JPS61210037A - 初乳由来ポリペプチド因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ＩｇＥ抗体に対して親和性を有しくＩｇＥ
−結合活性）そしてリンノや球によるＩｇＥ抗体の合成
を抑制することができる（ＩｇＥサプレッサー活性）ヒ
ト−初乳由来の新規なポリペプチド因子、これらの因子
を単離するための方法、及びアレルギー治療におけるこ
れらの使用に関する。

□この明細書においては次の略号を使用する。

・ＩｇＥ　　　：免疫グロブリンＥ： ｘｇａ　　　：免疫グロブリンＧ： ＩｔＥ−ｂｆ　　：　ＩｇＥ−結合因子、ＩｇＥ抗体に
結合するポリペプチド： ＩｇＥ−ＳＦ　：　ＩｇＥ−サプレッサー因子、Ｂリン
／′９球によるＩｇＥ抗体の合成を抑制する ポリペプチド： ＩｇＥ−ＰＦ　　：　ＩｔＢ−相乗因子、Ｂリッツ１球
によるＩｇＥの合成を相乗する、すなわち増 強するポリペプチド： ＩｇＡ　　　：免疫グロブリンＡ： ＩｇＭ　　　：免疫グロブリンＭ； ＧＩＦ　　　：グリコモル化阻害因子：ＧＥＦ　　　：
グリコモル化増強因子：ＫＤ　　：キロダルトン、ＩＫ
Ｄ＝１０００Ｊ’／Ｉｌｉ！ｏｌ：ＭＷ　　：分子量： Ｍ　　　：モル濃度： Ｅ−Ｉｇｌ　　：　ＩｇＥでコートされた赤血球；ＲＰ
ＭＩ８８６６　　：　ＦｃＲを示すＢリン１４球セルラ
イン：Ｔｒｌｓ　　　：）リス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン： ＢＳＡ　　　：ウシ血清アルブミン； ＨＢＳＳ　　　：ハンクの平衡塩溶液；ＩｇＥ−Ｐｇ　
　：骨髄腫ｐｓのヒトＩｇＥ　：Ｉ−ＩｇＥ−ＲＰＣ：
　ＩｇＥ−コートされ念赤血球とロゼツトを形成する細
胞： ＳＤ　　　：標準偏差。

〔従来の技術〕

アレルギー性疾患は、それによりて非常に多数の個体が
影響を受ける主要な健康問題である。通常、その治療は
抗ヒスタミン剤の使用又は幾分有効な免疫感作（ｉｍｍ
ｕｎｌｚａｔｉｏｎ）　法に限定されている。古典的な
抗アレルギー剤は、特に、治療され几患者において種々
の副作用を惹起するため、幾つかの欠点を有する。はと
んどの患者は多数のアレルゲンに対して感受性であるが
、免疫感作法は１又は２種類のアレルゲンに限定される
。さらに、除感作（ｈｙｐｏｓｅｎｓｉ　ｔｌｚａｔｌ
ｏｎ）治療は治療に役立つものでもなく、保護に役立つ
ものでもない。

アレルギー性疾患においてＩｇＥが主要な役割を演する
ことが知られているため、過去１０年間にわ念りＩｇＥ
の生産を制御する機構が広範に研究されてきた。これら
の研究は、ＩｇＥの合成を制御する幾つかの因子の動物
モデルにおける存在を証明した。これらの因子は８９７
７４球及びＴリンパ球により生産され、そして、アレル
ギー抑制因子（ＳＦＡ）、抑制エフェクター分子（ＳＫ
Ｍ）、Ｂ細胞又はＴ細胞由来のＩｇＥ−誘導制御物質（
ＥＩＲ，、及びＥＩＲＴ）、ＩｔＥ−結合因子（ＩｇＥ
−ＢＦ）、グリコジル化増強因子（ＧＥＦ）、及びグリ
コジル化阻害因子（ＧＩＦ’ｌと呼ばれている。

これらの因子の幾つかは、その分子量及び／又は生物学
的活性に基き、相互に明確に異る（概観する念めには参
照文献１及び２を参照のこと）。

ＩｇＥ抗体生産の非−抗原特異的制御におけるＩｆＥ−
結合因子（ＩｇＥ−ｂｆ）の役割が動物において広範に
研究されており（文献１に総説されているように）、Ｉ
ｇＥ−ｂｆはＩｇＥ−特異的アイソタイプ制御のエフェ
クター分子であることが示された。

主としてその炭水化物成分において異る２種類のＩｇＥ
−ｂｆ　、すなわちＩｇＥサプレッサー及びＩｇＥ相乗
因子（ＩｇＥ−ＳＦ、及びＩｇＥ−ＰＨ’　）が同定さ
れ念。

１、Ｅ−ＳＦとＩｇＥ−ＰＦとの比率がＩｇＥ抗体の実
際の生産を決定する。別個の制御的’ｌ’　ＩＪンノ々
球亜集団により分必されるグリコジル化阻害因子（ＧＩ
Ｆ）又はグリコジル化増強因子（ＧＥＦ　）のいずれか
の影響に依存して、同じ細胞がＩｇＥ−ＳＦ又はＩｇＥ
−ＰＦのいずれかを分泌することができる。

最近、ＩｇＥのためのレセプターを示すＴ−又はＢ−セ
ルライン培養上清中（３，４）、及び重篤な過敏皮膚炎
を有する選択され九患者の血清中（５）のヒトＩｇＥ−
ｂｆも記載されている。由来を異にするＩ　ｇＥ−ｂ　
ｆが同一の分子に対応するか否かを決定するためには、
それらの他の生化学的特徴付けが明らかに要求される。

母乳供与が新生児の免疫反応性を変化せしめることはす
でに知られている。これは、実験動物及びヒトにおいて
記載されておシ、そして例えば、ツベルクリン感受性の
母親からミルクを与えられ几乳先はツベルクリンに対す
る細胞性免疫を獲得することが示され几（７，８）。最
近の予想に基く研究はさらに、母乳のみの供与がアレル
ギー性疾患に対する高い危険性から幼児を保護すること
を示した。

後者の観察を説明するために多くの機構が提案された。

（ｉ）外来性の食品抗原に対する暴露の減少、（１１）
種々の食物抗原及び他の環境抗原に特異的な抗体をブロ
ックする乳１ｇＡによる保＠（９）、（ｉｉｉ）アレル
ギー疾患の開始を惹起することが知られている一般のウ
ィルス性疾患に対する保護（１０）、及び最後に（１■
）新生児の未成熟免疫系を調節することができる免疫制
御因子の人乳中での存在（１１）、がそれである。さら
に、アレルギー性疾患に対する高い危険性を有する新生
児が、家族層及び帯面（ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ）の血清
中の高いＩｇＥレベルに基いて同定され得ることも知ら
れている（１２）。

母乳を供与されｔ新生児の免疫反応性についてのよく証
明されｔ観察は、ヒト−初乳中の特異的抗体もしくはイ
ディオタイプ（１３，１４）、免疫制御因子、又は制御
リンパ球（ｒｇｕｌａｔｏｒｙｌｙｍｐｈｏｅｙｔａｓ
）　（１５、１６）の存在によって説明されるかも知れ
ない。従って、母乳の供与は、ＩｇＥ−サプレッサー、
又はＩｇＥ抗体の生産の制御に関与する新生児のリンパ
球を妨害することができる他の分子（例えばＧＩＦ　）
もしくは細胞を新生児に提供することによりそれらを保
護することが示唆される。

今まで、ＩｇＥ−ＳＦ活性を有するＩｇＥ−ｂｆはヒト
−初乳中には同定されておらず、その単離を今ここに記
載する。驚くべきことに、このようなＩｇＥ−ｂｆが今
や単離された。

〔発明の目的〕

この発明の第１の目的は、ヒト−初乳由来のＩｇＥ−Ｓ
Ｆ活性を有するＩｇＥ−ｂｆ　、及びその単離方法を提
供することである。

この発明の他の目的は、この発明のＩｇＥ−ｂｆを投与
することによるアレルギーの予防及び／又は治療の方法
を提供すること、並びにこのＩｇＥ−ｂｆを含んで成る
医薬組成物を提供することである。

以下１ＩＩＬｔ３ 〔具体的な説明〕 この発明は、ヒト−初乳から濃縮された形で得られる、
ＩｇＥサプレッサー（ＩｇＥ−ＳＦ　）活性を有するＩ
ｇＥ結合因子（ＩｇＥ−ｂｆ　）に関する。

この発明のＩｇＥ−ｂｆはさらに次のように特徴付けら
れる。（１）これらは、指梯を有するセファデックスＧ
−７５カラム上でのクロマトグラフィーにより決定され
る場合、１０〜２５キロダルトン（ＫＤ）の分子量を有
するポリペプチドであシ；（２）これらは、例えはＲＰ
ＭＩ８８６６細胞とＥ−１ｇＫとのロゼツト形成の阻害
により決定される場合、ＩｇＥのためのレセプターを担
持する細胞へのＩｇＥの結合をブロックし；（３）これ
らは、アレルギーを有するヒト供与体のＢリン１４１５
ｇによるＩｇＭの生産を変化せしめることなく、ＩｇＥ
の合成を投与量依存的に抑制し；（４）これらは、例え
はＩｇＥ−セファロースへのそれらの吸着により決定さ
れる場合ＩｇＥに結合し、そしてこれらは例えばＩｇＧ
−セファロースへの吸着の欠除により決定される場合Ｉ
ｇＧに結合せず：（５）ウェスタンプロットアッセイに
おいて、初乳ＩｇＥ−ｂｆは、放射性ラベルされたＩｇ
ＥＫ％異的に結合することができそしてラベルされたｘ
ｇａ、ｘｇｙ又はＩｇＡに結合することができない１個
のバンドとして同定され：初乳Ｉ　ｇＫ−ｂｆの見かけ
分子量は１４〜１６ＫＤであシ；そして（６）これらの
因子の生物学的活性は煮沸に対して耐性である、すなわ
ち、これらはドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｎ２　）の存
在下で３分間煮沸した後、なシ　　Ｉ−Ｉｇｌと結合す
る・ この発明のＩｇＥ−ｂｆはヒト−初乳調與物中に天然の
濃度よりも高濃度で存在する。これらはなお、類似の分
子量又は一層高い分子量、例えは約４５又は５０ＫＤま
での他のヒト−初乳ポリペグチドと混合されていてもよ
いが、しかしながらこれらはヒト−初乳の他の非−ポリ
ペプチド成分を本質上含有しない。好ましくは、ＩｇＥ
−ｂｆはｌ０ＫＤ以下の分子量を有するポリペプチド、
及び２５ＫＤ以上、特に２０ＫＤ以上の分子量を有する
ポリペプチドを含有せず、そして特に、ヒト−初乳の他
の非−４リペグチド成分を含有しない。

この発明のＩｇＥ−ｂｆの製造方法は、出発材料として
ヒト−初乳を使用すること、及びＩｇＥ−ｂｆを天然の
濃度より高濃度にまで濃縮することを特徴とする。

さらに詳しくは、健康な志願者からのヒト−初乳を出産
後最初の２日間に集める。但し、さらに後で集めた乳を
使用することもできる。まず、例えば超遠心分離によ）
初乳を透明にし、そして次に１例えは塩酸により約ＰＨ
４まで酸性化してカゼインを沈澱せしめる。例えばＦ遍
又は遠心分離によりカゼインを除去した後、透明なりＩ
４製物を、例えば２ＭＴｒ１ｇ緩衝液により中和し、そ
して好ましくは段階的に、フィルター系に通して５０Ｋ
Ｄ以上の大分子を除去する。例えば、第１フイルターの
孔は約０．４５μｍの直径を有し、そして次にそのｐ液
を５０　ＫＤの望ましいカット−オフ点を有するメンブ
ランフィルタ−１例えばアきコンＸＭ５０に通す。濾過
の後、ＴｈｊＪ物ｔ−蒸留水に対して透析し、そして凍
結乾燥する。

好ましくは、凍結乾燥物をクロマトグラフ法によりさら
に精製して約１０〜２５ＫＤの分子量を有するポリペプ
チドを集める。任意の常用のクロマトグラフ法、例えば
アガロースプレートグルクロマトグラフィー、又はカラ
ムクロマトグラフィー、例えばセファデックス６７５上
でのクロマトグラフィーを使用することができる。溶剤
は好ましくは、例えは塩化す）ＩＪウム（例えば、４０
ば〕、ＴｒＩｍ　−ＨＣＡ　（例えば、１０　ｍＭ　、
ｐＨ８，０）、界面活性化合物（例えば０．０５９６の
トクイーン２０）、アミノ酸（例えば１０ｍＭε−アミ
ノカプロン酸及び蛋白質（例えば０．１％ウシ血清アル
ブミン、ＢＳＡ　）を含有する緩衝液である。Ｉ　ｇＥ
−ｂ　ｆを含有する画分は、約１０〜２５ＫＤの分子量
のポリペプチドを含有する両分である。これらをプール
し、例えは真空中で濃縮し、そして例えばノ・ンクの平
衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に対して透析する。

Ｉ　ｇＥ−ｂ　ｆを単離するための他の任意の方法もこ
の発明に含まれると理解すべきである。

単離されたＩｇＥ−ｂｆのＩｇＥ結合活性及びＩｇＥ抑
制活性は、当業界において知られてｈる方法によ）、例
えばロゼツト阻害アッセイ、アフイニーティークロマト
グラフィー実験、及びアレルギーを有する個体由来のリ
ンパ球による進行中のインービトロＩｇＥ合成の抑制を
測定する実験にょシ決定することができる。

初乳のロゼツト阻害活性が砕かにＩｇＥに対するアフィ
ニティーを有する因子Ｋ１．＜ことを示す特異性対照と
して、　Ｅｇｌｌｉニーセファロース４Ｂ及びＩｇＧ−
セファロース４Ｂ上での吸着及び溶出実験を行うことが
できる。

最も興味あることには、このデータは、初乳がヒト−Ｉ
ｇＥのイン−ビトロ合成を抑制すること、及びこの抑制
がＩ　ｇＥ−ｂ　ｆによって介在されることを示す。確
かに、Ｉ　ｇＥ−ｂ　ｆ及びＩｇＥ−抑制活性の両者は
ＩｇＥ−セファロース上に特異的に吸着され友。初乳調
製物はＩｇＭ合成に対して効果を有しなは花粉、ネコの
フケ、イエダニ（ｈｏｕｓｅ　ｄｕｓｔｍｉｔｅ）等に
対するアレルギーを有する患者におけるアレルギー状態
の治療又は予防の念めの、この発明の新規なＩｇＥ−ｂ
ｆの使用に関する。特に母乳を供与されない高い危険を
有する新生児を含む危篤状態の高い危険を有する患者の
ために特１ｃｆｉ要であろう。この発明のＩｇＥ−ｂｆ
は経腸的に、例えば鼻内に１直腸にもしくは経口的に、
又は非経腸的に、例えば筋肉内に、皮下にもしくは静脈
内に、通常は単位投与形で、例えば錠剤、糖衣丸、アン
グル、バイアル、生薬として投与される。この発明のＩ
ｇＥ−ｂｆの投与量は患者の体重及び一般的状態、疾患
の重篤さ、及び投与の態様に依存し、そして医師の判断
に基かなければならない。一般に、体重ｋｉ描り約１０
０〜約５０００μＩが投与される。

この発明はさらに、抗アレルギー的に有効な量のこの発
明のＩｇＥ−ｂｆを、経口的又は非経腸的投与、例えば
筋肉内、皮下又は腹腔内投与の丸めに適当であシそして
活性成分と不都合な相互作用をしない常用の医薬として
許容される担体と共に含んで成る医薬に関する。

固体粉末を含有する錠剤、カブセル、又は注入溶液、好
ましくは水性溶液もしくは懸濁液を含有するバイアル、
アングル等が適当であシ、活性成分を単独で、又は担体
、例えばマンニトール、２クトース、グルコース、アル
ブミン等と共に含有する凍結乾燥物から、使用前に前記
の液剤を調製することもできる。医薬製剤は無菌化する
ことができ、そして所望により、添加剤、例えば防腐剤
、安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝剤、及び／又は侵透圧
調整剤を添加することができる。無菌化は、小孔サイズ
（０，４５μｍ以下の直径）のフィルターを通す無菌−
過によ〕達成することができ、次にこれを所望により凍
結乾燥することができる。

無菌状態を維持するために抗生物買を加えることもでき
る。

この発明の医薬製剤は、単位投与当力１〜２０００Ｉｎ
９の医薬として許容される担体、及び約１〜２００〜、
好ましくは約５〜５０ｒｎ９の活性成分（例えば、Ｉｇ
Ｅ−ｂｆを含有する凍結乾燥された初乳調製物）を含ん
で成る単位投与形、例えばアンプルとして投与される。

この発明はまた、医薬の製造方法に関し、この方法は、
この発明の生物学的に活性な蛋白質を医薬として許容さ
れる担体と混合することを特徴とする。

人体の予防的及び治療的処置のためのこの新規な蛋白質
の使用もま九この発明の対象である。

次に、例によりこの発明をさらに詳細に記載する。但し
、これにより、この発明の範囲を限定するものではない
。

例１゜ １５人の選択されなり健康な志願者から、出産後最初の
２日間に初乳を集める。サンプルはすぐに一２０℃に凍
結する。それぞれ３個ずつのアンプルからなる５個のプ
ールを平行して処理する。

これらをまず遠心分離により透明にし、そして次に塩酸
によル酸性（ｐＨ４，０）にしてカゼインを沈澱せしめ
、このカゼインを除去し、そして次に透明な調製物を２
ＭＴｒｉｓで中和し、そして０．４５μｍフィルターを
通す。アミコアＸＭ５０メンプラｙ　（ＭＷ力、　）　
オフ、　５０ＫＤ　）を通して濾過した後、サンプルを
蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥する。この材料
を以後“初乳ｖ！４製物″と称する。ｒル濾過ア、セイ
において、４０１ｎ９の凍結乾燥された初乳を１．５Ｊ
ＩＩ１０緩衝液（０，０５％トクィー７２０．１０ｍＭ
　ｇ−７ミノカデロン酸及ヒ０．１　％　ＵＳＡを含有
する４　０　ｙｎＭ　ＮａＣｔ、　１０　ｍＭＴｒｌｍ
−ＨＣｊ　、　ｐＨ８，０）を指標を有するセファデッ
クスＧ７５力９ム（２，５Ｘ９０３）に適用する。

１０−１５ＫＤ、１５−２０ＫＤ、２Ｏ−２５ＫＤ。

２５−３０ＫＤ、３Ｏ−４５ＫＤ、及び４５−６０肋の
分子量に対応する両分をプールし、１．５ｄ１１Ｃａｍ
し、そしてバンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）　Ｋ対して
透析する。

免疫試験により示されるように、分子量１０〜２０１Ｇ
）のＩす（プテドを含む両分がＩｇＥ−ｂｆを含有する
。

免疫試験 ＩｇＥ−ｂｆをロゼ、ト阻害試験により検出する。

この方法においては、ＩｇＥのための表面レセプターを
示すことが知られているＲＰＭＩ８８６６細胞を、最適
濃度以下の精製されたＩｇＥ骨髄腫Ｐ８（［０。

／９ルテモア、ジ、ンズホデ牛ンス大学、に、イシズカ
博士よ〕入手）が；−トされ九クシ赤血球とロゼ、ト形
成せしめる。ｘｇＥでコートされ九赤血球と共に繭イン
″？為ベートされた場合、　Ｉｇｌ−ｂｆはＲＰＭＩ８
８６６細胞へのＥ−ＩｇＥの結合を阻害する。

すべてのアッセイは２連で行い、チーーツに暗号を付し
、実験者はその暗号を無視しなければならない。実験誤
差は１５％未満である。アフィニティークロマトグラフ
ィー実験はセファロース４８に連結された高度に精製さ
れたＩｇＥ、例えばＩｇＥ−ＰＢ　、又はポリクローナ
ルＩｇＧ（４■蛋白質／ｄｒル）を用いて行う。Ｆ液及
び溶出液をサンプルの最初の体積に濃縮し、そしてすぐ
に中和しそしてＨＢＳＳ　Ｋ対して透析する。

フィコ−ルーツ翫イパク上で遠心分離することＫよりア
レルギーを有する供与体のへ・臂リン処理された血液か
らＢリン・譬球を分離する。グラスチック−（）り皿に
付着した後、リッツ４？球調典物から、ＡＥＴ　（２−
アミノエチルイソチオウロニウＡｌ１−化水素酸塩）で
処理されたヒツジ赤血球とロゼツトを形成する細胞を枯
渇させる。１．５１１７の培地に１〜１．５×・ｌＯ個
の細胞を含む２連の培養を２４ウ工ルリンプロ組織培養
プレート中で行う。

幾つかの培養物にはシクロヘキシミド（５０ｍａｇ　／
１ｔｔｌ　）及びピ、−ロマイシン（１０ｎａｇ／Ｍｌ
）を補充してあらかじめ形成されたＩｇＥの培養上清へ
の受動放出を測定しそして試験培養物中での正味のＩｇ
Ｅ合成を計算する。９２俤の空気と８４のｃｏ２を含有
する水飽和雰囲気中で７日間インキュベートした後、培
養物を収得する。固相ラジオイムノアッセイにより培養
上清中の免疫グロブリン？：測定する。２１１１類の異
るマウスモノクローナル抗体、すなわちクローン８９（
本発明者等の研究室でｉｌ！Ｉｐしたもの、及びクロー
ン４．１５　（ＣＡ、ロサンゼルス、ＵＣＬＡ、　Ａ、
　５ａｘｏｎ博士から入手したもの）をＩｇＥ測定のた
めに用いた。このアッセイの感度は、ＩｇＥについては
０．１　ｎｇ／ｒｔｔｌ、ＩｇＭ及びＩｇＡについては
０．４　ｎｇ／１ｒｔｌ、そしてＩｇＧについては０．
８ｎｇ膚である。

ウェスタンプロット分析 １００μｇの初乳ｖＩＲ製物を含有する８０μｔを４０
μｔのレムリー緩衝液（１チのＳＤＳ及び５％の２−メ
ルカグトエタノールを含有する）と共に１夜インキユベ
ートし、次にこの混合物を１２チＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上
で泳動せしめ（／リアクリルアミドダル電気泳動）、そ
してニトロセルロース膜に移す。すべての試薬及び装置
はビオ−ラド・ラゲラトリーズ裂であシ、そして正確な
方法はビオ−ラドの指示書に行って実施する。移行の後
、ニトロセルロース膜を放射性ラベルし几ＩｇＥ（１０
５ｃｐｍ／ｍ／　：比活性２Ｘ１ｏ４／ｎｇ）に２４時
間暴露し、そして次に前記指示書に従りてオートラジオ
グラフィーの九めに処理する。

結果 ヒト−初乳中のＩｇＥ−ｂｆの存在 上記のようにして調製された初乳プールを、１〜１００
１００Ｏ／１ＩＬｌの最終濃度において、ＩｇＥレセプ
ター担持細胞（ＲＰＭＩ　　８８６６　　）へのＩ　ｇ
Ｅ−コートウシ赤血球（Ｅ−ＩｇＥ）の結合をブロック
するそれらの能力について試験する。各初乳調製物は、
１０又は１００　ｍｅｇ　／ｒｔｔｌの最適濃度におい
てＲＰＭＩ８８６６とＥ−ＩｇＥとのロゼツト形成を有
意に阻害した（第１表１）。ロゼツト阻害がＩ　ｇＥ−
ｂｆ　　によって介在されることを証明するため、初乳
画分をＩｇＥ−セファロース又はＩｇＧ−セファロース
上に吸着せしめる。第１表２に示す結果は、ロゼツト阻
害活性がＩｇＥ−セファロース上への吸着によって除去
されるがＩｇＧ−セファロース上への吸着によっては除
去されないことを示し、阻害が初乳中に存在するＩｇＥ
−ｂｆ　によるものであることを示唆する。このことは
、ロゼツト阻害活性が、　　ＩｇＥ−セファロースの酸
溶出（０，１Ｍグリシン緩衝液、戸２．８）によりて回
収され得るが、ＩｇＧ−セファロースの酸溶出によって
は回収されないことにより確認される。ＩｇＥ−ｂｆ　
の分子ｉが、指標を存するセファデックスＧ７５カラム
を通すダル濾過（実験ｌ）により推足される。第１表３
に示すように、ＩｇＥ−結合活性は１０〜２０ＫＤの猫
に対応する両分中に回収される。

以下余白 初乳ＩｇＥ−ｂｆの免疫制御活性 初乳調製物を、アレルギーを有するヒト供与体３９から
のＢリンパ球培養物に１〜１０００１００Ｏの最終濃度
で加える。初乳の非存在下で１週間培養した後、ＩｇＥ
の自然分泌は１３例においては４００　ｐｆｌ／ｍｔよ
り多く（範囲：４００〜１１，６００ｐｇ／ＷＬｔ　）
、１４例においては１５０〜４００ｐ＃／縦であり、そ
して１２例に２いては検出されなかった。ｌ実験を除く
すべての実験において（第■表）。

初乳はＩｇＭの生Ｍｔ−変化せしめないでＩｇＥの合成
を投与量依存的に抑制した。ｌＯ〜１００　ｍａｌ／ｌ
ｄの最終濃度において、　４００９ｇ／ｉｔ未満のＩｇ
Ｅｔ−分泌する培養物中で初乳はＩｇＥ合成を完全に抑
制した（データーに示してない）。同じ条件下で。

４００　ｐｇ／１１Ｌｔより多くを分泌する培養物中で
ＩｇＥ合成の５０％の阻害が観察され九（第■表）。初
乳のＩｇＥ抑制活性はＩｇＥ−Ｂ−セフ了ロース上に吸
着され得るがＩｇＧ−セファロース４Ｂ上には吸着され
ず、これがＩ　ｇＥ−ｂ　ｆにより介在されることが示
される（第■表）。

ウェスタンプフット分析 １４〜１５ＫＤの見かけＭＷを有する１個のノ４ンドが
放射性ラベルされたＩｇｌＫ績合したが放射性ラベルさ
れたＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭには結合しなかった。こ
のバンドの特異性はまた、初乳がＩｇＥ−セファロース
に前吸着された場合には検出されないことにより証明さ
れた。

同じパターンが、初乳をレムリー緩衝液中で３分間煮沸
した場合にも観察された。

従って、初乳ＩｇＥ−ｂｆは還元剤（ＳＯ８のような）
及び煮沸に対して耐性であると結論される。

以下余白 第ｍ表 ＩｇＥ−ｂｆに基＜ＩｇＥ−抑制活性 ＩｇＥ　（ｐ＃〜） １２４０±２４０　　８９０±１３５ 初　　乳　　　　　　　　　５５０±１８０　　２００
±５０吸着さｎた初乳及び未吸着初乳は１００μＩ／ｍ
ｌで使用した。平均±ｉｓＤ　（２回の培！り１例２．
医薬製剤（非経腸投与用） ＩｇＥ−ｂｆを含有する凍結乾燥された初乳調製物５０
０ダを５ＱＱｍの５Ｎヒト−血清アルブミンに溶解する
。生ずる溶液を細菌学的フィルターに通し、そして濾過
された溶液を無菌条件下で、５ダの活性化合物を含有す
る１００バイアルに分割する。非経腸投与に適するこの
バイアルを、好ましくは冷所に、例えば−２０℃にて貯
蔵する。

同様にして、１００１１ｇ又け１０００！の前記初乳Ｍ
製物を用いて、それぞれ１ｍｇ又は１０〜の活性成分を
含有するバイアルを製造する”ことができる。

文　　献 １、　　Ｉｍｈｉｚａｋａ、に、　”　ＩｇＥ合成の制
御”Ａｎｎｕａ１２・Ｋａｔｚ、　Ｄ、Ｈ−及びＭａｃ
ｅｌｅｔｔｉ、　Ｊ、Ｆ、＋（１９８３）“ヒト及び実
験動物におけるＩｇＥ抗体系の制御”、　Ｐｒｏｇｒｌ
ＩＩｓｓ　ｌｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖ、　Ｙ。

Ｙａｍａｍｕｒａ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｔｏｄａｉ　、　Ａ
ａａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ。

４６５゜ ３、　５ａｒｆａｔｌ、　Ｍ、Ｉ　Ｒｅｃｔｏｒ、　Ｅ
、、　Ｒｕｂｉｏ−Ｔｒｕｊｉｌｌｏ、　Ｍ、、　Ｗｏ
ｎｇ、　Ｋ、、　５ｅｈｏｎ、　Ａ、Ｈｌ及びＤｅｌｅ
ｓｐ＠ｓｓｓ＋　Ｇ、”ヒト−リンパ球のＲＰＭＩ　８
８６６リン・卆芽球Ｂ細胞により分泌される因子の結合
によるＩｇＥのイン−ビトロ合成”、　Ｕ、　ＩｇＥ　
Ｋよる自然的ＩｇＥ合成の増強＊　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　１９８４＋　５３：１９７゜ ４、　　Ｈｕｆｆ、　Ｔ、Ｆ、及びｌ５ｈｉｚａｋａ、
　Ｋ、”ヒト−Ｔｉ胞ハイプリドーマによるＩｇＥ結合
因子の形成″。

Ｐｒｏｃ、　Ｎ１ｔ１．　Ａｅａｄ、　Ｓｅ１．　　（
ＵＳＡ）　１９８４．８１：１５１４゜ ５、　　Ｓａｎｄｂｅｒｇ＋　ｘ、ｌ　Ｐｒｏｖｏａｔ
、　Ｔ、及びｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｋ、　’過敏性紅皮
症におけるＩｇＥ結合ＭａｃＭｉｌｌａｎ＋　ｐ、１０
５゜ ６、　　Ｂｅ＠ｒ＋　Ａ、Ｅ、、　ＢｉｌｌＢｌｌｌｌ
ｎ、　Ｒ，Ｅ、及びｆ（ｓａｄ、　Ｊ、Ｒ，”授乳中に
おける白血球の自然移Ｓ＃Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐ
ｒｏｃ−１９７５，７：３９９゜７、　　Ｓｅｈｌａａ
ｉｎｇｅｒ、　Ｊ、Ｊ、及びＣｏｖａｌｌｉ、　Ｈ。

Ｄ、′　母乳によるツベルクリンに対するリッツ々対反
応の移行の証明”、　Ｌａ１１ｅｓｔ　１９７７、２：
５２９゜８、　　Ｍｏｈｒ、　Ｊ、Ａ、”初乳の摂取に
関連する細胞性過敏の誘導及び／又は獲得の可能性”。

Ｊ、　Ｐａｄｉａｔ、　１９７３．８２：１００２０９
、Ｃｒｕｚ、　Ｊ、Ｒ，、ＧａｒｃＳａ、　Ｂａｌ　Ｕ
ｒｒｕｔｉａ。

Ｊ−Ｊ、及びＨａｎｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、　”グアテマラ
の女性からの乳中の食品抗体″、　Ｊ、Ｐａｄｉａｔ、
　１９８１゜９３：６００゜ １０、　　Ｆｒ１ｃｋ、　０．Ｌ、、　Ｇｅｒｍａｎ、
　Ｄ、及びＭｉｌｌｓ。

Ｊ、“′子供におけるアレルギーの進行１．ウィルス１
９７９、６３：２２８゜ １１、　　Ｃｒａｇｏ、　Ｓ、Ｓ、及びＭｅｓｔ＠ｃｋ
ｙ、　Ｊ、　ヒト−Ｒｅｓ−１９８３，２：１６４゜ １２、　　Ｋｊａｌｌｍａｎ、　Ｎ、−１，Ｍ、及びＣ
ｒｏｎｅｒ、　８゜６アレルギー予知のための帯ｍ工ｇ
Ｅの測定。

１６５１人の子供における７オまでの追跡”Ａｎｎａｌ
ｓ　ｏｆ　Ａｌｌ＠ｒｇｙ　１９８４．５３：１６７゜
１３、　　Ｊａｒｒｅｔ、　Ｅ、Ｅ、Ｅ−及びＨａｕ、
　Ｅ、　　”物質の影響によるＩｇＥ抗体反応の選択的
抑制”、　Ｎａｔｕｒ・（ａンドン）　　１９７３．２
８０：４５゜１４、　　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｓ、Ａ、及
びＴｕｒｎｅｒ、　Ｍ、Ｗ、　”免疫された雌からの乳
及び血清抗体によるラットＩｇＥの特異的抑制’　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８３．４８：１９５゜１５、　
　　Ｒｌｃｈｌｙ、　　Ｅ−Ｒ，、Ｂａ５ｓ、　　Ｒ，
、Ｍｅｉｓｔｒｉｃｈ。

Ｍ、Ｌ、及びＤｓｎｎｉａｏｎ、　Ｄ、に、　”ヒト−
初乳中の１９７２球サブセットの分布”、　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ・１９８２、１２９：１１１６゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト−初乳から濃縮した形で得られるＩｇＥサプレ
   ッサー（ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有するＩｇＥ結合因子（
   ＩｇＥ−ｂｆ）。 ２、（１）指標を有するセファデックスＧ７５カラム上
   でのクロマトグラフィーにより決定した場合、１０〜２
   ５キロダルトン（ＫＤ）の分子量を有するポリペプチド
   であり； （２）例えばＲＰＭＩ８８６６細胞とＥ−ＩｇＥとのロ
   ゼット形成の阻害により決定した場合、ＩｇＥのための
   レセプターを担持する細胞へのＩｇＥの結合をブロック
   し； （３）アレルギーを有するヒト供与体のＢリンパ球によ
   るＩｇＭの生産を変化せしめることなくＩｇＥの合成を
   投与量依存的に抑制し、 （４）例えばＩｇＥ−セファロースへの吸着により決定
   した場合ＩｇＥと結合し、そして例えばＩｇＧ−セファ
   ロースへの吸着の欠除により決定した場合ＩｇＧと結合
   せず； （５）ウエスタンプロットアッセイにおいて、放射性ラ
   ベルされたＩｇＥに特異的に結合することができるがラ
   ベルされたＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡには結合すること
   ができない１個のバンドとして同定され、見かけ分子量
   が１４〜１６ＫＤであり；そして、 （６）生物学的活性が煮沸に対して耐性である、すなわ
   ちドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で３分間
   煮沸した後なお＾１＾２＾５Ｉ−ＩｇＥと結合する；こ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のＩｇＥ−ｂ
   ｆ。 ３、天然の濃度より高濃度でヒト−初乳調製物中に存在
   する特許請求の範囲第１項記載のＩｇＥ−ｂｆ。 ４、類似の分子量、一層低い分子量又は一層高い分子量
   を有する他のヒト−初乳ポリペプチドとの混合物として
   存在する特許請求の範囲第１項記載のＩｇＥ−ｂｆ。 ５、分子量１０ＫＤ以下で２５ＫＤ以上特に２０ＫＤ以
   上の他のヒト−初乳ポリペプチドを実質上含有せず、そ
   して特に約１４〜１５ＫＤの分子量を有する特許請求の
   範囲第１項記載のＩｇＥ−ｂｆ。 ６、ヒト−初乳の非−ポリペプチド成分を実質上含有し
   ない特許請求の範囲第１項記載のＩｇＥ−ｂｆ。 ７、ヒト−初乳から濃縮された形で得られるＩｇＥサプ
   レッサー（ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有するＩｇＥ結合因子
   （ＩｇＥ−ｂｆ）の製造方法であって、ヒト−初乳を出
   発材料として使用すること、及びＩｇＥ−ｂｆを天然の
   濃度より高濃度に濃縮することを特徴とする方法。 ８、出産後最初の２日間に集めたヒト−初乳を使用する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、ヒト−初乳を例えば超遠心分離により透明にし、例
   えば塩酸により約ｐＨ４まで酸性化し、例えばろ過又は
   遠心分離により沈澱したカゼインを除去し、例えば２Ｍ
   Ｔｒｉｓ緩衝液により中和し、例えば段階的に種々のメ
   ンブランフィルターに通すことによって５０ＫＤ以上の
   分子を除去し、水に対して透析し、そして凍結乾燥し、
   場合によっては追加の精製段階を実施することを特徴と
   する特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、前記追加の精製段階が１又は複数の常用のクロマ
   トグラフ法、及び／又は等電点フォーカシング、及び／
   又はモノクローナル抗体を用いる単離から成る特許請求
   の範囲第９項記載の方法。 １１、アレルギーを有する患者のアレルギー状態の治療
   又は予防のためのこの発明の新規なＩｇＥ−ｂｆの使用
   。 １２、ヒト−初乳から濃縮した形で得られるＩｇＥサプ
   レッサー（ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有するＩｇＥ結合因子
   （ＩｇＥ−ｂｆ）を含んで成る医薬。