JPS6120815B2 - - Google Patents
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- JPS6120815B2 JPS6120815B2 JP52113961A JP11396177A JPS6120815B2 JP S6120815 B2 JPS6120815 B2 JP S6120815B2 JP 52113961 A JP52113961 A JP 52113961A JP 11396177 A JP11396177 A JP 11396177A JP S6120815 B2 JPS6120815 B2 JP S6120815B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
本発明は非特異的結合を弱めることにより、抗
原抗体間相互の既知の親和性を利用して免疫学的
反応の一方の反応成分を定性的または定量的に測
定する方法に関するものである。本発明は、この
ような反応がある種の確認標識を使用することに
より一層正確に記録されうるという事実を利用し
ている。 標識された反応成分との免疫学的反応には原則
的には次の２種の方法がある。すなわち、一方は
直接試験であり他方は間接法である。 直接試験においては、通常抗原である測定され
るべき反応成分は、このものに対して特異的に調
整され標識された第二の反応成分（通常抗体であ
る）とのインキユベーシヨンにより証明されう
る。 間接法においては、測定されるべき反応成分の
先ずそれに対して特異的に調整された第二の反応
成分と共にインキユベートされ、前記第二の反応
成分の未結合部分の分離除去後、その反応混合物
は前記第二の反応成分に対して特異的に調整さ
れ、通常標識されている第三の反応成分と共にイ
ンキユベートされる。 直接試験が非常に高い特異性を示すことは当業
者に周知であるが、その欠点は感受性が小さいこ
とである。反対に間接法では感受性は高いが特異
性が小さいことが知られている。 この直接試験および間接法において特異性に影
響を及ぼす本質的な原因の１種としては、抗原に
対する抗体の非特異的結合および抗体のまわりの
抗原の構造と考えることができる。 この非特異的結合は主に抗体分子（＝免疫グロ
ブリン）のいわゆるFc−部分と呼ばれる領域に
起因する。このことはまた高い特異性をもつ抗体
に関しても同様である。 抗体分子に構造変化が起こる場合、文献中Fc
−受容体と記載されている細胞性あるいは組織の
各種の構造に対するFc部分の結合親和力は非常
に増大される。この変化は抗体プレパレイシヨン
中における抗体分子の自然発生的凝集の際、抗原
と抗体との結合の際（免疫錯体）または人工的表
面（たとえばラテツクス粒子）上の抗体分子の吸
着の際におこる。 従来、非特異的結合を弱めるための各種の方法
が行なわれた。たとえば、抗体プレパレイシヨン
からの凝集体または免疫錯体の超遠心分離による
除去、蛋白安定化または凝集体形阻止を目的とし
た、アルブミンの抗体プレパレイシヨンに対する
添加等である。 さらに前記直接試験および間接法においては、
そのFc−部分が、それ以外の残りのフラグメン
トＦ（ab）1またはＦ（ab）2の免疫反応に実質的に
害を与えることなしに、既知の方法によつて切断
されている抗体プレパレイシヨンが成功裏に使用
されている。 しかしながら、このような方法では各抗体のＦ
（ab）1またはＦ（ab）2分画を製造しなければなら
ないから費用がかかり、また一部、特に間接法に
おいて抗血清が使用される場合には実施が非常に
困難である。 本発明によれば、標識された反応成分を使用す
る免疫反応のための直接的または間接的方法が天
然の抗体またはそのような抗体を含む血清が使用
される際にも、既知の高い感受性が完全に保持さ
れ、一方既知の高い非特異性が最小に低減される
ように簡単な方法に変えられる。 本発明は、Fc−部分と反応する各種の抗原
（いわゆるFc−受容体）の構造が、このFc−受容
体に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフ
ラグメントにより前もつて飽和される場合には、
直接試験および間接法において前記Fcに油来す
る天然の抗体の非特異的結合が避けられうるとい
う思想に基づく。この際、前記の免疫グロブリン
フラグメントは（直接試験の）抗体あるいは（間
接法の）第一の抗体が由来する種の免疫グロブリ
ンに由来すべきである。他方、使用されるすべて
の抗体はこの免疫グロブリンに対して特異性を有
していてはならない。さらに、この試験において
必要である限り、使用した免疫グロブリンフラグ
メントは補体と結合してはならない。 例えば免疫グロブリンフラグメントのかわりに
天然の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン凝集
素が使用される際に起こるような、恐らく立体構
造に由来する特異的免疫反応の障害はFc−受容
体に対して親和性を有するグロブリンフラグメン
トを使用する際には見られない。 さらに、免疫グロブリンフラグメント、例え
ば、各種の免疫グロブリンクラスのFc−フラグ
メントの使用により、免疫グロブリンの一部、例
えばそのＬ鎖、Fd片または免疫グロブリンクラ
スのＦ（ab）−フラグメントに対して調整された
抗体を直接または間接試験においてFc−フラグ
メントの免疫学的反応を起こすことなしに適用す
ることができる。 本発明の主題は直接試験または間接法による免
疫学的反応における反応成分の定性的はたは定量
的測定の方法であり、本発明方法はいわゆるFc
−受容体を有する抗原をまず第一に該Fc−受容
体に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフ
ラグメントと接触させ、次にこの免疫グロブリン
フラグメントに対して全く特異性を有しない抗体
と接触させることを特徴とする。前記の方法によ
れば、非特異的幅反応の抑制により免疫学的測定
の結果が有意に改良される。 測定されるべき反応成分が１種より多くの他の
反応成分により検出されるすべてのテストは本発
明の意味においては間接法とみなされる。従つ
て、特に抗グロブリンテスナ、補体による間接試
験およびサンドイツチテスナは本発明の意味では
間接法として包含される。 これらの方法はJ.H.Humphery氏外著
「Kurzes Lehrbuch der Immunolongie」
（Stuttgart.1975）第257〜260頁、D.M.Weir氏著
「Handbook of Experimental Immunology」
（Oxford，1973）第18.14〜18.16頁およびG.Wick
氏著「Wienei Klinische Wochenschrift」
（1972）84.1、第２〜７頁において確認標識とし
て螢光色素を利用して詳細に記載されている。 使用されるすべての抗体が標識され、そして
（または）前記第三の反応成分に加えて、該反応
成分に対して特異的に調整されたさらに他の反応
成分が使用されるようにまで間接法概念を広げる
ことができる。 従つて、標識された抗体とのインキユベーシヨ
ンが数回くりかえされるすべての方法もまた間接
法に包含される。 いわゆるFc−受容体に対して免疫グロブリン
類のFc−部分の一定の領域が高い親和性を有す
ることが文献上知られている。また、抗体分子
（免疫グロブリン分子）が蛋白分解酸素より若干
のフラグメントに切断されることも知られてい
る。すなわち、プロテイナーゼのプラスミンまた
はパパインは免疫グロブリン分を２個のＦ
（ab）1−フラグメントと１個のFc−フラグメント
とに切断する。ペプシンはその分子の他の位置を
攻撃し、２価の、いわゆるＦ（ab）2−フラグメン
トとその他の小さいペプチド、例えばpFcを形成
する。Fc−フラグメントまたはpFcとしてあら
わされるこれらの抗体分の蛋白分解生成物は、た
とえば本発明により、いわゆるFc−受容体に対
して親和性を有する免疫グロブリンフラグメント
として使用されうる。 Fc−フラグメントまたはpFcの製造の例はR.
P.Porter氏著「Biochem.J.」（1959）第73巻、第
119頁、E.J.Hershgold氏外著「Nature」（1963）
第199巻、第284頁およびH.Haupt氏著「Klin.
Wschr.」（1969）第47巻、第270頁に記載されて
いる。 直接試験と間接法の方法を以下に簡単に例示す
る。 直接試験においては、抗原を含む基質を通常特
異的抗体である標識された反応成分と接触させ
る。この際、抗体は対応する抗原と結合し、それ
により抗原は直接証明される。 間接法では測定されるべき反応成分（例えば抗
原）は１種よりも多い他の反応成分により証明さ
れる。 たとえば抗グロブリン試験においては抗原を含
有する基質を、場合により標識されている特異的
抗体と反応させ、その反応混合物から過剰の抗体
を洗浄により除去し、次にその反応混合物を前記
第一の抗体に対して特異的に調整された第二の標
識された抗体と反応させ、そして次に未結合抗体
を除去する。 サンドイツチ法では、抗体を、該抗体に対して
特異的に調整された抗原と反応させ、未結合抗原
を除去し、そして次にその反応混合物を更に前記
の抗原に対して特異的に調整された標識抗体と反
応させ、そして未結合抗体を除去する。 補体による間接試験においては、抗原基質は直
接補体と結合するかあるいは前記抗原に対して特
異的に調整された補体結体性抗体と反応し、未結
合抗原は除去される。次にその反応混合物を補体
と反応させる。未結合補体の除去後、抗原または
抗原−抗体錯体に結合した補体は、その補体に対
して特異的に調整された標識抗体により証明され
る。 この発明の範囲内において、当業者に周知の確
認標識、たとえば螢光色素による標識、放射性標
識または酵素標識を使用しうることはいうまでも
ない。 いわゆるFc−受容体に対して結合親和性を有
する免疫グロブリンフラグメントをこの発明に従
つて使用する例を以下に直接試験および抗グロブ
リン試験に関して概説する。 本発明により、ある抗原を確認または測定する
場合には、試験されるべき試料またはその一連の
希釈列を、たとえば１mgからはじまる、異なつた
量のいわゆるFc−受容体に対して結合親和性を
有する免疫グロブリンフラグメント、例えばパパ
イン切断後のIgGのFc−フラグメントと接触させ
る。その後、その混合物を20分ないし20時間、特
に約30分間４〜30゜Ｃの温度、特に約20゜Ｃにお
いて水蒸気飽和雰囲気中に放置する。 次に反応混合物から未結合Fc−フラグメント
を除去する。この除去はたとえば反応混合物を特
にポリイオン性の等張水溶液で数回（通常２回）
洗浄することにより行なわれる。次に、反応混合
物を前記の抗原に対して特異的に調整された既知
量の標識された抗体と接触させる（直接試験の場
合）か、あるいは抗血清または標識されていない
抗体と接触させる（抗グロブリン試験の場合）。
そして、その後その混合物を20分ないし20時間、
特に約30分間４〜30゜Ｃの温度で水蒸気飽和雰囲
気中に放置する。 未結合抗体は反応混合物を特にポリイオン性等
張水溶液で数回（普通２〜６回）洗浄することに
より該反応混合物から除去される。次に、抗グロ
ブリン試験においては、前記反応混合物を、前記
第一の抗体に対して特異的に調整された既知量の
標識抗体と接触させ、そして最初に使用される抗
体に関して記載されたような条件下でインキユベ
ートしかつ洗浄する。 続いて、使用した抗原の種類に応じて、反応混
合物を顕微鏡の対物ガラス上に塗布する（たとえ
ば細胞懸濁液）かあるいは担体上に固定する（組
織学的細片）。 試験は当業者に既知でありしかも関連する特定
の会社から市販されている定性および定量用の測
定観察器械、たとえば直接光または透過光によつ
て励起された螢光顕微鏡、螢光光度計、光度計ま
たは放射能測定装置を使用することにより行なわ
れる。 非特異的結合を阻止するための、Fc−受容体
に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフラ
グメント、例えばFc−フラグメントの最適量は
特定の各抗原に対して予試験により容易に決定さ
れる。 抗原としては、例えばウイルス抗原（例えば風
疹抗原、麻疹抗原、肝炎抗原）、バクテリア抗原
（例えば、サルモネラ抗原、大腸菌抗原、ブドウ
球菌抗原）、炭水化物抗原（例えば、血液型物
質）、蛋白抗原（例えば、免疫グロブリンまたは
補体フアクターのようなプラスマ蛋白）、糖蛋白
抗原（例えば、α１抗トリプシン、セルロプラス
ミン）およびリポプロテイン抗原（例えば、α１
−リポプロテイン）があげられる。 それらは単離、溶解、懸濁されるか、あるいは
例えば化学的に交さ結合した炭水化物のような水
不溶性の重合体のような担体に結合されるか、あ
るいは細胞中または細胞上に存在するか、あるい
は組織学的組織細片中に存在しうる。 いわゆるFc−受容体に対して結合親和性を有
する免疫グロブリンフラグメントを製造するため
に必要な免疫グロブリンは既知の方法により人ま
たは動物の血液または血清から得られる。しかし
ながら、本発明においては合成免疫グロブリンフ
ラグメントの使用もまた考えられる。 本発明によれば、Fc−受容体に対して結合親
和性を有する免疫グロブリンフラグメント、例え
ばFc−フラグメントを使用することにより、直
接および間接法において感度を変えることなし
に、特異的抗体の非特異的結合が弱められること
が次の実験により明らかにされるが、その結果の
一部を以下に表示する。 表１は２人の供与者のリンパ細胞の表面上への
家兎−ｒ−グロブリンの非特異的結合に対するヒ
トIgGのFc−フラグメントの影響（ＡおよびＢ
欄）ならびに前記リンパ細胞とノイラミニダーゼ
とのブレインキユベーシヨンに対するその依存性
（ＣおよびＤ欄）を示す結果をあらわす。リンパ
細胞のノイラミターゼ処置はすでに文献に発表さ
れているように（Seiler氏外著（1974）Behring
Inst・Mitt・No.55，258参照）、Fc−受容体を有す
る細胞の量を増大する。 表１（Ｂ欄およびＤ欄）に示されるように、二
重抗体法による家兎−ｒ−グロブリンのリンパ細
胞に対する非特異的結合はFc−フラグメントに
よる前処置により、Fc−フラグメントで処理さ
れていない細胞（ＡおよびＣ欄）と比較して本質
的に低減されている。 さらにその他の例として、たとえば、マウス、
ラツト、家兎またはヒトの肝臓または腎臓のよう
な各種の器管の凍結細片を既知の方法で顕微鏡の
プレパラートガラス上に置き約0.1mlの１％また
は0.1％のヒトIgGのFc−フラグメント溶液と共
に湿濁空中で30分間、20゜Ｃでインキユベート
し、次に等張食溶液で軽く洗浄し、そして続いて
二重抗体試験が既知の方法（間接法）（G.Wick氏
著（1972）Wien.klin.Wschr.84，２〜７参照）に
よりヒトの抗血清を第一の抗体として使用し、そ
して第二の抗体としてFc−フラグメントと交さ
反応をしない抗体を使用して行なわれる場合に
は、上述のようにFc−フラグメントで前処理さ
れなかつた凍結細原片と比較して前記抗体の凍結
細片に対する非特異的結合は一層低減した。
原抗体間相互の既知の親和性を利用して免疫学的
反応の一方の反応成分を定性的または定量的に測
定する方法に関するものである。本発明は、この
ような反応がある種の確認標識を使用することに
より一層正確に記録されうるという事実を利用し
ている。 標識された反応成分との免疫学的反応には原則
的には次の２種の方法がある。すなわち、一方は
直接試験であり他方は間接法である。 直接試験においては、通常抗原である測定され
るべき反応成分は、このものに対して特異的に調
整され標識された第二の反応成分（通常抗体であ
る）とのインキユベーシヨンにより証明されう
る。 間接法においては、測定されるべき反応成分の
先ずそれに対して特異的に調整された第二の反応
成分と共にインキユベートされ、前記第二の反応
成分の未結合部分の分離除去後、その反応混合物
は前記第二の反応成分に対して特異的に調整さ
れ、通常標識されている第三の反応成分と共にイ
ンキユベートされる。 直接試験が非常に高い特異性を示すことは当業
者に周知であるが、その欠点は感受性が小さいこ
とである。反対に間接法では感受性は高いが特異
性が小さいことが知られている。 この直接試験および間接法において特異性に影
響を及ぼす本質的な原因の１種としては、抗原に
対する抗体の非特異的結合および抗体のまわりの
抗原の構造と考えることができる。 この非特異的結合は主に抗体分子（＝免疫グロ
ブリン）のいわゆるFc−部分と呼ばれる領域に
起因する。このことはまた高い特異性をもつ抗体
に関しても同様である。 抗体分子に構造変化が起こる場合、文献中Fc
−受容体と記載されている細胞性あるいは組織の
各種の構造に対するFc部分の結合親和力は非常
に増大される。この変化は抗体プレパレイシヨン
中における抗体分子の自然発生的凝集の際、抗原
と抗体との結合の際（免疫錯体）または人工的表
面（たとえばラテツクス粒子）上の抗体分子の吸
着の際におこる。 従来、非特異的結合を弱めるための各種の方法
が行なわれた。たとえば、抗体プレパレイシヨン
からの凝集体または免疫錯体の超遠心分離による
除去、蛋白安定化または凝集体形阻止を目的とし
た、アルブミンの抗体プレパレイシヨンに対する
添加等である。 さらに前記直接試験および間接法においては、
そのFc−部分が、それ以外の残りのフラグメン
トＦ（ab）1またはＦ（ab）2の免疫反応に実質的に
害を与えることなしに、既知の方法によつて切断
されている抗体プレパレイシヨンが成功裏に使用
されている。 しかしながら、このような方法では各抗体のＦ
（ab）1またはＦ（ab）2分画を製造しなければなら
ないから費用がかかり、また一部、特に間接法に
おいて抗血清が使用される場合には実施が非常に
困難である。 本発明によれば、標識された反応成分を使用す
る免疫反応のための直接的または間接的方法が天
然の抗体またはそのような抗体を含む血清が使用
される際にも、既知の高い感受性が完全に保持さ
れ、一方既知の高い非特異性が最小に低減される
ように簡単な方法に変えられる。 本発明は、Fc−部分と反応する各種の抗原
（いわゆるFc−受容体）の構造が、このFc−受容
体に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフ
ラグメントにより前もつて飽和される場合には、
直接試験および間接法において前記Fcに油来す
る天然の抗体の非特異的結合が避けられうるとい
う思想に基づく。この際、前記の免疫グロブリン
フラグメントは（直接試験の）抗体あるいは（間
接法の）第一の抗体が由来する種の免疫グロブリ
ンに由来すべきである。他方、使用されるすべて
の抗体はこの免疫グロブリンに対して特異性を有
していてはならない。さらに、この試験において
必要である限り、使用した免疫グロブリンフラグ
メントは補体と結合してはならない。 例えば免疫グロブリンフラグメントのかわりに
天然の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン凝集
素が使用される際に起こるような、恐らく立体構
造に由来する特異的免疫反応の障害はFc−受容
体に対して親和性を有するグロブリンフラグメン
トを使用する際には見られない。 さらに、免疫グロブリンフラグメント、例え
ば、各種の免疫グロブリンクラスのFc−フラグ
メントの使用により、免疫グロブリンの一部、例
えばそのＬ鎖、Fd片または免疫グロブリンクラ
スのＦ（ab）−フラグメントに対して調整された
抗体を直接または間接試験においてFc−フラグ
メントの免疫学的反応を起こすことなしに適用す
ることができる。 本発明の主題は直接試験または間接法による免
疫学的反応における反応成分の定性的はたは定量
的測定の方法であり、本発明方法はいわゆるFc
−受容体を有する抗原をまず第一に該Fc−受容
体に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフ
ラグメントと接触させ、次にこの免疫グロブリン
フラグメントに対して全く特異性を有しない抗体
と接触させることを特徴とする。前記の方法によ
れば、非特異的幅反応の抑制により免疫学的測定
の結果が有意に改良される。 測定されるべき反応成分が１種より多くの他の
反応成分により検出されるすべてのテストは本発
明の意味においては間接法とみなされる。従つ
て、特に抗グロブリンテスナ、補体による間接試
験およびサンドイツチテスナは本発明の意味では
間接法として包含される。 これらの方法はJ.H.Humphery氏外著
「Kurzes Lehrbuch der Immunolongie」
（Stuttgart.1975）第257〜260頁、D.M.Weir氏著
「Handbook of Experimental Immunology」
（Oxford，1973）第18.14〜18.16頁およびG.Wick
氏著「Wienei Klinische Wochenschrift」
（1972）84.1、第２〜７頁において確認標識とし
て螢光色素を利用して詳細に記載されている。 使用されるすべての抗体が標識され、そして
（または）前記第三の反応成分に加えて、該反応
成分に対して特異的に調整されたさらに他の反応
成分が使用されるようにまで間接法概念を広げる
ことができる。 従つて、標識された抗体とのインキユベーシヨ
ンが数回くりかえされるすべての方法もまた間接
法に包含される。 いわゆるFc−受容体に対して免疫グロブリン
類のFc−部分の一定の領域が高い親和性を有す
ることが文献上知られている。また、抗体分子
（免疫グロブリン分子）が蛋白分解酸素より若干
のフラグメントに切断されることも知られてい
る。すなわち、プロテイナーゼのプラスミンまた
はパパインは免疫グロブリン分を２個のＦ
（ab）1−フラグメントと１個のFc−フラグメント
とに切断する。ペプシンはその分子の他の位置を
攻撃し、２価の、いわゆるＦ（ab）2−フラグメン
トとその他の小さいペプチド、例えばpFcを形成
する。Fc−フラグメントまたはpFcとしてあら
わされるこれらの抗体分の蛋白分解生成物は、た
とえば本発明により、いわゆるFc−受容体に対
して親和性を有する免疫グロブリンフラグメント
として使用されうる。 Fc−フラグメントまたはpFcの製造の例はR.
P.Porter氏著「Biochem.J.」（1959）第73巻、第
119頁、E.J.Hershgold氏外著「Nature」（1963）
第199巻、第284頁およびH.Haupt氏著「Klin.
Wschr.」（1969）第47巻、第270頁に記載されて
いる。 直接試験と間接法の方法を以下に簡単に例示す
る。 直接試験においては、抗原を含む基質を通常特
異的抗体である標識された反応成分と接触させ
る。この際、抗体は対応する抗原と結合し、それ
により抗原は直接証明される。 間接法では測定されるべき反応成分（例えば抗
原）は１種よりも多い他の反応成分により証明さ
れる。 たとえば抗グロブリン試験においては抗原を含
有する基質を、場合により標識されている特異的
抗体と反応させ、その反応混合物から過剰の抗体
を洗浄により除去し、次にその反応混合物を前記
第一の抗体に対して特異的に調整された第二の標
識された抗体と反応させ、そして次に未結合抗体
を除去する。 サンドイツチ法では、抗体を、該抗体に対して
特異的に調整された抗原と反応させ、未結合抗原
を除去し、そして次にその反応混合物を更に前記
の抗原に対して特異的に調整された標識抗体と反
応させ、そして未結合抗体を除去する。 補体による間接試験においては、抗原基質は直
接補体と結合するかあるいは前記抗原に対して特
異的に調整された補体結体性抗体と反応し、未結
合抗原は除去される。次にその反応混合物を補体
と反応させる。未結合補体の除去後、抗原または
抗原−抗体錯体に結合した補体は、その補体に対
して特異的に調整された標識抗体により証明され
る。 この発明の範囲内において、当業者に周知の確
認標識、たとえば螢光色素による標識、放射性標
識または酵素標識を使用しうることはいうまでも
ない。 いわゆるFc−受容体に対して結合親和性を有
する免疫グロブリンフラグメントをこの発明に従
つて使用する例を以下に直接試験および抗グロブ
リン試験に関して概説する。 本発明により、ある抗原を確認または測定する
場合には、試験されるべき試料またはその一連の
希釈列を、たとえば１mgからはじまる、異なつた
量のいわゆるFc−受容体に対して結合親和性を
有する免疫グロブリンフラグメント、例えばパパ
イン切断後のIgGのFc−フラグメントと接触させ
る。その後、その混合物を20分ないし20時間、特
に約30分間４〜30゜Ｃの温度、特に約20゜Ｃにお
いて水蒸気飽和雰囲気中に放置する。 次に反応混合物から未結合Fc−フラグメント
を除去する。この除去はたとえば反応混合物を特
にポリイオン性の等張水溶液で数回（通常２回）
洗浄することにより行なわれる。次に、反応混合
物を前記の抗原に対して特異的に調整された既知
量の標識された抗体と接触させる（直接試験の場
合）か、あるいは抗血清または標識されていない
抗体と接触させる（抗グロブリン試験の場合）。
そして、その後その混合物を20分ないし20時間、
特に約30分間４〜30゜Ｃの温度で水蒸気飽和雰囲
気中に放置する。 未結合抗体は反応混合物を特にポリイオン性等
張水溶液で数回（普通２〜６回）洗浄することに
より該反応混合物から除去される。次に、抗グロ
ブリン試験においては、前記反応混合物を、前記
第一の抗体に対して特異的に調整された既知量の
標識抗体と接触させ、そして最初に使用される抗
体に関して記載されたような条件下でインキユベ
ートしかつ洗浄する。 続いて、使用した抗原の種類に応じて、反応混
合物を顕微鏡の対物ガラス上に塗布する（たとえ
ば細胞懸濁液）かあるいは担体上に固定する（組
織学的細片）。 試験は当業者に既知でありしかも関連する特定
の会社から市販されている定性および定量用の測
定観察器械、たとえば直接光または透過光によつ
て励起された螢光顕微鏡、螢光光度計、光度計ま
たは放射能測定装置を使用することにより行なわ
れる。 非特異的結合を阻止するための、Fc−受容体
に対して結合親和性を有する免疫グロブリンフラ
グメント、例えばFc−フラグメントの最適量は
特定の各抗原に対して予試験により容易に決定さ
れる。 抗原としては、例えばウイルス抗原（例えば風
疹抗原、麻疹抗原、肝炎抗原）、バクテリア抗原
（例えば、サルモネラ抗原、大腸菌抗原、ブドウ
球菌抗原）、炭水化物抗原（例えば、血液型物
質）、蛋白抗原（例えば、免疫グロブリンまたは
補体フアクターのようなプラスマ蛋白）、糖蛋白
抗原（例えば、α１抗トリプシン、セルロプラス
ミン）およびリポプロテイン抗原（例えば、α１
−リポプロテイン）があげられる。 それらは単離、溶解、懸濁されるか、あるいは
例えば化学的に交さ結合した炭水化物のような水
不溶性の重合体のような担体に結合されるか、あ
るいは細胞中または細胞上に存在するか、あるい
は組織学的組織細片中に存在しうる。 いわゆるFc−受容体に対して結合親和性を有
する免疫グロブリンフラグメントを製造するため
に必要な免疫グロブリンは既知の方法により人ま
たは動物の血液または血清から得られる。しかし
ながら、本発明においては合成免疫グロブリンフ
ラグメントの使用もまた考えられる。 本発明によれば、Fc−受容体に対して結合親
和性を有する免疫グロブリンフラグメント、例え
ばFc−フラグメントを使用することにより、直
接および間接法において感度を変えることなし
に、特異的抗体の非特異的結合が弱められること
が次の実験により明らかにされるが、その結果の
一部を以下に表示する。 表１は２人の供与者のリンパ細胞の表面上への
家兎−ｒ−グロブリンの非特異的結合に対するヒ
トIgGのFc−フラグメントの影響（ＡおよびＢ
欄）ならびに前記リンパ細胞とノイラミニダーゼ
とのブレインキユベーシヨンに対するその依存性
（ＣおよびＤ欄）を示す結果をあらわす。リンパ
細胞のノイラミターゼ処置はすでに文献に発表さ
れているように（Seiler氏外著（1974）Behring
Inst・Mitt・No.55，258参照）、Fc−受容体を有す
る細胞の量を増大する。 表１（Ｂ欄およびＤ欄）に示されるように、二
重抗体法による家兎−ｒ−グロブリンのリンパ細
胞に対する非特異的結合はFc−フラグメントに
よる前処置により、Fc−フラグメントで処理さ
れていない細胞（ＡおよびＣ欄）と比較して本質
的に低減されている。 さらにその他の例として、たとえば、マウス、
ラツト、家兎またはヒトの肝臓または腎臓のよう
な各種の器管の凍結細片を既知の方法で顕微鏡の
プレパラートガラス上に置き約0.1mlの１％また
は0.1％のヒトIgGのFc−フラグメント溶液と共
に湿濁空中で30分間、20゜Ｃでインキユベート
し、次に等張食溶液で軽く洗浄し、そして続いて
二重抗体試験が既知の方法（間接法）（G.Wick氏
著（1972）Wien.klin.Wschr.84，２〜７参照）に
よりヒトの抗血清を第一の抗体として使用し、そ
して第二の抗体としてFc−フラグメントと交さ
反応をしない抗体を使用して行なわれる場合に
は、上述のようにFc−フラグメントで前処理さ
れなかつた凍結細原片と比較して前記抗体の凍結
細片に対する非特異的結合は一層低減した。
【表】
後記表２に示される例は、例えばFc−フラグ
メントを使用してリンパ細胞上のFc−受容体を
飽和することは、免疫グロブリン凝集体を使用す
る場合と対照的に、隣接する抗原構造の立体障害
を起こさないことを示している。 この例においてはリンパ球Ｂ型（RPMT1788）
のリンパ芽球培養細胞がいわゆる混合リンパ球培
養（MLC）を抑える抗血清（血清196602）と共
にインキユベートされた。MLC中のＢ型のリン
パ球の抗原構造とリンパ芽球培養細胞が一致する
ために、前記抗血清の抗体はリンパ芽球細胞に結
合する。これらの抗体は前記第一の抗体に対して
特異的に調整された標識第二抗体（FITC−抗−
IgMまたはFITC−抗−Ｋ＋抗−ｌ）により証明
される。この際、抗体プレパレイシヨン中に存在
している、免疫集合体または免疫錯体のFc−部
分によつて非特異的反応がまちがつて陽性結果を
導くことが知られている。免疫グロブリンＧの集
合体よる細胞上のいわゆるFc−受容体の予飽和
は、Ｃ欄から明らかなごとく、また文献から知ら
れているように、おそらく立体障害のために実際
上すべての抗体が細胞に結合されることはないと
いう結果に終る。免疫グロブリン集合体のかわり
にFc−フラグメントを使用する際は、Fc−受容
体がFc−フラグメントにより飽和されているに
もかかわらず抗体の障害は起こらない（Ｄ欄）。
これは続いて免疫グロブリン集合体を適用しても
それはそれ以上細胞上に結合されないことにより
証明される（Ｅ欄）。 本発明の方法は、以上述べたように、たとえば
細胞形質の抗原、細胞膜抗原（特にMLC−決定
基）、細胞核の抗原、組織中の抗原または担体上
の抗原あるいは溶解している抗体の証明におい
て、非特異的結合を抑制することにより免疫学的
反応の改良に特に適している。
メントを使用してリンパ細胞上のFc−受容体を
飽和することは、免疫グロブリン凝集体を使用す
る場合と対照的に、隣接する抗原構造の立体障害
を起こさないことを示している。 この例においてはリンパ球Ｂ型（RPMT1788）
のリンパ芽球培養細胞がいわゆる混合リンパ球培
養（MLC）を抑える抗血清（血清196602）と共
にインキユベートされた。MLC中のＢ型のリン
パ球の抗原構造とリンパ芽球培養細胞が一致する
ために、前記抗血清の抗体はリンパ芽球細胞に結
合する。これらの抗体は前記第一の抗体に対して
特異的に調整された標識第二抗体（FITC−抗−
IgMまたはFITC−抗−Ｋ＋抗−ｌ）により証明
される。この際、抗体プレパレイシヨン中に存在
している、免疫集合体または免疫錯体のFc−部
分によつて非特異的反応がまちがつて陽性結果を
導くことが知られている。免疫グロブリンＧの集
合体よる細胞上のいわゆるFc−受容体の予飽和
は、Ｃ欄から明らかなごとく、また文献から知ら
れているように、おそらく立体障害のために実際
上すべての抗体が細胞に結合されることはないと
いう結果に終る。免疫グロブリン集合体のかわり
にFc−フラグメントを使用する際は、Fc−受容
体がFc−フラグメントにより飽和されているに
もかかわらず抗体の障害は起こらない（Ｄ欄）。
これは続いて免疫グロブリン集合体を適用しても
それはそれ以上細胞上に結合されないことにより
証明される（Ｅ欄）。 本発明の方法は、以上述べたように、たとえば
細胞形質の抗原、細胞膜抗原（特にMLC−決定
基）、細胞核の抗原、組織中の抗原または担体上
の抗原あるいは溶解している抗体の証明におい
て、非特異的結合を抑制することにより免疫学的
反応の改良に特に適している。
【表】
本発明はリンパ球上細胞膜に結合されたMLC
−決定基）の証明に関する以下の例により更に具
体的に説明される。 例 ヒトの末梢リンパ球を静脈全血から既知の方法
で単離する。このようにして得られたリンパ球懸
濁液は実質上Ｂ型リンパ球とＴ型リンパ球からな
る細胞混合物である。Ｔ型細胞を既知の方法によ
りできるだけ分離そして除去する。Ｂ型細胞に富
む残留リンパ球を等張食塩溶液で２回洗浄する。
細胞沈澱物の一定数、この場合には１×106リン
パ球をIgGのFc−フラグメントの１％溶液0.1ml
（この量は予試験により最適として証明された）
中に再懸濁させ、そして30分間室温においてイン
キユベートする。このバツチを次に等張食塩溶液
で２回洗浄する。各バツチ（細胞沈澱物）を試験
されるべきヒト血清0.1ml中に再び懸濁させ、室
温においてインキユベートする。以上の例におい
て９種の被試血清および１種の陰性の対称血清
（Ａ，Ｂ）が使用された。 次に反応混合物を等張食塩溶液中で３回洗浄す
る。 前記沈澱物をヒト免疫グロブリン（１％蛋白溶
液）のＬ鎖に対して特異的に調整された家兎の螢
光標識抗体0.05mlで再懸濁し、30分間室温におい
てインキユベートし、次に等張食塩溶液中で３回
洗浄する。 続いて、前記沈澱物を牛血清アルブミン溶液
（２％ｗ／ｖ）0.05ml中に再懸濁させ、その懸濁
液をプレパラートガラス上に添布して空気中で乾
燥させ、そして既知の方法によりグリセリンで包
埋する。 全細胞に対する螢光発生細胞の割合を螢光顕微
鏡により算出してパーセントで示す。 結果： Fc−フラグメントを用いて処理した後の陽性
細胞の数を後記表３の欄に示す。Fc−フラグ
メントで処理されなかつただけの同一の抗体から
得られた値（Ｉ欄）と比較して陽性細胞の減少が
明らかである。この減少は血清に応じて異なる。
従つて、陽性血清と陰性血清との鑑別がこれによ
り一層可能となる。
−決定基）の証明に関する以下の例により更に具
体的に説明される。 例 ヒトの末梢リンパ球を静脈全血から既知の方法
で単離する。このようにして得られたリンパ球懸
濁液は実質上Ｂ型リンパ球とＴ型リンパ球からな
る細胞混合物である。Ｔ型細胞を既知の方法によ
りできるだけ分離そして除去する。Ｂ型細胞に富
む残留リンパ球を等張食塩溶液で２回洗浄する。
細胞沈澱物の一定数、この場合には１×106リン
パ球をIgGのFc−フラグメントの１％溶液0.1ml
（この量は予試験により最適として証明された）
中に再懸濁させ、そして30分間室温においてイン
キユベートする。このバツチを次に等張食塩溶液
で２回洗浄する。各バツチ（細胞沈澱物）を試験
されるべきヒト血清0.1ml中に再び懸濁させ、室
温においてインキユベートする。以上の例におい
て９種の被試血清および１種の陰性の対称血清
（Ａ，Ｂ）が使用された。 次に反応混合物を等張食塩溶液中で３回洗浄す
る。 前記沈澱物をヒト免疫グロブリン（１％蛋白溶
液）のＬ鎖に対して特異的に調整された家兎の螢
光標識抗体0.05mlで再懸濁し、30分間室温におい
てインキユベートし、次に等張食塩溶液中で３回
洗浄する。 続いて、前記沈澱物を牛血清アルブミン溶液
（２％ｗ／ｖ）0.05ml中に再懸濁させ、その懸濁
液をプレパラートガラス上に添布して空気中で乾
燥させ、そして既知の方法によりグリセリンで包
埋する。 全細胞に対する螢光発生細胞の割合を螢光顕微
鏡により算出してパーセントで示す。 結果： Fc−フラグメントを用いて処理した後の陽性
細胞の数を後記表３の欄に示す。Fc−フラグ
メントで処理されなかつただけの同一の抗体から
得られた値（Ｉ欄）と比較して陽性細胞の減少が
明らかである。この減少は血清に応じて異なる。
従つて、陽性血清と陰性血清との鑑別がこれによ
り一層可能となる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞性抗原を、最初にFc−フラグメントと
接触させ、次に前記Fc−フラグメントに対して
特異性を示さない抗体と接触させることを特徴と
する、直接試験または間接法による免疫学的反応
における反応成分の定性的または定量的測定方
法。 ２ 飽和されるべきFc−受容体の量に対応する
Fc−フラグメントの量を導入することを特徴と
する、前記第１項による方法。 ３ 細胞原形質中、細胞性膜中、細胞核、組織中
の抗原、特にMLC−決定基を測定することを特
徴とする、前記第１または第２項の方法。 ４ 細胞性抗原がリンパ球である前記第１または
第２項の方法。 ５ 溶解した抗体を測定することを特徴とする前
記第１〜４項のいずれか一つによる方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2643208A DE2643208C2 (de) | 1976-09-25 | 1976-09-25 | Immunologisches Bestimmungsverfahren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5341422A JPS5341422A (en) | 1978-04-14 |
| JPS6120815B2 true JPS6120815B2 (ja) | 1986-05-23 |
Family
ID=5988821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11396177A Granted JPS5341422A (en) | 1976-09-25 | 1977-09-24 | Immunologically measuring method |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4166106A (ja) |
| JP (1) | JPS5341422A (ja) |
| AT (1) | AT358185B (ja) |
| AU (1) | AU513660B2 (ja) |
| BE (1) | BE859054A (ja) |
| CA (1) | CA1093464A (ja) |
| CH (1) | CH634150A5 (ja) |
| DE (1) | DE2643208C2 (ja) |
| DK (1) | DK421977A (ja) |
| FR (1) | FR2365800A1 (ja) |
| GB (1) | GB1592610A (ja) |
| IT (1) | IT1154001B (ja) |
| NL (1) | NL7710310A (ja) |
| NO (1) | NO773267L (ja) |
| NZ (1) | NZ185242A (ja) |
| SE (1) | SE7710710L (ja) |
| ZA (1) | ZA775700B (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4326027A (en) * | 1978-03-28 | 1982-04-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Antiglobulin control cells |
| US4292403A (en) * | 1978-08-24 | 1981-09-29 | Akzona Incorporated | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins |
| US4298593A (en) * | 1979-08-21 | 1981-11-03 | Abbott Laboratories | Reagents and methods utilizing labeled Fab bound to antigens |
| DE3173342D1 (en) * | 1980-03-03 | 1986-02-13 | Milton David Goldenberg | Agent for tumor localization and therapy with labeled antibodies and antibody fragments |
| US4399229A (en) * | 1980-04-14 | 1983-08-16 | Immutron, Inc. | Rapid radioimmunoassay product and method of making and using same |
| US4481298A (en) * | 1981-04-13 | 1984-11-06 | Amf Incorporated | Pre-precipitated double antibody immunoassay method |
| US4434227A (en) | 1982-02-08 | 1984-02-28 | Abbott Laboratories | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies |
| EP0109861A3 (en) * | 1982-11-23 | 1986-05-14 | Bio-Response Inc. | Method for isolating cells |
| CA1244781A (en) * | 1984-10-24 | 1988-11-15 | Vaal Reefs Exploration And Mining Company Limited | Cage deck |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
| DE3720983A1 (de) * | 1987-06-25 | 1989-01-05 | Hoechst Ag | Immunometrisches bestimmungsverfahren |
| CA2093494A1 (en) * | 1992-04-17 | 1993-10-18 | Keisuke Iwata | Method for the elimination of non-specific reactions in immuno-assays |
| US5487975A (en) * | 1993-11-15 | 1996-01-30 | Ventana Medical Systems, Inc. | Biotin/avidin formulation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2322533C2 (de) * | 1972-11-06 | 1986-08-28 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens |
| DE2322562C2 (de) * | 1972-11-06 | 1984-03-29 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe |
-
1976
- 1976-09-25 DE DE2643208A patent/DE2643208C2/de not_active Expired
-
1977
- 1977-09-20 NL NL7710310A patent/NL7710310A/xx unknown
- 1977-09-22 CH CH1160177A patent/CH634150A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-09-22 AU AU29004/77A patent/AU513660B2/en not_active Expired
- 1977-09-22 US US05/835,789 patent/US4166106A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-09-23 IT IT27905/77A patent/IT1154001B/it active
- 1977-09-23 GB GB39832/77A patent/GB1592610A/en not_active Expired
- 1977-09-23 NO NO773267A patent/NO773267L/no unknown
- 1977-09-23 SE SE7710710A patent/SE7710710L/xx unknown
- 1977-09-23 ZA ZA00775700A patent/ZA775700B/xx unknown
- 1977-09-23 DK DK421977A patent/DK421977A/da unknown
- 1977-09-23 CA CA287,375A patent/CA1093464A/en not_active Expired
- 1977-09-23 NZ NZ185242A patent/NZ185242A/xx unknown
- 1977-09-23 AT AT683877A patent/AT358185B/de active
- 1977-09-24 JP JP11396177A patent/JPS5341422A/ja active Granted
- 1977-09-26 BE BE181201A patent/BE859054A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-09-26 FR FR7728920A patent/FR2365800A1/fr active Granted
Also Published As
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| NZ185242A (en) | 1980-03-05 |
| FR2365800B1 (ja) | 1984-05-25 |
| NO773267L (no) | 1978-03-29 |
| DE2643208A1 (de) | 1978-04-06 |
| CA1093464A (en) | 1981-01-13 |
| DK421977A (da) | 1978-03-26 |
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| SE7710710L (sv) | 1978-03-26 |
| ZA775700B (en) | 1978-08-30 |
| FR2365800A1 (fr) | 1978-04-21 |
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| IT1154001B (it) | 1987-01-21 |
| AU2900477A (en) | 1979-03-29 |
| US4166106A (en) | 1979-08-28 |
| GB1592610A (en) | 1981-07-08 |
| JPS5341422A (en) | 1978-04-14 |
| AU513660B2 (en) | 1980-12-11 |
| BE859054A (fr) | 1978-03-28 |
| CH634150A5 (de) | 1983-01-14 |
| DE2643208C2 (de) | 1985-09-05 |
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