JPS61176529A - 特異的キラ−ｔ細胞の製造方法 - Google Patents
特異的キラ−ｔ細胞の製造方法Info
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- JPS61176529A JPS61176529A JP60017840A JP1784085A JPS61176529A JP S61176529 A JPS61176529 A JP S61176529A JP 60017840 A JP60017840 A JP 60017840A JP 1784085 A JP1784085 A JP 1784085A JP S61176529 A JPS61176529 A JP S61176529A
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Links
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特定のガン細胞に対して特異的なキラーＴ細
胞の大量製造方法に関する。
胞の大量製造方法に関する。
頭頚部ガンの中でも上咽頭ガンはその予後が悪く、放射
線・化学療法に非特異的免疫療法を加味しても５年間生
存高はおよそ３０％にすぎなかった。そして、その理由
としては、免疫監視機構の破綻が著しいことが指摘され
ていた。ガンに対する人体の免疫を向上させる手段とし
ては、そのガン細胞に対して特異的なキラーＴ細胞を投
与することが考えられるが、キラーＴ細胞は従来、患者
のリン／９球と患者から分離したガン細胞組織を混合培
養して生産していたため、その大量培養ができず、十分
な量を投与することが不可能であった。
線・化学療法に非特異的免疫療法を加味しても５年間生
存高はおよそ３０％にすぎなかった。そして、その理由
としては、免疫監視機構の破綻が著しいことが指摘され
ていた。ガンに対する人体の免疫を向上させる手段とし
ては、そのガン細胞に対して特異的なキラーＴ細胞を投
与することが考えられるが、キラーＴ細胞は従来、患者
のリン／９球と患者から分離したガン細胞組織を混合培
養して生産していたため、その大量培養ができず、十分
な量を投与することが不可能であった。
本発明者らは特定のガン細胞に対して特異的なキラーＴ
細胞を大量に得べく種々検討をおこなっていたところ、
ガン患者又はその遺伝的に近縁関係にある者から得たリ
ン、ｅ球と、同種の培養ガン細胞とを接触させても感作
τリンノ９球が得られるとと及び該感作１９７７９球に
Ｔ細胞増殖因子を加えれば大量にキラーＴ細胞が得られ
ることを見出した。
細胞を大量に得べく種々検討をおこなっていたところ、
ガン患者又はその遺伝的に近縁関係にある者から得たリ
ン、ｅ球と、同種の培養ガン細胞とを接触させても感作
τリンノ９球が得られるとと及び該感作１９７７９球に
Ｔ細胞増殖因子を加えれば大量にキラーＴ細胞が得られ
ることを見出した。
したがって、本発明は、ガン患者若しくけその者と遺伝
的に近縁関係にある者の血液中のリン／９球と患者ガン
と同種の、不活性化された培養ガン細胞を感作せしめて
感作’ｌ” １７ン、Ｑ球を得、更にこれにＴ細胞増殖
因子を加えて培養することを特徴とするキラーＴ細胞の
製造方法を提供するものである。
的に近縁関係にある者の血液中のリン／９球と患者ガン
と同種の、不活性化された培養ガン細胞を感作せしめて
感作’ｌ” １７ン、Ｑ球を得、更にこれにＴ細胞増殖
因子を加えて培養することを特徴とするキラーＴ細胞の
製造方法を提供するものである。
本発明で用いるリン／Ｑ球は患者本人若しくはこの者と
遺伝的に近縁関係にある者から得たものであることが必
要であり、遺伝的に近縁とは、血族のうち親、子、兄弟
（姉妹）等を指す。リン／Ｑ球を得るには、提供者の末
梢血を採取し、これを常法により分離すれば良く、斯く
することにより９７７９球の浮遊液が調製される。
遺伝的に近縁関係にある者から得たものであることが必
要であり、遺伝的に近縁とは、血族のうち親、子、兄弟
（姉妹）等を指す。リン／Ｑ球を得るには、提供者の末
梢血を採取し、これを常法により分離すれば良く、斯く
することにより９７７９球の浮遊液が調製される。
また、上記リン／Ｑ球を感作するガン細胞は、不活性化
されたもので、患者のガンと同種の培養ガン細胞である
ことが必要でるる。この培養ガン細胞を゛不活性化する
ためには、十分に遠心洗浄した培養ガン細胞を１〜２×
ｌＯ・個／１１１１のＲＰＭＩ −１６４０又はＰＢ８
の浮遊液に調製し、これに２０００Ｒ程度のコバルト照
射をおこなうか、又は１００ｐｉＦ／ｌＲ１程度のマイ
トマイシン−Ｃで３０分間、３７℃で処理をおこなう。
されたもので、患者のガンと同種の培養ガン細胞である
ことが必要でるる。この培養ガン細胞を゛不活性化する
ためには、十分に遠心洗浄した培養ガン細胞を１〜２×
ｌＯ・個／１１１１のＲＰＭＩ −１６４０又はＰＢ８
の浮遊液に調製し、これに２０００Ｒ程度のコバルト照
射をおこなうか、又は１００ｐｉＦ／ｌＲ１程度のマイ
トマイシン−Ｃで３０分間、３７℃で処理をおこなう。
こうして得られた不活性化ガン細胞は、直ちに十分洗浄
され、リンパ球の感作に使用される、 リンパ球の不活性化ガン細胞による感作は、通常、ｌ−
当りｌ〜２ Ｘ ｌ Ｏ’個のリン／Ｑ球と１〜２ Ｘ
ｌ Ｏ’個の不活性化ガン細胞とを、これらの比が約
５：１−１０：ｌとなるようにし、２０％ヒト新鮮血清
加ＲＰＭＩ −１６４０等の培地中で、好ましくは７２
〜１２０時間、３０〜３７℃の条件下公知の方法で混合
培養するととくよりおこなわれる。
され、リンパ球の感作に使用される、 リンパ球の不活性化ガン細胞による感作は、通常、ｌ−
当りｌ〜２ Ｘ ｌ Ｏ’個のリン／Ｑ球と１〜２ Ｘ
ｌ Ｏ’個の不活性化ガン細胞とを、これらの比が約
５：１−１０：ｌとなるようにし、２０％ヒト新鮮血清
加ＲＰＭＩ −１６４０等の培地中で、好ましくは７２
〜１２０時間、３０〜３７℃の条件下公知の方法で混合
培養するととくよりおこなわれる。
こうして得られた感作リン／９球は、培養終了後、密度
勾配遠心法等の分離手段により不活性化ガン細胞から分
離され、更に！細胞増殖因子（ＴＣＧＦ ）の存在下培
養がおこなわれる。
勾配遠心法等の分離手段により不活性化ガン細胞から分
離され、更に！細胞増殖因子（ＴＣＧＦ ）の存在下培
養がおこなわれる。
培養に用いられるＴＣＧＦとしては、インター・ロイキ
ン−２（ＩＬ−２）等が挙げられる。このＴＣＧＦは、
ヒト牌臓又はヘントウ由来のもののほか、カニクイザル
、ニホンザル、ミドリザル等のサルの牌臓由来のもの、
遺伝子操作によるもの及び因子産生細胞ノ１イブリドー
マ由来のもの等が使用される。この培養は、常法により
おこない得るが、好ましくは２０〜５０％の丁ＣＧＦ及
び１０〜２０％のヒト新鮮血清を加えた、例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０等の培地中でおこなわれ、培地中の濃度は
、２〜４ Ｘ ｌ Ｏ’個租度であることが好ましい。
ン−２（ＩＬ−２）等が挙げられる。このＴＣＧＦは、
ヒト牌臓又はヘントウ由来のもののほか、カニクイザル
、ニホンザル、ミドリザル等のサルの牌臓由来のもの、
遺伝子操作によるもの及び因子産生細胞ノ１イブリドー
マ由来のもの等が使用される。この培養は、常法により
おこない得るが、好ましくは２０〜５０％の丁ＣＧＦ及
び１０〜２０％のヒト新鮮血清を加えた、例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０等の培地中でおこなわれ、培地中の濃度は
、２〜４ Ｘ ｌ Ｏ’個租度であることが好ましい。
斯くして得られた、ガン細胞に対して特異的なキラーＴ
ａ胞は、常法により培地中から分離式れ、元のガン患者
若しくは、該患者と血縁関係にある他のガン患者に投与
される。
ａ胞は、常法により培地中から分離式れ、元のガン患者
若しくは、該患者と血縁関係にある他のガン患者に投与
される。
投与は、１回当り３〜４０ Ｘ ｌ ０７個を１透通９
２〜３回静脈内に注射するか、患部に直接注射するとと
Ｋよりおこなうことが好ましい。
２〜３回静脈内に注射するか、患部に直接注射するとと
Ｋよりおこなうことが好ましい。
本発明方法により調製されたキラーＴ細胞は、感作に用
いたガンと同種のガンに特異的に作用するため、ガン病
巣の消失のほか、転移ガンの抑制にも大きな効果を有す
るものである。
いたガンと同種のガンに特異的に作用するため、ガン病
巣の消失のほか、転移ガンの抑制にも大きな効果を有す
るものである。
実施例１
キラーＴ細胞の調製：
（１） 感作１９７７９球の調製
ガン患者の末梢血をヘノ９リン加で採取し、密度勾配遠
心法で分離してリンパ球細胞浮遊液を得た（高田満ら、
免疫実験操作法！。
心法で分離してリンパ球細胞浮遊液を得た（高田満ら、
免疫実験操作法！。
ｐ３０４５〜３０４９（１９８０）参照）。
一方１０００回転／分で１０分間遠心後、ＲＰＭＩ −
１６４０又はＰＲ８で３回洗浄した培養ガン細胞を１〜
２Ｘ１０＠個／−のＲＰＭＩ −１６４０又はＰＢ８浮
遊液に調製し、３７℃で３０分間２００ ＯＲのコバル
ト照射し、不活性処理をおこなった（コバルト照射に代
えマイトマイシン−〇（１００μｆ／ｌｄ＞処理でも良
い）。リンパ球細胞浮遊液と不活性処理をおこなったガ
ン細胞浮遊液をそれらの細胞数比で１０：ｌと々るよう
混合し、２０％ヒト新鮮崩清加ＲＰＭＩ−１６４０培地
で、３７℃、９６時間混合培養を行表った。混合培養細
胞は密度勾配遠心法によりガン細胞と感作り７７９球を
分離した。別途に感作リンパ球のキラー活性をＧａｒｏ
ｕｏｙら（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＣＩｉｎｉｃａｌＩＣ
ｌ１ｎｉｃａｌＩ＋ ｐ ２９０〜２９６（１９８０
）の方法によって調べた。
１６４０又はＰＲ８で３回洗浄した培養ガン細胞を１〜
２Ｘ１０＠個／−のＲＰＭＩ −１６４０又はＰＢ８浮
遊液に調製し、３７℃で３０分間２００ ＯＲのコバル
ト照射し、不活性処理をおこなった（コバルト照射に代
えマイトマイシン−〇（１００μｆ／ｌｄ＞処理でも良
い）。リンパ球細胞浮遊液と不活性処理をおこなったガ
ン細胞浮遊液をそれらの細胞数比で１０：ｌと々るよう
混合し、２０％ヒト新鮮崩清加ＲＰＭＩ−１６４０培地
で、３７℃、９６時間混合培養を行表った。混合培養細
胞は密度勾配遠心法によりガン細胞と感作り７７９球を
分離した。別途に感作リンパ球のキラー活性をＧａｒｏ
ｕｏｙら（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＣＩｉｎｉｃａｌＩＣ
ｌ１ｎｉｃａｌＩ＋ ｐ ２９０〜２９６（１９８０
）の方法によって調べた。
（２） インターロイキン−２（ＩＬ−２）の調製ヒ
ト牌臓およびへんとう由来リンパ球（１〜２ Ｘ １０
’個／−）を１％ヒトへマグルチニン・Ｍ、２％ヒト新
鮮血清加ＲＰＭＩ −１６４０培養後で３７℃、４８時
間スｆンナー培養（浮ｉ培養）シ、その上清をＩＬ−２
とした。又、サル牌臓由来リンパ球（１〜２ Ｘ １０
’個／−）をｌＯμｆ／−コンカナバリンム、２％ヒト
新鮮血清加ＲＰＭＩ−１８４０培養液でと） リンパ球
と同様に培養し、その上清をＩＬ−２としても良い。
ト牌臓およびへんとう由来リンパ球（１〜２ Ｘ １０
’個／−）を１％ヒトへマグルチニン・Ｍ、２％ヒト新
鮮血清加ＲＰＭＩ −１６４０培養後で３７℃、４８時
間スｆンナー培養（浮ｉ培養）シ、その上清をＩＬ−２
とした。又、サル牌臓由来リンパ球（１〜２ Ｘ １０
’個／−）をｌＯμｆ／−コンカナバリンム、２％ヒト
新鮮血清加ＲＰＭＩ−１８４０培養液でと） リンパ球
と同様に培養し、その上清をＩＬ−２としても良い。
（３） キラーＴ細胞の調製
（１）で得た感作リン、９球は、更に５０％ＩＬ−２原
液、２０％ヒト新鮮崩清加ＲＰＭＩ −１６４０培養液
にて２〜４ Ｘ １０’個／−の細胞濃度で１週間培養
した。その後、２〜３日毎に２〜４ Ｘ １０’個／−
の細胞濃度でＩＬ−２存在下で培養を続け、キラーで細
胞の培養増殖を行なった。
液、２０％ヒト新鮮崩清加ＲＰＭＩ −１６４０培養液
にて２〜４ Ｘ １０’個／−の細胞濃度で１週間培養
した。その後、２〜３日毎に２〜４ Ｘ １０’個／−
の細胞濃度でＩＬ−２存在下で培養を続け、キラーで細
胞の培養増殖を行なった。
実施例２
１５例の上咽頭ガン（ＮＰＣ）患者に対し、本発明方法
で調製したキラーＴ細胞を投与し、その作用を調べた。
で調製したキラーＴ細胞を投与し、その作用を調べた。
投与方法としては、−例の局所注入をのぞき全て静注に
よった。投与量は１回３ Ｘ １０’〜４Ｘ１０”個の
感作り７７９球を毎週２〜３回、合計４回から３４回の
投与とした。用いたリン／９球の内容は表−１に示すご
とく、１５例中種例が患者本人のリン、ｅ球、４例が患
者本人とその兄第（姉妹）、６例が患者の兄第（姉妹）
のリン／９球であった。
よった。投与量は１回３ Ｘ １０’〜４Ｘ１０”個の
感作り７７９球を毎週２〜３回、合計４回から３４回の
投与とした。用いたリン／９球の内容は表−１に示すご
とく、１５例中種例が患者本人のリン、ｅ球、４例が患
者本人とその兄第（姉妹）、６例が患者の兄第（姉妹）
のリン／９球であった。
以下余白
壷Ｆ：新鮮症例、Ｒ：再発癌、に）内は転移部位
症例４：鼻腔内腫瘍が局注にて消失
５：上咽頭から頭蓋内浸潤した腫瘍消
失、遠隔転移を防止
ｌＯ：上咽頭、所属９７１９節腫瘤のコントロールが可
能であったと同時に １年７ケ月（現在まで）にわたり 遠隔転移を防禦 １１．１２ ：遠隔転移を防禦 １３：肺遠隔転移巣の増大を防止 １４：遠隔臓器転移を防止 表−１の結果から明らかなように本発明方法により調製
されたキラーＴ細胞を投与することにより、局所及び頭
がい内に浸潤した腫瘍が消失した症例が二例認められた
。また、多くの患者において優れた遠隔ガン転移の抑制
効果が認められた（症例５，１０．１１．１２．１３．
１４等）。この結果から、本発明方法で調製されたキラ
ーＴ細胞は初期及び中期のガン患者に対し、著効を有す
ることが期待される。
能であったと同時に １年７ケ月（現在まで）にわたり 遠隔転移を防禦 １１．１２ ：遠隔転移を防禦 １３：肺遠隔転移巣の増大を防止 １４：遠隔臓器転移を防止 表−１の結果から明らかなように本発明方法により調製
されたキラーＴ細胞を投与することにより、局所及び頭
がい内に浸潤した腫瘍が消失した症例が二例認められた
。また、多くの患者において優れた遠隔ガン転移の抑制
効果が認められた（症例５，１０．１１．１２．１３．
１４等）。この結果から、本発明方法で調製されたキラ
ーＴ細胞は初期及び中期のガン患者に対し、著効を有す
ることが期待される。
実施例３
ＩＬ−２による細胞障害性増強効果（キラー活性）：
上咽頭ガン（ＮＰＣ）患者又は兄弟（姉妹）のリン／Ｑ
球とマイトマイシン（ＭＭＣ）処理ＮＰＣ由来培養細胞
（ＮＰＣ−２０４）（高田満らによって樹立＊ ＧＡＮ
Ｎ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ＦＪｎｌ ＯＩ？１４９〜１
６１ （１９７１））を、９７２９球（ｌ〜２ Ｘ １
０’個／−）１０に対しＭＭＣ処理 ４゜ＮＰＣ−２
０４細胞（１〜２Ｘ１０５個／−）ｌの割合で混合、３
７℃で９６時間培養して感作リンパ球を作製した。一部
感作すン、Ｑ球はさらにＩＬ−２存在下で１週間培養後
キラーＴ細胞とし、これらのＮＰＣ−２０４細胞に対す
るキラー活性を測定した。キラー活性の測定は５１（ｒ
ラベルＮＰＣ−２−０４細胞の障害度合による遊離＄１
（ｒの測定によって行なった。各ケースにおけるリンパ
球はＮＰＣ−２０４細胞との混合培養（感作）によりキ
ラー活性が誘導されるが、感作リンパ球を更にＩＬ−２
存在下で培養することによってキラー活性がさらに増強
されることがわかった。この結果を図−１に示す。
球とマイトマイシン（ＭＭＣ）処理ＮＰＣ由来培養細胞
（ＮＰＣ−２０４）（高田満らによって樹立＊ ＧＡＮ
Ｎ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ＦＪｎｌ ＯＩ？１４９〜１
６１ （１９７１））を、９７２９球（ｌ〜２ Ｘ １
０’個／−）１０に対しＭＭＣ処理 ４゜ＮＰＣ−２
０４細胞（１〜２Ｘ１０５個／−）ｌの割合で混合、３
７℃で９６時間培養して感作リンパ球を作製した。一部
感作すン、Ｑ球はさらにＩＬ−２存在下で１週間培養後
キラーＴ細胞とし、これらのＮＰＣ−２０４細胞に対す
るキラー活性を測定した。キラー活性の測定は５１（ｒ
ラベルＮＰＣ−２−０４細胞の障害度合による遊離＄１
（ｒの測定によって行なった。各ケースにおけるリンパ
球はＮＰＣ−２０４細胞との混合培養（感作）によりキ
ラー活性が誘導されるが、感作リンパ球を更にＩＬ−２
存在下で培養することによってキラー活性がさらに増強
されることがわかった。この結果を図−１に示す。
す。
図−１は各処理後のリンパ球及びキラーＴ細胞のキラー
活性を示す図面である。 以上
活性を示す図面である。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ガン患者若しくはその者と遺伝的に近縁関係にある
者の血液中のリンパ球と患者ガンと同種の、不活性化さ
れた培養ガン細胞を感作せしめて感作Ｔリンパ球を得、
更にこれにＴ細胞増殖因子を加えて培養することを特徴
とするキラーＴ細胞の製造方法。 ２、Ｔ細胞増殖因子がヒトの脾臓若しくはへんとう由来
リンパ球又はカニクイザル、ミドリザル、日本ザルの脾
臓リンパ球をマイトジエンで刺激することによつて産生
される因子、遺伝子操作によつて産生される因子又は因
子産生細胞のハイブリドーマによつて産生される因子の
いずれかである特許請求の範囲第１項記載のキラーＴ細
胞の製造方法。 ３、Ｔ細胞増殖因子がインターロイキン２である特許請
求の範囲第１項記載のキラーＴ細胞の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017840A JPS61176529A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | 特異的キラ−ｔ細胞の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017840A JPS61176529A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | 特異的キラ−ｔ細胞の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61176529A true JPS61176529A (ja) | 1986-08-08 |
Family
ID=11954870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60017840A Pending JPS61176529A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | 特異的キラ−ｔ細胞の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61176529A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6805861B2 (en) | 1996-01-17 | 2004-10-19 | Imperial College Innovations Limited | Immunotherapy using cytotoxic T lymphocytes (CTL) |
-
1985
- 1985-02-01 JP JP60017840A patent/JPS61176529A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6805861B2 (en) | 1996-01-17 | 2004-10-19 | Imperial College Innovations Limited | Immunotherapy using cytotoxic T lymphocytes (CTL) |
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