブミンを、
該血清アルブミンと該発光物質との非共有結合を促進す
るような条件下で混合してヘム蛋白質−血清アルブミン
−発光物質共役体を形成し； 該共役体を二官能性架橋剤と接触させてゲルを形成し； 該ゲルを電離線の可能な発生源に暴露する ことから成る電離線検出方法。 - （２６）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン
誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸か
ら成る群から選択する特許請求の範囲第２５項記載の方
法。 - （２７）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第２５項記載の方法。 - （２８）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第２５項記載の方法。 - （２９）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン及
びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求の
範囲第２５項記載の方法。 - （３０）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求の
範囲第２５項記載の方法。 - （３１）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許請
求の範囲第２５項記載の方法。 - （３２）該ゲルを不溶性支持マトリックスに塗布する特
許請求の範囲第２５項記載の方法。 - （３３）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カ
ルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジ
ル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第２５項記載の方法
。 - （３４）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドであ
る特許請求の範囲第２５項記載の方法。 - （３５）ルミノール、パーオキシダーゼ及び血清アルブ
ミンを、該血清アルブミンと該パーオキシダーゼとの結
合及び該血清アルブミンと該ルミノールとの非共有結合
を促進するような条件下で混合してパーオキシダーゼ−
血清アルブミン−ルミノール共役体を形成する； 該共役体をグルタールアルデヒドと接触させてゲルを形
成する；及び 該ゲルを電離性放射線の考えられる発生源に暴露する ことから成る電離性放射線検出方法。 - （３６）細胞サンプルを放射標識する； 該細胞サンプルを非共有結合した血清アルブミン−発光
物質複合体と接触させる； 該細胞サンプルをフィルム・エマルジョンと接触させる
；次に 該細胞サンプルの写真像を現像する ことから成る電離線検出方法。 - （３７）該細胞を、＾３Ｈ、＾１＾４Ｃ、＾２＾４Ｎａ
、＾３＾２Ｐ、＾３＾５Ｓ、＾４＾０Ｋ、＾４＾５Ｃａ
、＾５＾１Ｃｒまたは＾１＾３＾１Ｉから成る群から選
択した放射性同位元素で標識する特許請求の範囲第３６
項記載の方法。 - （３８）該細胞を＾３Ｈで標識する特許請求の範囲第３
６項記載の方法。 - （３９）該発光物質を、ルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第３６項記載の
方法。 - （４０）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第３６項記載の方法。 - （４１）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第３６項記載の方法。 - （４２）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カ
ルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジ
ル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第３６項記載の方法
。 - （４３）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドであ
る特許請求の範囲第３６項記載の方法。 - （４４）過酸化物性損傷を受けたと考えられる生活細胞
を、発光物質が血清アルブミンに非共有結合している発
光物質と血清アルブミンから成る複合体と接触させる； 該細胞を還元剤と接触させる； 該複合体から該細胞と結合していない複合体を除去する
； 発光反応を誘発する；及び 放出される光量を測定する ことから成る、生活細胞に対する過酸化物性損傷の測定
方法。 - （４５）該還元剤がホウ水素化カリウムである特許請求
の範囲第４４項記載の方法。 - （４６）の該発光反応が該細胞と塩基との接触によつて
誘発される特許請求の範囲第４４項記載の方法。 - （４７）該発光物質を、ルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第４４項記載の
方法。 - （４８）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第４４項記載の方法。 - （４９）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第４４項記載の方法。 - （５０）該共役体が極性溶媒に可溶である特許請求の範
囲第４４項記載の方法。 - （５１）該方法を実質的に生理学的ｐＨにおいて行う特
許請求の範囲第４４項記載の方法。 - （５２）該細胞を該共役体及び該還元剤に接触させる前
に、不溶性支持マトリックスに固定化する特許請求の範
囲第５０項記載の方法。 - （５３）過酸化物性損傷を受けたと考えられる生活細胞
を、ヘム蛋白質、ポリアミノ化合物、発光物質及び血清
アルブミンから成り該発光物質が該血清アルブミンに非
共有結合している共役体に接触させる； 該細胞を還元剤と接触させる； 該細胞と結合していない該共役体を除去する；及び 該細胞を加熱する ことから成る、生活細胞に対する過酸化物性損傷の検出
方法。 - （５４）該共役体が極性溶媒に可溶である特許請求の範
囲第５３項記載の方法。 - （５５）該方法を実質的に生理学的ｐＨにおいて行う特
許請求の範囲第５４項記載の方法。 - （５６）該細胞を該共役体及び該還元剤に接触させる前
に、不溶性支持マトリックスに固定化する特許請求の範
囲第５５項記載の方法。 - （５７）該還元剤がホウ水素化カリウムである特許請求
の範囲第５３項記載の方法。 - （５８）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン
誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸か
ら成る群から選択する特許請求の範囲第５３項記載の方
法。 - （５９）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第５３項記載の方法。 - （６０）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第５３項記載の方法。 - （６１）該共役体を二官能性架橋剤によつて架橋して、
可溶性共役体を形成する特許請求の範囲第５３項記載の
方法。 - （６２）該ポリアミノ化合物がリシンである特許請求の
範囲第５３項記載の方法。 - （６３）該ポリアミノ化合物を、リシン、スペルミジン
、プトレッシン、ヘキセンジアミン及びエチレンジアミ
ンから成る群から選択する特許請求の範囲第５３項記載
の方法。 - （６４）ヘム蛋白質、ポリアミノ化合物、発光物質及び
血清アルブミンから成る、細胞の過酸化物損傷の検出・
量化用組成物であつて、該発光物質が該血清アルブミン
と非共有結合して、ポリアミノ化合物−ヘム蛋白質−血
清アルブミン共役体を形成する組成物。 - （６５）該共役体を二官能性架橋剤によつて架橋する特
許請求の範囲第６４項記載の組成物。 - （６６）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ンと他のトリプトファン誘導体、インドールプロピオン
酸及びインドール酢酸から成る群から選択する特許請求
の範囲第６４項記載の組成物。 - （６７）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第６４項記載の組成物。 - （６８）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第６４項記載の組成する。 - （６９）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン及
びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求の
範囲第６４項記載の組成物。 - （７０）該ポリアミノ化合物をリシン、スペルミジン、
プトレッシン、ヘキセンジアミン及びエチレンジアミン
から成る群から選択する特許請求の範囲第６４項記載の
組成物。 - （７１）該ポリアミノ化合物がリシンである特許請求の
範囲第６４項記載の組成物。 - （７２）発光物質、ヘム蛋白質及び血清アルブミンから
成る熱化学発光分析用組成物であつて、該発光物質が該
血清アルブミンに非共有結合している組成物。 - （７３）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチル−トリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第７２項記載の
組成物。 - （７４）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第７２項記載の組成物。 - （７５）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第７２項記載の組成物。 - （７６）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン及
びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求の
範囲第７２項記載の組成物。 - （７７）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求の
範囲第７２項記載の組成物。 - （７８）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許請
求の範囲第７２項記載の組成物。 - （７９）次の要素： 発光物質 ルミノール誘導体、フェノールピルベート、インドール
−３−ピルベート、ドリフトフェン、Ｎ−アセチルトリ
プトファンと他のトリプトファン誘導体、インドールプ
ロピオン酸及びインドール酢酸から選択される； 血清アルブミン 該発光物質と非共有的に結合する； ヘム蛋白質 ヘモグロビン、ミオグロビンまたはパーオキシダーゼか
ら成る群から選択されたものであり、該血清アルブミン
に結合する から成る複合体を含有する熱化学発光アッセイ用組成物
。 - （８０）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第７９項記載の組成物。 - （８１）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第７９項記載の組成物。 - （８２）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求の
範囲第７９項記載の組成物。 - （８３）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許請
求の範囲第７９項記載の組成物。 - （８４）ルミノール、パーオキシダーゼ及び血清アルブ
ミンから成る熱化学発光アッセイ用組成物であつて、該
ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合している組
成物。 - （８５）ヘム蛋白質、発光物質及び血清アルブミンから
成る熱検出用組成物であつて、該発光物質が該血清アル
ブミンに非共有結合して、共役体を形成し、該共役体が
二官能性架橋剤によつて架橋してゲルを形成する組成物
。 - （８６）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン
誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸か
ら成る群から選択する特許請求の範囲第８５項記載の組
成物。 - （８７）該発光物質がルミノール誘導体である特許請求
の範囲第８５項記載の組成物。 - （８８）該発光物質がルミノールである特許請求の範囲
第８５項記載の組成物。 - （８９）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、カ
ルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミジ
ルー３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第８５項記載の組成
物。 - （９０）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドであ
る特許請求の範囲第８５項記載の組成物。 - （９１）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン及
びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求の
範囲第８５項記載の組成物。 - （９２）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求の
範囲第８５項記載の組成物。 - （９３）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許請
求の範囲第８５項記載の組成物。 - （９４）該ヘム蛋白質が該血清アルブミンに結合してい
る特許請求の範囲第８５項記載の組成物。 - （９５）ヘモグロビン、ルミノール及び血清アルブミン
から成る共役体を含有する熱検出用組成物であつて、該
ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合し、該ヘモ
グロビンが該血清アルブミンに結合し、該共役体がグル
タールアルデヒド中で架橋してゲルを形成している組成
物。 - （９６）パーオキシダーゼ、ルミノール及び血清アルブ
ミンから成る共役体を含有する熱検出用組成物であつて
、該ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合し、該
パーオキシダーゼが該血清アルブミンに結合し、該共役
体がグルタールアルデヒド中で架橋してゲルを形成して
いる組成物。 - （９７）発光物質、ヘム蛋白質及び血清アルブミンを、
該血清アルブミンと該発光物質との非共有結合を促進す
るような条件下で混合して、ヘム蛋白質一血清アルブミ
ン−発光物質共役体を形成する； 該共役体を二官能性架橋剤に接触させてゲルを形成する
；及び 該ゲルを考えられる熱発生源に暴露する ことから成る熱検出方法。 - （９８）該ゲルを約４℃〜約２５℃の温度において形成
する特許請求の範囲第９７項記載の方法。 - （９９）該発光物質をルミノール誘導体、フェノールピ
ルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトファ
ン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファン
誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸か
ら成る群から選択する特許請求の範囲第９７項記載の方
法。 - （１００）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第９７項記載の方法。 - （１０１）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第９７項記載の方法。 - （１０２）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン
及びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求
の範囲第９７項記載の方法。 - （１０３）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求
の範囲第９７項記載の方法。 - （１０４）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許
請求の範囲第９７項記載の方法。 - （１０５）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、
カルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミ
ジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートか
ら成る群から選択する特許請求の範囲第９７項記載の方
法。 - （１０６）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドで
ある特許請求の範囲第９７項記載の方法。 - （１０７）該ゲルを不溶性支持マトリックスに塗布する
特許請求の範囲第９７項記載の方法。 - （１０８）ルミノール、パーオキシダーゼ及び血清アル
ブミンを、該血清アルブミンと該パーオキシダーゼとの
結合及び該血清アルブミンと該ルミノールとの非共有結
合を促進するような条件下で混合してパーオキシダーゼ
−血清アルブミンールミノール共役体を形成する； 該共役体をグルタールアルデヒドと接触させてゲルを形
成する；及び 該ゲルを考えられる熱発生源に暴露する ことから成る熱検出方法。 - （１０９）ヘム蛋白質、血清アルブミン及び発光物質か
ら成り、該発光物質が該血清アルブミンと非共有結合し
ている共役体を含有し、 該共役体が二官能性架橋剤によつて架橋してゲルを形成
しており、 該ゲルが不溶性支持マトリックス上で形成されている ことから成る熱検出用装置。 - （１１０）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第１０９項記載
の装置。 - （１１１）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１０９項記載の装置。 - （１１２）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１０９項記載の装置。 - （１１３）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン
及びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求
の範囲第１０９項記載の装置。 - （１１４）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、
カルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミ
ジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートか
ら成る群から選択する特許請求の範囲第１０９項記載の
装置。 - （１１５）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドで
ある特許請求の範囲第１０９項記載の装置。 - （１１６）液体中で、リガンドと抗リガンドから成る特
定結合対の要素であるリガンドの存在を調べる化学発光
アッセイ法において 発光物質、特定抗リガンド及び血清アルブミンを、該血
清アルブミンと該発光物質との非共有結合を促進する条
件下で混合して、可溶な抗リガンド−血清アルブミン−
発光物質共役体を形成する； 該抗リガンドとともに、リガンドと抗リガンドから成る
特定結合対の要素をなすリガンドの存在が疑われる溶液
と該共役体とを接解させる；非結合リガンドを除去する
；及び 発光反応を誘発する ことから成るアッセイ法。 - （１１７）該リガンドが基質または、特定基質に対して
特異的な酵素のいずれかであり、該抗リガンドが該基質
に対して特異的な酵素または該特定基質のいずれかであ
る特許請求の範囲第１１６項記載のアッセイ法。 - （１１８）該リガンドが抗原または特定抗原に対して特
異的な抗体のいずれかであり、該抗リガンドが該抗原に
対して特異的な抗体または該特定抗原のいずれかである
特許請求の範囲第１１６項記載のアッセイ法。 - （１１９）該共役体が付加的にヘム蛋白質を含有し、該
発光反応加熱によつて誘発される特許請求の範囲第１１
６項記載のアッセイ法。 - （１２０）該リガンドが塩基によつて結合している該共
役体を接触させることによつて、該発光反応が誘発され
る特許請求の範囲第１１６項記載のアッセイ法。 - （１２１）該塩基が水酸化ナトリウムである特許請求の
範囲第１２０項記載のアッセイ法。 - （１２２）該共役体を、該リガンドを含むと考えられる
該液体と接触させる前に固定化する特許請求の範囲第１
１６項記載のアッセイ法。 - （１２３）該共役体を二官能性架橋剤によつて固定化す
る特許請求の範囲第１２２項記載のアッセイ法。 - （１２４）該共役体を、該リガンドの存在が疑われる液
体と接触させた後に固定化する特許請求の範囲第１１６
項記載のアッセイ法。 - （１２５）該共役体を二官能性架橋剤によつて固定化す
る特許請求の範囲第１２４項記載のアッセイ法。 - （１２６）該リガンドを固定化する特許請求の範囲第１
１６項記載のアッセイ法。 - （１２７）該リガンドを不溶性支持マトリックスとの結
合によつて固定化する特許請求の範囲第１２６項記載の
分析。 - （１２８）基質の破壊がデヒドロゲナーゼによつて触媒
される基質検出方法において、 発光物質、特定基質に対して特異的なデヒドロゲナーゼ
及び血清アルブミンを、該デヒドロゲナーゼと該血清ア
ルブミンとの結合及び該発光物質と該血清アルブミンと
の非共有結合を促進するような条件下で、混合してデヒ
ドロゲナーゼ−血清アルブミン−発光物質共役体を形成
する； 二官能性架橋剤と酸化型ヌクレオチド補因子を含む溶液
に該共役体を接触させてゲルを形成する； 該ゲルを該特定基質の存在が疑われるサンプルと接触さ
せる；及び 発光反応を誘発する ことから成る方法。 - （１２９）該共役体がさらにヘム蛋白質を含み、該発光
反応が熱によつて誘発される特許請求の範囲第１２８項
記載の方法。 - （１３０）該発光反応が該ゲルと塩基の接触によつて誘
発される特許請求の範囲第１２８項記載の方法。 - （１３１）ヘム蛋白質、発光物質及び血清アルブミンか
ら成る共役体を含有する、特定結合対の要素である特定
分析物の化学発光アッセイ用組成物であつて、該発光物
質が該血清アルブミンに共有結合しており、該共役体が
二官能性架橋剤中で架橋している組成物。 - （１３２）該発光物質は、ルミノール誘導体、フェノー
ルピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプト
ファン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトフ
ァン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢
酸から成る群から選択する特許請求の範囲第１３１項記
載の組成物。 - （１３３）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１３１項記載の組成物。 - （１３４）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１３１項記載の組成物。 - （１３５）抗原と抗体から成る特定結合対の要素である
抗原を液体中で検出するアッセイ法において、 検出することが望ましい抗原の第一決定基に対して特異
的な第一抗体を不溶性支持マトリックスに結合させる； 検出することが望ましい抗原の存在が疑われる液体に該
第一抗体を接触させる； 該抗原上の第二決定基に対して特異的な抗体、血清アル
ブミン及び発光物質から成り、該発光物質が該血清アル
ブミンに非共有結合している共役体を該第一抗体に結合
した抗原に、該共役体の該第二抗体と該抗原との結合を
促進する条件下で接触させる；及び 発光反応を誘発させる ことから成るアッセイ法。 - （１３６）不溶性支持マトリックスが不活性ポリマーか
ら成る特許請求の範囲第１３５項記載のアッセイ法。 - （１３７）該不活性ポリマーが架橋した蛋白質である特
許請求の範囲第１３６項記載のアッセイ法。 - （１３８）該第一抗体が蛋白質Ａに結合しており、該蛋
白質Ａが不溶性支持マトリックスに結合している特許請
求の範囲第１３５項記載のアッセイ法。 - （１３９）該不溶性支持マトリックスが多糖から成る特
許請求の範囲第１３８項記載の分析。 - （１４０）該発光反応を誘発する前に、非結合共役体を
除去する特許請求の範囲第１３５項記載の分析。 - （１４１）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第１３５項記載
のアッセイ法。 - （１４２）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１３５項記載のアッセイ法。 - （１４３）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１３５項記載のアッセイ法。 - （１４４）該光発生反応が塩基によつて誘発される特許
請求の範囲第１３５項記載のアッセイ法。 - （１４５）該共役体がさらにヘム蛋白質を含む、該光発
生反応が熱によつて誘発される特許請求の範囲第１３５
項記載のアッセイ法。 - （１４６）抗原とこの抗原に対して特異的な抗体から成
る特定結合対の要素である、液体中の抗原を検出するた
めの化学発光アッセイ法において、検出することが望ま
しい抗原上の第一決定基に対して特異的な第一抗体を、
不溶性支持マトリックスに結合した蛋白質Ａに結合させ
る； 検出することが望ましい抗原を含有すると疑われる溶液
と、該第一抗体とを接触させる；蛋白質Ａ、該抗原上の
第二決定基に対して特異的な第二抗体、血清アルブミン
及びルミノールから成り、該ルミノールが該血清アルブ
ミンに非共有結合している共役体に、該第一抗体に結合
した抗原を、該共役体の該第二抗体と該抗原との結合を
促進するような条件下で接触させる；及び 発光反応を誘発する ことから成るアッセイ法。 - （１４７）該不溶性支持マトリックスが多糖から成る特
許請求の範囲第１４６項記載のアッセイ法。 - （１４８）該光発生反応が塩基によつて誘発される特許
請求の範囲第１４６項記載のアッセイ法。 - （１４９）該共役体がさらにヘム蛋白質を含み、該光発
生反応が熱によつて誘発される特許請求の範囲第１４６
項記載のアッセイ法。 - （１５０）該光発生反応を誘発する前に非結合共役体を
除去する特許請求の範囲第１４６項記載の反応。 - （１５１）抗原とこの抗原に対して特異的な抗体から成
る特定結合対の要素である、液体中の抗原を検出するた
めの化学発光アッセイ法に用いる試薬であつて、血清ア
ルブミン、蛋白質Ａ及び発光物質から成り、該発光物質
が該血清アルブミンに非共有結合している試薬。 - （１５２）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第１５１項記載
の試薬。 - （１５３）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１５１項記載の試薬。 - （１５４）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１５１項記載の試薬。 - （１５５）さらにヘム蛋白質を含有する特許請求の範囲
第１５１項記載の試薬。 - （１５６）抗原とこの抗原に対して特異的な抗体とから
成る特定結合対の要素である、液体中の特定抗体を検出
するための化学発光アッセイ法であつて、 特定抗体が結合するような決定基を有する 抗原を不溶性支持マトリックスに結合させる；該結合抗
原を特定抗体の存在が疑われる溶 液に、該抗体と該抗原の結合を促進するような条件下で
接触させる； 蛋白質Ａ、血清アルブミン及び発光物質か ら成り、該発光物質が該血清アルブミンに非共有結合し
ている共役体を該第一抗体に、該共役体の該蛋白質Ａと
該結合抗体との結合を促進するような条件下で接触させ
る；及び 発光反応を誘発する ことから成るアッセイ法。 - （１５７）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
、ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプト
ファン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトフ
ァン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢
酸から成る群から選択する特許請求の範囲第１５６項記
載のアッセイ法。 - （１５８）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１５９）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１６０）該抗原が二官能性架橋剤によつて該不溶性支
持マトリックスに結合してゲルを形成する特許請求の範
囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１６１）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、
カルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミ
ジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートか
ら成る群から選択する特許請求の範囲第１６０項記載の
アッセイ法。 - （１６２）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドで
ある特許請求の範囲第１６０項記載のアッセイ法。 - （１６３）該光発生反応が塩基によつて誘発される特許
請求の範囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１６４）該発光試薬がさらにヘム蛋白質を含有し、該
光発生反応が熱によつて誘発される特許請求の範囲第１
５６項記載のアッセイ法。 - （１６５）該ヘム蛋白質をヘモグロビン、ミオグロビン
及びパーオキシダーゼから成る群から選択する特許請求
の範囲第１６４項記載のアッセイ法。 - （１６６）該ヘム蛋白質がヘモグロビンである特許請求
の範囲第１６４項記載のアッセイ法。 - （１６７）該ヘム蛋白質がパーオキシダーゼである特許
請求の範囲第１６４項記載のアッセイ法。 - （１６８）特定抗原を含有すると疑われる該液体が血清
である特許請求の範囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１６９）該発光反応を誘発する前に該非結合共役体を
除去する特許請求の範囲第１５６項記載のアッセイ法。 - （１７０）抗体とこの抗体によつて特異的に結合される
抗原とから成る特定結合対の要素である、液体中の該特
定抗体を検出するための化学発光アッセイ法において、 特定抗体が結合するような決定基を有する抗原を不溶性
支持マトリックスに結合させる；該特定抗体を含有する
と疑われる液体と該結合抗原を、該抗体と該結合抗原と
の結合を促進するような条件下で、接触させる； 蛋白質Ａ、血清アルブミン及びルミノールから成り、該
ルミノールが該血清アルブミンに非共有結合している共
役体を該結合抗原に、該共役体の蛋白質Ａと該結合抗体
の結合を促進する条件下で、接触させる；及び 結合共役体を塩基と結合させる ことから成るアッセイ法。 - （１７１）該抗体を含むと疑われる該液体が血清である
特許請求の範囲第１７０項の化学発光アッセイ法。 - （１７２）抗体とこの抗体によつて特異的に結合される
抗原とから成る特定結合対の要素である、液体中の該特
定抗体を検出するための化学発光アッセイ法において、 特定抗体が結合するような決定基を有する抗原を不溶性
支持マトリックスに結合させる；特定抗原を含むと疑わ
れる液体に該結合抗原を、該抗体と該結合抗原との結合
を促進するような条件下で、接触させる； ヘム蛋白質、蛋白質Ａ、血清アルブミン及びルミノール
から成り、該ルミノールが該血清アルブミンに非共有結
合している共役体を該結合抗体に、該共役体の蛋白質Ａ
と該結合抗体の結合を促進するような条件で接触させる
；及び該結合共役体を加熱する ことから成る化学発光アッセイ法。 - （１７３）該抗体を含むと疑われる該液体が体液である
特許請求の範囲第１７２項記載の化学発光アッセイ法。 - （１７４）特定タイプの細胞を検出するためのアッセイ
法において、 特定タイプの細胞を含有すると疑われるサンプルを固定
化する、 該特定タイプの細胞に特に有利に結合し得るために選択
したレクチン、血清アルブミン及び発光物質から成り、
該発光物質が該血清アルブミンに非共有結合している共
役体を該固定化細胞に、該共役体のレクチンと該特定タ
イプの細胞との結合を促進する条件下で接触させる；及
び 発光反応を誘発する ことから成るアッセイ法。 - （１７５）該発光反応が該結合共役体と塩基との接触に
よつて誘発される特許請求の範囲第１７４項記載のアッ
セイ法。 - （１７６）該共役体がさらにヘム蛋白質を含有し、該発
光反応が熱によつて誘発される特許請求の範囲第１７４
項記載の分析。 - （１７７）特定タイプの細胞を含有すると疑われる該液
体が体液である特許請求の範囲第１７４項記載のアッセ
イ法。 - （１７８）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
−ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプト
ファン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトフ
ァン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢
酸から成る群から選択する特許請求の範囲第１７４項記
載のアッセイ法。 - （１７９）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１７４項記載のアッセイ法。 - （１８０）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１７４項記載のアッセイ法。 - （１８１）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、
カルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシンイミ
ジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオネートから
成る群から選択する特許請求の範囲第１７４項記載のア
ッセイ法。 - （１８２）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドで
ある特許請求の範囲第１７４項記載のアッセイ法。 - （１８３）該レクチンをコンカナバリンＡ、小麦胚凝集
素ならびにレンズ豆レクチン、大豆レクチン及びヘリッ
クス・ポマシア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）レクチ
ンから成る群から選択する特許請求の範囲第１７４項記
載のアッセイ法。 - （１８４）該レクチンがコンカナバリンＡである特許請
求の範囲第１７４項記載のアッセイ法。 - （１８５）該発光反応を誘発する前に非結合共役体を除
去する特許請求の範囲第１７４項記載のアッセイ法。 - （１８６）血清アルブミン、レクチン及び発光物質から
成る共役体を含有する特定細胞タイプ検出用組成物にお
いて、該発光物質が該血清アルブミンに非共有結合して
いる組成物。 - （１８７）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチル−トリプトファンと他のトリプトフ
ァン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢
酸から成る群から選択する特許請求の範囲第１８６項記
載の組成物。 - （１８８）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１８６項記載の組成物。 - （１８９）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１８６項記載の組成物。 - （１９０）該レクチンをコンカナバリンＡ、小麦胚凝集
素、レンズ豆レクチン、大豆レクチン及びヘリックス・
ポマシア・レクチンから成る群から選択する特許請求の
範囲第１８６項記載の組成物。 - （１９１）該レクチンがコンカナバリンＡである特許請
求の範囲第１８６項記載の組成物。 - （１９２）さらにヘム蛋白質を含有する特許請求の範囲
第１８６項記載の組成物。 - （１９３）レクチン−血清アルブミン−発光物質共役体
を含有する特定細胞タイプ検出用装置において、該発光
物質が該血清アルブミンと非共有結合し、該共役体が二
官能性架橋剤によつて架橋している装置。 - （１９４）該発光物質をルミノール誘導体、フェノール
ピルベート、インドール−３−ピルベート、トリプトフ
ァン、Ｎ−アセチルトリプトファンと他のトリプトファ
ン誘導体、インドールプロピオン酸及びインドール酢酸
から成る群から選択する特許請求の範囲第１９３項記載
の装置。 - （１９５）該発光物質がルミノール誘導体である特許請
求の範囲第１９３項記載の装置。 - （１９６）該発光物質がルミノールである特許請求の範
囲第１９３項記載の装置。 - （１９７）該レクチンを、コンカナバリンＡ、小麦胚凝
集素、レンズ豆レクチン、大豆レクチン及びヘリックス
・ポマシア・レクチンから成る群から選択する特許請求
の範囲第１９３項記載の装置。 - （１９８）該レクチンがコンカナバリンＡである特許請
求の範囲第１９３項記載の装置。 - （１９９）該二官能性架橋剤をグルタールアルデヒド、
カルボジイミド、コハク酸無水物及びＮ−スクシン−３
−〔２−ピリジルジチオ〕−プロピオネートから成る群
から選択する特許請求の範囲第１９３項記載の装置。 - （２００）該二官能性架橋剤がグルタールアルデヒドで
ある特許請求の範囲第１９３項記載の装置。 - （２０１）該共役体がさらにヘム蛋白質を含有する特許
請求の範囲第１９３項記載の装置。
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