JPS6121077B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素反応を利用してβ―クロロアラニ
ン又はセリンとチオグリコール酸からＳ―カルボ
キシメチル―Ｌ―システインを合成する方法に関
し、特に、該反応に於いて、酵素としてピリドキ
サール・燐酸を補酵素とする酵素であつて且アミ
ノ酸を基質とするとき、そのβ―置換反応を促進
する働きを有する酵素を用いることを特徴とする
方法に関する。 Ｓ―カルボシメチル―Ｌ―システインは喀痰剤
などの医薬品として、或いはビオチン等他の医薬
品合成用の中間体として有用な物質であり、その
製造法としては従来、例えば、システインとモノ
クロル酢酸をアルカリ液で処理する方法等、専ら
化学的な合成法のみが知られていた。しかし、一
般に化学的な合成法ではＳ―カルボキシメチル―
Ｌ―システインの如き不斉炭素原子を有する光学
的に活性な化合物を取得するためには、反応原料
として相応する光学活性化合物を用いるか或いは
反応生成物を光学分割することが不可避であり、
このことがその経済的な製造を目指す上で大きな
障害の１つとなつている。 本発明者らは比較的入手が容易で経済的にも安
価なβ―クロロ―DL―アラニンやDL―セリンと
チオグリコール酸を原料とし、これから直接目的
とするＳ―カルボキシメチル―Ｌ―システインを
取得し得る方法を開発すべく種々検討を重ねた結
果、或る種の酵素を用いた酵素反応を利用するこ
とによつて所期の目的を達成し得ることを見出
し、本発明の方法を完成するに至つた。 即ち、本発明はピリドキサール・燐酸を補酵素
とする酵素であつて且アミノ酸を基質とするとき
そのβ―置換反応を促進する働きを有する酵素の
存在下にβ―クロロアラニン又はセリンとチオグ
リコール酸を反応させることを特徴とするＳ―カ
ルボキシメチル―Ｌ―システインの製造法を提供
せんとするものである。 以下、本発明の方法について更に詳しく説明す
る。 ピリドキサール・燐酸を補酵素とする酵素はビ
タミンB₆酵素とも呼ばれ、生体内に於けるアミ
ノ酸の合成、分解、相互変換などの反応に重要な
役割を演じており、その触媒する反応は基質アミ
ノ酸のα位の炭素原子を中心に、脱炭酸、アミノ
基転移、ラセミ化、α―β脱離、β―置換、Ｃ―
Ｃ結合の開裂など極めて多種多様の反応が含まれ
ている。しかし、この酵素が生体中で触媒する反
応の多彩さに比べて、これを産業上有用なアミノ
酸の製造に利用せんとする試みは少なく、実用例
としてはＬ―アスパラギン酸の脱炭酸反応による
Ｌ―アラニンの製造等非常に限られたものしかな
いことが指摘されている（“微生物とその応用第
２巻、生体触媒としての微生物”、第65頁〜第92
頁、共立出版株式会社；“ビタミン”第51巻第11
号、第463頁〜第476頁等）。 本発明者らは永年に亘り、各種のビタミンB₆
酵素の酵素的特性及びそれらを利用した多くの生
理活性アミノ酸やそれらの誘導体の酵素的合成法
について研究を重ねてきたが、数多くのビタミン
B₆酵素の中で基質アミノ酸のβ―置換反応を促
進する働きを有する一群の酵素がそれぞれ前記β
―クロロアラニン又はセリンとチオグリコール酸
からのＳ―カルボキシメチル―Ｌ―システインの
合成反応に特異的に働くことが見出された。該酵
素について代表的なものを列挙すれば、例えば、
β―チロシナーゼ（EC4，１，99，２）、トリプ
トフアナーゼ（EC4，１，99，１）、トリプトフ
アンシンターゼ（BC4，２，１，20）、システイ
ンデスルフヒドラーゼ（EC4，４，１，１）シス
テインシンターゼ（EC4，２，99，８）、Ｓ―ア
ルキルシステインリアーゼ（EC4，４，１，
６）、メチオニナーゼ（EC4，４，１，11）、シス
タチオニン―β―シンターゼ（EC4，２，１，
22）等があるが、括孤内にエンザイム・コミツテ
イによる所定の酵素番号（EC）を明示した通
り、これらはいずれも公知の酵素であり、その製
造、入手に格別困難はない。また、上記例示した
以外の酵素であつても、前述の通り、ビタミン
B₆酵素であつて基質アミノ酸のβ―置換反応を
促進する働きを有する酵素であれば原則として使
用可能である。 尚、本発明の方法の実施にあたり、反応に供す
べき酵素は、その生産菌を培養した培養液をその
まま酵素液として使用しても良く、また、培養液
から分離した菌体又は分離菌体を磨砕、音波処
理、酵素消化等の方法で得た菌体破砕液或いはこ
れらから遠心分離、塩析、溶剤沈澱等の方法で得
た酵素剤、適当な担体に担持した固化酵素剤等そ
の他酵素反応手段として実施される方法であれ
ば、その態様については特に制限はない。 反応に供すべき酵素として微生物の培養液又は
分離菌体等を用いる場合には、例えば、エルビニ
ア・ヘルビコーラ、エシエリヒア・インターメデ
イア、バチルス・アルベイ、プロテウス・レツト
ゲリイ、エシエリヒア・コリ、バチルス・ズブチ
リス、エアロバクター・エアロゲネス、サルモネ
ラ・テイフイムリウム、シユードモナス・クルシ
ビエ、シエードモナス・プチダ（シユードモナ
ス・オバリス）、ノイロスポーラ・クラツサ、サ
ツカロミセス・セレビシエ等やその他の前記酵素
を単独或いは複数産生する能力を有する各種の微
生物を適当な培地に培養する。培地組成としては
通常の天然培地か合成培地が用いられ、炭素源と
してグルコース、シユークロース、澱粉又はその
加水分解液、糖密、酢酸、エタノール等、窒素源
としてアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム或いは肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物、大豆粕、コーンスチープリカー等、
また、無機塩類としてリン酸１カリウム、リン酸
２カリウム、リン酸２ソーダ、硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、硫酸亜鉛、硫酸
銅、硫酸コバルト等が適宜用いられる。尚、これ
らは単なる例示であり、必要に応じて上記以外の
物質を添加、使用し得ることは勿論であり、ま
た、誘導酵素の生産を目的としてその生産菌の培
養を行うときは、その菌の特性に従つて培地中に
特定の基質となる物質を添加共存せしめることが
必要である。 培養条件は上述の培地組成、添加物の必要性等
と同様に微生物の種類、特性に依り適宜定められ
るため、必ずしも一律には規定し得ないが、一般
的な範囲を言えば、温度20〜50℃、PH5.0〜9.0、
培養時間10〜120時間程度が適当であり、振盪培
養、曝気培養などの好気性条件下に行われる。 本発明の酵素反応によるＳ―カルボキシメチル
―Ｌ―システインの製造の態様については特に制
限はないが、通常は前述の如き酵素を含む反応液
に反応基質としてβ―クロロアラニン又はセリン
とチオグリコール酸が添加され、反応が進行す
る。尚、原料としてのβ―クロロアラニンやセリ
ンはＬ―体は勿論のこと、DL―体をこそのまま
用いることができる。この際、同応液中の基質の
濃度が高過ぎるときは酵素の種類によつてはその
酵素活性を阻害される恐れを生じたり、また、β
―クロロアラニンを基質とするとき、反応当初よ
り高濃度にて用いるとその分解反応を生じたりす
る恐れがあるため、一般に反応基質の液中濃度を
0.5〜５重量％程度に保つことが適当である。そ
のため、反応基質特にβ―クロロニンは全量を数
次に分けて反応液に添加するか、或いは小量づつ
連続的に添加することが望ましい。原料モル比は
化学量論量で良く、例えば、原料β―クロロアラ
ニンやセリンとしてDL―体を用いる場合にはチ
オグリコール酸１モルに対して２モル用いられ、
またＬ―体を用いるときは１：１で良い。しか
し、必要に応じて反応を阻害しない範囲でいずれ
か一方の原料を過剰に用いることは別段差支えは
ない。酵素の使用量（濃度）は少な過ぎる場合に
は酵素活性が不充分であることは勿論であるが、
多過ぎても必ずしも相応する効果が得られるもの
ではなく不経済であると共に微生物の培養液をそ
のまま酵素液として用いる等場合には、その種類
によつては生成物や基質を分解したり、反応を阻
害する物質が副生共存することもあり、そのよう
な場合には余り高濃度の酵素液を用いることは避
けなければならない。具体的には反応に供される
酵素の種類、態様、力価等に基づいて適宜定めら
れ、必ずしも一律には規定し得ないが、一般的な
範囲を言えば反応液１あたり10〜10000単位
（但し、１単位とは生成物を１μmol/minにて生
成する酵素量を意味する）程度が適当である。 反応液のPHは原則的には酵素の至適PHに依るが
一般的に言つて酵素の至適PHはアルカリ側（PH８
位）のものが多いが、PHが高過るとβ―クロロア
ラニンを基質としたときにはこの化合物が不安定
となり、一方、酸性側ではβ―クロロアラニンの
安定性は増すが、PHが低過る場合には酵素が失活
する恐れがある。従つて、通常は６〜９の範囲内
で行われる。尚、反応の進行に伴つて塩素イオン
の遊離のため次第にPHが低下するため、必要に応
じて適宜アンモニア、苛性ソーダ等のアルカリを
加えてPHを上記範囲内に調整することが望まし
い。反応温度についても酵素の至適温度に依る
が、通常は20〜50℃程度が適当である。反応時間
は酵素の力価、基質の濃度、その他回分反応であ
るか連続反応であるかによつて異なる。 生成したＳ―カルボキシメチル―Ｌ―システイ
ンは反応液より分離後イオン交換樹脂処理、加溶
媒晶析、再結晶等の手段により精製される。 以下、本発明の方法について代表的な例を示
し、更に具体的に説明する。尚、これらの例は本
発明の理解を容易にするための単なる例示であ
り、本発明の方法はこれらのみに限定されないこ
とは勿論のこと、これらによつて何ら制限されな
いことは言うまでもない。 実施例 １ 酵素の精製 表１に示した培地500mlを含む２容フラスコ
に、予めブイヨン培地にて前培養したエシエリヒ
ア・コリATCC―15491を接種し、28℃にて24時
間振揺培養した。 表 ― １ グルコース 5.0 ｇ／ クエン酸 2.0 〃 カザアミノ酸 0.5 〃 K₂HPO₄ 10. 〃 NaNH₄HPO₄ 3.5 〃 MgSO₄・7H₂O 0.2 〃 インドール 0.005 〃 このようにして得られた培養液100を
10000rpmで遠心湿重量550ｇの菌体を得た。この
菌体を５℃、30分間の超音波処理により破壊し、
無細胞抽出液2.2を得た。この無細胞抽出液よ
り、硫安分画、DEAE―セフアデツクスによるカ
ラムクロマトグラフイー、セフアデツクスムＧ―
200によるゲル過などの常法により比活性が9.4
単位〓/mgの純粋なトリプトフアンシンターゼ
10.6mgを得た。 反 応 このようにして得られた酵素34単位を表―２に
示した組成の反応液200mlに加て37℃にて10時間
反応を行つた。 表 ― ２ チオグリコール酸 4.6ｇ β―クロロ―DL―アラニン 12.3〃 ピリドキサルりん酸 8.0mg EDTA・２ナトリウム 1.5ｇ0.2Mホウ酸ナトリウムバツフアー （PH8.0） 250ml 全液量 １ 〓 トリプトフアン合成酵素の１単位は、37℃に
おいて１μmol/minのトリプトフアンをセリン
とインドールから合成する酵素量とする。 反応開始後、30分毎にβ―クロロ―DL―アラ
ニン0.6ｇを加え、その度に反応液のPHを
2NNaOHで8.0に調節する。また反応開始後１時
間毎にチオグリコール酸0.23ｇを添加する。反応
間始後９時間目にこれら基質の添加は終了する。
反応終了後、6NHClを40ml加え反応を停止し、反
応液を遠心分離し、上清のＳ―カルボキシメチル
システインの定量を行つたところ、2.3ｇ生成蓄
積していた。 実施例 ２ 実施例１のようにして得た純粋なトリプトフア
ン合成酵素34単位を用いて表―３に示した組成の
反応液200mlに加えて37℃で10時間反応を行つ
た。 表 ― ３ チオグリコール酸 4.6ｇ Ｌ―セリン 5.3〃 ピリドキサルりん酸 8.0mg EDTA・２ナトリウム 1.5ｇ0.2Mホウ酸ナトリウムバツフアー （PH8.0） 250ml 全液量 １ 反応終了後6NHClを40ml加え反応を停止する。
反応液を遠心分離し、上清のＳ―カルボキシメチ
ルステインの定量を行つたところ3.1ｇ生成して
いた。 実施例 ３ 酵素の固定化 実施例１のようにして得た酵素標品12.0単位
（1.25mg）を1Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）
2.5mlに溶解した溶液をOxgran Acrylic Beads
（商品名Eupergit Ｃ，Rohm Pharma社製）625
mgに加え、内径2.5cmの平底のガラス容器中で25
℃にて２時間反応する。反応後、６mlの0.1Mり
ん酸カリウム緩衝液（PH7.8）（２―メルカブトエ
タノール10mM、ピリドキサールりん酸
0.02mM、EDTA4mMを含む）で、３回洗浄し、
反応を停止する。洗液中には酵素活性は検出でき
なかつた。このようにして得た固定化酵素は、固
定化前の26.9％の26.9％の酵素活性を有してい
た。 反 応 このようにして得た固定化酵素12.3単位を表―
２に示した組成の反応液10mlに加え37℃にて反応
を行つた。反応開始後、時間を置いて0.1mlの反
応液をとりろ過により反応を停止し、ろ液のＳ―
カルボキシメチルシステインの定量を行つたとこ
ろ、表４に示すような結果を得た。 表４ 固定化トリプトフアン合成酵素によるＳ
―カルボキシメチルステインの合成 反応時時間 Ｓカルボキシメチルシステイン生成
量ｇ/ 30分 1.2 １時間 1.7 ２〃 2.5 ３〃 2.5 ４〃 2.7 実施例 ４ 酵素液の調製 表５に示した培地500mlを含む２容フラスコ
２本に予めブイヨン培地にて前培地養したバチル
スズブチルスSD―９（微工研菌寄第1483号）を
接種し、28℃で24時間振揺培養した。 表 ― ５ （NH₄）₂SO₄ ２ ｇ／ K₂HPO₄ 14 〃 KH₂PO₄ ６ 〃 クエン酸ソーダ １ 〃 MgSO₄・7H₂O 0.2 〃 グルコース 20 〃 培養液から菌体を遠心分離し、湿重量７ｇの菌
体を得、これを35mlの0.02Mりん酸緩衝液PH7.5
に懸濁した。この懸濁液を５℃で15分間超音波処
理し、無細胞抽出液28mlを得た。この無細胞抽出
液は9.0単位のトリプトフアン合成酵素を含んで
いた。 この酵素液を用いて、実施例１のと同じ方法
でＳ―カルボキシメチルシステインの合成反応を
行つたところ、反応液の上清に0.8ｇのＳ―カル
ボキシメチル―Ｌ―システインが生成蓄積してい
た。 実施例 ５ 表６に示した培地500mlを含む２容フラスコ
２本に予めブイヨン培地にて前培養したエルビニ
アヘルビコーラATCC21434を接種し、28℃にて
28時間振揺培養した。 表 ― ６ Ｌ―チロシン ２ ｇ／ KH₂PO₄ １ MgSO₄・7H₂O 0.5 フマール酸 ７ グリセリン ６ グリシン 0.5 DL―アラニン ３ DL−メチオニン 1.5 酵母エキス 10 ピリドキシン PH 7.5 遠心分離により湿重量20ｇの菌体を得て、これ
を、0.01Mりん酸カリ緩衝液（PH6.0）100mlに懸
濁した。この懸濁液を５℃で30分間超音波処理
し、無細胞抽出液70mlを得た。この無細胞抽出液
は、220単位のβ―チロシナーゼ活性を有してい
た。このようにして調製した酵素44単位を用い
て、実施例１ののようにして反応を行つたとこ
ろ、反応液の上清に0.6ｇのＳ―カルボキシメチ
ル―Ｌ―システインが生成していた。 〓〓 β―チロシナーゼの１単位は30℃において
１μmol/minのピルビン酸を、Ｌ―チロシン
から生成する酸素量とする。 実施例 ６ 表７に示した培地500mlを含む２容フラスコ
２本に予めブイヨン培地にて前培養したエシエリ
ヒアユリATCC10798を接種し、28℃にて20時間
振揺培養した。 表 ― ７ Ｌ―トリプトフアン 6.0ｇ／ コーン・ステイブ・リカー 60 〃 ソルポール Ｗ―200 40 〃 酵母エキス ４ 〃 Ｌ―システイン 0.6 〃 DL―メチオニン 0.3ｇ／ Ｌ―プロリン 0.3 〃 Ｌ―アルギニン 0.6 〃 コハク酸 ３ 〃 KH₂PO₄ ３ 〃 MgSO₄・7H₂O ３ 〃 PH 7.0 培養液から遠心分離により湿重量10ｇの菌体を
得た。これを50mlの0.01Mりん酸カリウム緩衝液
PH7.0に懸濁した。この懸濁液を５℃で20分間超
音波処理し、無細胞抽出液36mlを得た。この無細
胞抽出液は102単位のトリプトフアナーゼ活性を
有していた。このようにして調整した酵素51単位
を用いて実施例１ののようにして反応を行つた
ところ、反応液の上清に、0.5ｇのＳ―カルボキ
シメチル―Ｌ―システインが生成蓄積していた。 〓〓〓 トリプトフアナーゼの１単位は、30℃に
おいて、１μmol/minのピルピン酸をＬ―ト
リプトフアンから生成する酵素量とする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ピリドキサール・燐酸を補酵素とする酵素で
   あつて且アミノ酸を基質とするときそのβ―置換
   反応を促進する働きを有する酵素の存在下にβ―
   クロロアラニン又はセリンとチオグリコール酸を
   反応させることを特徴とするＳ―カルボキシメチ
   ル―Ｌ―システインの製造法。 ２ 酵素がβ―チロシナーゼ、トリプトフアナー
   ゼ、トリプトフアンシンターゼ、システインデス
   ルフヒドラーゼ、システインシンターゼ、Ｓ―ア
   ルキルシステインリアーゼ、メチオニナーゼ又は
   シスタチオニン―β―シンターゼから選ばれる少
   くとも一種である特許請求の範囲第１項のＳ―カ
   ルボキシメチル―Ｌ―システインの製造法。