JPS61185189A - 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 - Google Patents
新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体Info
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- JPS61185189A JPS61185189A JP60024050A JP2405085A JPS61185189A JP S61185189 A JPS61185189 A JP S61185189A JP 60024050 A JP60024050 A JP 60024050A JP 2405085 A JP2405085 A JP 2405085A JP S61185189 A JPS61185189 A JP S61185189A
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- fragment
- dna
- plasmid
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子工学の分野における新規なヒトインタ
ーフェロン−α１ （以下、ＩＦＮ−α１という）のＤ
ＮＡ配列に関する。
ーフェロン−α１ （以下、ＩＦＮ−α１という）のＤ
ＮＡ配列に関する。
ＩＦＮ−αは一般に各種ウィルス（例えば、センダイウ
ィルス、ニューキャフスルデイジーズウィルス、インフ
ルエンザウィルスなど）によって誘発された白血球など
の細胞から産生されるものであり、ウィルスに起因する
各種疾病に対して有用であるとされている。
ィルス、ニューキャフスルデイジーズウィルス、インフ
ルエンザウィルスなど）によって誘発された白血球など
の細胞から産生されるものであり、ウィルスに起因する
各種疾病に対して有用であるとされている。
ところで最近の遺伝子工学の発達に伴い、ＩＦＮ−αも
遺伝子レベルでの構造解析あるいは生理活性との関係に
ついて研究・検討がなされている。
遺伝子レベルでの構造解析あるいは生理活性との関係に
ついて研究・検討がなされている。
その結果、ＩＦＮ−ｃｘ遺伝子は、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｉｃであること、ヒト染色体上には少な（とも２０種類
のＩＦＮ−α遺伝子が存在することが報告されている。
ｉｃであること、ヒト染色体上には少な（とも２０種類
のＩＦＮ−α遺伝子が存在することが報告されている。
そのうち、１３種類のＩＦＮ−α遺伝子が既にクローニ
ングされ、そのＤＮＡ配列も明らかにされている。ＩＦ
Ｎ−α１はサブタイプの一つであり、すでにＤＮＡ配列
も解明されて−る（特開昭５６−１５０１００）。また
、ＩＦＮ−αはアミノ酸配列等の違いにより、生理活性
の種類あるいは強度が異なることも判ってきた。
ングされ、そのＤＮＡ配列も明らかにされている。ＩＦ
Ｎ−α１はサブタイプの一つであり、すでにＤＮＡ配列
も解明されて−る（特開昭５６−１５０１００）。また
、ＩＦＮ−αはアミノ酸配列等の違いにより、生理活性
の種類あるいは強度が異なることも判ってきた。
従って、新規なアミノ酸を有するＩＦＮ−α。
は、従来のＩＦＮ−α１とは異なる生理活性を示す可能
性が充分にある。
性が充分にある。
本発明者らは組み換えＤＮＡ技術を用いて、ＩＦＮ−α
１のアミノ酸配列について検討を行った結果、誘発させ
たヒト白血球より得たｍＲＮＡを鋳型として得られるヒ
ト由来ＴＦＮ−α１遺伝子のクローニングを行い、その
ＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を決定することによ
り、従来の■ＦＮ−α、とは異なる新規なアミノ酸をコ
ードする新規なヒト由来ＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列、該
ＤＮＡ配列を含有することを特徴とする組み換えプラス
ミド及び該組み換えプラスミドで形質転換した形質転換
体を見出して本発明を完成した。
１のアミノ酸配列について検討を行った結果、誘発させ
たヒト白血球より得たｍＲＮＡを鋳型として得られるヒ
ト由来ＴＦＮ−α１遺伝子のクローニングを行い、その
ＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を決定することによ
り、従来の■ＦＮ−α、とは異なる新規なアミノ酸をコ
ードする新規なヒト由来ＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列、該
ＤＮＡ配列を含有することを特徴とする組み換えプラス
ミド及び該組み換えプラスミドで形質転換した形質転換
体を見出して本発明を完成した。
（以下余白）
本発明は、
ＡＲＧ ＡＲＧ ＴＨＲＬＥＤ ＭＥＴ ＬＥＤ ＬＥ
Ｕ ＡＬＡ ＧＬＮ Ｍ［！Ｔ Ｓｌ！ＲＡＲＧ ＩＬ
Ｅ ＳＥＲＰＲＯＳＥＲＳＥＲＣＹＳ ＬＥｔｌ ？Ｉ
ＥＴ ＡＳＰ ＡＲＧｎｒｓ ｌ力ｐｎＥＧＬＹ Ｐ）
１２ ＰＲＯｃｃＡ ＧＬｕ ＧＬＬＩ ＰＨＥ ＡＳ
ＰＧＬＹ ＡＳＮ ＧＬＮ ＰＩＥ ＧＬＮ
ＬＹＳ ＡＬＡ ＰＲＯＡＬＡ ＩＬＥ ５
ＥＲＶＡＬ ＬＩｌ’Ｄ Ｉ（Ｉｓ ＧＬｔｌ ＬＥＬ
Ｉ ＩＬＥＧＬＮ ＧＬＮ ＩＬＥ ＰＨＥ ＡＳＮＬ
ＥＵ ＰＩＥ ＴＨＲＴＨＲＬＹＳ ＡＳＰ ＳＥＲＳ
ＥＲＡＬＡ ＡＬＡ ＴＲＰＡＳＰ ＧＬＩＩ ＡＳＰ
ＬＥＵＬＥ［Ｉ ＡＳＰ ｌ、ＹＳ Ｐ）ＩＥＣＹＳ
Ｔ）ＩＩ？ ＧＬＵＬＥ［ｌ ＴＹＲＧＬＮ ＧＬＮ
ＬＥＵ ＡＳＮ ＡＳＰ ＬＥｔｌ ＧＬＵ ＡＬＡ
ＣＹＳｔ＋Ｌυ で表わされるポリペプチドをコードすることを特徴とす
るＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列に関するものであり、好ま
しくは、 ＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ＾ の塩基配列を有することを特徴とするＩＦＮ−α１のＤ
ＮＡ配列に関する。
Ｕ ＡＬＡ ＧＬＮ Ｍ［！Ｔ Ｓｌ！ＲＡＲＧ ＩＬ
Ｅ ＳＥＲＰＲＯＳＥＲＳＥＲＣＹＳ ＬＥｔｌ ？Ｉ
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１２ ＰＲＯｃｃＡ ＧＬｕ ＧＬＬＩ ＰＨＥ ＡＳ
ＰＧＬＹ ＡＳＮ ＧＬＮ ＰＩＥ ＧＬＮ
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ＬＥＵ ＡＳＮ ＡＳＰ ＬＥｔｌ ＧＬＵ ＡＬＡ
ＣＹＳｔ＋Ｌυ で表わされるポリペプチドをコードすることを特徴とす
るＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列に関するものであり、好ま
しくは、 ＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ＾ の塩基配列を有することを特徴とするＩＦＮ−α１のＤ
ＮＡ配列に関する。
従来の［ＦＮ−Ｚ＋ は、３５番目のアミノ酸がアスパ
ラギン酸からなり、それをコードするＤＮＡはＧＡＣで
あった０本発明からなるＩＦＮ−α１の３５番目のアミ
ノ酸はアスパラギンであり、それをコードするＤＮＡは
ＡＡＣである。
ラギン酸からなり、それをコードするＤＮＡはＧＡＣで
あった０本発明からなるＩＦＮ−α１の３５番目のアミ
ノ酸はアスパラギンであり、それをコードするＤＮＡは
ＡＡＣである。
さらに本発明は、該ＤＮＡ配列を含有することを特徴と
する組み換えプラスミドに関するものであり、さらには
、該組み換えプラスミドによって形質転換した形質転換
体に関するものである。
する組み換えプラスミドに関するものであり、さらには
、該組み換えプラスミドによって形質転換した形質転換
体に関するものである。
本発明からなるＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列は以下のよう
に調製される。
に調製される。
ＩＦＮ−α産生用のヒト末梢血白血球を白血球由来ＩＦ
Ｎでブライミング後、センダイウィルス等で誘発し培養
する。培養後、細胞をホモゲナイズし、ＩＦＮ−αをコ
ードするｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡから例えば逆
転写酵素を用いて単鎖のｃＤＮＡを合成する。更に二重
鎖ＤＮＡを導き、適当なベクター、例えばｐＢＲ３２２
やｐＵＣ９に挿入する。この組み換えプラスミドで例え
ば大１）Ｅ１を形質転換させる。薬剤耐性等の適当なマ
ーカーで形質転換体をスクリーニングし、更にコロニー
ハイブリダイゼーションや、プラスミドＤＮＡの制限酵
素処理により、ｆＦＮ−α１のｃＤＮＡ含有プラスミド
を単離する。これにより、ＩＦＮ−α、をコードする二
重１）［ＤＮＡを製造することができる。この二重鎖Ｄ
ＮＡの塩基配列を例えばＭａｘａｍ−Ｇ１）ｂｅｒｔ法
（Ｍａｘａｍ＋ Ａ、 ａｎｄ Ｇ１）ｂｅｒｔ。
Ｎでブライミング後、センダイウィルス等で誘発し培養
する。培養後、細胞をホモゲナイズし、ＩＦＮ−αをコ
ードするｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡから例えば逆
転写酵素を用いて単鎖のｃＤＮＡを合成する。更に二重
鎖ＤＮＡを導き、適当なベクター、例えばｐＢＲ３２２
やｐＵＣ９に挿入する。この組み換えプラスミドで例え
ば大１）Ｅ１を形質転換させる。薬剤耐性等の適当なマ
ーカーで形質転換体をスクリーニングし、更にコロニー
ハイブリダイゼーションや、プラスミドＤＮＡの制限酵
素処理により、ｆＦＮ−α１のｃＤＮＡ含有プラスミド
を単離する。これにより、ＩＦＮ−α、をコードする二
重１）［ＤＮＡを製造することができる。この二重鎖Ｄ
ＮＡの塩基配列を例えばＭａｘａｍ−Ｇ１）ｂｅｒｔ法
（Ｍａｘａｍ＋ Ａ、 ａｎｄ Ｇ１）ｂｅｒｔ。
Ｈ，１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇ）＋ ６５＋ ４９９−５６０ ）によって決定し
、ＩＦＮ−α１遺伝子の存在を確認する０次に得られた
ＩＦＮ−α、のＤＮＡ配列を含育する組み換えプラスミ
ドの調製を以下に示す。
ｏｇ）＋ ６５＋ ４９９−５６０ ）によって決定し
、ＩＦＮ−α１遺伝子の存在を確認する０次に得られた
ＩＦＮ−α、のＤＮＡ配列を含育する組み換えプラスミ
ドの調製を以下に示す。
得られたクローンからＩＦＮ−α１遺伝子の全部あるい
は一部をきり出し、必要ならば翻訳開始部位に翻訳開始
コドンを付加する。さらに適当なプロモーター、ＳＤ（
シャイン アンド ダルガーノ）配列の下流につなぐこ
ともできる。
は一部をきり出し、必要ならば翻訳開始部位に翻訳開始
コドンを付加する。さらに適当なプロモーター、ＳＤ（
シャイン アンド ダルガーノ）配列の下流につなぐこ
ともできる。
プロモーターとしては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、アミラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモ
ーター、λフアージプロモーター、ｔｕｆＢプロモータ
ー及びそれらのハイブリッドプロモーター、例えば、ｔ
ａｃプロモーター等が挙げられる。
ロモーター、アミラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモ
ーター、λフアージプロモーター、ｔｕｆＢプロモータ
ー及びそれらのハイブリッドプロモーター、例えば、ｔ
ａｃプロモーター等が挙げられる。
翻訳開始コドンやプロモーターを必要に応じて付加した
ＩＦＮ−α１遺伝子を適当なベクターに挿入して組み換
えプラスミドを得る。
ＩＦＮ−α１遺伝子を適当なベクターに挿入して組み換
えプラスミドを得る。
得られた組み換えプラスミドで適当な宿主を常法に従い
形質転換することにより、形質転換体を得ることができ
る。
形質転換することにより、形質転換体を得ることができ
る。
宿主としては、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞等が挙
げられるが、好ましくは大腸菌が挙げられる。
げられるが、好ましくは大腸菌が挙げられる。
このようにして得られた宿主を公知の培地で培養する。
培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば緩衝液に懸濁
させた後、菌体を破壊し、遠心分離により上澄みを得る
。
させた後、菌体を破壊し、遠心分離により上澄みを得る
。
上記上澄み中のＩＦＮ−αは、抗ＩＦＮ−αポリクロー
ナル抗体又は／及び抗ｒＦＮ−αモノクローナル抗体を
用いて精製することができる。
ナル抗体又は／及び抗ｒＦＮ−αモノクローナル抗体を
用いて精製することができる。
かくして本発明によって提供されたＩＦＮ−α１のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、既知ＩＦＮ−α１
のアミノ酸配列と３５番目において異なるアミノ酸をコ
ードしており、新規なＩＦＮ−α、の誘導体の供給を可
能とするものであり、ＩＦＮの開発技術における技術的
多様化を満足させるものである。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、既知ＩＦＮ−α１
のアミノ酸配列と３５番目において異なるアミノ酸をコ
ードしており、新規なＩＦＮ−α、の誘導体の供給を可
能とするものであり、ＩＦＮの開発技術における技術的
多様化を満足させるものである。
以下、実施例を以て、本発明をより具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない、な
お、実施例において制限酵素Ｐｖｕｌｌ、Ｈｉｎｃ■、
５ａｕ３ＡＩ、Ｈ４ｎｆ Ｉ、ＢａｍＨ１％ Ｈａ ｅ
■、Ｈａｅｌ［［、Ｂｇｌ■、Ｐｖｕ■は宝酒造社製、
ＥＣＯＲＩ、ＰｓｔＩはニラポンジーン社製、Ｄｄｅｌ
はＢＲＬ社製を使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造
社製を用いた。
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない、な
お、実施例において制限酵素Ｐｖｕｌｌ、Ｈｉｎｃ■、
５ａｕ３ＡＩ、Ｈ４ｎｆ Ｉ、ＢａｍＨ１％ Ｈａ ｅ
■、Ｈａｅｌ［［、Ｂｇｌ■、Ｐｖｕ■は宝酒造社製、
ＥＣＯＲＩ、ＰｓｔＩはニラポンジーン社製、Ｄｄｅｌ
はＢＲＬ社製を使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造
社製を用いた。
（１） ｍ ＲＮ Ａの抽出
ヒト末梢血より分離した白血球１０ ” ｃｅｌｌｓ／
！を５！ｊ１ｉプラズマネ一ト含有Ｍ Ｅ Ｍ培地中で
１００ＴＬＩ／＋ｓｌの白血球ＩＦＮによりプライミン
グした後、２００ＨＡ／ｍｌのセンダイウィルスで４．
５〜５時間誘発した＊ ３．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠
心して細胞を集め、１×１Ｏ１ｏ〜３Ｘ１０”個の細胞
をグアニジンチオシアネート（Ｇｕ−Ｈ３ＣＮ）溶液（
４ＭＧｕ−Ｈ３ＣＮ、０．１Ｍ トリス−塩酸、ｐＨ１
，５，０，１Ｍ２−メルカプトエタノール）中でホモゲ
ナイズした。これをベックマン６０Ｔｉローター用ポリ
アロマ−チューブ中に入れた１５〜２０ｍ１の５．７Ｍ
塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ溶液の上に重層し、３
０．００Ｏｒｐｍ 、 １５℃で１７時間以上遠心し、
ＲＮＡ沈澱を得た。得られたＲＮＡ沈澱を、１５〜２０
１ｍ１のグアニジン塩酸（Ｇｕ−ＨＣｊり溶ｆＦＬ （
６ＭＧｕ ・ＨＣＩ、 １０＋ｓＭ ＥＤＴＡ、 ｐ
）Ｉ７．０．１０＋ｗＭ ジチオスレイトール）に懸
濁し、６８℃、３分間加熱処理後氷水で急冷した。０．
０４容量のＩＮ酢酸および０．５容量のエタノールを加
え、−８０℃で２時間放置後遠心し、ＲＮＡ沈澱を得た
。このＲＮＡを７０９Ａエタノールで洗浄し、乾燥後０
．Ｏ１？Ｉ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
後、６５℃、３分間加熱急冷し、１／９容量の５ＭＮａ
Ｃｊ！を加えオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムでポリ
（Ａ） ＲＮ Ａｆｃ濃縮した。得られたポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡ画分をエタノール沈澱後、８−３０％（ｗ／ｗ）シ
！Ｉｔ１）密度勾配遠心した（ＳＷ４１Ｔｉローター、
２２．００Ｏｒｐｍ 、５℃、１７時間）０分画化して
６分画を得、各分画につきＲＮＡの一部ずつをアフリカ
ッメガエルの卵母細胞に注入し、合成されたＩＦＮ−α
の活性を測定した（ミドリ十字社製、ＲＰＨＡ試薬）と
ころ、分画３ （１２〜１５Ｓ）に２．６００〜４，０
００１）Ｊ／ｐｔＲＮ Ａの活性を検出した。
！を５！ｊ１ｉプラズマネ一ト含有Ｍ Ｅ Ｍ培地中で
１００ＴＬＩ／＋ｓｌの白血球ＩＦＮによりプライミン
グした後、２００ＨＡ／ｍｌのセンダイウィルスで４．
５〜５時間誘発した＊ ３．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠
心して細胞を集め、１×１Ｏ１ｏ〜３Ｘ１０”個の細胞
をグアニジンチオシアネート（Ｇｕ−Ｈ３ＣＮ）溶液（
４ＭＧｕ−Ｈ３ＣＮ、０．１Ｍ トリス−塩酸、ｐＨ１
，５，０，１Ｍ２−メルカプトエタノール）中でホモゲ
ナイズした。これをベックマン６０Ｔｉローター用ポリ
アロマ−チューブ中に入れた１５〜２０ｍ１の５．７Ｍ
塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ溶液の上に重層し、３
０．００Ｏｒｐｍ 、 １５℃で１７時間以上遠心し、
ＲＮＡ沈澱を得た。得られたＲＮＡ沈澱を、１５〜２０
１ｍ１のグアニジン塩酸（Ｇｕ−ＨＣｊり溶ｆＦＬ （
６ＭＧｕ ・ＨＣＩ、 １０＋ｓＭ ＥＤＴＡ、 ｐ
）Ｉ７．０．１０＋ｗＭ ジチオスレイトール）に懸
濁し、６８℃、３分間加熱処理後氷水で急冷した。０．
０４容量のＩＮ酢酸および０．５容量のエタノールを加
え、−８０℃で２時間放置後遠心し、ＲＮＡ沈澱を得た
。このＲＮＡを７０９Ａエタノールで洗浄し、乾燥後０
．Ｏ１？Ｉ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
後、６５℃、３分間加熱急冷し、１／９容量の５ＭＮａ
Ｃｊ！を加えオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムでポリ
（Ａ） ＲＮ Ａｆｃ濃縮した。得られたポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡ画分をエタノール沈澱後、８−３０％（ｗ／ｗ）シ
！Ｉｔ１）密度勾配遠心した（ＳＷ４１Ｔｉローター、
２２．００Ｏｒｐｍ 、５℃、１７時間）０分画化して
６分画を得、各分画につきＲＮＡの一部ずつをアフリカ
ッメガエルの卵母細胞に注入し、合成されたＩＦＮ−α
の活性を測定した（ミドリ十字社製、ＲＰＨＡ試薬）と
ころ、分画３ （１２〜１５Ｓ）に２．６００〜４，０
００１）Ｊ／ｐｔＲＮ Ａの活性を検出した。
＋２１ ｃ Ｄ Ｎ Ａの合成
得られた２ＯＮのＲＮＡを含む１３３ＰＪの反応混合液
１を、５分間水冷後、４６℃で１０分間処理した。これ
をフェノールで除蛋白し、０． Ｉ ＮのＮａＯＨで７
０℃、２０分間処理してＲＮＡを分解した。
１を、５分間水冷後、４６℃で１０分間処理した。これ
をフェノールで除蛋白し、０． Ｉ ＮのＮａＯＨで７
０℃、２０分間処理してＲＮＡを分解した。
反応混合液ｌ
トリス−ＨＣＪ、 ｐＨ８，３５０ａ＋ＭＫＣＩＩ
７（１＋
ＭＭｇＣｊｔｔ
１０ＭＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
７（１＋
ＭＭｇＣｊｔｔ
１０ＭＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
及びＴＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ） 各０．
５ ｍＭα−” Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａ＋ｗｅｒｓｈａｓ
） ５０ μｃｉジチオスレイトール
０．２ ｍＭオリゴ（ｄＴ）＋□−＋＊（
ＣＲＩ） ２５イ／端１ｍＲＮＡ
１５０ Ｐｇ／ｍｌＡＭＶ ｒｅ
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ８
００ Ｕ／１ｆＩＩχ０ 全量を１３
３μとする量（３）二本鎖ＤＮＡの合成 得られたｃＤＮＡを１００μの溶液（２００ｓ＋Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７，４，２０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、２ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）に溶解し、５８℃で２．５
分間処理後、１０．ＯＯＯｒｐｍ＋ 、 ２分間遠心し
、得られた上清にＤＮＡポリメラーゼｌクレノーフラグ
メント２２ユニツトを添加し、全量を２００μとした。
５ ｍＭα−” Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａ＋ｗｅｒｓｈａｓ
） ５０ μｃｉジチオスレイトール
０．２ ｍＭオリゴ（ｄＴ）＋□−＋＊（
ＣＲＩ） ２５イ／端１ｍＲＮＡ
１５０ Ｐｇ／ｍｌＡＭＶ ｒｅ
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ８
００ Ｕ／１ｆＩＩχ０ 全量を１３
３μとする量（３）二本鎖ＤＮＡの合成 得られたｃＤＮＡを１００μの溶液（２００ｓ＋Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７，４，２０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、２ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）に溶解し、５８℃で２．５
分間処理後、１０．ＯＯＯｒｐｍ＋ 、 ２分間遠心し
、得られた上清にＤＮＡポリメラーゼｌクレノーフラグ
メント２２ユニツトを添加し、全量を２００μとした。
１５℃で一夜反応させた後、フェノールで除蛋白し、グ
リセロールを終濃度１０％となるよう添加した。これを
セファデックスＧ−１００カラムにアプライし、Ｇ−１
００緩衝液で溶出した。溶出液を５滴１分画とし、各分
画の放射活性を測定し、放射活性のピーク部分を集めて
混合し、エタノール沈澱を行った。
リセロールを終濃度１０％となるよう添加した。これを
セファデックスＧ−１００カラムにアプライし、Ｇ−１
００緩衝液で溶出した。溶出液を５滴１分画とし、各分
画の放射活性を測定し、放射活性のピーク部分を集めて
混合し、エタノール沈澱を行った。
得られた二本１）［ＤＮＡを７２ＰＪの水に溶解し、０
．２容量の５×３１ヌクレアーゼ緩衝液（０，１６７Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５，５ｍＭ ＺｎＣｊ！ｉ
）を添加し、次にＳｌヌクレアーゼを０．０２ ｕｎｉ
ｔ／７μを添加し、３７℃で５分間反応させた。反応終
了後、等溶（１）０ｕＩｔ）の水飽和フェノール−クロ
ロホルム（１： １）でＤＮＡをフェノール抽出し、得
られた溶液をエタノール沈澱した。
．２容量の５×３１ヌクレアーゼ緩衝液（０，１６７Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５，５ｍＭ ＺｎＣｊ！ｉ
）を添加し、次にＳｌヌクレアーゼを０．０２ ｕｎｉ
ｔ／７μを添加し、３７℃で５分間反応させた。反応終
了後、等溶（１）０ｕＩｔ）の水飽和フェノール−クロ
ロホルム（１： １）でＤＮＡをフェノール抽出し、得
られた溶液をエタノール沈澱した。
得られた沈澱をＴＥ緩衝液（１ｏＩｌ１Ｍトリス、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に？容解し、６５℃、３
分間加熱した後氷水で急冷する。５−２５％シヨ糖密糖
蜜配上に重層し、スピンコ５Ｗ４１Ｔｉローターを用い
て４℃、３８．０００ｒｐｎ＋で１７．５時間遠心した
。遠心後、２０分画を得、放射活性を測定し、活性の強
い両分を混合し、エタノール沈澱を行い、７０％エタノ
ールで沈澱を洗った後、乾燥した。
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に？容解し、６５℃、３
分間加熱した後氷水で急冷する。５−２５％シヨ糖密糖
蜜配上に重層し、スピンコ５Ｗ４１Ｔｉローターを用い
て４℃、３８．０００ｒｐｎ＋で１７．５時間遠心した
。遠心後、２０分画を得、放射活性を測定し、活性の強
い両分を混合し、エタノール沈澱を行い、７０％エタノ
ールで沈澱を洗った後、乾燥した。
以上の操作により、二本ｔｉＤＮＡが得られた。
（４１ｄ Ｃテイルの付加
二本鎖ＤＮＡ１６２ｎｇとその３° −ＯＨ末端のｓ、
ｏｏｏ倍量のｄＣＴＰと５μの１ＯＸＴｄＴ緩衝液（１
，４Ｍカコジル酸カリ、０．３ Ｍ ）リス−塩酸。
ｏｏｏ倍量のｄＣＴＰと５μの１ＯＸＴｄＴ緩衝液（１
，４Ｍカコジル酸カリ、０．３ Ｍ ）リス−塩酸。
ｐＨ７，０，１０ｍＭ ＣＯＣｌ１ｔ 、１ｍＭジチ
オスレイトール）を混合し、全量を５０μとし、３７℃
で２分間処理後ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ４５ユニットを添加し、３７℃で１分間
反応させ、２１．５残基のｄＣティルが二本１）［ＤＮ
Ａの３’ −ＯＨ末端に結合した。
オスレイトール）を混合し、全量を５０μとし、３７℃
で２分間処理後ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ４５ユニットを添加し、３７℃で１分間
反応させ、２１．５残基のｄＣティルが二本１）［ＤＮ
Ａの３’ −ＯＨ末端に結合した。
フェノール抽出及びエタノール沈澱によりｄＣテイル二
本鎖ＤＮＡを回収した。
本鎖ＤＮＡを回収した。
（５）大腸菌プラスミドの開裂及びｄＧティルの付加大
腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の６ＨをＰｓｔＩ反応溶液
（Ｐ ｓ ｔ Ｉ １２ユニツト、０．０２Ｍ トリ
ス−塩酸、 ｐＨ７，５，０，０１Ｍ ＭｇＣｊ！ｚ
、０．０５Ｍ （Ｎ Ｈｓ） ｔ Ｓ Ｏ４）中で３
７℃、２時間反応させた。
腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の６ＨをＰｓｔＩ反応溶液
（Ｐ ｓ ｔ Ｉ １２ユニツト、０．０２Ｍ トリ
ス−塩酸、 ｐＨ７，５，０，０１Ｍ ＭｇＣｊ！ｚ
、０．０５Ｍ （Ｎ Ｈｓ） ｔ Ｓ Ｏ４）中で３
７℃、２時間反応させた。
得られたＰｓｔｌ消化ｐＢ Ｒ３２２（４ｐｍｏ＋）と
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ （１２ｎｍｏｌ）と１０ＸＴｄＴｌｌ
街液１０μを混合し、全量１００μに調製し、３７℃で
２分間放置後、ターミ゛ナルデオキシジルトランスフェ
ラーゼ８４ユニットを添加し、３７℃で１０５秒間反応
させ、約１８残基のｄＧを付加した。フェノール抽出、
及びエタノール沈澱によりｄＧテイルｐＢＲ３２２を回
収した。
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ （１２ｎｍｏｌ）と１０ＸＴｄＴｌｌ
街液１０μを混合し、全量１００μに調製し、３７℃で
２分間放置後、ターミ゛ナルデオキシジルトランスフェ
ラーゼ８４ユニットを添加し、３７℃で１０５秒間反応
させ、約１８残基のｄＧを付加した。フェノール抽出、
及びエタノール沈澱によりｄＧテイルｐＢＲ３２２を回
収した。
（６）アニーリング反応及び大腸菌の形質転換（３）で
得られたｄＣテイル二本鎖Ｄ Ｎ Ａｏ、２５ｐｍｏｌ
、（４）で得られたｄＧテイルｐＢ Ｒ３２２（０，０
２５ｐａ＋ｏｌ）、１０×アニーリング緩衝液（１００
ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，５、ＩＭ ＮａＣ１，２
５ｍＭ ＮａｇＥＤＴＡ）１５μを全量６００Ｐｔに
調製し、７０℃で１０分間加熱処理後、−昼夜で７０℃
から３７℃へ徐々に温度を下げ、アニーリング反応を終
了した。得られたＤＮＡで常法に従ってＥ、ｃｏｌｉ
ＲＲＩを形質転換し、テトラサイタリン耐性、アンピシ
リン感受性の性質を有する７４，０００株を選択した。
得られたｄＣテイル二本鎖Ｄ Ｎ Ａｏ、２５ｐｍｏｌ
、（４）で得られたｄＧテイルｐＢ Ｒ３２２（０，０
２５ｐａ＋ｏｌ）、１０×アニーリング緩衝液（１００
ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，５、ＩＭ ＮａＣ１，２
５ｍＭ ＮａｇＥＤＴＡ）１５μを全量６００Ｐｔに
調製し、７０℃で１０分間加熱処理後、−昼夜で７０℃
から３７℃へ徐々に温度を下げ、アニーリング反応を終
了した。得られたＤＮＡで常法に従ってＥ、ｃｏｌｉ
ＲＲＩを形質転換し、テトラサイタリン耐性、アンピシ
リン感受性の性質を有する７４，０００株を選択した。
（７１ｃ Ｄ Ｎ Ａ含有プラスミドの選択（１）で得
たｍＲＮＡからＭａｉｚｅｌの方法（ＮｏＭａｉ−ｚｅ
ｌｓ、 Ｃｅ１ｌ、 ９．４３１−４３８ （１９７
６））に従ってプローブを調製した。用いたｍＲＮＡの
量、加水分解時間、（ｒ−”Ｐ）ＡＴＰ量を表１にまと
めた。
たｍＲＮＡからＭａｉｚｅｌの方法（ＮｏＭａｉ−ｚｅ
ｌｓ、 Ｃｅ１ｌ、 ９．４３１−４３８ （１９７
６））に従ってプローブを調製した。用いたｍＲＮＡの
量、加水分解時間、（ｒ−”Ｐ）ＡＴＰ量を表１にまと
めた。
（以下余白）
得られた（”Ｐ）ｍＲＮＡをプローブとして、コロニー
ハイブリダイゼーションを行った結果、８９４個が選択
された。
ハイブリダイゼーションを行った結果、８９４個が選択
された。
次に、制限酵素による選択を行った。Ｎａｔｕｒｅ＋跡
埠、 ２０−２６ （１９８１）に示されたＩＦＮ−α
、の塩基配列から予想される制限酵素の消化による断片
の大きさを表２に示した。コロニーハイブリダイゼーシ
ョンによって選択された株からＤＮＡを抽出し、各制限
酵素で消化した（表３）。表２に示す断片を生ずるＤＮ
Ａを選択したところ、ｐＨＬ６９６がほぼ同等の大きさ
の断片を生じた。そこで、ｐＨＬ６９６を大量調製し、
制限酵素切断部位の地図を作成した（第１図）ところ、
予想される制限酵素地図と一致した。
埠、 ２０−２６ （１９８１）に示されたＩＦＮ−α
、の塩基配列から予想される制限酵素の消化による断片
の大きさを表２に示した。コロニーハイブリダイゼーシ
ョンによって選択された株からＤＮＡを抽出し、各制限
酵素で消化した（表３）。表２に示す断片を生ずるＤＮ
Ａを選択したところ、ｐＨＬ６９６がほぼ同等の大きさ
の断片を生じた。そこで、ｐＨＬ６９６を大量調製し、
制限酵素切断部位の地図を作成した（第１図）ところ、
予想される制限酵素地図と一致した。
（以下余白）
表２
表３
一二フラグメントが得られなかった．
ＮＴ ： ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ
単位： （ｂｐ）
さらに、ＩＦＮ−α１構造遺伝子の全塩基配列をＭａｘ
ａ＋ｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により決定したところ、下記
に示す塩基配列であった。
ａ＋ｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により決定したところ、下記
に示す塩基配列であった。
ＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣ辷ＴＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣ
ＴＧＧＡＴ′ＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＣｃｔｒｃａｔｃｃ
ｔｃｃｔｃｃｃＡｃＡａｒｃＡｃｃａｃａＡｔｃｔｃｒ
ｃｃｒｔｃｃＴＣＣＴＧＴＣＴＧ入ＴＧＧＡＣＡＧＡＣ
ＡＴＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＴＴＴＧ′ＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡ計ｒｃｃＡｃａＡｃ
ｉ；ｃｒｃｃａｃｃｃＡｔｃｔｃｔｃｒｃｃｒｃｃＡ丁
ＧＡＧＣＴＧ′ＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡ′ＴＣＴＴＣＡＡ
ＣＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＣＡｉ１＾ＡＧａｔｒｃａｔｃ
ｔｃｃｔｃｃｔｔｃムＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣｔｃｃｔｘ
ｃＡｃａｉａｔｔｃｙｃｃＡｃ辷Ｇ＾＾ＣＴＣＴＡＣ辷
ＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＡゐＧＡＡＧＧ
ＡＡ （８） ｍａｔｕｒｅ Ｉ Ｆ Ｎ一α１遺伝子の作成
得られたｐＨＬ６９６にクローニングされたＩＦＮ−α
，遺伝子のシグナル配列をコードする領域を除去し、タ
ンパク開始コドンであるＡＴＧを結合した．概略を第２
図及び第３図に示す．ｐＨＬ６９６ （４９８Ｎ）をｓ
ａｕ３Ａｒで消化し、６％ＰＡＧＥで１７６ｂｐの断片
を分離した．分離した断片をＤＢＡＥ−セルロースベー
バーを用いて回収し、８、２ｎの断片が得られた。得ら
れた断片をＨｉｎｆ Ｉで消化し、ｌＯ％ＰＡＧＥで分
離し、６４ｂｐの断片（１．５Ｐｇ）を得た．５゜末端
を３１ｐでラベルした１） ｍｅｒ ＧＡＴＣＡＣＡＣ
ＡＴＧ （Ｃｅｌｌ一ｔｅｃｈ社製）５００ｐａ＋ｏｌ
を１ １ ｍｅｒ ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴ（日本ゼオ
ン社製）５ ０ ０ ｐｍｏｌおよび６４ｂｐ断片１．
５ｑと混合し、６５℃、５分加熱一急冷後、リゲーショ
ン用反応緩衝液（６６ｍＭｔ−リスー塩酸，ｐＨ７．６
、６．６ｍＭ ＭｇＣ７！ｉ 、１０ｍＭジチオスレ
イトール、０．５ｍＭ ＡＴＰ）を添加し、１６℃、
一夜反応させた。反応後、常法に従ってフェノール・ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、次に３０ユニ
ットのＨｉｎｒ Ｉで３７℃、１時間消化した。Ｈｉｎ
ｆ［処理後１０％ＰＡＧＥで断片の分離を行い、目的の
サイズ＜７５ｂｐ）の断片を確認した。この断片をＤＥ
ＡＥ−セルロースペーパー法で回収した。得られた断片
の放射活性は、２．３４Ｘ１０’ｃｐ＋ｍであった．得
られた断片を６０ユニットのＤｄｅｌで消化し、ｌＯ％
ＰＡＧＥにかけ、目的の１８ｂｐ付近のゲルヲ９Ｊリ出
し、ＤＥＡＥ−セルロースペーパーに吸着、溶出を行っ
たところ２．０ ４ Ｘ １ ０’ ｃｐｓの放射活性
が測定された． 一方、ｐＨＬ６９６ （１０Ｐｇ）をＰｓｔｌとＤｄａ
ｌで消化して８２９ｂｐの断片を単離した．次にこの８
２９ｂρをＥＣＯＲＩ消化して５４９ｂｐの断片２５０
ｎｇを得た。
ＴＧＧＡＴ′ＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＣｃｔｒｃａｔｃｃ
ｔｃｃｔｃｃｃＡｃＡａｒｃＡｃｃａｃａＡｔｃｔｃｒ
ｃｃｒｔｃｃＴＣＣＴＧＴＣＴＧ入ＴＧＧＡＣＡＧＡＣ
ＡＴＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＴＴＴＧ′ＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡ計ｒｃｃＡｃａＡｃ
ｉ；ｃｒｃｃａｃｃｃＡｔｃｔｃｔｃｒｃｃｒｃｃＡ丁
ＧＡＧＣＴＧ′ＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡ′ＴＣＴＴＣＡＡ
ＣＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＣＡｉ１＾ＡＧａｔｒｃａｔｃ
ｔｃｃｔｃｃｔｔｃムＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣｔｃｃｔｘ
ｃＡｃａｉａｔｔｃｙｃｃＡｃ辷Ｇ＾＾ＣＴＣＴＡＣ辷
ＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＡゐＧＡＡＧＧ
ＡＡ （８） ｍａｔｕｒｅ Ｉ Ｆ Ｎ一α１遺伝子の作成
得られたｐＨＬ６９６にクローニングされたＩＦＮ−α
，遺伝子のシグナル配列をコードする領域を除去し、タ
ンパク開始コドンであるＡＴＧを結合した．概略を第２
図及び第３図に示す．ｐＨＬ６９６ （４９８Ｎ）をｓ
ａｕ３Ａｒで消化し、６％ＰＡＧＥで１７６ｂｐの断片
を分離した．分離した断片をＤＢＡＥ−セルロースベー
バーを用いて回収し、８、２ｎの断片が得られた。得ら
れた断片をＨｉｎｆ Ｉで消化し、ｌＯ％ＰＡＧＥで分
離し、６４ｂｐの断片（１．５Ｐｇ）を得た．５゜末端
を３１ｐでラベルした１） ｍｅｒ ＧＡＴＣＡＣＡＣ
ＡＴＧ （Ｃｅｌｌ一ｔｅｃｈ社製）５００ｐａ＋ｏｌ
を１ １ ｍｅｒ ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴ（日本ゼオ
ン社製）５ ０ ０ ｐｍｏｌおよび６４ｂｐ断片１．
５ｑと混合し、６５℃、５分加熱一急冷後、リゲーショ
ン用反応緩衝液（６６ｍＭｔ−リスー塩酸，ｐＨ７．６
、６．６ｍＭ ＭｇＣ７！ｉ 、１０ｍＭジチオスレ
イトール、０．５ｍＭ ＡＴＰ）を添加し、１６℃、
一夜反応させた。反応後、常法に従ってフェノール・ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、次に３０ユニ
ットのＨｉｎｒ Ｉで３７℃、１時間消化した。Ｈｉｎ
ｆ［処理後１０％ＰＡＧＥで断片の分離を行い、目的の
サイズ＜７５ｂｐ）の断片を確認した。この断片をＤＥ
ＡＥ−セルロースペーパー法で回収した。得られた断片
の放射活性は、２．３４Ｘ１０’ｃｐ＋ｍであった．得
られた断片を６０ユニットのＤｄｅｌで消化し、ｌＯ％
ＰＡＧＥにかけ、目的の１８ｂｐ付近のゲルヲ９Ｊリ出
し、ＤＥＡＥ−セルロースペーパーに吸着、溶出を行っ
たところ２．０ ４ Ｘ １ ０’ ｃｐｓの放射活性
が測定された． 一方、ｐＨＬ６９６ （１０Ｐｇ）をＰｓｔｌとＤｄａ
ｌで消化して８２９ｂｐの断片を単離した．次にこの８
２９ｂρをＥＣＯＲＩ消化して５４９ｂｐの断片２５０
ｎｇを得た。
得られた１８ｂｐの断片の全量と１２５ｎｇの５４９ｂ
ｐの断片をリゲーションした後、５％ＰＡＧＥで分離し
た。その結果、目的の５６７ｂｐ付近にバンドが検出さ
れた。このバンドよりＤＮＡを抽出し、放射活性を測定
すると１．４ ９ Ｘ １ ０’ ｃｐａ＋であった。
ｐの断片をリゲーションした後、５％ＰＡＧＥで分離し
た。その結果、目的の５６７ｂｐ付近にバンドが検出さ
れた。このバンドよりＤＮＡを抽出し、放射活性を測定
すると１．４ ９ Ｘ １ ０’ ｃｐａ＋であった。
ｐＢＲ３２２をＥＣ０ＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ア
ンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’）を含む３９８５ｂｐの
断片を単離した。この断片を３４０ｎｇと５６７ｂｐの
断片の全量を５．６ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いてリゲーションした。反応液の全量を用いてＥ、ｃｏ
ｌｉ ＲＲＩ株を形質転換したところ、約４，０００個
のＡ ｐ ｒの形質転換体が得られた。
ンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’）を含む３９８５ｂｐの
断片を単離した。この断片を３４０ｎｇと５６７ｂｐの
断片の全量を５．６ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いてリゲーションした。反応液の全量を用いてＥ、ｃｏ
ｌｉ ＲＲＩ株を形質転換したところ、約４，０００個
のＡ ｐ ｒの形質転換体が得られた。
得られた形質転換体より、ミニブレツブ法でプラスミド
ＤＮＡを抽出し、ｓｓ’ｙｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を持つものを選択した。その結果、調べた１２０
クローンのうち１）８クローンが５６７ｂｐに近いサイ
ズのＥｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨ■断片を与えるプラスミド
ＤＮＡを有していた。
ＤＮＡを抽出し、ｓｓ’ｙｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を持つものを選択した。その結果、調べた１２０
クローンのうち１）８クローンが５６７ｂｐに近いサイ
ズのＥｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨ■断片を与えるプラスミド
ＤＮＡを有していた。
そのうち４クローンのプラスミドＤＮＡを種々の制限酵
素で分析したところ、すべて目的のプラスミドである可
能性が強く示唆された。そこでクローン患１）のプラス
ミドＤＮＡをｃｌｅａｒｅｄ Ｉｙｓａｔｅ法で大量に
調製し、以下に述べるｉ認実験を行った。
素で分析したところ、すべて目的のプラスミドである可
能性が強く示唆された。そこでクローン患１）のプラス
ミドＤＮＡをｃｌｅａｒｅｄ Ｉｙｓａｔｅ法で大量に
調製し、以下に述べるｉ認実験を行った。
ｃｌｅａｒｅｄ Ｉｙｓａｔｅ法で純化精製したクロー
ン磁１）由来のプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で処
理し、その断片のサイズを６％ＰＡＧＥで測定した。そ
の結果クローバ１）のプラスミドは目的のプラスミドと
同じサイズの断片を与えたく表４）。
ン磁１）由来のプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で処
理し、その断片のサイズを６％ＰＡＧＥで測定した。そ
の結果クローバ１）のプラスミドは目的のプラスミドと
同じサイズの断片を与えたく表４）。
（以下余白）
表４
Ｐνｕｌｌの部ｍ１ｉｌ（ヒにより生じたフラグメント
また、このプラスミドをＤｄｅｌで消化すると目的のプ
ラスミドに特徴的な２つのＤｄｅｌ断片（１，２２３ｂ
ｐ、 ６２１ｂｐ ）が確認された。クローン１ｋｌｌ
のプラスミドＤＮＡ＠ｐＩα１ と命名した。
また、このプラスミドをＤｄｅｌで消化すると目的のプ
ラスミドに特徴的な２つのＤｄｅｌ断片（１，２２３ｂ
ｐ、 ６２１ｂｐ ）が確認された。クローン１ｋｌｌ
のプラスミドＤＮＡ＠ｐＩα１ と命名した。
更に、このプラスミドのＢｇｔｎサイトを３！Ｐでラベ
ルし、）（ｉｎｃｌ［で切断して得られる４７０ｂｐの
断片について、塩基配列を求めた（ Ｍａｙａｍ −Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法）。第４図に求めた塩基配列の一部を示
した。求めた配列は予想される配列と一致した。
ルし、）（ｉｎｃｌ［で切断して得られる４７０ｂｐの
断片について、塩基配列を求めた（ Ｍａｙａｍ −Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法）。第４図に求めた塩基配列の一部を示
した。求めた配列は予想される配列と一致した。
（９）大腸菌における発現用プラスミドの作製（概略を
第５図に示す、） ａ）各断片の単離 ｐｌαｌをＥｃｏＲＩと１３ａｍＨＩで消化し、１％ア
ガロースゲル電気泳動で分離して、目的の５６７ｂｐの
断片２３．８ｑを得た。
第５図に示す、） ａ）各断片の単離 ｐｌαｌをＥｃｏＲＩと１３ａｍＨＩで消化し、１％ア
ガロースゲル電気泳動で分離して、目的の５６７ｂｐの
断片２３．８ｑを得た。
１） Ｄ Ｒ５４０（ＰＬ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１
社より入手）ＬＯｌｎをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌ［Ｉで
消化して、目的のｔａｃプロモーターを含む９１ｂｐの
断片、８．４６Ｎを得た。一方３７．５ＰｇのｐＤＲ５
４０をＢａｍＨｌとＥｃｏＲＩで消化して目的の３７１
ｂｐの断片１．９８ ｐｇを得た。
社より入手）ＬＯｌｎをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌ［Ｉで
消化して、目的のｔａｃプロモーターを含む９１ｂｐの
断片、８．４６Ｎを得た。一方３７．５ＰｇのｐＤＲ５
４０をＢａｍＨｌとＥｃｏＲＩで消化して目的の３７１
ｂｐの断片１．９８ ｐｇを得た。
ｐＨＬ６９６の３゛末端のＡＡＴＡＡＡの配列を含む領
域をＥｃｏＲＩとＢｇｌｌで消化し、３８０ｂｐの断片
１４．６ｐｇを得た。・ ｐＢＲ３２２の５．６５Ｍ−をＥｃｏＲＩとＰａｔＩで
処理し、テトラサイタリン耐性遺伝子（Ｔ ｃ ’）を
含む３．６１０ ｂｐ断片２．８１Ｍを得た。一方、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃ ｏＲＩとＨｉｎｄｌｌＩで消化し、
その一部を１０％ＰＡＧＥに流して消化されたことを確
認した。残りの反応液は、断片の分離を行わずにＢ Ａ
Ｐ （Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＲＬ社製）〕処理して、そのま
まりゲーシッン反応に用いた。
域をＥｃｏＲＩとＢｇｌｌで消化し、３８０ｂｐの断片
１４．６ｐｇを得た。・ ｐＢＲ３２２の５．６５Ｍ−をＥｃｏＲＩとＰａｔＩで
処理し、テトラサイタリン耐性遺伝子（Ｔ ｃ ’）を
含む３．６１０ ｂｐ断片２．８１Ｍを得た。一方、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃ ｏＲＩとＨｉｎｄｌｌＩで消化し、
その一部を１０％ＰＡＧＥに流して消化されたことを確
認した。残りの反応液は、断片の分離を行わずにＢ Ａ
Ｐ （Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＲＬ社製）〕処理して、そのま
まりゲーシッン反応に用いた。
ｂ）大腸菌における発現用プラスミドｐｌα１ｔａｃｌ
の作製 まず、ＩＦＮ−α１遺伝子を含む断片（５６７ｂｐ）？
、５ｑと＾ＡＴＡＡＡ配列を含む断片（３８ｏｂｐ）４
．５可をリゲーションした。リゲーシッン反応物を各８
０ユニツトのＰｓｔｌとＢａｍＨＩで処理し、４．５％
ＰＡＧＥで分離して、目的の８４７ｂｐの断片を得た。
の作製 まず、ＩＦＮ−α１遺伝子を含む断片（５６７ｂｐ）？
、５ｑと＾ＡＴＡＡＡ配列を含む断片（３８ｏｂｐ）４
．５可をリゲーションした。リゲーシッン反応物を各８
０ユニツトのＰｓｔｌとＢａｍＨＩで処理し、４．５％
ＰＡＧＥで分離して、目的の８４７ｂｐの断片を得た。
この断片をＢＡＰ処理し、３７１ｂｐの断片（ＴａＣプ
ロモーター／オペレーターとＳＤ配列を含む断片）Ｉｎ
とリゲーシッンした。
ロモーター／オペレーターとＳＤ配列を含む断片）Ｉｎ
とリゲーシッンした。
リゲーション反応物を５ユニツトのＰｓｔＩで消化後、
４．５％ＰＡＧＥで分析すると目的のサイズ（１２１８
ｂｐ ）に近い断片が検出された。この断片を回収し、
２００ｎｇのｐＢＲ３２２ＥｃｏＲｌ−Ｐｓｔｌ断片（
３，６１０ｂｐ）とリゲーションした後、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ １０３を形質転換した。その結果、６００個
のテトラサイタリン耐性の形質転換株が得られた。
４．５％ＰＡＧＥで分析すると目的のサイズ（１２１８
ｂｐ ）に近い断片が検出された。この断片を回収し、
２００ｎｇのｐＢＲ３２２ＥｃｏＲｌ−Ｐｓｔｌ断片（
３，６１０ｂｐ）とリゲーションした後、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ １０３を形質転換した。その結果、６００個
のテトラサイタリン耐性の形質転換株が得られた。
これら形質転換株のプラスミドをミニブレツブ法で調製
し、種々の制限酵素を用いて分析したところ目的のプラ
スミドを含むと思われる株が得られた。この株のプラス
ミドをｃｌｅａｒｅｄ Ｉｙｓａｔｅ法で純化して更に
分析したところ、種々の制限酵素処理で得られる断片の
大きさは、すべて、予想される値と一致した（表５）、
そこでこのプラスミドをｐｌα１・ｔａｃｌと命名した
。
し、種々の制限酵素を用いて分析したところ目的のプラ
スミドを含むと思われる株が得られた。この株のプラス
ミドをｃｌｅａｒｅｄ Ｉｙｓａｔｅ法で純化して更に
分析したところ、種々の制限酵素処理で得られる断片の
大きさは、すべて、予想される値と一致した（表５）、
そこでこのプラスミドをｐｌα１・ｔａｃｌと命名した
。
（余白）
表５
Ｃ）大腸菌における発現用プラスミドｐｌα１ｔａｃ２
の作ｌ！Ｉ（概略を第６図に示す）。
の作ｌ！Ｉ（概略を第６図に示す）。
まず、ＩＦＮ−α１遺伝子を含む断片（５６７ｂｐ）５
／Ｉｆと’［’ａｃプロモーター／オペレーター及びＳ
Ｄ配列を含む９１ｂｐの断片１．４６／Ｉｆをリゲーシ
ョンシ、６０ユニツトのＨｉｎｄｌｌ［でポリマーを分
解してから４．５％ＰＡＧＥに流した。その結果、目的
の６５８ｂｐの断片が検出された０回収したこの断片の
半量をＢＡＰ処理したｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄ［［断片１．１８／１）−とリゲーションし、Ｅ、
ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３を形質転換したところ、７５
０個のアンピシリン耐性の形質転換体が得られた。これ
ら形質転換体のプラスミドをミニブレツブ法で調製し、
種々の制限酵素を分析したところ、目的のプラスミドを
含むと思われる株が得られた。そこでこの株のプラスミ
ドをｃｌｅａｒｅｄＩｙｓａｔｅ法で調製し、更に分析
を行った結果種々の制限酵素処理で得られる断片の大き
さは予想される値と一致したく表６）。このプラスミド
をｐｌαｌ ｔａｃ２と命名した。
／Ｉｆと’［’ａｃプロモーター／オペレーター及びＳ
Ｄ配列を含む９１ｂｐの断片１．４６／Ｉｆをリゲーシ
ョンシ、６０ユニツトのＨｉｎｄｌｌ［でポリマーを分
解してから４．５％ＰＡＧＥに流した。その結果、目的
の６５８ｂｐの断片が検出された０回収したこの断片の
半量をＢＡＰ処理したｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄ［［断片１．１８／１）−とリゲーションし、Ｅ、
ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３を形質転換したところ、７５
０個のアンピシリン耐性の形質転換体が得られた。これ
ら形質転換体のプラスミドをミニブレツブ法で調製し、
種々の制限酵素を分析したところ、目的のプラスミドを
含むと思われる株が得られた。そこでこの株のプラスミ
ドをｃｌｅａｒｅｄＩｙｓａｔｅ法で調製し、更に分析
を行った結果種々の制限酵素処理で得られる断片の大き
さは予想される値と一致したく表６）。このプラスミド
をｐｌαｌ ｔａｃ２と命名した。
表６
１共に３．ａｍＨＩの部分消化により生じたフラグメン
トＱＩ Ｉ Ｆ Ｎ−α、遺伝子の発現 ＪＭ１０３／ｐＩα１ｔａｃｌ及びＪＭ１０３／ｐｉα
ｌ ｔａｃ２をＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ
ｌ ｏｇ、 Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
５ ｇ、 Ｎ ａ Ｃ１２１０ｇを１）の蒸留水に溶
解し、Ｑ、ＩＮ ＮａＯＨでｐｌ＋７．５に調製）に
アンピシリンまたはテトラサイクリンを加えた培地中で
３７℃で一夜振とう培養し、そのＱ、５ｍｌを５（１＋
１の前記と同様の培地に接種し、３７℃で振とう培養し
た。ＯＤ、、。＝１で終濃度１ｍＭのＩ Ｐ ＴＧ （
１ｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄｅ ）を添加した。その後さらに振とう培養を続
け、ＯＤ６．。−３で培養液４０ｍ１から集菌し、菌体
を生理食塩水で洗浄後５１の５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
）１Ｂ） 、３０ｍＭ ＮａＣＲ。
トＱＩ Ｉ Ｆ Ｎ−α、遺伝子の発現 ＪＭ１０３／ｐＩα１ｔａｃｌ及びＪＭ１０３／ｐｉα
ｌ ｔａｃ２をＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ
ｌ ｏｇ、 Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
５ ｇ、 Ｎ ａ Ｃ１２１０ｇを１）の蒸留水に溶
解し、Ｑ、ＩＮ ＮａＯＨでｐｌ＋７．５に調製）に
アンピシリンまたはテトラサイクリンを加えた培地中で
３７℃で一夜振とう培養し、そのＱ、５ｍｌを５（１＋
１の前記と同様の培地に接種し、３７℃で振とう培養し
た。ＯＤ、、。＝１で終濃度１ｍＭのＩ Ｐ ＴＧ （
１ｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄｅ ）を添加した。その後さらに振とう培養を続
け、ＯＤ６．。−３で培養液４０ｍ１から集菌し、菌体
を生理食塩水で洗浄後５１の５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
）１Ｂ） 、３０ｍＭ ＮａＣＲ。
６ｍＭＥＤＴＡ、１０ｑ／ａ＋１フエニルメチルスルフ
オニルフルオリドに懸濁し、終濃度１ ｍｇ／ｌｌ１）
（７）リゾチームを添加して０℃で３０分間処理した。
オニルフルオリドに懸濁し、終濃度１ ｍｇ／ｌｌ１）
（７）リゾチームを添加して０℃で３０分間処理した。
次に急速凍結と急速融解を５回行った後、１０，０００
ｒｐｍ ｓ ４℃、２０分間の遠心と４０． ＯＯＯｒ
ｐｍ、４℃、１時間（５ｐｉｎｃｏ ５Ｗ５０．１０−
ター）の超遠心を行い、上清（Ｓ −１００ｓｕｐ、）
を得た。得られたＳ−１００ｓｕｐ、のＩＦＮ−α活性
を測定した。なお集菌した菌体の湿重量は、２種の株と
もに０．１８〜０．２０ ｇ ／４０１培養液であった
。
ｒｐｍ ｓ ４℃、２０分間の遠心と４０． ＯＯＯｒ
ｐｍ、４℃、１時間（５ｐｉｎｃｏ ５Ｗ５０．１０−
ター）の超遠心を行い、上清（Ｓ −１００ｓｕｐ、）
を得た。得られたＳ−１００ｓｕｐ、のＩＦＮ−α活性
を測定した。なお集菌した菌体の湿重量は、２種の株と
もに０．１８〜０．２０ ｇ ／４０１培養液であった
。
ＩＦＮ−αの活性の測定は、ＣＰＥ法（ＦＬ３−１ｃｅ
ｌｌと５ｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓを用いる予研法）で
行った。ＪＭ１０３／ｐｌα１ｔａｃｌは３．８Ｘ１０
’＋１）／ｆ培養液、ＪＭ１０３／ｐｒＬ０ｘｌｔａｃ
２は？、６ Ｘ Ｌ Ｏ’ Ｉｕ／ｌ培養液テアツタ。
ｌｌと５ｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓを用いる予研法）で
行った。ＪＭ１０３／ｐｌα１ｔａｃｌは３．８Ｘ１０
’＋１）／ｆ培養液、ＪＭ１０３／ｐｒＬ０ｘｌｔａｃ
２は？、６ Ｘ Ｌ Ｏ’ Ｉｕ／ｌ培養液テアツタ。
αυＩＦＮ−α１の精製
モノクローナル抗体カラムの作製
ＩＦＮ−α１をＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系マウスに１０週間
免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その肺細
胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエローマ
細胞であるＸ６３−Ａｇ８６５３（アメリカ、ＦＬＯＷ
社より入手）とポリエチレングリコール＃１０００存在
下で混合し融合せしめた。
免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その肺細
胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエローマ
細胞であるＸ６３−Ａｇ８６５３（アメリカ、ＦＬＯＷ
社より入手）とポリエチレングリコール＃１０００存在
下で混合し融合せしめた。
この融合細胞の内、ＩＦＮ−α１に対する抗体を産生じ
ている細胞を、血球凝集反応、酵素免疫反応、及び中和
抗体反応等の方法で検査しながらＩＦＮ−α、抗体産生
株を得た。この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜１０
日目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水はＩＦＮ
−α１の活性を強く阻害した。このマウス腹水中のモノ
クローナル抗体を常法に従いＣＮＢｒ活性化セファロー
ス（ファルマシア社製）へ結合せしめ、水不溶性固定化
モノクローナル抗体を調製した。
ている細胞を、血球凝集反応、酵素免疫反応、及び中和
抗体反応等の方法で検査しながらＩＦＮ−α、抗体産生
株を得た。この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜１０
日目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水はＩＦＮ
−α１の活性を強く阻害した。このマウス腹水中のモノ
クローナル抗体を常法に従いＣＮＢｒ活性化セファロー
ス（ファルマシア社製）へ結合せしめ、水不溶性固定化
モノクローナル抗体を調製した。
この水不溶性固定化モノクローナル抗体１０ｍ１をカラ
ムへ充填し、溶菌液の上清を室温にて５０ｍ１／時の流
速で流下させ、ＩＦＮ−α、を吸着せしめた。総計４Ｘ
１０’ｌｌｌのＩＦＮ−α１を吸着させた後、０．１〜
】、ＯＭのＮａＣ１溶液でカラムを洗浄し不純物質を除
去した。
ムへ充填し、溶菌液の上清を室温にて５０ｍ１／時の流
速で流下させ、ＩＦＮ−α、を吸着せしめた。総計４Ｘ
１０’ｌｌｌのＩＦＮ−α１を吸着させた後、０．１〜
】、ＯＭのＮａＣ１溶液でカラムを洗浄し不純物質を除
去した。
次に３．５ＭのＫＳＣＮ溶液をカラムへ注入し、ＩＦＮ
−α１を溶出した。
−α１を溶出した。
溶出したＩＦＮ−α、の回収率は８０％、比活性は１．
５ Ｘ １０ ’ １）１７ｍｇであった。
５ Ｘ １０ ’ １）１７ｍｇであった。
第１図はｐＨＬ６９６のｃＤＮＡ挿入部分の制限酵素切
断部位を示す。□はｃＤＮＡ挿入部分を、・−・・はｐ
ＢＲ３２２由来を示す。 第２図はｍａｔｕｒｅ Ｉ Ｆ Ｎ−α１遺伝子作成
の概略を示す。 第３図は翻訳開始部（立の構築方法を示す。 第４図は、クローンＮａ １）由来のプラスミドのＩＦ
Ｎ−α１の翻訳開始部位のＤＮＡ配列を示す。 第５図は、発現用プラスミドｐＩα１ｔａｃｌの作製方
法を示す。 第６図は、発現用プラスミドｐｉαｌ ｔａｃ２の作製
方法を示す。
断部位を示す。□はｃＤＮＡ挿入部分を、・−・・はｐ
ＢＲ３２２由来を示す。 第２図はｍａｔｕｒｅ Ｉ Ｆ Ｎ−α１遺伝子作成
の概略を示す。 第３図は翻訳開始部（立の構築方法を示す。 第４図は、クローンＮａ １）由来のプラスミドのＩＦ
Ｎ−α１の翻訳開始部位のＤＮＡ配列を示す。 第５図は、発現用プラスミドｐＩα１ｔａｃｌの作製方
法を示す。 第６図は、発現用プラスミドｐｉαｌ ｔａｃ２の作製
方法を示す。
Claims (4)
- （１）下記で表わされるポリペプチドをコードすること
を特徴とするインターフェロン−α＿１のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 - （２）下記の塩基配列を有することを特徴とする特許請
求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 - （３）下記で表わされるポリペプチドをコードすること
を特徴とするインターフェロン−α＿１のＤＮＡ配列を
含有することを特徴とする組み換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 - （４）下記で表わされるポリペプチドをコードすること
を特徴とするインターフェロン−α＿１のＤＮＡ配列を
含有することを特徴とする組み換えプラスミドで形質転
換した形質転換体。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60024050A JPS61185189A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 |
| DE19863603958 DE3603958A1 (de) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Dna-sequenz eines neuen interferon-(alpha)(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts), rekombinantes plasmid und transformand, welche beide die dna-sequenz enthalten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60024050A JPS61185189A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185189A true JPS61185189A (ja) | 1986-08-18 |
Family
ID=12127639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60024050A Pending JPS61185189A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61185189A (ja) |
| DE (1) | DE3603958A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0240224A3 (en) * | 1986-03-31 | 1989-02-01 | Interferon Sciences, Inc. | An alpha interferon analogue |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56150100A (en) * | 1980-01-08 | 1981-11-20 | Biogen Nv | Manufacture of dna order,recombination dna molecule and human interferon-like polypeptide |
| JPS58201798A (ja) * | 1982-03-23 | 1983-11-24 | ブリストル―マイヤーズ スクイズ カンパニー | アルフア−インタ−フエロンＧｘ−１ |
-
1985
- 1985-02-08 JP JP60024050A patent/JPS61185189A/ja active Pending
-
1986
- 1986-02-07 DE DE19863603958 patent/DE3603958A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56150100A (en) * | 1980-01-08 | 1981-11-20 | Biogen Nv | Manufacture of dna order,recombination dna molecule and human interferon-like polypeptide |
| JPS58201798A (ja) * | 1982-03-23 | 1983-11-24 | ブリストル―マイヤーズ スクイズ カンパニー | アルフア−インタ−フエロンＧｘ−１ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3603958A1 (de) | 1986-08-14 |
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