JPS6119500A - 多形性制限部位の検出方法 - Google Patents

多形性制限部位の検出方法

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JPS6119500A
JPS6119500A JP60114408A JP11440885A JPS6119500A JP S6119500 A JPS6119500 A JP S6119500A JP 60114408 A JP60114408 A JP 60114408A JP 11440885 A JP11440885 A JP 11440885A JP S6119500 A JPS6119500 A JP S6119500A
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probe
restriction site
restriction
nucleic acid
labeled
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JP60114408A
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ランドール　ケイチ　サイキ
ヘンリー　アントニー　アーリツチ
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Cetus Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、特定の核酸配列中の特定の制限部位の存在
又は不存在の検出に関し、この検出においては該部位に
わたる配列にアニールされる末端ラベルされ基オリゴヌ
クレオチドプローブを使用する。この検出系の使用例は
、鎌状赤血球貧血の検出においてヒトβ−グロビン遺伝
子の直接分析のたあにオリゴヌクレオチドプローブを使
用する方法及びキットである。
〔従来の技術〕
近年、ヘモグロビン疾患の分子的基礎が大きな発展をと
げた。モデル系として鎌状赤血球貧血及びβ−地中海貧
血を用いて、研究者達はこれらの遺伝的疾患の分子的基
礎を十分に理解すること及び胎児期疾患の直接的診断手
段を開発することを試みてきた。
１９８１年まで、この分野の研究は制限断片の長さの多
形性（ｒｅａｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌ
ｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈ　ｉｓｍ　；　ＲＦＬＰ
　）の研究に集中していた。
研究者達は、部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用い
るヌクレオチド配列の切断が限定された長さのα仏断片
をもたらすことを見出した。カン及びドジー、プロシー
ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ
・サイエンシス・オプ・デ・ユナイテッド・スティソ・
オプ・アメリカ（ＰＮＡＳ　）　（１９７８）　７５　
：　５６３１−５６３５は、ヒトβ−グロビン遺伝子の
Ｈｐａ　Ｉ切断により生成されるＲＦＬＰを報告し、正
常７．６ｋｂ断片の１３ｋｂ変形物と鎌状赤血球変異と
の関係を示した。
この連鎖分析法（ｌｉｎｋＬｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）
は非常に有用であるが、家族構成員の分析を必要とし、
そして正常遺伝子と変異遺伝子との間の区別がしばしば
不可能でさえある。連鎖分析は家族内の特定の疾患に関
連するＲＦＬＰの相互分離に基礎を置いており、家族調
査が不完全であるか又は不可能である場合にはこの分析
は限定され又は結論的でない。
１９８１年に、ギーペル等、グロシーディングス・オツ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・
オブ・デ・ユナイテンド・スティソ・オプ・アメリカ（
ＰＮＡＳ　）　（１９ｓ　１　）　７　ｓ　：５０８１
−５’０８５が初めて鎌状赤血球貧血を診断するための
連鎖分析にたよらない直接的手段を報告した。この報告
は、使用し得る診断法における大きな改良を示した。分
析を完全なものにするた一ペル等は、鎌状赤血球貧血の
直接分析のために、ヌクレオチド塩基配列″’　ＣＴＮ
ＡＧ″（ここでＮは任意の塩基である）を認識する制限
汗ンドヌクレアーゼＤｄｅ　Ｉの使用を報告した。β−
グロビン遺伝子の鎌状赤血球対立遺伝子中の変異（Ａか
らＴへ）によりＤｄｅ　Ｉ認識部位が廃止される。この
研究の結果は、このような特定のエンドヌクレアーゼ゛
の使用が、鎌状赤血球貧血を生じさせる変異が存在する
か否かに依存して種々の長さの制限断片の形成をもたら
すであろうことを示した。鎌状赤血球貧血の直接分析の
ための、ギーペル等により用いられた方法の詳細な記載
は１９８３年７月２６日に与えられた米国特許４，３９
５，４８６号中に見出される。
キーヘル等の方法の改良がオルキン等、ニュー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ、　Ｅｎｇ
ｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）　（１９８２）　３０７：３２
−３６に記載されている。この方法は、正常α偽を切断
するが鎌状赤血球訪仏を切断しない制限酵素Ｍｓｔｌｌ
を使用する点においてギーペル等の方法と異る。
ＭｓｔｌｌはＤｄｅ　ｌにより得られる断片よ）大きな
断片を生じさせ、そしてＭｓｔｌｌの使用によりギーペ
ル等の方法に存在する限界の幾つかが除去される。
特に、オルキン等による改変は、Ｄｄｅ　ｌを用いる消
化により生ずる小ＤＮＡ断片の同定を必要としないで鎌
状赤血球遺伝子の直接分析を可能にする。
さらに、この方法は、培養されていない羊水から直接得
られた細胞の直接分析を可、能にする。
鎌状赤血球貧血の直接分析の方法の他の改良がコナー等
、プロシーディンゲス・オツ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オツ・サイエンシス・オツ・ザ・ユナイテッド・
スティソ・オプ・アメリカ（型態）　（１９８３）８０
　：２７８−２８２により記載されている。この書物に
おいては、ＤＮＡ配列中の点変異を含む任意の遺伝的疾
患の診断のための一般的方法が記載される。試験された
モデル系は鎌状赤血球貧血に関連するβ−グロビン遺伝
子であるが、しかしながら他の類似の方法〔ネイチ＾ア
ー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（１９８３）　、　３０４　：
　２３０−２３４）がα１−抗トリゾシン不全の胎児期
診断のために使用されている。鎌状赤′血球貧血及びα
１−抗トリゾシン不全の両者に適用されるこの技法は１
９塩基長（１９−ｍａｒ　）オリゴデオキシリがヌクレ
オチドプローブを使用する。コナー等の方法を用いる鎌
状赤血球貧血の分析においては、正常β−グロビン遺伝
子と鎌状赤血球変異遺伝子とを識別するために単一点変
異を含む約１９塩基長の特異的ゾｏ−ｆが必要である。
この方法はαｌ−抗トリプシン不全の検出において特に
有用である。臨床的に有益な多形性ノ臂ターンをもたら
す制限酵素を欠くためにＲＦＬＰにより前記の不全を容
易に検出することができないからである。
コナー等の方法の欠点は１９塩基オリゴマーを使用する
ことに基〈限界である。対立遺伝子変異間の識別はゲノ
ムＤＮＡと合成オリゴデオキシリゾヌクレオチド（１９
−ｍａｒ）プローブとの間に形成されるデュプレックス
の熱安定性に基礎を置いている。１９塩基オリゴマーよ
シ非常に大きいオリゴデオキシリがヌクレオチドは１個
の塩基ミスマツチ（ｂａｓｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　）に
よって十分に不安定化されず、従ってこの方法は１９塩
基よシ実質的に長いプローブを用いることができない。
しかしながら、グツ五〇ＮＡが複雑であれば、１９−ｍ
ａ　ｒプローブは特異的β−グロビン）杭配列の＃１か
に多くの）仏配列にハイブリダイズするであろう。この
問題は、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生
成されたβ−グロビン断片をプローブとハイブリダイズ
する他のすべての断片から分離するグル電気泳動段階を
必要なものとする。この段階は“シグナル＃（β−グロ
ビン）をンイズ”２５−　ラ物理的に分離するために必
須である。
断片を分離した後、ｒルを乾燥し、次に電気泳動的に分
離された断片とプローブとの“インーシチュ′ハイブリ
ダイゼーションを行う。このよりなグル操作には時間が
かかり、技術的に困難な分析方法を提供する。
検討したように、引用した文献は、制限断片長多形性（
ｒｅｓｔｒｊｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇ
ｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｌｓｍｓ　：　ＲＦＬＰ　）又
は差ハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｊ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　）を用いる遺伝的疾
患の検出のための直接法を記載している。シ赤しながら
、この分析を行うために必要とされる複雑さのために、
日常的臨床試験にこれらの方法を応用するには限界があ
る。この発明は、特異的多形質（及び非多形性“）制限
部位の存在又は不存在を検出するための迅速で鋭敏な方
法を記載することによって上記の限界を克服す不。
この方法は、多形性制限部位が臨床的有意義である鎌状
赤血球貧血又は他の遺伝的疾患のごとき胎児期診断の可
能な遺伝的疾患に適用することができる。
〔発明が解決しようとする問題点〕
との発明は、特に設計されたオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて特定の核酸配列中の特定の制限部位の存在又
は不存在を検出する方法を導入することにより、上に検
討した技法に伴う欠点を克服する。
〔問題点を解決するだめの手段〕
この発明の１つの態様は、特定の核酸配列中の少なくと
も１つの特定の制限部位の存在又は不存在を決定する方
法であって、この方法は、（ｅ）　　前記核酸配列を検
出されるべき各制限部位のためのオリゴヌクレオチドプ
ローブ（このプローブは、対応する制限部位にわたる前
記核酸配列中の−゛域に相補的であり、そしてこのプロ
ーブは前記対応する制限部位に近い方の末端においてラ
ベルされている）とハイブリダイズせしめ；（ｂ）　　
前記ハイブリダイズされた核酸配列を各プローブのため
の制限エンドヌクレアーゼ（この制限エンドヌクレアー
ゼは検出されるべき前記制限部位においてその対応する
プローブを切断し、とれによってラベルされたオリゴマ
ー断片とラベルされていないオリゴマー断片を生成する
ことかでき、ここで該ラベルはプローブ上のそれと同じ
である）により消化し； （ｃ）　　ラベルされ切断されたオリゴマー断片をラベ
ルされているが切断されていないオリゴマーから分離し
；そして （ｄ）　　ラベルされたオリゴマー断片の存在又は不存
在を決定する； ことを特徴とする。
ハイブリダイゼーション段階（＝）に十分なバックグラ
ウンドシグナルが存在する場合・段階（ｅ）の後であっ
て消化段階（ｂ）の前に２つの追加の段階すな　　　　
　　賢わち、段階（ａ）のハイブリダイゼーション混合
物に、検出されるべき各制限部位において少なくとも１
塩基対のミスマツチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ　）を有する点
を除き各プローブに相補的であるラベルされていないブ
ロッキングオリゴマーを加え；そして前記ハイブリダイ
ゼーション混合物を前記ブロッキングオリゴマーの存在
下でハイブリダイズせしめる；段階をさらに含める。
特異的オリゴヌクレオチドプローブは、感染性の又は遺
伝的疾患のごとき特定の疾患と一般に関連する注目の核
酸配列の有益な制限部位にわたる・ように選択する。プ
ローブは、核酸へのハイブリダイゼーションの所望の適
切な特異性を達成するのに十分な長さを有しなければな
らない。鎌状赤血球貧血の場合・約４０塩基の長さのオ
リゴヌクレオチドプローブが効果的であることが見出さ
れた。但し、一層長いか又は一層短いプローブを使用す
ることもできる。プローブは一端においてラベルされ、
そして注目の制限部位がラベルされない末端よシもラベ
ルされた末端に一層近いように設計される。ラベルには
当業者により知られている任意の適当なラベルが含まれ
、これには放射性ラベル及び非放射性ラベルが含まれる
。典型的な放射性ラベルには３２ｐ　、　１２５１　、
３５Ｓ、又はこれらに類似するものが含まれる。非放射
性ラベルには、例えばリガンド、例えばビオチンもしく
はチロキシン、又は酵素、例えばヒドロラーゼもしくは
・（−オキシダーゼ、又は種々の化学発光物質例えばル
シフェリン、又は螢光化合物、例えばフルオレッセイン
及びその誘導体が含まれる。プローブはまた、分離を容
易にするために両端を異るタイプのラベルによ）ラベル
することができ、例えば上記の一端に同位元素ラベルを
用い、そして他端にビオチンラベルを用いることができ
る。
との゛発明の好ましい態様は、一方又は両方の対立遺伝
子の特定の核酸配列中の多形性制限部位の存在又は不存
在を検出するための方法であって、この方法は、 （ａ）　　前記核酸配列を、オリゴヌクレオチドプロー
ブ（このプローブは、１方のみの対立遺伝子中に存在す
る第１制限部位及び両対立遺伝子に共通の第２制限部位
にわたる前記核酸配列中の領域に相補的であり、そして
このプローブは前記制限部位の１方に近い末端において
ラベルされている）とハイブリダイズせしめ： （ｂ）　　前記ハイブリダイズされた核酸配列を第１制
限エンドヌクレアーゼ（この制限エンドヌクレアーゼは
前記第１制限部位のみにおいて前記プローブを切断して
ラベルされたオリゴマー断片及びラベルされていないオ
リゴマー断片を生成することができ、ここで該長ペルは
プローブ上のそれと同じである）により消化し； （ｅ）　　段階（ｂ）からの前記消化物を第２制限エン
ドヌクレアーゼ（この制限エンドヌクレアーゼは前記第
２制限部位のみにおいて前記プローブを切断してラベル
されたオリゴマー断片及びラベルされていないオリゴマ
ー断片を生成することができ、ここで該ラベルはプロー
ブ上のそれと同一である）により消化し； （ｄ）　　ラベルされ切断されたオリゴマー断片を切断
されていないオリゴマーから分離し；そして（ｅ）　　
第１又は第２制限エンドヌクレアーゼによる切断と一致
する特定の塩基長さを有するラベルされた断片の存在又
は不存在を検Ｉｌｔ、する：ことを特徴とする。
この発明の他の態様は組状赤血球貧血の胎児期検出のた
めの診断キットに関し、このキットは（ｅ）注目の制限
部位において正常β−グロビン（βＡ）と相補的であっ
て該制限部位の近い方の末端においてラベルされている
特異的４０」１基オリゴデオキシリボヌ多レオチドレロ
ープ、（ｂ）制限酵素Ｄｄｅ　Ｉ（及び逐次的消化を用
いる場合にはＨｉｎｆ　Ｉ）、及び場合によっては適当
な比較対照、こうして生成されたラベルされたオリゴマ
ーを検出するための手段、゛及び検出のために必要であ
ればプローブに相補的な特異的ブロッキングオリゴマー
を含ンで成る。このキットは組状赤血球貧血の胎児期診
断のだめの迅速で鋭敏な測定音もたらし、この測定は複
雑な操作を必要とする複雑なＲＦＬＰ測定に比べて大き
く改良されている。
この明細書において、プローグ、検出されるべきオリゴ
マー断片、オリゴマ一対照、ラベルされていないブロッ
キングオリゴマー、及び配列の増幅のためのブライマー
について使用される６オリゴヌクレオチドなる語は、３
、個よシ多くのデオキシリボヌクレオチド又はりがヌク
レオチドを含んでなる分子として定義される。この正確
なサイズは多くの因子に依存し、この因子は今度は該オ
リゴヌクレオチドの最終的機能及び用途に依存する。
この明細書において″制限エンドヌクレアーゼ″及び６
制限酵素″なる語は、特定のヌクレオチド配列の又はそ
の近傍の２本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を意味する。
この明細書において″）払多形性（ＤＮＡｐｏ１７ｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ　）”なる語は）２又はそれよシ多くの異
るヌクレオチド配列が胱中の特定の部位に存在し得る状
態について用いる。
この明細書において”制限断片長さ多形性（ＲＦＬＰ）
′なる語は、特定の制限断片の長さの個体間の相違を意
味する。
この明細書において１十分なバックグラウンドシグナル
”とは、非特異的ゲノム配列へのオリゴヌクレオチドプ
ローブの場合によっては生ずる交差ハイブリダイゼーシ
ョン、及びこれに続く、正しいシグナルの検出を妨害す
るのに十分な頻度で生ずる制限エンドヌクレアーゼによ
る切断によって生ずるシグナルを意味する。
この発明において使用することができる一核酸は、それ
が所与の核酸配列中の注目の特定の制限部位（１又は複
数）を含有する限り、生物を包含する任意の入手源から
誘導することができる。従ってこの発明の方法は、単鎖
もしくは２本鎖の純ＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はＤＮＡ
−ＲＮＡバイブリド、あるいけ核酸の混合物を用いるこ
とができる。但し、これらが注目の特定の制限部位に対
応する制限二ン１−。
ヌクレアーゼにより切断され得ることを条件とする。入
手源には例えば、ＰＢＲ３２２のごときプラスミド、ク
ローン化α勉もしくは沿仏、又はゲノムＤＮＡもしくは
ＲＮＡが含まれ、これらは任意の分離源、例えば細菌、
酵母、ウィルス、並びに高等生物、例えば植物、トリ、
は虫類及び哺乳類に由来する。
ダノムＤＮＡは血液、尿、組織材料、例えば絨毛膜又は
羊毛細胞から、種々の技法〔例えば、マニアチス等、モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｔａｒ　Ｃ１
ｏｎｉ’ｎｇ　）　（１９８２）　＋２８０−２８１に
記載されている技法〕により調製することができる。必
要であるか又は望ましければ、粘度を低下せしめるため
に、分析されるべき、調製されたヒ）　ＤＮＡのサンプ
ルを物理的に剪断し、又は特異的制限エンドヌクレアー
ゼを用いて消化することができる。
核酸はそのま塘で使用することができ、又は例に記載す
るように、核酸を含有する配列を増幅して感度を上昇せ
しめることができる。
注目の核酸をすぐ使用できるように用意した後、注目の
制限部位に相補的な領域を含有するオリゴヌクレオチド
プローブを、存在する各異る制限部位のために・好まし
くはモル過剰において加える。
次に、核酸中のその相補的配列へのアニールを行う。使
用される末端ラベルされたオリゴヌクレオチドノａ−グ
は、注目の制限部位に近い方にラベル末端を有するその
制限部位にわたり、そして厳重な（’　ｓｔｒｉｎｇｅ
ｎｔ　）条件下で特異的なノ・イブリダイゼーションを
生じさせるのに十分な長さを有するように設計される。
プローブは好ましくはオリゴデオキシリ〆ヌクレオチド
プローブである。
注目の核酸にアニールする特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブの使用は、オリゴマーハイブリダイゼーションの
ための当業界において知られている方法とは相当に異る
。従来記載されている方法においては、ＤＮＡが制限酵
素により消化され、サイズ画分され、そしてアガロース
ゲル又は濾過膜のどとき支持体上に固定化された後にＤ
ＮＡ　プローブが加えられる。この発明においてはオリ
ゴヌクレオチドプローブはン欠の機能を有する。すなわ
ち（１）溶液・・イブリダイゼーションにより注目の核
酸の特定の配列を同定し、（２）該ヌクレオチドにアニ
ールした後制限酵素のだめの基質として機能する。
前記のように、十分なバックグラウンドが存在　　　　
　　　０する場合には、使用されたプローブに特異的な
ラベルされていないオリゴヌクレオチド（ブロッキング
オリゴマー）を、前記ノ・イブリダイゼーション後に反
応混合物に加える。このオリゴマーはプローブに相補的
であるが検出されるべき各制限部位内に少なくとも１個
の塩基対５スマツチを有し、このため核酸にまだハイブ
リダイズしていないラベルされたプローブがこのブロッ
キングオリゴマーとハイブリダイズし、そしてそれ故に
、検出されるべき各制限部位を認識する制限酵素を用い
る消化によって切断されないであろう。ブロッキングオ
リゴマーの機能は、次に加えられる制限酵素の作用のた
めに必要な低下した厳重さくｒｅｄｕｃｅｄｓｔｒ　ｉ
ｎｇｅｎｃｙ）の条件下での過剰量のラベルプローブと
非多形性核酸断片との非特異的ハイブリダイゼーション
を除去することである。各制限部位内の塩基対ミスマツ
チ数は主としてプローブ中の制限部位の位置に依存する
であろう。
ブロッキングオリゴマーを添加した後、反応混合物を再
びハイブリダイゼーション条件にかける。
この条件は一般に第１ハイツリダイゼーシヨン段階で使
用される条件と同じであるが通常は一層短時間である。
第１ハイツリダイゼーシヨン段階においてラベルされた
陽性対照が存在する場合・この陽性対照に特異的なラベ
ルされていないブロッキングオリゴマーを添加すること
が必要であろう。
このラベルされていないブロッキングオリゴマーは検出
されるべき各制限部位内に少なくとも１塩基対のミスマ
ツチを含有する。ブロッキングオリゴマーはラベルされ
た過剰の陽性対照を除去するであろう。このブロッキン
グオリゴマーはプローブのためのブロッキングオリゴマ
ーと同時に添加することができる。
適切な制限酵素による、オリゴヌクレオチドプローブと
核酸とのデユプレツクスの適当な消化条件における消化
によって、調製された核酸とハイブリダイズしそして制
限部位ｔｌ−再形成したオリゴマーのみが切断される。
この部位はオリゴヌクレオチドゾａ−グのラベルされた
末端に近いので、使用される制限酵素によって核酸配列
が切断され得るのであれば、消化生成物はラベルされた
プロ−ツの非常に短い断片を含むであろう。
ラベルされた切゛断されたオリコ゛マーと切断されない
オリがマーの得られ要理合物は任意の適当な分離技法に
よ）分離することができる。この方法には、他端がビオ
チン化されるプローブへのアビジンの添加、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、及び薄層クロマトグラフィーが
含まれる。オリゴマー制限生成物の薄層クロマトグラフ
ィーによる分析はクローン化された遺伝子のために有用
である。しかしながら、）ＩａツムＤＮＡのためには、
例えば３０１グルを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動が優っている。なぜなら、この電気泳動は一層速く
展開し、小才リプマーを可視的に分離するのに十分な程
度の分離性を有し、そして一層鋭敏であって無傷のプロ
ーブのノ々ツクグラウンドストリーキングが少なく、こ
の結果、検出し得るシグナルを生成するのに必要なｒツ
ムＤＮＡが少なくてよいからである。上記の制限部位に
近い方の端に異るラベルを有するビオチン化プローブに
アビジンを添加する技法もまた・ラベルされた断片から
未切断プローブを分離する場合に非常に効果的である。
注目の制限部位に近い方のプローブ端をラベルするため
に使用されるラベルのタイプに依存して、分離された断
片は次に、例えばオートラジオグラフィーによυ、又は
螢光もしくは化学ルミネセンスのごとき他の検出法によ
り検出することができ　　、る。
この技法の実際的な用途は鎌状赤血球貧血の検出のため
のその使用に見ることができる。鎌状赤血球貧血は、β
−グロビン遺伝子の６番目のコドンにおけるアデニンか
らチミンへの１個の塩基対の変化によル惹起されるヘモ
グロビン疾患である。
正常β−グロビン（１勺は、第５コドンと第６コドンに
わたる制限酵素Ｄｄ＊　Ｉのだめの制限部位を含有する
。ｏａ＠Ｉの一般的なｇ識配列はＣＴＮＡＧであり、こ
こでＮは任意のヌクレオチドでおる。正常β−グロビン
の特定の配列はＣＴＧＡＧである。鎌状赤血球β−グロ
ビン（β８）の場合、変異がこの５個の塩基配列をＣＴ
ＧＴＧに変え、この配列はもはやＤｄｅ　１の切断部位
ではない。従って、正常β−グロビン遺伝子はその第５
コドンにおいてＤｄｅ　Ｉにより切断されるが、鎌状赤
血球対立遺伝子中の同じ部位はこの酵素によって切断さ
れない。同じ目的に役立つ他の制限酵素、例えばＭａｔ
　ＩＩ　、　Ｃｖｎ　Ｉ又は８ａｕ　ＩをＤｄｅ　１の
代シに使用することができる点に注目すべきである。
多形性Ｄｄｅ　（制限部位を含む正常β−グロビン遺伝
子の領域に相補的な４０塩基オリゴデオキシリボヌクレ
オチドプローブ（４０−ｍａｒ　）　（プローブＨＥＯ
９）を合成し、そしてその５′末端においてラベルする
ことができる。次に、ラベルされたプローブをゲノムＤ
ＮＡに、好ましくはモル過剰に添加し、そしてＤＮＡ中
のその相補的配列にアニールせしめる。有意義な結果を
保証するために必要であれば・陽性対照及び／又は陰性
対照をノ・イブリダイゼーション混合物中に存在せしめ
ることができる。
ハイブリダイゼーションの後、反応混合物に、プローブ
と相補的であるがＤｄｓ　１部内にミスマツチを有する
ラベルされていない４０塩基長オリデデオキシリポヌク
レオチド（ブロッキングオリゴマー）（ＨＥＩＯ）を加
えることができる。この場合、このブロッキングオリゴ
マーとハイブリダイズするラベルされたプローブはＤｄ
ｅ　、　ｌ消化によって切断されないであろう（第１図
）。次に、この混合物を一層短時間にわたって同じハイ
ブリダイゼーション条件にかける。
次に、ハイツリダイゼーション混合物をＤｄ＠１又は同
等な制限酵素で消化する。制限酵素によるこの処理に続
き、切断されラベルされたオリゴマー及び未切断のラベ
ルされたオリコ゛マーを上記のようにして迅速に分離し
、そして適当な技法により可視化することができる。
第２図は、正常β−グロビン遺伝子、及び鎌状赤血球β
−グロビン遺伝子に対してこのタイプの分析が行われた
場合に生ずるラベルされたオリゴマーを図解的に例示す
る。
使用する特定のプローブに依存して、該プローブとのア
ニーリングに先立りて注目のＤＮＡを制限酵素８ｆａＮ
Ｉで処理することが必要である。このことは、プローブ
がヒト−ゲノムのδ−グロビン遺伝子と交差ハイブリダ
イズする場合に必要である。
プローブＨＥＯ９の場合、δ−グロビン遺伝子はＤｄｅ
　Ｉ制限部位を常に再形成する。第３図は、正常β−グ
ロビン遺伝子、鎌状赤血球β−グロビン遺伝子、及びδ
−グロビン遺伝子の間の１塩基の相違、並びにこれらの
対応するＤｃｌｅ　Ｉ部位及び８ｆａ　ＮＩ部位を示す
。生成するオリゴマーが正常β−グロビン遣゛伝子中の
みに存在する制限部位を反映する（間違った陽性結果を
回避する）ことを保証するため、このプローブを使用す
る場合にはδ−グロビン遺伝子中のＤｄｅ　１部位を除
去しなければならない。
δ−グロビン遺伝子からＤｄｅ　１部位を除去するため
に酵素Ｓｆａ　ＮＩを使用することができる。
８ｆａ　ＮＩ部位（ＧＣＡＴＣ）はδ−グロビン遺伝子
の２３〜２７位に存在するが、正常β−グロビン遺伝子
及び鎌状赤血球β−グロビン遺伝子中では塩基２６にお
いて異るため８ｆａＮＩ部位は存在しない（第３図）。
８ｆａ　ＮＩはその認識部位の５及び９塩基“下流”を
切断するため、５ｆａＮＩ消化によりＤｄｓ　１部位が
除去される。ｒツムＤＮＡが、δ−グロビン遺伝子と交
差反応するオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブと
アニールする前にこの酵素によυ消化されれば、このプ
ローブはδ−グロビン遺伝子と共にＤｄｅ　Ｉ部位を再
形成することができず、従ってこの方法により生成する
３−ｍａｒが正常グロビン遺伝子にアニールするプロー
ブのみに基づくことが保証されるであろう。第４図は、
５ｆａＮＩによる処理の後のグロビン遺伝子の３つの形
の間の比較を示し、正常β−グロビン遺伝子を除きＤｄ
ｅ　１部位を欠いていることを示す。従ってＤｄｓ　Ｉ
による消化は正常β−グロビンのみについて３−ｍａｒ
の形成をもたらし、この測定が正常β−グロビンの検出
のために限定的であることが確認される。この方法にお
いて、正常（β１βりである患者又は鎌状赤血球対立遺
伝子（β１β８）のキヤ　　　　　　　背リヤーが、鎌
状赤血球貧血遺伝子（β８β８）を有する患者から区別
されるであろう。
好ましい態様においては、プローブはδ−グロビン遺伝
子と交差ハイブリダイズせず、その結果δ−遺伝子を不
活性化するためにＳｆ＠ＮＩによジグツムＤＮＡを前消
化する必要がない。５ｆａＮＩは高価な酵素であり、そ
して薄い、濃度でのみ入手することができる。β−グロ
ビン遺伝子に特異的であるがδ−グロビン遺伝子と５個
のミスマツチを形成するプローブの例を耶１１として第
７図に示す。これが、両グロビン遺伝子と非常に良好に
７・イブリダイズするプローブＨＥ：０９と比較される
。
５個のミスマツチが、プローブ）ｆＥｌｌ　カシ−グロ
ビン遺伝子とハイブリダイズするのを回避するのに十分
な程度に不安定化している。第７図はさらにＨＷｌｌと
その特異的ブロッキングオリゴマー（ＨＥＩ２と称する
）との間の関係を示す。塩基対ミスマツチがＤｄａ　１
部位内に存在し、そして酵素によるＨＥＩ　］　／ＨＥ
１２バイブリドの切断を除去している。
シグナルの欠如が試験を実施する際の誤まシに基〈もの
でないことを保証するために、プローブを含有するハイ
ブリダイゼーション混合物にラベルされた陽性対照オリ
ゴヌクレオチド（オリゴマー）を加えることができる。
例えｄ、β−グロブリン遺伝子は幾つかの不変（１ｎｖ
ａｒｉａｎ、ｔ）　（非多形性）　Ｄｄｅ　１部位を含
有し、この部位は鎌状赤血球貧血と関連する多形性Ｄｄ
＠１部位と異υ、β−グロブリン遺伝子中に常に存在す
る。これらの非−多形性Ｄｄｅ　１部位の１つを含む領
域にアニールし、そしてとの非−多形性Ｄｄｅ　１部位
に近い方の末端においでラベルされている陽性対照オリ
ゴマーを設計することができる。このものが７１イブリ
ダイゼ一シヨン混合物に加えられた場合、プローブのハ
イブリダイゼーション及び消化についての内部陽“性対
照として機能する。
第８図は、プローブＨｇ１ｌに特異的なＧＨ］、１　と
称するラベルされた４０−ｍａｒ陽性対照を示しており
、このものはプローブ厄１１か・ら約３５０塩基下流の
β−グロビン遺伝子の（刊鎖にアニールする。
ＧＨ１１トβ−グロビンとのアニーリング混合物をＤｄ
ｅ　Ｉにより消化した後ラベルされたヘキサマー（６−
ｍａｒ）が生ずる。この陽性対照は、第８図に示すよう
に、β−グロビンに特異的であり、６塩基対のミスマツ
チのためδ−グロビン遺伝子とは有意にアニールしない
。第８図はさらに、１１１と、ＧＨＩ２と称するその特
異的ブロッキングオリゴマーとの間の関係を示している
。塩基対ミスマツチがＤｄｅ　１部位内に存在し、そし
てこれがＧＨＩ　１　／ＧＨ１２バイブリドの酵素によ
る切断を防止する。
この陽性対照は特に、錐状赤血球対立遺伝子についてホ
モ接合体であるかもしれないｒツムＤＮＡを試験する場
合に重要である。この場合には、プローグが鋸状赤血球
β−グロビン遺伝子にアニールした場合にＤｄｅ　１部
位を形成することができないため、このオリゴヌクレオ
チドプローブはＤｄｅ　１によ）切断されないであろう
。しかしながら陽性対照を用いなければ、試験の誤りの
ためにシグナルが生じなかったという可能性を排除する
ことが困難である。陽性対照のためのブロッキングオリ
ゴマーは、・陽性対照の存在下でプローブとＤＮＡとの
ハイブリダイゼーションを行った後に該プローブのため
のブロッキングオリゴマーと共に反応混合物に加える。
このブロッキングオリゴマーの機能は、バイブリグ、イ
ゼーション混合物中に存在する過剰の陽性対照を除去す
ることである。
配列中の１個の塩基対変異によって惹起される遺伝性疾
患の検出のための好ましい態様においては、対立遺伝子
の性質、すなわち遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ’）が正
常であるが、変異体であるが、又はキャリヤー（ｃａｒ
ｒｉｅｒ）であるかを直接的且つポジティブに決定する
ために逐次消化法が使用される。上記のオリゴデオキシ
リボヌクレオチドプローブＨＥＩＩは正常β−グロビン
遺伝子を直接検出することができるが、錐状赤血球対立
遺伝子を直接検出することはできない。これは、プロー
ブが正常遺伝子にアニールし、そしてＤｄｅ１部位を再
形成する場合にのみトリマー（ｔｒｌｍｅｒ　）シグナ
ルが発生するからである。ＨＥ１１７″ロープが鎌状赤
血球配列にハイブリダイズする場合にはオリゴマー切断
生成物は生成されないから、シグナルの不存在が錐状赤
血球遺伝子の存在を示す。従って、臨床的に有意義な鎌
状赤血球個体（ＳＳ）の同定は特異的なシグナルの不存
在によって行われる。
さらに、プローブＨＥＩＩを用いて錐状赤血球形質を担
持する個体（Ａｓ）から正常個体（ＡＡ）を区別するこ
とは困難である。トリマーシグナルはいずれの場合にも
生ずるからである。（原理的には、晶個体のシグナル強
度は、−遺伝子の量に基いて、ＡＳ患者のそれの２倍で
あるべきである。しかしながら実際には、非常に注意深
い技法を用いない限ル強度の差にたよることは困難であ
る。）これらの問題を克服するために新しい方法及びＲ
８０６と称するプローブを開発した。このプローブは、
これがアニールした特定の対立遺伝子に依存して異るシ
グナルを発生せしめる。すなわち、Ｒ８０６が正常遺伝
子にアニールすればオクタマーが生じ、錐状赤血球遺伝
子に結合すればトリマーが生ずる。この方法は、β−グ
ロビン遺伝子中の多形性Ｄｄｅ　ｆに直接隣接する不変
Ｈ３ｎｆ１部位に頼る（第１０図）。４ｏ−塩基Ｒ８０
６プローブはプローブＨＥ１１と密接に関連し、これら
両制限部位にわたる（第１１図）。第１１図はさらに、
Ｒ８０６とその特異的ブロッキングオリゴマーＲ８ｌ０
との関係を示す。ＨｉｎｆＡ部位内に存在する１個の塩
基対ミスマツチ及びＤｄａ　！部位内の２重ミスマツチ
が、これらの酵素によるＲ８Ｏ６’／Ｒ８１０バイブリ
ドの切断を防止する。
概説すれば、この方法はラベルされたプローブをβ−グ
ロビン配列にアニールせしめ、そして次にＤｄｅ　Ｉに
より消化することを含む。正常β−グロビン遺伝子にア
ニールしたすべてのＲ８０６分子はＤｄｅ　夏部位を再
形成しそしてこの酵素によって切断されてラベルされた
オクタマーを生成するであろう（卿２図）。鎌状赤血球
配列にハイブリダイズしたこれらのプローグ分子はＤｄ
ｅ　１部位を再形成せず、そして言うまでもなくこの酵
素によ）切断されない。次に反応混合物にＨｉｎｆ　Ｉ
を加えることによ）、錐状赤血球遺伝子に結合した状態
にあるすべてのオリゴマーはＨｉｎｆ　Ｉによ）切断さ
れ、そしてラベルされたトリマーが生成するであろう（
第１３図）。
プローブＲ８０６はラベルされた陽性対照もこの対照の
ためのブロッキングオリゴマーも必要としない。陽性対
照がプローブの中に組み込まれているからである。
化学量論的には、正常個体（ＡＡ）は２個のオクタマー
を生成し、鎌状赤血球キャリヤー（ＡＳ）は１個のオク
タマーと１個のトリマーを生成し、そして錐状赤血球個
体（ＡＡ）は２個のトリマーを生成するであろう。従っ
て、特異的シグナルが鎌状赤血球対立遺伝子の存在と関
連しており、そして今や晶遺伝子型とＡｓ遺伝子型との
区別が可能である。
この発明の方法はさらに、感染性疾患のごとき疾患と関
連する特定の核醗配列中の特定の不変（非多形性）制限
部位の存在を検出するためにも使用することができる。
感染性疾患の例には、細菌類、例えばサルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ　）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｉｄｉ
ａ）、ゴルア（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、レジオネラ（Ｌ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａ゛）等；ウィルス類、例えば肝炎ウ
ィルス及びＲＮＡウィルス；マラリアのごとき寄生生物
；並びに他の関連生物によって惹起される疾患が含まれ
る。さらに、この発明の方法は、α−地中海貧血の臨床
診断のための特定の遺伝子（例えばα−グロビン）の不
存在又はα−グロビンの１〜３コピーの存在、於び特定
の遺伝子の変異及び増幅、例えばゾロトー腫瘍遺伝子か
ら腫瘍遺伝子への変換を検出するために使用することが
できる。例えば、種々の癌においてｎ−ｒＱｙｅ遺伝子
が増幅されることが示されている。
次に・この発明をさらに具体的に説明するために例を記
載する。但し、これによってこの発明の範囲を限定する
ものではない。これらの例において、特にことわらない
限り、すべてのチは固体については重量基準であり、そ
して液体については容量基準であり、そしてすべての温
度は℃で示す。
以下余白 例１　多形性制限部位の検出方法の原理を説明す自動化
合成法：ビーケージ及びカルーサーズ〔テトラヘドロン
・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｓｔｔｅｒｇ　
）　（１９８１）２２　：　１８５９−１８６２１に従
って合成されにノエチルホスホルアミデイトを、ビオサ
ーチＳＡＭ−１を用いて、制御された多孔性ガラス支持
体に誘導体化されたヌクレオチドに逐次縮合せしめた。
この方法は、ジクロロメタン中でのトリクロロ酢酸によ
る脱トリチル化、活性化プロトン供与体としてベンゾト
リアゾールを用いる縮合、並びにテトラヒドロフラン及
びピリジン中で無水酢酸及びジメチルアミノピリジンを
用いるカップリングを含む。サイクルタイムは約３０分
である。各段階における収率は本質上定量的であり、そ
してこれは脱トリチル化中に放出されるジメトキシトリ
チルアルコールの収集及び分光測定によ）決定された。
オリゴデオキシリボヌクレチドの脱保護及び精製：固体
支持体をカラムから取シ出し、そして密閉チューブ中で
、室温にて４時間、１−の濃水酸化アンモニウムに暴露
した。次に支持体を炉去し、そして部分的に保護された
オリゴデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液を５５
℃にて５時装置いた。アンモニアを除去し、そして残渣
を調製用ポリアクリルアミドゲルに適用した。電気泳動
を３０ゲルト／ｃｒｎにて３０分間行い、そして次に生
成物を含有するバンドを、螢光プレートのＵＶシャドウ
ィングにより同定した。バンドを切り取シ、１−の蒸留
水により４℃にて一液溶出した。この溶液？アルチック
（Ａｌｔｅｃｈ　）　ＲＰ　１８カラムに適用し、そ１
て１チ酢酸アノモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）中アセト
ニトリルの７〜１３ｑ６のグラジェントにより溶出した
。溶出ケ２６０　ｎｍ　ＫおけるＵＶ吸収により監視し
、そして適切な画分金集め、一定容量におけるＵＶ吸収
により定量し、そして真空遠心により室温にて蒸発乾固
した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付け：精製され
たオリゴデオキシリボヌクレオチドの試験アリコートを
ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−５２Ｐ　−ＡＴＰに
より５２ｐでラベルした。ラベルされた化合物を、１４
〜２０チポリアクリルアミドグル上で５０デルト／副に
て４５分間電気泳動した後、オートラジオグラフィーに
より調べた。この方法により分子量を確かめる。塩基組
成を次のようにして決定する。すなわち、ヘビ毒ジェス
テラーゼ及び細菌アルカリ性ホスファターゼを用いてオ
リゴデオキシリボヌクレアーゼをヌクレオシドに消化し
、そして次に、逆相ＨＰＬＣカラム及び１０チアセトニ
トリル７１％酢酸アンモニウム移動相を用いてヌクレオ
シドの分離及び定量を行う。
倉　オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブのリン酸
化 ４０ｍ基長０合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプロ
ーブ’ｆｔ　１０　ｐｍｏｌｅの量において、７０ｍＭ
Ｔｒｉｍ　（ＰＨ７，６）、１００ｍＭ　ＮａＣｔ、　
１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜及び１０　ｍＭ　２−メルカ
プトエタノールを含有する４０μｔの反応容積中で、２
ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにューイング
ランドビオラブス）及び５０　ｐｍｏｌｅのγ−３２Ｐ
　−ＡＴＰ　（ニューイングランドニュクレア、３００
０　Ｃ３／ｍｎｏｌｅ）を用いて３７℃にて１時間、５
′−末端でラベルした。次に、反応容積をＴｒｉｓ　−
Ｆｘｆ′ｒＡ　（ＴＥ）緩衝液（１０ｒＩｉＭＴｒｉｇ
緩衝液、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）に
よりｌＯＯμｔＫ調與し、そしてＴＥ緩衝液で平衡化さ
れたビオグルＰ−４カラム（ビオラド）１−中でのスピ
ン透析によりオリゴマーを未導入ＡＴＰから分離した。
〔マニアチス等、モレキュラー・クローニング（Ｍｅｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）（１９８２）４６４
−４６５）。スピン透析前後の反応°生成物のＴＣＡ沈
澱により、７０〜８０％のプローブオリゴマーがう、ベ
ルされたこと、及び適用された材料の７０チがカラムか
ら回収されたことが示された。キナーゼ処理されたオリ
ゴデオキシリがヌクレオチドプローブの濃度ヲＴＥ緩衝
液によ＃）２０　ｐ　ｍｏｌｅ　／ｍｆｃ調ＩＮした。
クローン化グロビン遺伝子の造成 正常β−グロビン遺伝の１．９ｋｂシ、ｍＨＩ断片をＦ
、コリンズ等、グロシーデインダス・オブ・デ・ナシ、
ナルアカデミ−・オツ・デ・サイエンス・オツ・ユナイ
テッド・スティソ・オプ・アメリカ（旦￥）８１．４８
９４−４８９８（１９８４）により記載されてｈるコス
ミドｐＦｃ１１から単離し、そしてｐＢＲ３２８（ンパ
ーロン等、ゾーン（Ｇｅｎｅ　）　（１９８０）　９　
：　２８７−３０５　）中に挿入した。合成４０−ｍｅ
ｒ７’ロープにハイブリダイズする領域を含むこの断片
は、該遺伝子の第１及び第２エクンン、第１イントロン
、長びに５’フランキング配列を含む〔ラウン等、セル
（Ｃｅ１１．）（１９７８）１５：１１５７−１１７４
）。このクローンをｐＢＲ３２８：コβＡ−１，９（ｐ
ＢＲ：β１と略す）と称する。このものは１９８４年５
月２５日にＡＴＣＣ４３９，６１８として寄託された。
β−グｐピンの鎌状赤血球対立遺伝子の対応する１、　
９　ｋｂ榊ＨＩ断片を、Ｆ、コリンズ等（前掴により記
載されているコスミドｆ１ＦＣ１２から単離し、そして
上記のようにしてクローン化した。この・クローンをｐ
ＢＲ３２８：：Ａ８−１９　（ｐＢＲ：Ａ８と略す）と
称する。このものは１９８４年５月２５日Ｋ　ＡＴＣＣ
屋３９，６９９とて寄託された。
正常δ−グロビン遺伝子の同様の１．４ｋｂ４逮ＲＩ／
ＢｍｍＨＩ断片をｐＦＣ１２から単離し、そしてｐＢＲ
３２８の４すＲＩ　／　ＢａｍＨ１部位にクローン化し
た。この断片は、前記プローブと交差ハイブリダイスす
るδ−グロビン遺伝子の領域にわナシ、そして該遺伝子
の第１エクソン及び５′フランキング配列を含む〔ラワ
ン等、セル（創） （１９７８）１５：１１５７−１１７４３゜このりｐ−
ンをｐＢＲ３２８：：δ−１，４（ｐＢＲ：　δと略す
）と称する。このものは１９８４年５月２５日にＡＴＣ
ＣＡ３９，７００として寄託された。
各組換プラスミドをＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）（ＡＴ
ｃｃＡ３９，６０７　）に形質転換し、そして増加せし
めた。
Ａｌｕ　Ｉ又は５ｆａＮＩＫよるクローン“化グロビン
遺伝子の消化 ８μ９ずりのｐＢＲ：β１、ｐＢＲ：Ａ６、及びｐＢＲ
：δを別々に１００μｔｏ答積中で、３０ユニツトのＡ
ｌｕ　Ｉ　にューイングランドビオラブス）を用いて３
７℃にて１．５時間又は２．４ユニツトの傷＾ＮＩ　に
ニューイングランドビオラプス）を用いて３７℃にて一
夜、いずれの場合にも製造者によって推奨される緩衝液
条件を用いて、消化した。消化され７ｊ　ＤＮＡサンプ
ルをエタノール沈澱し、そしてＴＥ緩衝液中に再懸濁し
て最終濃度ｆ　２５ｐｍｏｌｅ／ｆｎｔとした。
ン及び消化 １０　ＩＬＬ　（０，２５ｐｍｏｌｅ）ずつの、Ａｌｕ
　Ｉ−消化されたか又は５ｆａＮＩ消化された、ｐＢＲ
：β”、ｐＢＲ：β８、及びｐＢＲ：δのそれぞれを５
μｔのキナーゼ処理されたプローブ（０，１０ｐｍｏｌ
ｅ　）及びＴＥ緩衝液と混合し、１．５−のエッペンド
ル７ミクロフユージチュープ中で最終容器３６μｔとし
た。ヒートブロック中で９５℃にて１０分間加熱するこ
とによｆｉＤＮＡｔ−変性し、ミクロヒュージ中で短時
間回転せしめることによりチューブのキャップから凝集
物金除去し、そしてヒートブロックにもどした。サンプ
ルに４μｔの１．５　Ｍ　ＮａＣ１を加え、おだやかに
混合し、そして５６℃に設定されたファンインキーベー
ターに移し、そして３時間アニールせしめた。均一な熱
の分布を促進しそしてハイブリダイゼーション期間中の
凝集を防止するためにはヒートブロック又は水浴よシも
ファン−インキュベーターの方が好ましい。
次に、次の配列：５′− ＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ
ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡ　−３’合有しそして
上記のようにして調製されたラベルされていないブロッ
キングオリゴマーＨＥ　１０（ｅｏ、　１　ｐｍｏｌｅ
）　を加え、そして同じ温度においてさらに、３０分間
ハイブリダイゼーションを続けｗ。
６０ｍＭのＭｇｃｔ２　ｔ　４　μｔ　、及びＤｄｅ　
Ｉ　（１０ユニツト、ニューイングランドビオラプス）
を１μを加え、そしてアニールし７’ｃＤＮＡ１．５６
℃にて１５分間消化した０９５℃にて短時間加熱するこ
とにより反応を停止した。
１０μｔずつの各サンプルをブレコートされたガンスパ
ックシリカダル薄層クロマトグラフィープｖ−）（Ｍ−
ＮシルＧ−２５ＵＶ２５４．プリンクマン・インストル
メンツ）Ｋ適用し、加熱ラングの下で乾燥し、そして４
５４ｎ−プロノイノール、４５）水酸化アンモニウム及
び１０％水から成る溶剤により一夜展開した。次にグレ
ートを乾燥し、１枚の強化スクリーンを用いて一８０℃
にて一夜オートラジオグラフした。
オートラジオグラフの検討（第５図） ４０−　ｍａｒプローブとの７ニーリングに先立って、
正常β−グロビンクロ−ン化ゲノムＤＮＡ（ｐＢＲ：β
Ａ）、鎌状赤血球β−グロビンクＣ＋　−ン化ゲノムＤ
ＮＡ　（ｐＢＲ：β８）、及びδ−グロヒンクローン化
？”／　Ａ　ＤＮＡ（ｐＢＲ：　ａ　）　ｆ、制限酵素
５ｆａＮＩによる処理と同様にして、ＤＮＡをおよそ同
じサイズに切断する制限酵素人復Ｉ（３０５−二、　）
　）　ＶＣよ多処理し７ｔ。４０−　ｍ＠ｒプｐ−ブと
７ニーリングしそして次に制限酵素角１１ｖｃより処理
する場合、正常β−グロビン遺伝子及びδ−グロビン遺
伝子中にはＤｄｅ　Ｉ部μが再形成され、セしてレー′
ンｌ及び３に示されるようにトリマーが生成する。鎌状
赤血球β−グロビン遺伝子は点変異を含むため功ρｌに
よる切断が防止され、オートラジオグラフのレーン２中
には４０−ｍ＠ｒバンドのみが見られる。
レーン４〜６はレーン１〜３！４’ｊＬ、クローンを示
すが、制限醇素釘ムＮＩによ多処理したものである。５
ｆａＮＩを用いる処理によりδ−グロビン遺伝子から以
ｉｓ　１部位が除去され、この結果正常β−グロビン遺
伝子が存在する場合にのみトリマーが形成される。この
オートラジオグラフ中に示されるように、５ｆａＮＩに
よる処理によって、合成プローブはδ−グロビン遺伝子
ト共ＫＤｄ見！部位な再成形することができなくなる。
この部位は鐘状赤血球β−グロビン遺伝子中にも存在し
ないから、トリマーを代表するバンドはプローブが正常
β−グロビン遺伝子とアニールし７’（場合にのみ形成
されるであろう。　　　　　　　　　以下全白ｔｉｏｎ
）の使用 オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成及びリン１囮 末端ラベルされたオリコゝデオキシリ？ヌクレオチドプ
ローブ及びその相補的ブロッキングオリゴマーを例１に
記載したようにして調製した。但し、キナーゼ処理した
プローブの最終濃度をｌｐｍｏｌａ／　ｍｌとし１、そ
してブロッキングオリゴマーの濃度を１００　ｐｍｏｌ
ｅ／ｒ／Ｌｌとした。
ＤｄｅｌによるヒトゲノムＤＮＡの消化正常β−グロビ
ン遺伝子と同等のヒトゲノムＤＮＡを、リンノ（Ｔ細胞
系Ｍｏ１ｔ４［ヒユーマン・ゼネティク・ミュータント
・セル・レボジトリ−（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏａｉｔｏｒｙ）（Ｈ
ＭＣＲ）、０Ｍ２２１９Ｃ）から、前記の方法〔ステト
ラ−等、ｆロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　）（１９８２）、　７９　：
５９６６−５９７０）を用いて抽出した。
１００μＩのヒトゲノムＤＮＡを６０ユニツトのＤｄｅ
　Ｉ　にニューイングランドビオラプス）により製造者
により推奨される緩衝液条件を用いて消化した。３７℃
にて一夜インキユペートした後、ＤＮＡをエタノール沈
澱し、真空乾燥し、そして１００μｌのＴＥ緩衝液中に
再懸濁した。
ゲノムＤＮＡ再構成物の調製 ３ｘｌｆｆ９塩基対のヒト１缶体ｒツムサイズに基いて
、２０μｇのゲノムＤＮＡは１０℃ｍｏｌｅ（ＩＸＩＯ
ｐｍｏｌｅ）のβ−グロビン遺伝子を含有する。これは
２倍体細胞当たシワコピーと同等である。
２０μｙずつ５つのＤｄｅ　’Ｉ消化Ｍｏｌ　ｔ　４　
ＤＮＡにＯｔｍｏｌｅ、５　ｔｍｏｌｅ　、　　１０　
ｔｍｏｌｅ　、２０℃ｍｏｌｅ。
又は４０　ｔ’ｍｏｌｅのＢａｍ　ＨＩ消化、ｐＢＲ：
β１（これはそれぞれ２倍体細胞当シＯ１１，２，４、
又は８コピーのβ−グロビン遺伝子に相当する）を加え
た。各最終容積なＴＥ緩衝液によ１）３２μＺに調製し
た。
ゲノムＤＮＡ再構成物とプローブとのハイプリダイ例Ｉ
Ｋ記載したのと本質上同じ方法を用いた。
４μｌのキナーゼ処理されたプローブ（０，００４ｐｍ
ｏｌｅ）を各３２μｌのゲノム再構成物に加え、そして
ヒートノロツク中で９５℃にて１０分間変性した。次に
サンプルを短時間回転せしめ、そしてヒートブロックに
もどした。４μ１０１．５ＭＮＩＬＣｔを各チューブに
加え、おだやかに混合し。
そして５６℃のファンインキュベーターに移し、そして
−夜アニールせしめた。
次に、４μｌのラベルされていないブロッキングオリゴ
？−）ＩＥ　１０　（０，４ｐ　ｍｏｌｅ　）を加え、
そして同じ温度にてさらに１５分間ハイブリダイゼーシ
ョｙを続けた。６０ｍＭのＭｇＣｌ２を４ｔｔｌｌ、及
び乃坊〜Ｉ（１０ユニツト、ニューイングランドビオラ
プス）を１μ！加え、そしてアニールしたＤＮＡを５６
０にて１５分間消化した。９５℃にて短時間加熱するこ
とにより反応を停止した。
各サングルをプレコートしたガラスパックシリカゲル薄
層クロマト　グラフィール−）（Ｍ−Ｎ８３１　Ｇ−２
５ＶＵ２５４　、プリンクマン・インストリメンツ）に
１２μｌずつ４回適用し、加熱ランプ下で乾燥し、そし
て４５％ｎ−プ０パノール、４５チ水酸化アンモニウム
及び１０％水から成る溶剤によりー夜展開した。次に、
プレートを乾燥し、そして１枚の強化スクリー／を用い
て一８０℃にて４日間オートラジオグラフした。
オートラゾ誓グラフの検討（第６図） レーン１〜５は２０μＩのＭｏ−１ｔ　４ダノムＤＮＡ
を含み、このゲノムＤＮ４１ｋ　Ｋは、β−グロビンが
２倍体細胞当たシＯ１１，２，４、及び８コピー存在す
゛る場合に遺伝的量を示すように計算された量のｐＢＲ
：β”が添加さ、れている。
ラベルされたプローブとのハイブリダイゼーションに先
立って迎ρｌによりｇｏｌｔ４を消化することによｐ、
、７″ローブとアニールした後にＤＮＡがＤｄｅ、Ｉ部
位を再形成することができなくなシ、そしてこのために
このプローブのその後の切断が゛不可能となる。このこ
とがレーン１に示されてお広この場合外来性ｐＢＲ：β
１が存在しないためにラベルされたトリマーは観察され
ない。
レーン２は２缶体細胞当たシ正常β−グロビン遺伝子が
１コピー存在する場合に期待されるシグナル強度を示し
、そして鎌状赤孟球形質（βす°）を担持するペテロ接
合体個体と同等であるパレーン３は２缶体細胞当たシ正
常β−グロビン遺伝子が２コピー存在する場合に期待さ
れるシグナル強度を表わし、そして正常ホモ接合個体（
βり勺と同等である。
レーン４及びレーン５は比較のために含めたものであり
、結果の強度を比較する相対的手段を提供する。通常、
個体が２缶体細胞当たシイコピー又は８コピーを有する
ことは見出されないであろン酸化 第７図に示すプローブＨＥＩＩ、及びブロッキングオリ
ゴマー１１２を例１に記載した方法に従って合成した。
さらに、第８図に示す陽性対照オリゴマーＧ）（１１，
及びそれに関するブロッキングオリゴマーＧＨ１２を同
様の方法で合成した。
ＳｐｍｏｌｅずつのＨＥＩＩ及びＧＨＩＩ（合計１０ｐ
ｍｏｌｅ　　　）　を、　７　０　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
　　（ｐＨ７，６）　　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．
１．５　ｍＭスペルミン及び２．５ｍＭｍナノスレイト
ールを含有する４０μでの反応容積中で、チユニットの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにューイングランドビオ
ラブス）及び５０ｐｍｏｌｅのγ−３２Ｐ−ＡＴＰ　　
にューイングランドニュクレア、約７２００　（ｊ／ｍ
　ｍｏ　ｌｅ　）を用いて一緒にラベルした。次に、こ
の容積を２５　ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて１００μｌに調
製し、そして例１に記載したのと同様にしてＰ４スピン
透析カラム上で精製した。ラベルされたオリゴマーを、
１８％ポリアクリルアミドダル（１９二１アクリルアミ
ド：　ＢＩＳ　。
″ｉ′四上・１゛１°−硼酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ
）　　　　　　　　。
（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　８９　ｍＭ硼酸、　２．５　
ｍＭ　ＥＤＴＡ　。
ｐＨ８，３）中で５００　ｖｈｒ電気泳動することによ
りさらに精製した。オートラジオグラフィーにより位置
を決定した後、ラベルされた）（Ｅｌｌ／ＧＨＩＩを含
有するグルの部分を切シ出し、破砕し、そして０．２　
ｍＭのＴＥ緩衝液に４℃にて一夜溶出した。
反応生成物のＴＣＡ沈澱によυ、反応が約７０％完結し
たこと（５，Ｉ　Ｃ４７ｍ　ｍｏｌｅ　）、及び３５％
（３，５ｐｍｏｌｅ　　）のキナーゼ処理されたオリゴ
マーがグルから１７．５　ｐ　ｍｏｌｅ　／ｍｌ　（そ
れぞれ８７５ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）の濃度で回収されたこ
とが示された。
ラベルされていないＨｇＩ２及びＧＨ１２ブロッキング
オリゴマーを一緒にし、そして４００ｐ’ｍｏｌｅ　／
ｒｔｔｌ　（それぞれ２００　ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）の濃
度で使用した。
細　系からのヒトゲノムＤＮＡの単離 マニアチスの方法〔マニアチル等、モレキュラー〇クロ
ーニング（Ｍｅ　１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）
（１９８２，）２８０−２８１１と実質上同じ方法を用
いて、リンパ細胞系Ｍｏ１ｔ４．５Ｃ−１、及びＧＭ２
０６４から高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。
Ｍｏ１ｔ４は例２に記載したように正常β−グロビンに
ついてホモ接合型のＴ細胞系であ夛、そして５Ｃ−１（
１９８５年３月１９日にＡＴＣＣＫ舒託された）は錐状
赤血球対立遺伝子についてホモ接合型の、ＥＢｖで形質
転換されたＢ細胞系である。
ＧＭ２０６４　（ＨＭ、ＣＲ，ＧＭ２．０６４　）は、
胎児ヘモグロビンの遺伝的持続（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ
　ｐｅｒｓｌｓ−ｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ｆｅｔａｌ　ｈｅ
ｍｏｇｌｏｂｉｎ　：　ＨＰＦＨ）についてホモ接合型
の個体から単離されたものでアシ、そしてβ−又はδ−
ダロビン遺伝子配列を含有しない。すべての細胞系を胎
児ウシ血清を含むＲＰＭＩ　−１６４０中に維持した。
臨床血液サンプルからのヒトゲノムＤＮＡの単離既知の
β−グロビン遺伝子型の臨床血液サンプル（５〜１０反
ずつ）８個をカリホルニア、オークランドの小児病院の
Ｂｅｒｔｒａｍ　Ｌｕｂｉｎ　博士から入手した。これ
らのサンプルには正常ホモ接合体（ＡＡ）、錐状赤血球
キャリヤー（Ａｓ）、及び線状赤血球ホモ接合体（ＳＳ
）が含まれる。実験的側シを回避するため、サンプルに
暗号を付し遺伝子型がわからないようにした。ナンベル
グ等、ゾロシーデインダス・オツ・デ・ナシ、ナル・ア
カデミ−・オプ・ザ・サイエンシスＣＦｒ＠ｅ、　Ｎｕ
ｔ。
Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　）　７５．５５５３−５５５６
（１９’７ｇ　３に記載されている方法の変法を用いて
、−次的属末梢血白血球から成るバフイーコー、ト画分
からｒツムＤＮＡを単離した。
細胞を５ｄのＴｒ　ｉ　ｓ　−ＥＤＴＡ−ＮａＣｔ緩衝
ｇ（ｍ）（１０ｒｒＭＴｒｉｓ、　ｐｔｉｇ　、　１　
ｎＭ　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭＮａＣ２）中に再懸濁し、
そして０．２　Ｆｎ９／′ＩＬｌのグロティナーゼに、
０．５チＳＤ８に調整し、そして３７℃にて一夜インキ
ユペートした。次に、過塩素酸ナトリウムを０．７Ｍと
なるように加え、そして細胞溶解物を室温にて１〜２時
間おだやかに振とうした。
この溶解物を３０１１Ｌｌの７エノール／クロロホルム
（１：１）により抽出し、次に３０ｄのクロロホルムに
より抽出し、そして核酸のエタノール沈澱を行った。ペ
レットを２ｄのＴＥ緩衝液に再懸濁し、そして駅アーゼ
ＡをＯ，ＯＯ５ｔａｇ／ｙＲ１となるように加えた。３
７℃にて１時間消化した後、ＤＮＡを同量のフェノール
、フェノール／クロロホルム、及びり１２０ホルムによ
りそれぞれ１個ずつ抽出し、そしてエタノール沈澱した
。ＤＮＡを０．５ｄのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして
２６０　ｎｍでの吸光により濃度を決定した。
ｒツムＤＮＡ再構成物の調製 比較のため、ゲノムＤＮＡへの計算量のクローン化正常
β−グロビン遺伝子の添加を用いる再構成を例１１に記
載したのと同様にして行い、細胞当たシおよそ１．２．
４、及び８コピーの遺伝子量とした。但し、Ｄｉａ　ｌ
で切断したＭｏ１ｔ４の代９にキャリヤーとして切断さ
れていない５Ｃ−ＩＤＮＡを使用した。
一般に例１に記載した方法を用いた。２０ｎ９のｒツム
ＤＮＡを１．５ｄミクロ、フユーノチューブに入れ、そ
してＴＥ緩衝液により最終濃度を３０μｌに調製した。
次に鉱油キャップ（約Ｑ、１ＩＩｔｌ）を重層して蒸発
を防止し、そしてファンインキュペー゛ターの必要性を
回避した。ｒツムＤＮＡを９５℃にて１０分間加熱する
ことによ）変性した。０．０４ｐｍｏｌｅのラベルされ
たＨＥＩ　１　／　ＧＨ１１７６ａ−ブオリ！マー（０
，０２ｐｍｏｌ＠ずつ）を含有する０、　６　Ｍ　）ｈ
ｃｔ　Ｉ　ＯＩＩＩをチューブに加え、おだやかに混合
し、そしてすぐに５６℃のと一ドブロックに移して３時
間量いた。４μｌのラベルされていないＨＥ１２／’Ｇ
Ｈ１２ブロッキングオリゴマー（各０．８　ｐ　ｍｏｌ
ｅ　）を加え、そして同じ温度にお〜・てさらに２０分
間ハイブリダイゼーションを続けた。５μノの６０　ｒ
ｒＩＭＭｇＣＩ、２及び１　ｔｔｌのＤｄｅｌ（１０ユ
ニツト、ニューイングランドビオラプス）を加え、そし
てアニールＬ、たＤＮＡを５６℃にて２０分間消化した
。４μ！０７５　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び６μ４のトラッキ
ング（ｔｒａｃｋｉｎｇ　）色素を最終容量が６０μｌ
となるように加えるととＫよシ反応を停止した。
鉱油を０．２ｄのクロロホルムで抽出し、そして１８μ
ｌの反応混合物（ゲノム１）ＮＡ　６μｇ）をヘファー
８Ｅ２００装置中で３０％ポリアクリルアミドミニ−ダ
ル（１９：１ビオラド）上に負荷した。
ブロムフェノールブルー色素が原点から３．０ｃｍまで
移動するまで３００ｆルトにおいて１時間グルを電気泳
動にかけた。無傷の４０−　ｍａｒプローブを含有する
グルの先端１．５鋼を切断しそして廃棄することによっ
て次のオートラジオグラフィー中の・ダックグラウンド
量を少なくした“。残］のグルな、２枚の強化スクリー
ンを用いて一７０℃にて５日間暴露した。
ゲノムＤＮＡのオートラジオグラフの検討（第９図）１
　各レーンは６μｇのゲノムＤＮＡを含有する。レーン
Ａ、Ｂ、及び工〜Ｎは、それぞれｃｎｉ。
ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃ’　Ｈ４、ＧＨ５、ＣＨ６、ＧＨ７
、及びＣ’Ｈ８と称する臨床サンダルを含み、レーンＣ
及びＯは上記の正常β−グロブリン細胞系ＩＭａｌｔ４
からの対照ＤＮＡを含有し、レーンＤ及びＰは上記の錐
状赤血球β−グロビン細胞系８Ｃ−１からの対照ＤＮＡ
を含有し、レーンＥ−Ｈは５Ｃ−１を含有する再構成物
であって、これには細胞当たシそれぞれｌ、２，４及び
８コピーになる量の゛クローン化正常β−グロビン遺伝
子が添加されている。
Ｍｏ　ｌ　ｔ　４及び５ｃ−ｉ　対照レーンは正常ホモ
接合体（ＡＡ）及び線状赤血球（ＳＳ）において予想さ
れる種類のシグナルを示す。臨床サンゾルＣ１１３゜Ｃ
Ｈ４、ＣＨ５、ＣＨ６、及びＣＨ８は明瞭にトリマーシ
グナルを欠いておシ、そして線状赤血球ホモ接合体（Ｓ
Ｓ）であると推定される。Ｃ）Ｉｔ及びＣＨ２Ｏ両者に
おける強いトリマーシグナルの存在は、これらの個体が
正常（ＡＡ）であることを示し、他方ＣＨ７におけるや
や弱いシグナルはこの患者が線状赤血球キャリヤー（Ａ
ｓ　）であることを示唆する。
例４．クロー化ＤＮＡにおけるプローブＨＥＩＩの使！
− 例１の技法を用いて例１の３種類のクローン化遺伝子に
プローブＨＥＩ　１をハイブリダイズさせた場合、正常
β−グロビンについてのめ３−ｍａｒが生成し、線状赤
血球β−グロビン遺伝子及びδ−ガロビン遺伝子につい
ては生じなかった。これによりこのプローブが正常β−
グロビンに特異的であることが示された。
酸化 第１１図に示すプローブＦＬ８０６．１ａッキングオリ
ゴマーＲ８ｌ０を例１に記載した方法に従って合成した
。Ｒ８０６を例３に記載したのと実質上同様にしてラベ
ルし、そして精製し、４．９Ｃ１／ｍｍｏｌｅの比活性
及び２０　ｐｍｏｌｅ／ＩＩＬｌの最終濃度にした。
ラベルされていないＲ８ｌ０ブロツキングオリゴマーは
２００　ｐ　ｍｏ’ｌｅ／―の濃度で使用した。
細胞系からのヒトゲノムＤＮＡの単離 例３に記載したようにして、リンパ細胞系Ｍｏ１ｔ４、
Ｂｅ−１、及び０Ｍ２０６４から高分子貴ゲノムＤＮＡ
を単離した。
臨床血液サンダルからのヒトゲノムＤＮＡの単離既知の
線状赤血球キャリヤー（Ａｓ）からのＣＨＩ２と称する
臨床サンプルをＬｕｂｉｎ博士（例３参照のこと）から
得５そして例３に記載した方法によルＤＮＡを抽出した
。
上記の４種類のゲノムＤＮＡそれぞれ２μｇを、１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭ　Ｎ
ａＣｔ、１０’ｍＭ　ＭｇＣｔ２％配列ｄ　（ＣＡＣＡ
ＧＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ　）のプライマーＡ１５０ｐｍ
ｏｌｅ　　、及び配列ｄ（ＣＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣ
ＡＣＡ）　＋７）プ５イマ−Ｂ１５０ｐ　ｍｏｌｅを含
有する最初１００μｌ　の反応容積罠加え、そして蒸発
を防止するため約１００μノの鉱油を重層した。
各ＤＮＡサンプルを１５゛サイクルの増幅にかけた。
１サイクルは次の３段階から成る。
１）９５℃に設定されたヒートブロック中で２分間変性
した。
２）すぐに、３０℃に設定されたヒートブロックに移し
、２時間ブライマーとゲノムＤＮＡとを７ニールせしめ
た。
３）Ｅ、：ｒすＤＮＡ　ポリメラーゼｌ　（Ｄ　Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片にューイングランドビオラブス）５ユニツト
、ｌｎｍｏｌｅずつのｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ
及びＴＴＰを１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐ）１７．５　
）、５０　ｍＭ　ＮａＣ１。
１０　ｒｎＲＩ　ＭｇＣｌ２及び４ｍＭジチオスレイト
ールから成る緩衝液中に含有する溶液２μノを加える。
この延長反応を３０℃にて１０分間行つた。
最終サイクルの後、９５℃にて２分間加熱することによ
って反応を停止した。鉱油を０．２ｄのクロロホルムで
抽出しそして廃棄した。最終反応容積は１３０にであっ
た。
例３に記載した一般的方法を用いた。４１５μノの増幅
されたｒツムＤＮＡをエタノール沈澱し、そして同量の
・ＴＥ緩衝液に再懸濁した。１０μｌ（増幅前１５４　
ｎ、！９相当量のゲノムＤＮＡを含有する）を１．５Ｎ
のミクロフユージ、チューブに入れ、そして２０μｌの
ＴＥ緩衝液によ＃）３０μ！の最終容積にした。サンプ
ルに鉱油を重層し、そして９５℃にて１０分間変性した
。０．０２　ｐ　ｍｏｌｅ゛のラベルされたＲ８０６ノ
ロープを含有する０、６Ｍ、ＮａＣ１１０μｌをチュー
ブに加え、おだやかに混合し、そしてすぐに５６℃のヒ
ートブロックに移して１時間置いた。４μｌのラベルさ
れていないＲ８ｌ０ブロツキングオリゴマ（０，８ｐ　
ｍｏｌｅ　）を加え、そして同じ温度においてさらに１
０分間ハイブリダイゼーションを続けた。５μｌの６０
ｍＭ　ＭｇＣＡ２／　０−１％ＢＳＡ及び１　μｌｌの
Ｄｄｅ　Ｉ　（１０ユニツト、ニューイングランドビオ
ラプス）を加え、そしてアニールしたＤＮＡを５６℃に
て３０分間消化した。次に１μｌのＨｉｎｆｌ（１０ユ
ニツト。
ニューイングランドビオラプス）を加え、そしてさらに
３０分間インキュベートした。４μノの７５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ及び６μノのトラッキング色素を最終容積が６１μ
ｌになるように加えることＫよシ反応を停止した。
鉱油を０．２−のクロロホルμて抽出し、そして１８μ
ノの抽出混合物（ｒツムＤＮＡ　４５１１．β９　）を
、ヘッファ−８Ｅ２００　　装置中３０％ポリアクリル
アミドミニ−グル（１９：　１　、ビオラド）に負荷し
た。このグルを約３００．Ｎルトにおいて１時間。
ブロムフェノールブルー色素の先端が原点から３．０ｒ
Ｉｎまで移動するまで電気泳動にかけた。グルの先端１
．５　ｃｍを除去し、そして残シのグルを１枚の強化ス
クリーンを用いて一７０℃にて４時間暴露した。
オートラジオグラフの検討（第１４図）各クローンは４
５　ｎ９の増幅されたゲノムＤＮＡを含有する。レーン
ＡはＭｏ１ｔ４のＤＮＡを含有し、レーンＢはＣＨＩ　
２を含有し、レーンＣは５Ｃ−１のＤＮＡを含有し、そ
してレーンＤはＧＭ２０６４のＤＮＡを含有する。Ｍｏ
１ｔ４は細胞当＃）２コピーのβ”遺伝子を有する正常
個体（ＡＡ）の遺伝子型を代表し、ＣＨＩ　２は細胞当
９１個のβ”遺伝子及び１個のβ８遺伝子を含有する錐
状赤血球キャリヤー（Ａｓ　）からの臨床サンプルでア
シ、そして５Ｃ−１は細胞当たりβ８遺伝予め２個のコ
ピーを有する錐状赤血球個体（ＳＳ）の遺伝子型を代表
＝スル。′β−又はδ−グロビン配列を含有しないＧＭ
２０６４は陰性対照として存在する。
オートラジオグラフかられかるように、Ｄｄｅ　ｌで切
断されたβ”−特異的オクタマーはβ１遺伝子を含有す
るＤＮＡにのみ存在しくレーンＡ及びＢ）、Ｈｌｎ　ｆ
　Ｉで切断されるβ８−特異的トリマーはβ８遺伝子を
含有するＤＮＡにのみ存在する（レーンＢ及びＣ）。ト
リマー及びオクタマーの両者の存在（レーンＢ）により
鎌状赤血球キャリヤーが診断され、そしてオクタマーの
みを伴う正常個体（レーン・Ａ）及び、トリマーのみを
伴う錐状赤血球に悩まされる個体（レーンＣ）から区別
される。
比較として、増幅されないｒツムＤＮＡを用いて上記の
実験を反復することにより、増幅が検出感度を少なくと
も１０００倍上昇せしめることが示された。
不変Ｈｉｎｆ１　部位を含有するプローブＲ８Ｏ６を用
いて、例５に記載したようにして増幅されたｒツムＤＮ
Ａ中の配列の不存在を検出するために実験を行った。β
−グロビン遺伝子力″−ＤＮＡ中に゛存在すればＨ１ｎ
ｆｌ切断トリマー生成物が検出されたが、β−グロビン
が除去された場合には検出されなかった。
β０鎖をコードするβ−グロビンの対立遺伝子はＲＦＬ
Ｐ分析によってβ”対立遺伝子から区別することができ
ない。β０鎖を生じさせるヌクレオ置換は平復Ｉ　（Ｍ
ａｔ　ｎ、登Ｕ」、盈り」）認識配列ＣＴＮＡＧのＮ部
分に存在するからである。従って、制限部位中の実際の
配列が異っていてもエンドヌクレアーゼはβ１及びβ０
対立遺伝子の両者を切断する。この発明のオリゴヌクレ
オチド制限法の特異性は、制畝部位内のミスマツチによ
り断片を防止し又は実質上阻害することができることに
基礎を置いている。従って、β”配列に基礎を置く末端
ラベル化オリゴヌクレオチドがβ”ゲノム配列とバイア
２リダイズした場合には切断されるはずであるが、β８
配列又はβ０配列と・・イブリダイズした場合には切断
されない。逆に、β０配列に基礎を置く末端ラベルオリ
ゴヌクレオ、ラドプローブはβ０配列とハイブリダイズ
した場合には切断されるはずであるが、β”又はβ８に
ノ・イブリダイズした場合にはそうではない。従って、
この発明のオリゴマー制限法は、β０対立遺伝子の検出
を可能にし、そしてそ、のためにＡＣキャリヤー及び臨
床的に重要なＳＣ状態の診断を可能にする。
材料の寄託 次のクローン及び細胞系を米国、メリーランド２０８５
２、　　ロックビレ、ノ臂−クラウンドライブ１２３０
１　、　　アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレク
ション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
ｐＢＲ：βＡ　　２０３６　　１９８４年５月２５日　
３９，６９８ｐＢＲ：βｓ　　２０３７　　１９８４年
５月２５日　３９，６９９ｐｎａ：δ　　　２０３８　
１９８４年５月２５日　３９，７００８Ｃ−１００８２
１９８５年３月１９日　　□クローンｐＢＲ：β１、ｐ
ＢＲ：β６、及びｐＢＲ：δ、並びに細胞系５Ｃ−１は
ＡＴＣＣとこの出願の出願人であるシタス・コーポレー
ションとの間の契約に従って行われた。ＡＴＣＣとの契
約は１．これらのクローン及び細胞系の子孫の永久的入
手可能性を、該寄託を記載し又は特定している米国特許
出願の発行又は公告の後、あるいは米国又は外国の特許
出願の公衆への公表の後、これらのいずれが先に生ずる
としても、公衆に与え、そしてこれらのクローン及び細
胞系の子孫の入手可能性を、３５ＣＦＲ５１２２及びこ
れに従う長官規則（８８６０Ｇ　６３８への特別の言及
を伴５３７　ＣＦＲＳ　１．１４を含む）に従りて米国
特ｉ商標局長官により資格があると決定されたものに与
える。この出願の出願人は、寄託されたクローン又は細
胞系が適切な条件下で培養されたｉ合に失われ又は破壊
された場合には、通知の後すみやかにそれらが同一クロ
ーン又は細胞系の生存培養物によって置き換えられるで
あろうことを承認した。
要約すれば、この発明のオリゴマー制限法は、オリゴヌ
クレオチドプローブの配列により定義でれる特定の核酸
配列中の特定の制限部位の存在又は不存在を検出する。
鎌状赤血球貧血の検出のため多形性制限部位の不存在が
診断される。遺伝的に多形性ではなく不変性である特定
の制限部位の検出が不可能であるため、プローブに相補
的な配列の不存在が診断に使用される。１例は、β”及
びβ８ダノムＤＮＡから生ずるがβ−グロビンを欠くゲ
ノムＤＮＡからは生じないＨｉｎｆ　Ｉ切断トリマー生
成物の存在によりβ−グロビン特異的オリコ９デオキシ
リ？ヌクレオチドゾロープＲ８０６中の不変町４１部位
の検出である。従ってこの方法は。
α−地中海貧孟（胎児水腫）の臨床診断のために特定の
遺伝子（例えばα−グロビン）の不存在を検出するため
に使用することができる。同様に、この方法は、特定の
配列の存在、例えば感染性疾患の診断のための臨床サン
プル、例えばクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　）及び
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）中に存在する病
原特異的ＤＮＡ配列を検出するために使用することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、正常β−グロビンのコード鎖に特異的な合成
４０塩基長オリゴデオキシリゲヌクレオチドプローブ（
ＨＦＯ２）、及びラベルさ、れたプローブの゛非特異的
ノ・イブリ〆イぜ−ションを最小にするために必要な場
合に使用される相補的プロツキンダオリゴマ−（）ＩＥ
ＩＯ）を示す。 第２図は、プローブＨＥＱ　９が正常β−グロビン、及
び１個の塩基ミスマツチを含有する錐状赤血球β−グロ
ビンにハイブリダイズし、次に制限酵素Ｄｄｅｌで処理
された場合に得られる結果を示す。 第３図は、正常β−グロビン、錐状赤血球β−グロビン
、及び正常δ−グロビンの配列の比較を示し、１個の塩
基の相違から生ずるＤｄｅ）及びμ’ａＮＩのための制
限部位が示されている。 第４図は、“プローブＨＥＯ９へのアニーリングに先立
って制限酵素５ｆａＮＩによジグツムＤＮＡを処理する
効果を示す− 第５図は、ゾロニブＩ（ＥＯ９へのアニーリングに先立
つ°て、クローン化された遺伝子がＡｌｕ　ｌ又は５ｆ
ａＮｌにより処理された場合に得られる結果を示すオー
トラジオグラフである。 第６図は、２缶体細胞当たシ増加するコピー数における
正常β−グロビンのゲノム再構成物がプローブＨＥＯ９
にハイブリダイズする場合に得られる結果を示すオート
ラジオグラフを示す。 第７図は、１個のミスマツチを伴りてβ−グロビン遺伝
子にマツチしセしてδ−グロビン遺伝子に完全にマツチ
するプローブＨＥＯ９と、β−グロビン遺伝子に完全に
マツチするがδ−グロビン遺伝子と５個のミスマツチを
有するブローｆＨＥ１１との比較を示す。ＨＥＯ９は両
遺伝子の（＋）鎖にアニールし、他方ＨＥＩＩは両遺伝
子の（−）鎖にアニールする。第７図はさらにＨＥ１１
に特異的なブロッキングオリゴマーであるＨＥ１２の配
列を特定する。 第８図は、陽性対照オリゴヌクレオチド（Ｇｌ（１１）
を正常β−グロビンにハイブリダイズさせ次に制限酵素
−Ｄｄｅ　Ｉで処理してラベルされたヘキサマーな生成
せしめる場合に得られる結果を示す。オリゴヌクレオチ
ドＧＨＩＩは、オリゴデオキシリ〆ヌクレオチドプロー
ブＨＥＩＩから約３５０塩基下流のβ−グロビン遺伝子
の（＋）鎖にアニールする。 星印は分子の５′−末端の放射性標識を示し、そして棒
は不変Ｄｄｅ　Ｉ部位ＣＴＧＡＧを示す。第８図はさら
ＫＧＨｌｌとハイブリダイズするδ−グロビンの領域を
示す。ＧＨＩＩはδ−゛グロビンの（＋）鎖と幾らかの
類似性を示すが存在する６個のミスマツチは反応に用い
られる条件下での有意なハイブリダイゼーションを回避
するのに十分である。さらＫ、第８図はＧＨＩＩに特異
的なブロッキングオリゴマーであるＧＨ１２の配列を特
定する。 第９図は、臨床サンプルから分離されたゲノムＤＮＡが
プローブＨＥＩＩ及び陽性対照ＧＨＩＩにハイブリダイ
ズする場合に得られる結果を示すオートラジオグラフで
ある。 第１０図は、Ｄｄｅ　１部位（１本線）及び旦堕ｆ１部
位（２本線）の領域における正常（βＡ）β−グロビン
遺伝子及び錐状赤血球（β８）β−グロビン遺伝子の配
列を示す。゛ 第１１図は、プローブＨＥＩＩと、ルｎｆ１部位にわた
るように配列を５塩基移動せしめることによ、９’ＨＥ
１１から誘導されたプロー°ブＲ８０６との比較を示す
。星印は分子の５′末端における放射性標識を示す。第
１１図はさらに、Ｒ８０６が正常遺伝子の負鎖にいかに
アニールしてＨｉｎｆ　１部位（２本線）及びＤｄｅ　
１部位（１本＃）を再形成するかを示す。さらに、第１
１図はＲ８０６に特異的なブロッキングオリゴマーであ
るＲ８ｌ０の配列を特定する。 第１２図は、プローブＲ８０６が正常β−グロビンにハ
イブリダイズし、次に！２０Ｉ及ヒＨ１ｎｆＩＫよシ逐
次消化されて、ラベルされたオクタマーが生ずる場合に
得られる結果を示す。 第１３図は、プローブＲ８０６が錐状赤血球β−グロビ
ンにハイブリダイズし、次にＤｄａ　Ｉ及び旦１ｎｆ　
ｌにより逐次消化されて、ラベルされたトリマーが生ず
る場合に得られる結果を示す。 第１４図は、セルラインから単離されそして２つのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドノライマーを用いて増幅さ
れたゲノムＤＮＡがプローブＲ８Ｏ６とハイブリダイズ
し、そしてそれぞれＤｄｅ　ｌ及びＨｉｎｆ　Ｉにより
逐次消化された場合に得られる結果を示すオートラジオ
グラフである。 以下余白

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、特定の核酸配列中の少なくとも１つの特定の制限部
    位の存在又は不存在を決定する方法であって、 （ａ）前記核酸配列を、検出されるべき各制限部位のた
    めのオリゴヌクレオチドプローブ（このプローブは、対
    応する制限部位にわたる前記核酸配列中の領域に相補的
    であり、そしてこのプローブは前記対応する制限部位に
    近い方の末端においてラベルされている）とハイブリダ
    イズせしめ；（ｂ）前記ハイブリダイズされた核酸配列
    を各プローブのための制限エンドヌクレアーゼ（この制
    限エンドヌクレアーゼは検出されるべき前記制限部位に
    おいてその対応するプローブを切断し、これによってラ
    ベルされたオリゴマー断片とラベルされていないオリゴ
    マー断片を生成することができ、ここで該ラベルはプロ
    ーブ上のそれと同じである）により消化し； （ｃ）ラベルされ切断されたオリゴマー断片をラベルさ
    れているが切断されていないオリゴマーから分離し；そ
    して （ｄ）ラベルされたオリゴマー断片の存在又は不存在を
    決定する； ことを特徴とする方法。 ２、感染性疾患に関連することが知られている制限部位
    の存在を検出するための方法である特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ３、一方又は両方の対立遺伝子の特定の核酸配列中の多
    形性制限部位の存在又は不存在を検出するための方法で
    あって、 （ａ）前記核酸配列を、オリゴヌクレオチドプローブ（
    このプローブは、１方のみの対立遺伝子中に存在する第
    １制限部位及び両対立遺伝子に共通の第２制限部位にわ
    たる前記核酸配列中の領域に相補的であり、そしてこの
    プローブは前記制限部位の１方に近い末端においてラベ
    ルされている）とハイブリダイズせしめ； （ｂ）前記ハイブリダイズされた核酸配列を第１制限エ
    ンドヌクレアーゼ（この制限エンドヌクレアーゼは前記
    第１制限部位のみにおいて前記プローブを切断してラベ
    ルされたオリゴマー断片及びラベルされていないオリゴ
    マー断片を生成することができ、ここで該ラベルはプロ
    ーブ上のそれと同じである）により消化し； （ｃ）段階（ｂ）からの前記消化物を第２制限エンドヌ
    クレアーゼ（この制限エンドヌクレアーゼは前記第２制
    限部位のみにおいて前記プローブを切断してラベルされ
    たオリゴマー断片及びラベルされていないオリゴマー断
    片を生成することができ、ここで該ラベルはプローブ上
    のそれと同一である）により消化し； （ｄ）ラベルされ切断されたオリゴマー断片を切断され
    ていないオリゴマーから分離し；そして（ｅ）第１又は
    第２制限エンドヌクレアーゼによる切断と一致する特定
    の塩基長さを有するラベルされた断片の存在又は不存在
    を検出する；ことを特徴とする方法。 ４、前記疾患が鎌状赤血球貧血であり、前記第１制限部
    位が正常β−グロビン遺伝子中に存在するが鎌状赤血球
    β−グロビン遺伝子中には存在しない￥Ｄｄｅ I ￥で
    あり、そして前記第２制限部位が正常β−グロビン遺伝
    子及び鎌状赤血球β−グロビン遺伝子の両者中に存在す
    る￥Ｈｉｎ￥ｆ I であることを特徴とする特許請求の
    範囲第３項記載の方法。 ５、段階（ａ）の後であって段階（ｂ）の前に、（ａ′
    ）段階（ａ）からのハイブリダイゼーション混合物に、
    検出されるべき各制限部位において少なくとも１塩基対
    のミスマッチを有する点を除き各プローブに相補的であ
    るラベルされていないブロッキングオリゴマーを加え；
    そして （ａ″）前記ハイブリダイゼーション混合物を前記ブロ
    ッキングオリゴマーの存在下でハイブリダイズせしめる
    ； 段階をさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
    項又は第２項記載の方法。 ６、段階（ａ）の後であって段階（ｂ）の前に、（ａ′
    ）段階（ａ）からのハイブリダイゼーション混合物に、
    検出されるべき各制限部位において少なくとも１塩基対
    のミスマッチを有する点を除き各プローブに相補的であ
    るラベルされていないブロッキングオリゴマーを加え；
    そして （ａ″）前記ハイブリダイゼーション混合物を前記ブロ
    ッキングオリゴマーの存在下でハイブリダイズせしめる
    ； 段階をさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲第３
    項又は第４項記載の方法。 ７、前記制限部位が多形性であり、そして前記ハイブリ
    ダイゼーション段階を、前記核酸配列の領域（この領域
    は前記制限エンドヌクレアーゼのための非多形性制限部
    位を含有する）とアニールする陽性対照オリゴマーの存
    在下で行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項、第
    ２項又は第５項に記載の方法。 ８、前記制限部位が多形性であり、そして前記ハイブリ
    ダイゼーション段階を、前記核酸配列の領域（この領域
    は前記制限エンドヌクレアーゼのための非多形性制限部
    位を含有する）とアニールする陽性対照オリゴマーの存
    在下で行うことを特徴とする特許請求の範囲第３項、第
    ４項又は第６項に記載の方法。 ９、前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、そして前記プロ
    ーブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである特許請求
    の範囲第１項、第２項、第５項、又は第７項記載の方法
    。 １０、前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、そして前記プ
    ローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである特許請
    求の範囲第３項、第４項、第６項、又は第８項記載の方
    法。 １１、特定の核酸配列中の少なくとも１つの特定の制限
    部位の存在又は不存在の迅速検出のためのキットであっ
    て、 （ａ）各検出部位のためのオリゴヌクレオチドプローブ
    （このプローブは、対応する制限部位にわたる前記核酸
    配列中の領域に相補的であり、そしてこのプローブは前
    記対応する制限部位に近い方の末端においてラベルされ
    ている）：及び（ｂ）各プローブのための制限エンドヌ
    クレオチド（前記制限部位において前記プローブを切断
    することができる）； を含むことを特徴とするキット。 １２、前記制限部位において少なくとも１塩基対のミス
    マッチを有する点を除き各プローブに相補的なラベルさ
    れていないブロッキングオリゴマーをさらに含むことを
    特徴とする特許請求の範囲第１１項記載のキット。 １３、一方又は両方の対立遺伝子の特定のＤＮＡ配列中
    の多形性制限部位の存在又は不存在を 検出するためのキットであって、 （ａ）オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ（この
    プローブは、１つの対立遺伝子のみに存在する第１制限
    部位及び両対立遺伝子に共通な第２制限部位にわたる前
    記ＤＮＡ配列中領域に相補的であり、そしてこのプロー
    ブは前記制限部位の一方に近い末端においてラベルされ
    ている）；（ｂ）前記第１制限部位のみにおいて前記プ
    ローブを切断することができる第１制限エンドヌクレア
    ーゼ；及び （ｃ）前記第２制限部位のみにおいて前記プローブを切
    断することができる第２制限エンドヌクレアーゼ； を含むことを特徴とするキット。
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